ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA

LABORATORIO CLINICO
Curso: Química Clínica General

ENZIMAS

• Métodos Analíticos: punto final, puntos múltiples,

cálculos de la actividad enzimática.
• Métodos Analíticos: Colorimétricos y Enzimáticos.
• Las enzimas como reactivos.

Profesora: Lic. María Flores

Email: [email protected]
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Métodos analíticos
METODOS ANALITICOS
Según el comportamiento de la materia frente a
la energía ESPECTROSCOPIA

Electromagnética
Interacciones de la materia
con radiación
electromagnética
Interacciones con haces de
De electrones
electrones
Interacciones de especies
Excitación De masa cargadas con campos
eléctricos y/o magnéticos
Acústica frecuencia de sonido
frecuencia de campo
Dieléctrica
eléctrico
Mecánica Frecuencia de un estrés
mecánico externo
Fluorescencia
de emisión
Fosforescencia
Infrarrojo
Resonancia magnética
de absorción nuclear (RMN)
Proceso de medida Resonancia de spin electrón
(RES)
Turbidimetria
de dispersión
Nefelometría
Reflexión Química seca
Refractómetro Refractómetro
Ultravioleta 200-400nm
X 0.01-10nm
Espectro de luz
Visible 400-700nm
Infrarrojo 760-10000nm
METODOS ANALITICOS
 Según el desarrollo de la reacción
◦ Método de punto final o de equilibrio
◦ Métodos cinéticos o puntos múltiples
 Según el espectro de luz que evidencia la reacción
◦ Métodos colorimétricos
◦ Métodos ultravioleta (UV)
 Según donde se encuentre la enzima en la reacción
◦ Métodos enzimáticos
◦ Métodos de actividad enzimática
¿Cómo se denominan los métodos?
Bajo por tres condiciones:
 Rx que se forma. Según se produce la actividad:
enzimático o químico
 La forma como se lee: UV o colorimétrico
 El tiempo en el que se lee: al final o en periodo de
tiempo
 Método químico colorimétrico punto final
Las enzimas como
reactivo
Análisis de enzimas
La concentración de enzimas en suero es muy baja, sin
embargo, dada su elevada capacidad catalítica, es posible
determinar su actividad y presuponer que esta es proporcional
a su concentración. Por tanto, el estudio de las enzimas en el
laboratorio se basa en la demostración “in vitro” de la actividad
catalítica.
Se puede determinar la actividad enzimática analizando:
. La aparición de algún producto
. La desaparición del sustrato
. La variación de un cofactor o de algún componente de la
reacción.
La actividad de una enzima
Se mide mediante la determinación de la cantidad de
sustrato formado por unidad de tiempo, en condiciones
exactamente definidas (pH, T°, Tpo...) y estrictamente
colocadas.
La actividad enzimática se expresa en Unidades
Internacionales (UI) por unidad de volumen (UI/mL,
UI/L…) siendo una UI la cantidad de enzima que
transforma un micromol de sustrato por minuto en
condiciones estándar previamente establecidas.
Reacción válida
Realizado en la fase lineal donde el único factor limitante
sea la concentración de la propia enzima y las condiciones
de reacción las optimas ( exceso de sustrato y otros
reactivos…) .
El limite de linealidad es la actividad enzimática mas alta
que se puede medir con exactitud. Por encima de este
valor se tendrá que diluir el suero con solución salina y
multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.
Fases de una reacción enzimática
Fases de una reacción enzimática
Fase de Retardo:
Tiene lugar inmediatamente después de mezclar los reactivos con la
muestra biológica. Es una fase de encuentro y acoplamiento de
sustrato y enzima. Su duración es variable (segundos y minutos).
Fase lineal:
En esta la formación del producto que permanece constante, siendo la
concentración de enzima de la muestra el único factor limitante.
Fase de agotamiento del sustrato:
Es el momento en que el sustrato u otro reactivo se agota y la
velocidad de la reacción disminuye hasta anularse.
Cuantificación de la actividad enzimática
Uso de ensayos espectrofotométricos, seguir uno de los elementos que
participan en la reacción. Condición: debe absorber luz a una determinada
longitud de onda.
 Si el producto absorbe luz a una longitud de onda determinada, evaluar su
aparición analizando el incremento de absorbancia a dicha longitud de onda.
 Si el sustrato absorbe luz a una longitud de onda determinada, evaluar su
desaparición analizando el disminución de absorbancia a dicha longitud de
onda.
 En el caso de un cofactor o de algún componente de la reacción. Ej. es muy
frecuente utilizar la aparición o desaparición de NADH o NADPH, así
¿Como se realizan los cálculos?
Analizar como evoluciona la absorbancia a lo largo del
tiempo y obtener un valor de ΔA/min.
Reacciones acopladas
Si ninguno de los elementos que participan en la reacción
absorben la luz se acopla una segunda reacción en la que
alguno de los reactivos o productos presenten un máximo
de absorción. Analizando esta segunda reacción podremos
evaluar la actividad enzimática de la primera.
Sistema de lectura Bicromática
Esta técnica esta basada en la premisa que aunque un
compuesto puede dar una interferencia espectral, la
absorbancia máxima del interferente será diferente de la de
la reacción analítica verdadera.
El uso de este procedimiento permite también que cada
muestra sea utilizada como su propio blanco para el color
endógeno.
Sistema de lectura Bicromática
Esta técnica involucra la medición de la absorbancia de una
mezcla de reacción a dos longitudes de onda diferentes
simultáneamente.
Estas son:
- La longitud de onda principal (1)
- La longitud de onda cercana (2)
- (1) es la longitud de onda a la cual el cromógeno tiene
máxima absorción. En (2) hay un mínimo de absorción del
cromógeno. Como la reacción es monitoreada
simultáneamente a dos longitudes de onda, esta es conocida
como análisis bicromático.
Corrección de Allen
Método similar para la corrección de interferencia de
fondo, consiste en medir la absorbancia a la longitud de
onda primaria Amax y a dos longitudes de onda adicional,
generalmente equidistantes del pico, A1 y A2. Las lecturas
de absorbancia a estas dos últimas longitudes de onda son
promediadas para dar la absorbancia de fondo promedio en
la muestra.
 Métodos de
Métodos punto final
analíticos Métodos
cinéticos
Métodos de punto final
Métodos analíticos punto final o de equilibrio
Se incuba la muestra (que aporta la enzima) y el reactivo
(que aporta el sustrato) durante un tiempo determinado y
a una temperatura determinada para que se complete
totalmente la reacción, de tal forma que la sustancia que
buscamos debe consumirse totalmente. Si no fuera así y
quedase parte de la sustancia sin consumir, al medir el
producto, estaríamos midiendo menos cantidad de la que
realmente hay. Por tanto se mide al final de un tiempo fijo
de incubación.
Métodos analíticos punto final o de equilibrio
ABSORBANCIA:
La respuesta analítica primaria es medida con absorbancia
Los valores de absorbancia son evaluados sobre la base de las
intensidades de luz de muestras que no absorben (blanco) y muestras
que absorben por la siguiente ecuación:
A = log [(Io/I)x(Ir/Io,r)]
Donde
A= valor de la absorbancia
Io= intensidad de luz luego de la celda de blanco
I= intensidad de luz luego de la celda del test
r= se refiere a la intensidad de la señal de referencia que monitorea la
intensidad de la lámpara.
Métodos analíticos punto final o de equilibrio
En mediciones de tiempo fijo, la velocidad de reacción (v)
es directamente proporcional a la concentración del
sustrato [S] dentro de un periodo especifico, esto es
v= k[S]
A medida que se consume el sustrato de forma continua, la
velocidad de reacción disminuye gradualmente, al igual que
el cambio de absorbancia. Se requiere un periodo de
tiempo prolongado para que la reacción alcance el
equilibrio.
Métodos analíticos punto final o de equilibrio
La reacción de tiempo fijo también se denomina reacción
de velocidad, reacción cinética de primer orden y reacción
cinética de segundo orden
La reacción de tiempo fijo también esta disponible en
intervalo único o intervalo doble, según el modo de
entrada de los puntos de medición.
En la reacción de intervalo doble, el blanco de muestra, que
es el cambio de absorbancia en dos puntos dentro del
tiempo de incubación, se resta de la absorbancia de la
reacción.
Métodos cinéticos
Métodos cinéticos
También denominadas mediciones cinéticas de orden cero
o mediciones de seguimiento continuo, la velocidad de
reacción no esta relacionada con la concentración del
sustrato y permanece constante en el proceso de reacción.
Como resultado, la absorbancia de los analitos cambia de
manera uniforme y la velocidad de cambio (ΔA/min) es
directamente proporcional a la actividad o a la
concentración del sustrato. El método cinético se utiliza
normalmente para medir la actividad enzimática.
Métodos cinéticos
En ellos se mide la velocidad de la reacción mediante la medida
de la variación de la Absorbancia en el tiempo y esto se
relaciona con la concentración. Es una medición continua, a
diferencia de la del punto final, se mide en tiempos regulares. Se
puede medir la cantidad de sustrato no transformado o la
cantidad de producto formado.
Si se detectan desvíos de linealidad se puede despreciar algunas
de las medidas finales de la absorbancia.
En muchas reacciones enzimáticas participan como cofactores
los complejos NAD-NADH o NADP-NADPH y en esta
participación se basan muchos métodos analíticos.
 Valor definitivo de la actividad enzimática
AE (UI/L) = ΔDO . 1.000 . VF
min. ε .d VI
Donde:
ε es el coeficiente de extinción molar de aquel compuesto cuya absorbancia estamos
siguiendo en el espectrofotómetro.
d es el espesor de la cubeta
VF es el volumen total de la reacción
V I es el volumen de muestra en el ensayo
Si los datos en rojo son constantes tendremos:
UI/L = ΔA/min . cte
Métodos cinéticos
Las lecturas de absorbancia son medidas contra valores de
blanco tantas veces como se defina en los parámetros del
test. El numero máximo de mediciones es relativo a los
equipos, en algunos puede ser 12. El primer valor es
restado del segundo valor para obtener la diferencia de
absorbancia en el intervalo dado.
La información de la medición cinética es ajustada a una
recta usando el método de cuadrados mínimos o regresión
lineal. El ΔA/min es la pendiente (slope) de esa recta.
Métodos cinéticos
Cambio de absorbancia ΔA en la
determinación cinética
 Ejemplo de método cinético
 Útiles para minimizar las interferencias positivas. Al efectuar la lectura en
autoanalizadores, se permiten múltiples puntos de lectura.
 En cuanto a los tiempos de lectura realizar, lo importante es efectuar no solo
la lectura al principio pues reaccionarían solo los interferentes de reacción
rápida, sin reaccionar la creatinina. Ni tampoco realizar un único punto al final
porque se leerían tanto creatinina como interferentes.
 El método de Jaffe cinético con compensación y con blanco de muestra,
resultaría comparable al método enzimático si se tienen en cuenta las
siguientes limitaciones:
◦ Pacientes neonatos (bilirrubina y hemoglobina fetal).
◦ Pacientes bajo tratamientos con cefalosporinas

Prueba colorimétrica-cinética
Creatinina + acido pícrico complejo de acido pícrico-creatinina
Solución alcalina
Importancia de la absorbancia inicial
Los limites de la absorbancia inicial aseguran mediciones
confiables
 Muestras turbias o con una actividad muy alta en
reacciones crecientes pueden causar una absorbancia
inicial muy alta.
 Reactivos deteriorados o con una actividad muy alta en
reacciones decrecientes pueden causar una absorbancia
inicial muy baja. El valor mínimo puede ser negativo.
Importancia de la absorbancia inicial
Importancia de la absorbancia inicial
 Para el test de CK-mb la
absorbancia inicial va de 0.0 a
1.5 A.
 En los equipos automatizados
se predetermina cuantas
lecturas realiza describiendo
el ΔA con una grafica que en
este caso es ascendente
 Métodos
colorimétricos
Métodos químicos
analíticos
Métodos
enzimáticos
Métodos colorimétricos
Métodos colorimétricos
 Utilizan reacciones analíticas que se miden empleando
longitudes de onda dentro del espectro visible.
 Empleo de reactivo cromógenos en la reacción.
◦ Uniéndose al analito y formar un compuesto coloreado
◦ Apareciendo en el medio como consecuencia de la existencia
del mismo
◦ Desapareciendo a causa del analito
Métodos colorimétricos
La intensidad del color es directamente proporcional a la
concentración del analito a determinar.
Cmx = (Amx / Ast) x Cst

Pueden ser reacciones a punto final o colorimétricas y

cineticas, siguiendo la siguiente expresión:
ΔDO/min = K . C
Métodos enzimáticos
Métodos enzimáticos
 Son aquellos métodos analíticos en las que uno o varios
de los reactivos son enzimas
 La enzima añadida como parte de los reactivos al unirse
al analito desencadena una reacción que permite su
determinación bien por aparición de un compuesto
coloreado (reacción de punto final), bien por la variación
de la absorbancia por unidad de tiempo (reacción
cinetica).
TRABAJO APLICATIVO
 Analice su inserto del área comercial.
 Elabore un cuadro considerando los siguientes aspectos:
◦ Método Analítico (como se denomina, ya sea por la técnica, por la persona que lo
estandarizo o si es referencia de algún grupo de trabajo como: IFCC, DGKC, etc.)
◦ Enzimas empleadas
◦ Posee reacciones acopladas
◦ Tipo de medición (según se utiliza emisión o absorción de luz visible o UV)
◦ Factores que afectan la reacción en la prueba
◦ Tipo de método según el desarrollo de la reacción (método punto final o
cinético)
IFCC: Federación Internacional de Química Clínica y Medicina de Laboratorio
DGKC: Sociedad Alemana de Química Clínica
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