MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

RA 1. Identificación de los distintos tipos celulares:

UD 1. Nivel celular
Contenidos básicos curriculares:
1.1 Tipos de células: eucariotas y procariotas.
1.2. Estructura celular: Componentes celulares y sus funciones.
1.3. Ciclo celular; Fases del ciclo celular: Interfase y mitosis.
1.4. Genética celular.
Criterios de evaluación:
a) Se han reconocido las estructuras celulares y subcelulares y
sus funciones.
b) Se han caracterizado los diferentes tipos de células.
c) Se han reconocido las etapas del ciclo celular.
d) Se han descrito los principios de la genética celular.

UD 2. Introducción a cultivos celulares

Contenidos básicos curriculares:
2.1. Cultivo celular: Historia del cultivo celular.
2.2. Soportes de cultivo: Tipos de frascos de cultivo.
​ 2.2.1. Aplicaciones.
​ 2.2.2. Líneas celulares.
​ 2.2.3. Células primarias.
​ Criterios de evaluación:
e) Se ha descrito la evolución histórica de los cultivos celulares.
f) Se han caracterizado las células primarias y las líneas
celulares.

UD3. Concepto de asepsia.

Contenidos básicos curriculares:
​

​ .1. Factores a tener en cuenta en la manipulación aséptica:

3
materiales, personal, instalaciones, entre otros.
​3.2. Importancia de la manipulación aséptica en cultivos celulares.
Criterios de evaluación:
​

g) Se ha descrito la metodología para garantizar la

asepsia en los cultivos celulares.
h) Se ha justificado la importancia de la asepsia en los
cultivos celulares.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

UD 3 Concepto de Asepsia

La palabra asepsia es de origen griego; significa ausencia o falta de

materia séptica, es decir, de alguna bacteria o microbios que puedan
causar infección.

Podemos encontrarnos distintas definiciones; una muy común es “Método

o procedimiento para evitar que los gérmenes infecten una cosa o un
lugar”.

La asepsia es también el conjunto de procedimientos que impiden la

introducción de gérmenes patológicos en determinado organismo,
ambiente y objeto.

3.1. Contaminaciones.

El problema más frecuente en los cultivos son las contaminaciones. Si la

contaminación es un componente en un sistema celular, tenemos tres
tipos:
1. Físicos: Temperaturas máximas cerca de donde trabajas. Esto
determina que el habitáculo deba de tener unas características
determinadas con la localización del aparataje concreto, ej:
centrífugas deben estar en un sitio determinado.
2. Químicos: Son los que pueden llevar en relación al tren de
lavado. En cultivos celulares se lava todo sin jabón, materiales de
plástico con lejía.
3. Biológicos: Tipos de contaminantes más frecuentes bacterias,
levaduras, hongos, virus, micoplasmas.
La asepsia es determinante por tanto para cada contaminación.
Los portadores son:
a) La atmósfera. El calor, temperatura, sudor, etc. son factores que
incrementan la probabilidad de aumentar la contaminación.
b) El usuario por:
- Mala manipulación del material.
- No descontaminar las superficies de trabajo.
- No emplear material estéril.
- Por los medios o las soluciones.

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La tasa de crecimiento de las células en un cultivo es muy inferior a la de

sus contaminantes.
Contaminación por bacterias
Bacterias procariotas, bacterias con flagelos o con pared celular, etc. se
alimentan de todo lo que pueden.
- Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para su
crecimiento.
- Fácil de detectar por microscopía.
- Formas motiles (cocos, bacilos)
- Originan cambios en el pH del medio.
- Originan turbidez en el medio.
Para evitarlo:
● Extremar las precauciones de esterilidad.
● Mantener durante menos tiempo los recipientes abiertos.
● Las botellas que se atemperan en el baño, rocialos con alcohol de
70% y secarlos.
Control por antibióticos: penicilina/estreptomicina, gentamicina.
Eliminar los cultivos contaminados a los contenedores especiales
(amarillos)
Pocillos contaminados echar lejía en el que está mal para que no pase a
otros.
Contaminación por levaduras
Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para su crecimiento.
- Fácil de detectar por microscopía.
- Partículas redondeadas u ovoides formando cadenas.
- No causan cambios rápidos en el pH.
- El medio se vuelve turbio.
- Puede causar alcalinización del medio
Para evitarlo:
● Extremar las precauciones de esterilidad.
● Mantener durante menos tiempo los recipientes abiertos.
● Las botellas que se atemperan en el baño, rocialos con alcohol de
70% y secarlos.
Control: Anfotericina B (antifúngico, antilevaduras)
Contaminación por hongos
Pared celular con quitina.
o Se ven a simple vista.
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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

o No provocan cambios inmediatos en el pH del medio.

o Generalmente no son citotóxicos.
o Las esporas difíciles de detectar.
Control: Anfotericina B (Fungizona) o Nistatina.
Limpiar cada 15 días el incubador. Necesitan humedad, por lo que una
mala higiene en el incubador puede ser un factor para su crecimiento.

Contaminación por virus

No se nutren ni se relacionan, sólo crecen.
- Difíciles de detectar por su tamaño.
- Requerimientos muy específicos (hospedador)
- Pueden causar efecto citopático.
- Peligro potencial para el operador al manipular cultivos infectados.
- Hay virus que crecen a baja tasa o en pocas células, sin mostrar
señal alguna tras varios pases.
Para trabajar con virus se debe hacer todo en el mismo habitáculo y no
sacar nada de ahí.

Contaminación por micoplasmas

Son bacterias que carecen de pared celular. Su tamaño es de alrededor de
un micrómetro al ser tan pequeñas pueden entrar donde quieran.
- Formas muy variadas, alargadas, espirales…
- No observable al microscopio óptico, sino con fluorescencia.
- No causan efectos notorios.
- Retardan el crecimiento celular y alteran el metabolismo celular,
pudiendo destruir la línea celular.
- Su forma puede variar, teniendo distintos grados de complejidad.
Al no ser detectables tenemos que pasarlo a un incubador y pasar una
cuarentena y luego hay que hacer el test de micoplasmas para ver como
es el micoplasma, quien tiene micoplasma y qué tipo de micoplasma.
Fuente de contaminación:
El suero o el manipulador de las líneas celulares.
Disminución de la vitalidad en la reanimación de la línea celular al
descongelarlas.

Control:
- Si se puede reemplazar el cultivo, mejor eliminarlo.
- Si no es reemplazable:
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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

● Antibiótico: Kanamicina, aunque por la ausencia de pared celular

suelen ser resistentes a los antibióticos.
● Pase por un animal. El sistema inmune del animal limpia el cultivo
de micoplasmas.
Se recomienda la comprobación periódica de la contaminación por
micoplasma a todos los laboratorios que realicen cultivos celulares cada
mes.
Hay diferentes técnicas para su detección:
- Tinción con orceína.
- Autorradiografía de cultivos incubados con timidina tritiada.
- Tinción fluorescente con Hoechst o DAPI. Fácil, barata,
detectable.
- Sonda con DNA para mycoplasma.
- PCR.

Contaminaciones cruzadas
Son aquellas contaminaciones con otras líneas celulares.
Las principales causas:
● Obtener líneas celulares de procedencia no lo suficientemente
documentadas que nos certifiquen su origen.
● Tener frascos abiertos con más de una línea celular al mismo
tiempo.
● Manipular las líneas de crecimiento rápido en solitario y tras otros
cultivos.
● Utilizar la misma pipeta o las mismas soluciones para líneas
celulares diferentes.
Precauciones:
● Manipular cada línea por separado.
● Limpiar y desinfectar las superficies y útiles de trabajo cada vez que
terminemos el trabajo con cada línea celular.
● No compartir medios de cultivo entre diferentes líneas celulares.
● Verificar periódicamente las propiedades del cultivo. Esto podemos
hacerlo mediante observación en el microscopio invertido, excepto
para ver el micoplasma que necesitamos un microscopio UV (tiene
una tinción fluorescente en la tinción de Hoechst)
● Usar un programa adecuado de almacenamiento.
● Revisar el estado de las placas en el incubador.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

3.2. Importancia de la manipulación aséptica en cultivos

celulares.
Los medios de cultivo celular son ideales para el crecimiento de
bacterias, virus, micoplasmas, levaduras y hongos filamentosos. La
abertura de los frascos y las diversas manipulaciones que hemos de
realizar para el mantenimiento de los cultivos son ocasiones en que se
pueden contaminar. Las contaminaciones provienen principalmente del
aire o de material mal utilizado y pueden tener efecto citopático en el
cultivo.
Por otro lado, las células eucariotas son de crecimiento lento con
tiempo de duplicación de 24 horas y más, mientras que los posibles
contaminantes tienen una velocidad de crecimiento superior y pueden
matar el cultivo en poco tiempo. Con el crecimiento de los contaminantes,
aparece turbidez en el medio y el indicador de pH de los medios (rojo
fenol) vira a amarillo, de forma que los cultivos contaminantes se
pueden identificar visualmente y esto facilita su eliminación. Pero hay
contaminaciones que no acidifican y no hacen virar el rojo fenol:
- Micoplasmas.
- Hongos filamentosos.
Bacterias, levaduras y hongos son fáciles de detectar por la
turbidez, por el color del medio y microscópicamente. Los virus y
micoplasmas son de difícil detección.
La prevención de la contaminación se basa en tres estrategias:
● El trabajo en ambientes estériles que nos proporcionan equipos
como las cabinas de flujo laminar (siempre que su uso y
mantenimiento sean correctos), el material estéril y la adecuada
ubicación de equipos y salas de cultivo.
● Las técnicas de trabajo que han de mantener la asepsia:
trabajamos con técnica aséptica.
● El suplemento de antimicrobianos y fungicidas que se usan en
los medios de cultivo.
La contaminación por micoplasmas es muy habitual. Algunos son
saprófitos humanos (de boca o faringe) procedentes del manipulador, pero
los contaminantes aislados de cultivos celulares son principalmente de
origen animal. Estos infectan en origen los productos animales que
usamos en el cultivo celular, como por ejemplo los sueros y la tripsina.
Incluso muchas líneas celulares continuas nos llegan también
contaminadas de origen por micoplasmas (50-95%). Sus efectos sobre el
cultivo pueden ser variados:
● Inducción de cambios morfológicos.
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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

● Enlentecimiento del crecimiento del cultivo porque consumen

determinados nutrientes según la especie.
● Aberraciones cromosómicas en las células en cultivo.
● Alteraciones del metabolismo celular.
● Efecto citopático con muerte celular.

Los cultivos contaminados serán eliminados tan pronto se

detecten: no se abrirán dentro de la cabina ni se guardarán en la
estufa.

Para detectar la contaminación por micoplasmas hay que hacer controles

periódicos en cada subcultivo:
o Pruebas directas - Se trata de hacer un cultivo en medios selectivos
para micoplasmas. Las colonias presentan un aspecto típico en forma
de huevo frito. Esta es la prueba de referencia (gold standard).
o Pruebas indirectas - Para este uso se han desarrollado diversas
técnicas:
o Tinción de DNA con fluorocromos que tiñen los núcleos
celulares y el DNA de los micoplasmas, que aparecen como un
punteado teñido entre los núcleos.
o Ribotipificación por PCR o RT-PCR usando cebadores que
identifican el RNA 16S de 8 especies de micoplasmas
causantes del 95% de las contaminaciones.
Cuando el cultivo es insustituible, se descontamina el cultivo
aplicando tratamientos con antimicrobianos. Pero el tratamiento puede ser
largo y a veces sin éxito.
El suero bovino es una fuente importante de contaminación por virus. Los
virus pueden tener un importante efecto citopático pero algunos crecen
poco o infectan sólo unas pocas células, de forma que sus efectos se
manifiestan cuando el cultivo ya lleva tiempo, después de diversos
subcultivos.
1. Aspecto típico de las colonias de 2. Tinción de DNA con fluorocromo en un
Mycoplasma en cultivo cultivo celular con Mycoplasmas.

https://onscience.es/comparar-metodos-detec
cion-micoplasma/
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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Otro aspecto de la contaminación es la contaminación cruzada que se

puede dar entre líneas celulares diferentes. En los procedimientos de
técnica aséptica se incluyen precauciones a tener en cuenta para evitar
esta eventualidad:
● Se trabaja solo con una línea celular a la vez.
● Cuando se acaba el trabajo con una línea celular, se limpia y
desinfecta la cabina de flujo laminar antes de empezar con una
nueva línea y nos volvemos a desinfectar las manos con alcohol.
● Cada línea celular tiene sus botellas de medios y suplementos;
aunque para diversas líneas usemos el mismo medio, tendremos
una botella diferente para cada línea.
● Manipulamos las líneas de crecimiento más rápido al final.
La contaminación cruzada se controla en las diferentes líneas
celulares periódicamente haciendo cariotipos y estudios de
marcadores genéticos (DNA fingerprinting).

3.3. Factores a tener en cuenta en la manipulación

aséptica: Hábitos de trabajo en cultivos celulares.

Algunas normas básicas de trabajo en la sala de cultivos

Dentro de la sala de cultivos se debe hablar lo menos posible y cuando es

necesario dar alguna charla o explicación en el interior de la sala de
cultivos es obligatorio ponerse una mascarilla. Se debe trabajar siempre
con material estéril, y éste solo debe abrirse dentro de la campana de
cultivos. Por defecto, todo aquello de lo que no se esté seguro al 100% de
su esterilidad ha de ser considerado como no estéril, y debe ser
desechado o esterilizado nuevamente.

Todo el material biológico (células o material que haya estado en

contacto con ellas) ha de ser inactivado antes de tirarlo. Lo más usual es
recoger los residuos en un recipiente o matraz que contiene lejía diluída, o
también se autoclavan los residuos antes de eliminarlos.

No se debe comer ni beber en el laboratorio, y tampoco se debe

pipetear con la boca.

Material autoclavado:

En la sala de cultivo debe haber un autoclave para no tener que sacar y

meter siempre el material.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Lo que ha quedado del día anterior del lavavajillas pasamos todo al

autoclave, precintado con papel de aluminio. Se pone la cinta de autoclave
encima, cinta con bandas amarillas, que pasan a tener un color tipo
chocolate, para poder diferenciar el que está autoclavado del que no.
Elegimos el programa que queremos utilizar.

Secar el material tras autoclavado en la estufa de secado,

manteniendo a 85 º C hasta el día siguiente. El material no se cierra del
todo para que el calor llegue al interior de todo el material.

El material autoclavado debe de guardarse en las vitrinas, que

deben permanecer cerradas.

Todo el material de vidrio, puntas, eppendorfs, debe estar

autoclavado.

Material de cirugía: también deben autoclavarse. Se colocan en unas

cajitas metálicas que van perforadas. Existen unos aparatos llamados
germinator que llevan unas bolitas de cuarzo donde introduciremos
nuestro material de cirugía, llegan a alcanzar unos 350 º C.

I. Antes del trabajo en la campana

Es de extrema importancia lavarse las manos antes, después, y

frecuentemente durante el trabajo en cultivos. Se suele usar jabón
germicida y debemos secarnos las manos con papel secante, evitar tocar
el grifo con las manos limpias, por lo que lo cerraremos con papel
secamanos.

Preferentemente, y es, además, lo más habitual, suelen pulverizarse

las manos con alcohol al 70%, para evitar contaminaciones en los
experimentos, y contaminación del usuario con material biológico y
posible diseminación de éste. Secar igualmente con papel secamanos.

Asimismo, la superficie de trabajo de la campana de cultivo se

descontaminan antes y después de trabajar con material biológico. Para
ello al encender la cabina de flujo de laminar, mantenemos durante 15 a
30 minutos con luz UV-C antes de trabajar en ella, para eliminar
bacterias, hongos y levaduras. No olvidar apagarla cuando vayamos a

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

comenzar a trabajara en ella ya que a corto plazo podría producirnos

fotoqueratitis y a largo plazo cataratas.

Una vez apagada la lámpara de UV-C rociar con alcohol al 70% la

superficie de la campana y secarlo con papel, siempre de atrás hacia
adelante.

Conectar el flujo de aire.

Introducir el material necesario en la campana:

● Trabajar siempre con material estéril. Si no estamos seguros no

utilizarlo y considerarlo como no estéril.
● Colocarlo de manera que el flujo de aire tome contacto con todo el
material.

Material bien ubicado Material mal ubicado

El tamaño del tapón al ser más pequeño no circula bien el aire

● Solo tendremos el material que necesitamos NO USAREMOS LA

CAMPANA COMO ALMACÉN.
● Desinfectar el material con EtOH al 70%. Los medios de cultivo se
atemperan y después secamos con papel. También los pipeteros.

● No se recomienda meter material que emitan partículas que puedan

estar en el aire como el algodón o papeles. Por lo que el protocolo de
trabajo lo dejaremos fuera de la campana.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Listos para trabajar en la campana

● Lavarse de nuevo las manos y rociarla con alcohol al 70 %

● Esperar 5 minutos antes de ponernos a trabajar en la campana para
que se estabilice el flujo de aire para evitar corriente de aire.

Las salas de cultivo tienen doble puerta, debemos asegurarnos que la

puerta interior que da a la sala de cultivos permanece cerrada mientras se
abre la exterior (que conecta con el pasillo).

II. Mientras trabajamos en la campana:

● No hablar mientras se trabaja en la campana de cultivos.

● El material siempre lo abriremos en el interior de la campana (las

placas, los medios, las pipetas, etc.)

● Una vez que se está trabajando dentro de la cabina, no se debe sacar

las manos sin cerrar botellas o tubos, para evitar posibles
contaminaciones.

Cómo trabajar con el material dentro de la campana:

● No tocar nunca con las manos la parte que luego va a estar en contacto
con nuestras células.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Jeringa para filtrar medio: nunca tocar lo Ependoff en bote: coger con pinzas estériles o
que va a estar en contacto con el medio flameadas.

Cambiar las puntas al realizar diferentes Pipetas de cristal no meter las manos
pipeteos directamente para cogerlas, volcar el envase
para sacar alguna ni dejar lo tumbado

con las llemas de los dedos

- No realizar movimientos bruscos, si no movimientos lentos de manos y

brazos en el interior de la campana.
- Si introducimos material nuevo, esperamos unos 2-3 minutos antes de
reanudar el trabajo.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

- No se recomienda trabajar (pipetear) directamente sobre la superficie

de la campana sino a 5-10 cm sobre la superficie de la campana.

- Nuestra manera de trabajar, tiene que permitir el flujo de aire por todo
el material que tenemos en la campana, sobre todo lo que tenemos
abierto.

-
- No debemos pasar por encima del material de trabajo nuestros brazos
(placas, los medios, etc.)

- Las pipetas estériles sólo deben tocar el interior de los frascos. Si al

coger la pipeta roza en la superficie de la campana o con cualquier otro
material, la desechamos.
- En el caso de necesitar un mechero Bunsen, debemos situarlo en un
lugar adecuado dentro de la campana y no moverlo nunca de lugar.
Hay quien opina que puede provocar desviaciones y turbulencia del
flujo laminar y quemar los filtros de la campana.
- Es imprescindible marcar cualquier tubo o recipiente que contenga
cosas necesarias para el trabajo en la sala de cultivos de la forma
más segura posible, y para ello se debe
marcar tanto la tapa como el tubo o
recipiente que lo contenga. Así mismo se
deben marcar siempre las placas de cultivos
en la tapa y en un lateral de la base, de
manera distinta para cada placa, para evitar
el intercambio entre ellas.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Guardar las placas en el incubador:

Mantener el menor tiempo posible la puerta del incubador abierta para

evitar la descompensación de la temperatura y del CO2. Tener claro dónde
vamos a colocar la placa antes de abrir la segunda puerta.

- No debemos abrir ninguna placa, frasco, etc. en el incubador.

- No debemos cambiar de lugar ninguna placa de otros compañeros.

III. Cuando hemos acabado el trabajo

- Apagar el flujo de aire de la campana.
- Inactivar todo el material biológico (placas, frascos, vasos de
precipitados, etc. ) con lejía (germicida químico de amplio espectro)
antes de tirarlo o dejarlos para su limpieza y esterilización. También
inactivar con lejía los tubos del sistema de vacío.

Sistema de succión

- Las pipetas irán a un bidón de residuos peligrosos.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

Bidón de residuos sólidos y líquidos

Etiquetas

- Sacaremos nuestro material de trabajo y descontaminamos de

nuevo la superficie de trabajo con alcohol al 70 % (de igual modo
que antes de empezar nuestro trabajo).
- Conectar la lámpara de UV-C.
- Lavarnos bien las manos antes de salir de la sala de cultivos.

En caso de derrame:

- Se descontamina con lejía y se lavará con agua y jabón

inmediatamente.
- Antes de reanudar el trabajo nos lavamos de nuevo las manos.

Los animales de experimentación no entran en la sala de las líneas

cultivos, solo en la de cultivos primarios.

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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

POSIBLES SITUACIONES EN LA SALA DE CULTIVOS

1. ¿Qué hacer si se va la luz en la sala de cultivos?

- Con la campana no podríamos seguir trabajando. Pero nuestras
células estarían a salvo porque el incubador está conectado al
sistema electrógeno.
- Si por alguna razón el incubador estuviera por encima de 45 º C
mueren las células, habría que tirar los cultivos. Si por lo contrario
estuviera a 20 ºC sí podemos mantenerla porque estaría por debajo
de la temperatura de mantenimiento.
2. El nivel de CO2 no es del 5 %. Habrá que llamar a mantenimiento.
3. Si por alguna razón encontramos placas sin identificar, por lo
general debe de eliminarse. Si no estuviera contaminada se puede
intentar identificar de quién es.
4. Encontramos placas abiertas en el incubador. Se cierran y se
eliminan.
5. Placas frascos en el incubador de color:
◦ Rosa. Podemos pensar que el medio tiene poco CO2, que el
crecimiento es muy lento o que se ha contaminado por hongos o
levaduras.

◦ Amarillo. Quiere decir que tenemos una concentración de CO2

muy superior a 5 %, se ha contaminado con bacterias, habrá que
cambiar el medio y si es por el CO2 habrá que cambiarlos a un
incubador que funcione correctamente.

6. Las células crecen muy lentamente. Si tras varios pases siguen

creciendo lento puede ser por contaminación por micoplasma. Hacer
test de micoplasma.
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 MÓDULO 1: CULTIVOS CELULARES

7. Condensación de agua en el incubador. Las gomas del

incubador hay que cambiarlas porque podrían contaminar los
cultivos.
8. Células vacuolizadas. El medio hay que descomplementarlo. Una
opción es comprar el medio ya descomplementado.

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