GRADO EN QUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL 1

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA

TEMA 4.- ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA MOLACULAR

1.- FUNDAMENTO
2.- RELACIÓN ENTRE CONCENTRACIÓN Y FLUORESCENCIA
3.- INSTRUMENTACIÓN
4.- APLICACIONES
5.- FOSFORESCENCIA
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

Absorción de radiación ⇒ estado electrónico excitado ⇒ t vida ↓ ↓ (10-5 s – 10-8 s)

Procesos de relajación

Radiantes: Fluorescencia y Fosforescencia No radiantes

Camino más propicio
⇓
minimiza el tiempo de vida
del estado excitado
Relajación vibracional
Conversión interna
Átomos: fluorescencia de resonancia Conversión externa
Cruce entre sistemas
Moléculas: fluorescencia a λ ↑, E ↓ ⇒ desplazamiento Stokes

Estados electrónicos
Principio de exclusión de Pauli
Moléculas diamagnéticas
Moléculas paramagnéticas
Transiciones permitidas
Transiciones prohibidas
tvida (triplete) > tvida(singulete)
E (triplete) < E (singulete)
POCAS ESPECIES FLUORESCENTES
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

PROCESOS DE DESACTIVACIÓN

ET1 < ES1

 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

Compuestos fluorescentes Poseen composición y estructura que

ralentizan los procesos no radiantes

https://www.youtube.com/watch?v=d5ugY9zZIIs

Pigmentos fluorescentes y fosforescentes

left: Zinc sulfide, right: SrAl2O4 pigments in the dark pigments in the dark after 4 min
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

PROCESOS DE DESACTIVACIÓN RADIANTES

Fluorescencia
Nivel vibracional más bajo del estado singlete excitado
↓
Distintos niveles vibracionales del estado fundamental

Fosforescencia
Estados inicial y final de diferente multiplicidad
Baja probabilidad de tránsito (t vida estado triplete: 10-4-10 s)
La emisión puede persistir después de interrumpir irradiación
Condiciones especiales

VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

n o moleculas que producen fluorescencia

RENDIMIENTO CUÁNTICO φ= 0<φ<1
n o total de moleculas excitadas

TIPO DE TRANSICIÓN Transición de E más baja tipo π→ π* Eficacia cuántica ↑

 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

Compuestos con grupos aromáticos (π→ π* de ↓ E)

COMPOSICIÓN Y ESTRUCTURA Compuestos con grupos carbonilo o dobles enlaces conjugados

Hidrocarburos aromáticos no sustituidos Sustitución en el anillo bencénico

Fluorescencia en disolución Cambios en λ de abs. ⇒ picos fluorescentes
φ ↑ con nº de anillos y grado de condensación Afecta al φ
-NH2, -OH, -OCH3
(deslocalización de e- π) ↑ fluorescencia
Compuestos heterocíclicos simples -NO2, -COOH, ↓ fluorescencia
Halógenos ↑ cruce entre sistemas
E↓: n→ π* → triplete -C=O- ↓ fluorescencia (E↓: n→ π*)

Moléculas más rígidas: fluorescencia favorecida

No fluorescencia

Núcleos heterocíclicos
Grupo metileno: ↑ rigidez ⇒ ↑ fluorescencia

VARIABLES DEL ENTORNO

- temperatura
T de vida estado excitado más corto - disolvente y oxígeno disuelto
(fluorescencia) - pH
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

Efecto de la temperatura
↑ T ⇒ ↓ rendimiento cuántico (↑ nº choques ⇒ ↑ desactivación por conversión externa)

Efecto del disolvente

↓ Viscosidad ⇒ ↓ rendimiento cuántico (↑ nº choques ⇒ ↑ desactivación por conversión externa)
Disolventes con átomos pesados (Br4C, EtI) ⇒ ↓ fluorescencia (↑ cruce entre sistemas ⇒ ↑ fosforescencia)

Efecto del pH
Compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos
Formas ionizada y no ionizada: diferentes λ excitación, λ emisión e intensidad
Ej: ↑ nº de formas resonantes ⇒ ↑ estabilidad 1er estado excitado ⇒ fluorescencia a λ más largas

Efecto del oxígeno disuelto

Presencia de O2 disuelto ↓ fluorescencia (hasta 50%):
- propiedades paramagnéticas del O2 ⇒ ↑ cruce entre sistemas
- oxidación inducida por la luz
Desgasificación en atmósfera de He
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

RELACIÓN ENTRE CONCENTRACIÓN Y FLUORESCENCIA

La potencia de la radiación fluorescente es proporcional a la potencia del haz de excitación que es absorbido
por el sistema

P0: potencia del haz incidente

F= K’(P0 – P) ⇒ F= K’ P0 (1-P/ P0) P: potencia después de atravesar una longitud d del medio
K’ depende del rendimiento cuántico

Ley de Beer: P/ P0= 10-εbC

F= K’ P0 (1- 10- εbC) ⇒ F= 2,3 K’ εbC P0 F= KC

A bajas concentraciones: representación gráfica de F en función de C ⇒ lineal

A altas concentraciones: desviaciones de la linealidad:
- autoamortiguación: choques entre moléculas excitadas (transferencia de E sin emisión)
- autoabsorción: λ fluorescente ~ λ absorción ⇒ moléculas no excitadas absorben rad. fluorescente
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Fundamento

ESPECTROS

Espectros de excitación: λ luminiscencia fija, λ de excitación variable

(casi idénticos a los de absorción)
Espectros de fluorescencia y fosforescencia: λ de excitación fija, λ luminiscencia variable

fenantreno
Señales de fondo
Dispersión Raileygh de la radiación de excitación
Reflexión de la radiación
Dispersión Raman y fluorescencia del disolvente
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

INSTRUMENTACIÓN - COMPONENTES

Fuentes
- Lámpara de arco de Hg a baja presión con ventanas de sílice fundida (fluorómetros)
Emite a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm.
Muy útil: alguna de las líneas resulta adecuada
- Lámpara de arco de Xenón de alta presión (espectrofluorímetros)
Emite entre 300 y 1300 nm.
- Láseres (uso restringido debido a precio y complejidad)
Ventajas: muestras pequeñas, haz de radiación altamente monocromático

Filtros y monocromadores
- Filtros de interferencia o de absorción Todos los equipos incluyen dos elementos para seleccionar
- Monocromadores de red la λ de la radiación:
uno de excitación y otro de emisión

Cubetas
- Cilíndricas o rectangulares
- Principalmente sílice , también cuarzo o vidrio
- Deflectores para reducir la radiación dispersada
- Huellas dactilares ⇒ fluorescencia

Detectores
- Tubos fotomultiplicadores (refrigerados para mejorar S/R)
- Detectores muticanales: diodos en serie, detectores de transferencia de carga
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

FUENTES LÁSER Amplificación de luz mediante emisión estimulada de radiación

 Medio generador de láser

- cristal (rubí)
- semiconductor (arseniuro de Ga)
- disolución de colorante orgánico
- gas (argón o criptón)

 Activación o bombeo
- fuente de radiación intensa
- corriente eléctrica
- descarga eléctrica

 Relajación al nivel vibracional más bajo: (t. vida: 1 ms)

 Emisión espontánea: emisión fluorescente
 Emisión estimulada: base del comportamiento láser

Fotones de igual E que emisión espontánea

 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

FUENTES LÁSER

Fotón emitido
Igual E que fotón incidente
Se propaga en la misma dirección
(a) Bombeo (excitación mediante E eléctrica, radiante o química)
En fase
Paso repetido a través del láser
(↑ I, haz paralelo)

(b) Emisión

Fuentes láser λ (nm)

Helio/neón 632, 8
Ión argón (azul) 488,0 ó 514,5
Ión criptón (verde) 530,9 ó 647,1 (c) Emisión estimulada
De diodos 782,0 ó 830,0
IR prox
Nd/YAG 1064,0

(Ión de neodimio en un cristal de granate de Al e Itrio)

(d) Absorción
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

INSTRUMENTACIÓN

Fluorómetro
Filtros de excitación y emisión
Resultados cuantitativos satisfactorios

Espectrofluorímetro
Monocromadores de excitación y emisión
(espectro de excitación y de fluorescencia)
Elevada selectividad muy valiosa en:
- estudio de características electrónicas y estructurales
- análisis cualitativo (espectros no comparables, porque
la señal depende de características instrumentales

fenantreno
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

INSTRUMENTACIÓN
Espectrofluorímetros con detectores en serie

xy

Rad excitación dispersada en xy

Policromador de excitación Rad emisión dispersada en yz
Policromador de emisión

xy Detector de acoplamiento
de carga bidimensional
Girados 90° yz
Espectros clásicos

Espectro de luminiscencia total

Sensores de fluorescencia de fibra óptica
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

Muestreo con fibra óptica

Transmisión a través de fibra óptica
Radiación UV, VIS o IR cercano

Fibra óptica
Hebras finas de vidrio o plástico (d: 0,05 µm – 0,6 cm)
Transmisión de imágenes: haces de fibras unidos en los extremos
Diagnóstico médico (flexibilidad)
Iluminación de objetos (sin calentamiento)

Transmisión de la luz → reflexión interna total

Fibra de vidrio
Inferior al de la fibra Núcleo n= 1,6
Cubierta de vidrio n= 1,5

Transmisión de radiación
UV, VIS e IR
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

Muestreo con fibra óptica

Transmisión a través de fibra óptica
Radiación VIS o IR cercano
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Instrumentación

INSTRUMENTACIÓN Fosforímetros Diseños similares a fluorescencia

Dos componentes adicionales

Dispositivo para irradiar de forma alternada Dispositivo de refrigeración (N2L)

Mide la fosforescencia con retardo Prevenir degradación de señal por colisiones
Electrónico o mecánico (accesorios)
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Aplicaciones

APLICACIONES

Sensibilidad
Mayor sensibilidad que métodos de absorción

Potencia de la radiación fluorescente se mide independientemente de la potencia de la fuente

F= 2,3 K’ εbC P0 = KC

Métodos de absorción:
evaluación de P0 y P (Abs= lg P0/P) Sensibilidad
- ↑ P0
- Amplificar señal

Selectividad
Muy selectivos: Señales de fondo
- pocas especies fluorescentes Dispersión Raileygh de la radiación de excitación
- espectro de luminiscencia total Reflexión de la radiación
Dispersión Raman y fluorescencia del disolvente

Exactitud y Precisión
- Métodos fluorimétricos menos precisos y exactos que los de absorción
- Métodos fosforimétricos menos precisos y exactos que los fluorimétricos
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Aplicaciones

Metales de transición: quelatos no fluorescentes

Especies inorgánicas Paramagnéticos → fosforescencia
Niveles de E muy próximos → conversión interna
Cationes metálicos, métodos indirectos:
- quelato fluorescente → emisión
- reactivo fluorescente → amortiguación
Otros metales: quelatos fluorescentes

Especies orgánicas y bioquímicas

Productos alimentarios, farmacéuticos, naturales, muestras
clínicas, etc:
enzimas, agentes medicinales, esteroides, vitaminas, etc.
Sensibilidad y selectividad

Contaminación ambiental
amortiguación Muestras de agua y aire
Compuestos aromáticos policíclicos (HAP’s)
- contaminantes prioritarios EPA
- cancerígenos
- Benzo(a)pireno
Versatilidad y sensibilidad
amortiguación
 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Aplicaciones

HAP’s etiquetados como contaminantes prioritarios por la EPA

 Espectroscopía de fluorescencia molecular - Aplicaciones

HAP’s etiquetados como contaminantes prioritarios por la EPA

Espectro de fluorescencia del naftaleno Recta de calibrado para la determinación fluorométrica

Longitud de onda de excitación 250 nm de naftaleno a 324 nm (λ de excitación: 250 nm)

Detección de la presencia de sangre.

Catalizador: Fe de la hemoglobina

catalizador

oxidante

λ= 425 nm
 Espectroscopía de fosforescencia molecular - Aplicaciones

Métodos fosforimétricos
Complementarios a los fluorimétricos:
- hidrocarburos aromáticos con anillos condensados con átomos pesados ⇒ fosforescencia
- hidrocarburos aromáticos con anillos condensados sin átomos pesados ⇒ fluorescencia
Determinación de especies orgánicas y bioquímicas
(ácidos nucleicos, aminoácidos, hidrocarburos del petróleo, pesticidas, etc.
Menor difusión que métodos fluorimétricos, debido a:
- trabajo a bajas T
- peor precisión
- pocas especies fosforescentes (mayor selectividad)

Desarrollo de métodos a T ambiente

1) Compuestos adsorbidos sobre sólidos (filtro de papel)
↑ fosforescencia → minimiza la desactivación del estado triplete por colisiones
2) Solubilización del analito en micelas formadas por detergente, en presencia de metales pesados
↑ fosforescencia → ↑ la proximidad entre el analito y los metales pesados

http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/lumin1.htm
(tiene un cuestionario al final)