Ecosistemas 15 (2): 50-57. Mayo 2006.

http://www.revistaecosistemas.net/articulo.asp?Id=417

El papel de las biotecnologías

(1) Grupo de Ecología y Biología de la Reproducción, Departamento de Ecología Evolutiva, Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC), José Gutierrez
Abascal 2, 28006 Madrid. España
(2) Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos (CSIC-UCLM-JCCM), 02071, Albacete. España
(3) Estación Experimental de Zonas Áridas (CSIC). General Segura 1. E-04001 Almería, España - Dpto. de Biología Vegetal y Ecología. Escuela
Politécnica Superior. Universidad de Almería. Crta. de Sacramento s/n. La Cañada de S. Urbano, Almería E-04120. España.

La destrucción y fragmentación del hábitat está conduciendo a un aumento de la consanguinidad que amenaza la viabilidad, tanto de
poblaciones naturales como de programas de cria en cautividad. La consanguinidad aumenta la mortandad y disminuye la capacidad
reproductiva de los individuos. En machos, la consangunidad empeora la calidad seminal en aspectos clave para la fecundación. Para evitar
los efectos de la consanguinidad es fundamental promover el intercambio de material genético entre diferentes poblaciones. Las
biotecnologías reproductivas han aportado nuevas soluciones para facilitar el manejo genético de poblaciones de especies en peligro de
extinción, como es el desarrollo de bancos de recursos genéticos, que permiten el almacenamiento de semen, óvulos y embriones
congelados, además de otros tejidos. La ventaja principal de dichos bancos es que permiten mantener la variabilidad genética de una
especie en forma casi indefinida. La aplicación de biotecnologías reproductivas como la congelación de semen y la inseminación artificial
facilita el intercambio de genes entre poblaciones diferentes y permite llevar a cabo los apareamientos más aconsejables desde un punto de
vista genético.

Palabras clave: consanguinidad, especies en peligro de extinción, biotecnologías reproductivas, congelación semen, inseminación artificial

The role of reproductive biotechnologies in animal conservation. Habitat destruction and fragmentation is leading to an increase in
inbreeding which threatens the viability of both natural populations and captive breeding programmes. Inbreeding increases individual
mortality rates and decreases reproductive rates. Among males inbreeding decreases seminal quality affecting traits crucial for fertilization
success. To avoid the deleterious effects of inbreeding it is necessary to promote gene exchange between populations. Reproductive
biotechnologies offer new solutions to facilitate the genetic management of endangered species, such as the development of genetic
resource banks, which allow the preservation of semen, ova, and embryos, as well as other tissues. The main advantage of these banks is
that they preserve the genetic variability of a given species indefinitely. The use of reproductive biotechnologies such as semen
cryopreservation and artificial insemination facilitate the exchange of genes between populations and allow matings which are desirable
from the point of view of genetic management.

Key words: inbreeding, endangered species, reproductive biotechnologies, semen cryopreservation, artificial insemination

La crisis de la biodiversidad: los programas de reproducción en cautividad

La tasa de extinción de especies se ha acelerado en los últimos años debido al crecimiento exponencial de la población
humana y al uso intensivo de recursos naturales que ello conlleva (May et al., 1995). En mamíferos, de las 4.853 especies
evaluadas, se sabe que 1.101 están amenazadas o son vulnerables, es decir el 23% de todas las especies de las que se
posee suficiente información (IUCN, 2004), aunque el número real es probablemente mucho mayor. Este número es muy
superior a la proporción de especies amenazadas que hay en otros grupos como las aves, probablemente porque muchas
especies de mamífero son sobre-explotadas a través de la caza (Mace y Balmford, 2000). Entre los grupos de mamíferos que
contienen una mayor proporción de especies amenazadas se encuentran los ungulados, siendo la causa principal su
sobreexplotación a través de la caza para la obtención de comida, pieles y cuernas. De hecho es el único grupo de mamíferos
donde la caza es una causa más frecuente de amenaza que la pérdida de hábitat.

Ecosistemas no se hace responsable del uso indebido de material sujeto a derecho de autor. ISBN 1697-2473.
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Ecosistemas 15 (2). Mayo 2006.

Cuando resulta muy difícil detener las causas que están provocando el declive de las poblaciones en su hábitat, y las
poblaciones naturales se han reducido por debajo de lo que se considera una población viable, se recomienda la cría en
cautividad de una especie. La reproducción en cautividad ha salvado de la extinción a un número considerable de especies,
incluso en aquellos casos en los que el declive de las poblaciones naturales había llegado a tal extremo que la cría en
cautividad se tuvo que iniciar con muy pocos individuos. Este es el caso del turón de patas negras cuya población fundadora
consistió en seis individuos, la del caballo de Prezwalski cuya población fundadora incluyó a 13 individuos, y la de la gacela
de Speke que comenzó con cuatro, y posteriormente se incorporaron tres individuos más capturados en libertad (revisión en
Hedrick y Kalinowski, 2000). Algunas de estas especies han sido reintroducidas posteriormente a su hábitat natural, aunque
hasta la fecha el éxito de los programas de reintroducción ha sido muy bajo (Mackinnon, 2000).

Tradicionalmente se ha considerado que el objetivo principal de los programas de cría en cautividad era el de producir muchos
individuos, con el fin de re-introducir un número suficientemente elevado de animales al hábitat natural como para garantizar la
viabilidad a largo plazo de las poblaciones re-introducidas. Sin embargo, este enfoque se ha encontrado con importantes
obstáculos. Por un parte, cuando se recurre a la cría en cautividad como reacción de emergencia ante una extinción
inminente, a menudo se conoce tan poco de la reproducción de la especie que es muy difícil saber cómo contribuir a que
aumente el número de individuos. Por otra, el coste de mantener animales en cautividad es muy elevado, y el espacio
disponible limitado, por lo que los recursos no permiten establecer programas de cría en cautividad para todas las especies
que lo necesitan. Finalmente, el objetivo final que este enfoque plantea ha resultado muy poco exitoso, puesto que tan sólo
cinco programas de re-introducciones de especies de mamíferos (que representa el 11% de todos los intentos) han
conseguido poblaciones viables en libertad (Balmford, 2000).

Estos problemas han obligado a re-evaluar los objetivos de los programas de cría en cautividad. En la actualidad dichos
programas se contemplan como una estrategia complementaria, en lugar de alternativa, a la protección de las poblaciones
naturales. Bajo este enfoque se considera que un objetivo fundamental de los programas de cría en cautividad es el de contar
sólo con algunos de los individuos de la especie, con el fin de mejorar el conocimiento de su reproducción y desarrollar
técnicas de reproducción asistida que facilitan el intercambio genético entre poblaciones mantenidas en cautividad, y entre
éstas y poblaciones naturales. La aplicación de biotecnologías reproductivas permite preservar el máximo de diversidad
genética y evitar los efectos de la consanguinidad en todas las poblaciones (Gomendio y Roldan, 2004; Roldan y Garde,
2004).

Dentro de este contexto se encuadran los programas de cría en cautividad de ungulados en peligro de extinción que se
desarrollan en la Estación Experimental de Zonas Áridas (CSIC). Entre 1971 y 1975 se iniciaron programas de cría en
cautividad de tres especies de gacelas procedentes del Norte de África: la gacela de Cuvier (Gazella cuvieri), gacela dorcas
(Gazella dorcas neglecta) y gacela Mohor (Gazella dama mhorr). Gazella cuvieri es una especie de montaña que habita la
zona del Atlas, donde quedan grupos pequeños y dispersos. Está categorizada por la IUCN en la Lista Roja como
'Amenazada'. Gazella dorcas neglecta es una especie de menor tamaño corporal que habita zonas desérticas, y la especie
está categorizada como 'vulnerable', aunque no se especifica el status de la subespecie neglecta que se cree está
amenazada, debido en gran medida a la caza indiscriminada de la que es objeto. Finalmente, G. dama mhorr es la especie de
mayor tamaño corporal, que habitaba zonas semi-desérticas. Está categorizada como 'Amenazada' y no se han observado
animales en libertad desde 1968. El éxito de los programas de cría en cautividad de estas tres especies de gacelas, y los
protocolos de manejo desarrollados, permiten abordar estudios que en general no son posibles en especies amenazadas. Ello
hace de estas especies un modelo ideal para estudios reproductivos de aplicabilidad a otras especies de ungulados en peligro
de extinción. Nuestro grupo de investigación trabaja desde hace 10 años con estas tres especies de gacelas amenazadas
con el doble objetivo de comprender los efectos de la consanguinidad sobre la reproducción y de desarrollar biotecnologías
reproductivas que contribuyan a su conservación.

Depresión por consanguinidad y heterocigosis

Es habitual que la reproducción en cautividad de una especie se inicie sólo cuando se considera que las poblaciones
naturales corren un riesgo inminente de extinguirse. Cuando una especie llega a esa situación, y la cría en cautividad se inicia
con una población fundadora con pocos individuos, la consanguinidad a lo largo de las primeras generaciones es inevitable, y
el éxito del programa de cría depende en gran medida de que se puedan evitar los efectos deletéreos de la consanguinidad
sobre la supervivencia y reproducción de los individuos (es decir, la 'depresión por consanguinidad'). El término
'consanguinidad' se refiere al apareamiento entre individuos relacionados genéticamente y sus efectos deletéreos están
relacionados con la disminución de la heterocigosidad que se produce a medida que se generan descendientes
consanguíneos (Charlesworth y Charlesworth, 1987).

La forma tradicional de abordar el estudio de la consanguinidad y su efecto sobre la eficacia biológica ha sido calculando el
coeficiente de consanguinidad f en base a la información genealógica (Wright, 1922). El coeficiente de consanguinidad se
define como la probabilidad de que los dos alelos de un locus sean idénticos por descendencia, y representa el valor esperado
de homocigosis para todo el genoma. En animales mantenidos en cautividad y en animales domésticos la depresión por

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consanguinidad se ha reconocido desde hace tiempo (Charlesworth y Charlesworth, 1987; Thornhill, 1993), siendo el efecto
más frecuentemente detectado un aumento en la mortandad juvenil (Ralls et al., 1979; Ralls y Ballou, 1986; Mitton, 1993).

Nuestros estudios en gacelas han profundizado en los efectos de la consanguinidad sobre la fisiología reproductiva masculina.
Puesto que las tres especies de gacelas en peligro de extinción con las que trabajamos tienen poblaciones fundadoras de
diferente tamaño, sus poblaciones en cautividad tienen diferentes niveles de consanguinidad. Nuestros resultados demuestran
que los machos de la especie con niveles más elevados de consanguinidad (Gazella cuvieri) tienen una peor calidad seminal
que los machos de las otras dos especies (Cassinello et al., 1998). Cuando comparamos machos de Gazella cuvieri con
diferentes coeficientes de consanguinidad pudimos comprobar que los machos más consanguíneos sufren una disminución en
la proporción de espermatozoides mótiles, en la proporción de espermatozoides morfológicamente normales, y en la
proporción de espermatozoides con acrosoma intacto, características importantes de cara a la capacidad fecundante de los
espermatozoides (Roldan et al., 1998). Los efectos de la consanguinidad sobre la calidad seminal no son tan marcados en
Gazella dorcas neglecta y Gazella dama mhorr cuyas poblaciones tienen niveles bajos e intermedios respectivamente de
consanguinidad (Gomendio et al., 2000). Otro efecto negativo de la consanguinidad es que aumenta la vulnerabilidad de los
individuos frente a los parásitos (Cassinello et al., 2001), lo que podría suponer un riesgo para su supervivencia.

La consanguinidad no es un problema limitado a las poblaciones mantenidas en cautividad, pues se ha detectado depresión
por consanguinidad en poblaciones naturales (Keller y Waller, 2002). Durante mucho tiempo se negó la posibilidad de que la
consanguinidad fuese un fenómeno relevante en poblaciones naturales debido a la falta de evidencia. Parte del problema
reside en la dificultad de construir genealogías en poblaciones naturales para poder calcular la consanguinidad. En las pocas
poblaciones de aves donde se ha conseguido esta información, los análisis han revelado que la consanguinidad está presente
y que disminuye el éxito reproductor, principalmente a través de una reducción en la tasa de eclosión, y que también
disminuye la tasa de supervivencia tanto de juveniles como de adultos (Keller, 1998; Keller et al., 1994; Kruuk et al., 2002).
Dadas las dificultades de construir genealogías en poblaciones naturales, un enfoque alternativo ha sido el de aprovechar el
hecho de que la consanguinidad reduce la heterocigosis. Por lo tanto, se ha propuesto que la depresión por consanguinidad
se puede detectar relacionando la heterocigosis medida con marcadores moleculares con caracteres asociados a la eficacia
biológica. Estudios llevados a cabo en poblaciones naturales de diferentes especies han encontrado asociaciones entre los
niveles de heterocigosidad medida con marcadores moleculares y diversos componentes de la eficacia biológica como el peso
al nacer y la supervivencia neonatal (Coltman et al., 1998; Coulson et al., 1998; Rossiter et al., 2001), la supervivencia juvenil
(Coulson et al., 1999), el éxito reproductivo de las hembras (Slate et al., 2000), el éxito de cópula de los machos (Hoglund et
al., 2002), y la vulnerabilidad frente a los parásitos y patógenos (Coltman et al., 1999; Acevedo-Whitehouse et al., 2003; Reid
et al., 2003). Los efectos de la consanguinidad sobre la reproducción y la supervivencia pueden conducir a las poblaciones
naturales a la extinción, como es el caso de una metapoblación de mariposas (Melitaea cinxia; Saccheri et al., 1998). Un
estudio reciente llevado a cabo por nuestro grupo de investigación en poblaciones cinegéticas de ciervos aisladas por vallados
ha puesto en evidencia que los individuos con niveles bajos de heterocigosis (estimada sobre la base de microsatélites) sufren
mayores cargas parasitarias (Gomendio et al., 2006). Además, en poblaciones naturales de corzo hemos demostrado que los
individuos con niveles más bajos de heterocigosis están en peor condición física (Ruiz et al., 2006). Por lo tanto, numerosos
estudios han hallado relaciones entre los niveles de heterocigosis medida con marcadores moleculares y caracteres
relacionados con la eficacia biológica individual. Es probable que la consanguinidad sea un fenómeno cada vez más extendido
en poblaciones naturales debido a que la destrucción del hábitat está conduciendo a la fragmentación y aislamiento de
muchas poblaciones.

Bancos de recursos genéticos y técnicas de reproducción asistida

Para evitar la consanguinidad es fundamental promover el intercambio de material genético entre diferentes poblaciones y
mantener poblaciones de gran tamaño. Sin embargo, cumplir dichos objetivos entraña serias dificultades. El intercambio de
animales entre poblaciones genera estrés en los animales traslocados, plantea riesgos sanitarios, a menudo los animales
incorporados a una población diferente no se integran adecuadamente al nuevo grupo social, y en animales de gran tamaño
los traslados suponen un elevado coste económico. Por otra parte, mantener poblaciones de gran tamaño en los programas
de cría en cautividad es a menudo impracticable debido a la limitación de recursos.

Las biotecnologías reproductivas han aportado soluciones alternativas para facilitar el manejo genético de poblaciones de
especies en peligro como es el desarrollo de bancos de recursos genéticos (Holt et al., 1996; Wildt et al., 1997; Wildt y
Wemmer, 1999). Los bancos de recursos genéticos permiten el almacenamiento de semen, óvulos y embriones congelados,
además de otros tejidos. La ventaja principal de dichos bancos es que permiten mantener la variabilidad genética de una
especie en forma casi indefinida. Así pues, el semen de los machos que se almacena en estos bancos se puede utilizar
durante muchos años después de la muerte del animal. La existencia de un banco de recursos genéticos reduce
considerablemente el número de individuos vivos que se necesitan para mantener una población viable, por lo que se reducen
las necesidades de espacio que se requieren para recuperar una especie, lo que permite reducir los costos, y ampliar el
número de especies que se pueden beneficiar de dichos programas.

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Ecosistemas 15 (2). Mayo 2006.

La principal dificultad de crear un banco de recursos genéticos radica en la necesidad de conocer en profundidad la
reproducción de la especie en cuestión. Puesto que a lo largo de la evolución las especies han divergido principalmente en los
aspectos reproductivos, las diferencias entre especies en comportamiento y fisiología reproductiva son mucho mayores que
en otros niveles. Por ello, la reproducción de cada especie presenta muchas características específicas, que limitan la
aplicación de conocimientos procedentes de especies cercanas filogenéticamente. Los intentos llevados a cabo hasta la
fecha han demostrado hasta qué punto las técnicas de reproducción asistida y los protocolos de congelación varían de una
especie a otra. Dicha variabilidad entre especies dificulta a veces los primeros pasos, precisamente cuando la situación de
una especie se considera límite.

El primer paso para el establecimiento de un banco de recursos genéticos es el desarrollo de protocolos de congelación de
espermatozoides adecuados (Fig. 1). Los espermatozoides son células delicadas que para sobrevivir la criopreservación
requieren ser deshidratados y rehidratados mediante el uso de diluyentes que contienen crioprotectores específicos
(productos que estabilizan las membranas celulares), y mediante unos procesos de enfriamiento y congelación que minimicen
el daño que el hielo produce en la célula. Por lo tanto, los protocolos de criopreservación deben de ser modificados y
optimizados cuidadosamente para cada especie. Hemos trabajado en el desarrollo de protocolos de congelación para Gazella
cuvieri, Gazella dorcas neglecta y Gazella dama mhorr, y hemos encontrado que el diluyente más eficiente es diferente para
cada especie. Además, el éxito en relación a la capacidad del semen de cada especie de sobrevivir a la congelación varió
entre las tres especies, de forma que los mejores resultados se consiguieron en G. dorcas neglecta, en G. dama los
resultados fueron intermedios, y los peores resultados se obtuvieron en G. cuvieri (Roldan et al., 2002; Garde et al., 2003a). El
hecho de que estas diferencias correspondan con los niveles de consanguinidad de cada especie sugiere que la
consanguinidad no sólo afecta a la morfología y motilidad de los espermatozoides, sino que también aumenta su
vulnerabilidad frente a la congelación. Las diferencias entre especies podrían deberse a distinta constitución de las
membranas de los espermatozoides (Roldan y Shi, 2006) y, con ello, a distintos grados de resistencia diferentes al choque
osmótico (Roldan y Garde, 2004). Se ha seguido trabajando en la mejora de los protocolos de congelación para G. dama y G.
cuvieri pero, aunque se han conseguido avances para la primera especie, los resultados para G. cuvieri siguen siendo poco
satisfactorios debido a la mala calidad seminal que presentan los machos (Garde et al., 2003b; Arregui et al., 2005). También
se ha evaluado la capacidad fecundante de los espermatozoides en el laboratorio, lo que ha revelado que en G. cuvieri se
encuentra disminuida respecto a las otras dos especies (del Olmo et al., 2005).

Figura 1a. Espermatozoides de gacela dama antes Figura 1b. Congelación de espermatozoides en
de la congelación. pajuelas sobre vapores de nitrógeno liquido.

Una vez se han desarrollado protocolos de congelación de semen adecuados, el siguiente paso es la puesta a punto de
técnicas de sincronización de ciclos ováricos y de inseminación artificial, que permitan el intercambio de material genético
entre poblaciones. La posibilidad de inseminar hembras con semen congelado también aumenta la eficiencia de la cría en
cautividad puesto que se pueden elegir los apareamientos que minimicen los efectos de la consanguinidad sin necesidad de
someter a los animales al estrés de cambios continuos de grupo social, y sin los riesgos de que incompatibilidades de tipo
comportamental impidan apareamientos aconsejables desde un punto de vista genético. La inseminación artificial requiere
mucho más que depositar espermatozoides en el tracto reproductor de una hembra, puesto que requiere un conocimiento
muy preciso del momento de la ovulación, y del lugar específico en el que depositar espermatozoides. Experiencias previas
en ciervo ibérico permitieron poner a punto la técnica y examinar factores que determinan el éxito de fecundación. Los
resultados indican que una elevada velocidad de natación de los espermatozoides y una elevada proporción de
espermatozoides normales son fundamentales para el éxito de la inseminación artificial (Malo et al., 2005). A su vez, la
velocidad de natación de los espermatozoides está determinada por el diseño morfológico de los mismos (Malo et al., 2006).
Hemos realizado un ensayo de inseminación artificial intrauterina mediante laparoscopia bajo anestesia quirúrgica y
empleando semen congelado en G. dama mhorr. Como resultado de dicho ensayo en el año 2005 se obtuvo una gestación

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que transcurrió con normalidad y a los 202 días de la inseminación artificial nació un macho por parto natural que, en la
actualidad, se encuentra en perfecto estado de salud (Garde et al., 2006). Este resultado representa el primer nacimiento en
el mundo de una cría de gacela obtenida mediante inseminación artificial con semen congelado (Fig. 2).

Figura 2. Primera cria de gacela dama nacida en el mundo mediante

Hasta el presente, se ha puesto mucho énfasis en la obtención, criopreservación y uso de gametos masculinos
(espermatozoides) en los esfuerzos de conservación de recursos genéticos de especies amenazadas. Sin embargo, y para
lograr conservar un máximo de diversidad genética, es importante desarrollar métodos que permitan también la obtención,
conservación y uso de los gametos femeninos, lo cual involucra una serie de desafíos técnicos. Con este propósito, hemos
comenzado estudios de obtención, maduración, fecundación y cultivo in vitro de oocitos de gacela Mohor, con el fin de
desarrollar protocolos adecuados de conservación de gametos femeninos y embriones para un banco de recursos genéticos
(González et al., 2005; Berlinguer et al., 2006, Roldan et al., 2006). Los resultados preliminares obtenidos en gacela dama
son muy alentadores, pues constituyen el primer caso de maduración y fecundación in vitro de oocitos y cultivo de embriones
in vitro en especies de gacelas, y representa un avance considerable en la conservación de germoplasma femenino para el
establecimiento de bancos de recursos genéticos de estas especies amenazadas. También se ha tenido oportunidad de
iniciar un estudio con recuperación y maduración in vitro de oocitos a partir de ovarios de animales que mueren súbitamente
(Roldan et al., 2006).

Perspectivas de futuro

La escala a la que se está produciendo la destrucción del hábitat en todo el Planeta hace predecir que la fragmentación de las
poblaciones naturales en unidades pequeñas y aisladas será un fenómeno cada vez más extendido. Ello hace suponer que la
consanguinidad adquirirá cada vez mayor importancia, y evitar sus efectos deletéreos será un objetivo fundamental en las
estrategias de conservación. Por un parte, en los casos en los que las causas del declive de una especie no puedan ser
frenadas, será necesario establecer programas de cría en cautividad. En estos casos los bancos de recursos genéticos
permitirán reducir las necesidades de espacio para cada especie, y la aplicación de biotecnologías reproductivas permitirá el
intercambio de genes entre poblaciones diferentes y facilitará los apareamientos más aconsejables desde un punto de vista
genético. Por otra parte, las poblaciones naturales que se fragmenten necesitarán de un manejo genético que evite la
consanguinidad y promueva el flujo génico entre poblaciones aisladas, por lo que las biotecnologías reproductivas serán
herramientas de indudable utilidad en el campo. Finalmente, en las ocasiones en las que sea posible, la estrategia óptima
consistirá en el intercambio de gametos entre poblaciones mantenidas en cautividad y poblaciones naturales, de forma que
los programas de cría puedan incorporar material genético de poblaciones naturales sin necesidad de extraer individuos de
poblaciones que están en declive, y que las poblaciones naturales puedan incorporar material genético de los individuos que
forma parte de un programa de cría sin necesidad de re-introducciones que implican un elevado coste y una tasa de éxito
baja.

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Ecosistemas 15 (2). Mayo 2006.

Agradecimientos

Los proyectos de nuestro grupo de investigación han sido financiados por el Ministerio de Educación y Ciencia. Agradecemos
a Eulalia Moreno (Directora EEZA-CSIC) el permiso para trabajar con los animales, y al personal del Parque de Rescate de la
Fauna Sahariana (EEZA-CSIC) el entusiasmo con el que han colaborado en los proyectos de investigación y su
profesionalidad en el manejo de los animales.

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