Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Facultad de Estomatología

Capítulo 2
Métodos y técnicas de
estudio en histología,
embriología e ingeniería
tisular bucodental
Paola Berenice Ortiz Rodríguez
Semestre 2 Grupo 5
Embriohistología II
Dra. María del Pilar Medina Curiel
 Generalidades

El conocimiento de los tejidos se

debe a la existencia por una parte
de instrumentos amplificantes -los
microscopios- y, por otra, a la
existencia de técnicas histológicas
e histoquímicas que hacen posible
la observación de los tejidos a
través de dichos instrumentos
amplificantes.
Instrumentos
amplificantes
Los instrumentos amplificantes fundamentales
son los microscopios ópticos o fotónicos, los
microscopios electrónicos y los microscopios de
resolución atómica.
 Microscopio óptico de luz
El microscopio óptico de luz puede definirse como un
instrumento amplificante que consta de dos sistemas: un
sistema óptico compuesto por dos lentes convergentes el
ocular (próxima al observador) y el objetivo (próxima al objeto a
examinar) y un sistema mecánico que permite enfocar las
lentes sobre el objeto a observar y el desplazamiento de éste
sobre un soporte llamado platina El poder de resolución de un
microscopio de luz (capacidad de distinguir entre dos puntos
sumamente próximos) es de 0,2 µm o 20 µm y la fuente de luz
que ilumina el objeto puede ser natural o proceder de una
lámpara de incandescencia.
 Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro es un

instrumento amplificante en el que se
observa la luz esparcida por las partículas
del objeto iluminado lateralmente
mediante un condensador especialmente
diseñado para ello. Las partículas
aparecen como puntos brillantes en un
campo oscuro.
 Microscopio de luz ultravioleta
El microscopio de luz ultravioleta es un instrumento
amplificante que utiliza como fuente de luz los rayos
ultravioleta (UV). El poder de resolución de este
microscopio es algo mayor que el de luz convencional
(0,13-0,15 µm). Este tipo de microscopio se utiliza
especialmente como microscopio de fluorescencia y para
detectar y determinar la cantidad de ácidos nucleicos que
hay en la célula, ya que estos compuestos absorben la luz
UV. Esta técnica ha recibido la denominación de
microespectrofotometría con luz UV.
 Microscopio de luz ultravioleta
El microscopio de fluorescencia es un instrumento amplificante
en el que los objetos son iluminados por rayos de una
determinada longitud de onda. La imagen que se observa es e!
resultado de la radiación emitida por las moléculas que han
absorbido la excitación primaria y remitido una luz con mayor
longitud de onda y menor energía. Para dejar pasar sólo la
emisión secundaria deseada se utilizan filtros. Esta variedad de
microscopio permite detectar sustancias con autofluorescencia
como las tetracicinas y sustancias marcadas con colorantes
fluorescentes o fluorocromos. El microscopio de fluorescencia
se utiliza tanto para material fresco como fijado.
 Microscopio confocal
El microscopio confocal es un instrumento amplificante
que utiliza el láser como fuente luminosa. Es un
microscopio de fluorescencia en el que la luz se dirige
hacia un punto de la muestra a una profundidad
específica. El barrido del haz de rayos láser a lo largo y a lo
ancho de la muestra, así como en diferentes planos
focales genera la respuesta fluorescente en los diferentes
puntos. La reconstrucción de la imagen se realiza
actualmente por computador en el que se lleva a cabo el
almacenamiento digital y la reconstrucción final de la
imagen.
 Microscopio electrónico de transmisión
El microscopio electrónico de transmisión es un
instrumento amplificante con poder de resolución de
hasta 0,25 µm que tiene por objeto visualizar la estructura
interna de la célula y los tejidos. La imagen se forma a
atravesar un haz de electrones, en el interior de una
cámara de vacío, provista de lentes magnéticas, el corte
muy delgado de una muestra fijada. Las estructuras del
corte que absorben todos los electrones son
electrodensas. Las que permiten atravesar los electrones
son electrolúcidas. Algunas estructuras tienen un carácter
intermedio absorbiendo algunos electrones y permitiendo
pasar a otros.
Los electrones que atraviesan el corte inciden en
una pantalla fosforescente que registra la imagen
de negros, blancos y grises que genera la muestra.
La observación puede hacerse en pantalla o en
placa fotográfica. Las muestras pueden reforzar su
electrodensidad y electrolucidez natural si se
contrastan con tetróxido de osmio y otras sales de
metales pesados.
 Microscopio electrónico de barrido
El microscopio electrónico de barrido es un instrumento
amplificante, con poder de resolución de hasta 3 µm, que
tiene por objeto visualizar tridimensionalmente superficies de
células, tejidos y material inerte. La imagen se forma a barrer
un haz de electrones, punto por punto, la superficie de la
muestra en el interior de una cámara de vacío. La emisión de
electrones secundarios que se origina en la superficie de la
muestra tras ser ésta barrida por el haz de electrones
primarios queda registrada en una pantalla fluorescente. La
imagen tridimensional es reflejo del nivel de electrones
secundarios emitidos desde las diferentes profundidades
existentes en la superficie.
 Microscopio electrónico analítico

El microscopio electrónico analítico es el microscopio

electrónico de transmisión o de barrido al que se
incorporan detectores con capacidad para captar distintas
emisiones procedentes de la muestra (rayos X, electrones
retrodispersos, electrones Auger, etc.). El registro de las
emisiones permite determinar analíticamente la
composición química, cualitativa y cuantitativa, de la
muestra y su distribución en el seno de la misma.
 Microscopio de fuerza atómica

El microscopio de fuerza atómica es un instrumento

amplificante que permite obtener imágenes de superficie
con una alta resolución atómica (subnanométrica).

La preparación de la muestra es mínima por lo que la

morfología de la superficie a observar es muy semejante a
la que existe en condiciones fisiológicas.
Si la microscopía de fuerza atómica se combina con la
técnica de «nanoindentación» al barrer la superficie de la
muestra con una punta de 2 µm de longitud (la cual está
sujeta a un soporte retráctil) se produce una indentación o
muesca de ±300 µm de profundidad. Las fuerzas que se
generan entre la superficie a examinar y la punta hacen
curvar el soporte, que es muy sensible a los cambios de
posición. La ventaja de esta combinación es que permite
simultáneamente observar la microestructura del tejido y
valorar sus propiedades físicas, concretamente las
propiedades mecánicas de elasticidad y dureza en distintos
sitios del esmalte.
Métodos y técnicas
histológicas e
histoquímicas
Las técnicas histológicas necesarias para preparar las muestras
con destino a su observación pueden ser vitales, cuando se
realizan directamente en el individuo vivo (se llevan a cabo en
muy escasas ocasiones, generalmente en forma experimental
en animales de laboratorio); supravitales, cuando se estudian
tejidos vivos separados del individuo y para ello generalmente es
necesario realizar técnicas de cultivos celulares y tisulares y
postvitales cuando se realizan sobre muestras de tejidos
muertos fijados o no fijados. Los estudios sobre tejidos fijados
son los que se realizan con mayor frecuencia, y se obtienen a
partir de biopsias, autopsias o extendidos celulares o raspado
-citología exfoliativa-.
 Tejidos blandos
Técnica histológica básica

- Fijación

Es el primer paso del proceso. Mediante la fijación se interrumpen

los procesos del metabolismo celular y se conservan de una
manera fidedigna las estructuras celulares y tisulares (imágenes
equivalentes a las que presentan las estructuras in vivo). La
fijación se puede realizar mediante procedimientos físicos
-congelación- o procedimientos químicos, los utilizados
generalmente, y que consisten en la inmersión de la muestra en
una solución fijadora que suele ser formol neutro o tamponado
(10-15%).
La fijación debe iniciarse lo más pronto posible, para
evitar la autolisis; uno de los requisitos para obtener una
buena fijación es que los bloques de tejido a fijar tengan
un tamaño que no exceda de 1 x 1 cm y que no sean más
gruesos de 5 mm y si lo fueran deberán cortarse de
forma adecuada. El volumen de fijador deberá ser veinte
veces mayor que el volumen de la muestra, ya que el
fijador pierde eficiencia durante el proceso de fijación.

El tiempo de fijación debe durar desde unas horas a

varios días dependiendo del tamaño y espesor de las
muestras. Tras la fijación en formol se debe realizar un
lavado con agua para eliminar los restos de fijador.
 - Inclusión

La inclusión más utilizada de forma rutinaria es la inclusión en parafina. El punto de

fusión de la parafina oscila entre los 45 y los 60°C, según su composición. Esto
quiere decir que hasta estas temperaturas la parafina es líquida y cuando
desciende a temperatura ambiente la parafina se solidifica y su consistencia es la
suficiente para poder obtener láminas delgadas de un espesor adecuado. Como la
parafina no se mezcla con el agua es imprescindible retirar el agua existente en las
muestras fijadas y para ello se realiza la deshidratación, que además da algo de
dureza a los tejidos.
El agente deshidratante suele ser alcohol etílico y para la
deshidratación se procede a colocar las piezas de tejido en
soluciones acuosas de concentraciones crecientes de etanol
(50, 70, 80, 90, 95 y 100%), el tiempo de cada paso depende
del tipo de tejido a estudiar y del tamaño de la pieza. Una vez
deshidratadas las piezas se procede a su aclaramiento, es decir,
a la sustitución del agente deshidratante por otro, llamado
líquido intermedio, que sea miscible con el medio de inclusión,
en nuestro caso con la parafina. Los productos más utilizados
para este fin son, entre otros, el benceno, el xileno y el tolueno,
todos ellos productos tóxicos.
Una vez fijado y parado el metabolismo celular y retirada toda el
agua de la muestra se realiza la inclusión, que tiene por objeto
la ocupación por parafina de todos los espacios de la pieza de
tejido que en vida estaban ocupados por agua. El proceso de
infiltración se realiza en estufas de inclusión y a una
temperatura un poco por encima del punto de fusión de la
parafina que se utilice. Para iniciar el proceso de la infiltración
de la parafina se introduce la pieza en una mezcla a partes
iguales de líquido intermedio y parafina a la temperatura
anteriormente citada. Más tarde se realizan varios pases por
parafina líquida hasta conseguir que la parafina caliente ocupe
todos los espacios intra e intercelulares. Este proceso suele
requerir varias horas a 45-60°C.
 - Corte

Para la obtención de láminas delgadas a partir del bloque de

parafina se realiza el corte con unos instrumentos llamados
micrótomos. El tipo más utilizado es el llamado de rotación o
tipo Minot que tiene una cuchilla de acero asegurada
fuertemente y que permanece fija con un ángulo de inclinación
adecuado; un sistema de fijación del bloque de parafina que se
desplaza verticalmente durante el corte; y un sistema mecánico
que nos permite seleccionar las mieras que tendrá e corte en su
espesor. Estos cortes se extienden por flotación en agua a 37 °
C y se recogen con los portaobjetos, que se dejan
posteriormente secar en una estufa.
 - Coloración

Para proceder a la coloración de la muestra el primer paso

es la desparafinación, es decir, la eliminación de la
parafina, ya que los colorantes suelen ser soluciones
acuosas y como se ha descrito con anterioridad la
parafina no se mezcla con el agua. Para eliminar la
parafina se suelen utilizar disolventes orgánicos tipo
xileno. Más tarde se procede a la hidratación del corte en
soluciones decrecientes de etanol y como paso final agua
destilada.
La coloración más habitual es la de
hematoxilina-eosina (HE) que utiliza un colorante de
carácter básico -la hematoxilina- que coloreará
estructuras ácidas de las células y tejidos; dichas
estructuras se denominan basófilas -el núcleo celular
o acúmulos de ácidos nucleicos como los ribosomas-;
y un colorante de carácter ácido -la eosina que
coloreará estructuras básicas que se denominan
eosinófilas o acidófilas -e citoplasma celular o algunos
orgánulos como las mitocondrias-.
Para realizar esta coloración en primer lugar se
introducen los cortes en una cubeta con hematoxilina
(las hay de distintos tipos) durante unos minutos, se
lavan en agua corriente y luego en agua destilada, y a
continuación se colorean con la eosina durante un
minuto o menos. Con la coloración de HE los núcleos
celulares se ven de color azul violeta y el citoplasma
de color rosa-anaranjado.
 - Montaje

Finalmente los cortes son lavados en agua destilada,

deshidratados en soluciones crecientes de etanol,
aclarados en xileno y cubiertos con el cubreobjetos
depositando previamente unas gotas de medio de
montaje (bálsamo del Canadá, Eukitt, DPX, etc.). Tras el
montaje los preparados histológicos ya están disponibles
para su observación microscópica.
Técnicas histoquímicas

La histoquímica es la utilización de reacciones químicas y/o

bioquímicas en la técnica histológica para localizar ciertas
substancias o la actividad de enzimas en muestras
histológicas. De esta manera se pueden observar la
hemoglobina y sus derivados, la melanina, la lipofucsina, el
hierro, el calcio (método de von Kossa), el ADN (reacción de
Feulgen), e ARN (verde metilo pironina), el glucógeno
(reacción del PAS), glucosaminoglicanos, enzimas como la
fosfatase alcalina, fosfatasa ácida, esterases,
deshidrogenasas, peroxidasas, etc.
Para la demostración de enzimas se utilizan unas
sustancias denominadas cromógenos que tras la
acción de la enzima adquieren una coloración que es
observable con el microscopio óptico. Durante las
últimas décadas se ha producido un gran avance en el
desarrollo de las técnicas denominadas
inmunohistoquímicas, que tienen por base la
utilización de antisueros o anticuerpos específicos
contra los componentes celulares o tisulares que se
quieren identificar.
 Tejidos duros
Para obtener láminas delgadas de los tejidos mineralizados con
destino a la observación con el microscopio pueden utilizarse
distintos métodos. El primero de ellos consiste en descalcificar y
ablandar dichos tejidos tras la fijación e incluirlos en parafina para
ser cortados y teñidos. Para eliminar los depósitos de sales
cálcicas se pueden utilizar: a) soluciones de ácidos fuertes (ácido
nítrico concentrado al 5-10% en agua destilada o en formol al
10%), el tiempo para la descalcificación oscila entre días y
semanas dependiendo del grosor de la muestra; b) soluciones de
ácidos débiles (ácido fórmico al 90% en agua destilada), el tiempo
de descalcificación de un bloque de 5 mm de espesor puede ser
de hasta una semana.
Esta solución fija y descalcifica al mismo tiempo; c) quelantes
químicos (EDTA a 5,5%) que se combinan con los iones metálicos
formando compuestos solubles en agua.

Un segundo método para estudiar los tejidos mineralizados

consiste en la inclusión del tejido duro fijado sin descalcificar. Para
conseguir cortar láminas delgadas sin descalcificar es necesario,
en primer lugar, utilizar en vez de parafina o celoidina una
sustancia que sea mucho más dura, generalmente
metilmetacrilato u otro tipo de metacrilato, que al polimerizar
alcance una gran dureza, y en segundo lugar utilizar un
micrótomo motorizado con una cuchilla de carburo de tungsteno
que permita realizar cortes a una velocidad lenta y constante.
La inclusión en metilmetacrilato consiste brevemente en un
primer paso en el que la pieza se introduce 24 horas en
monómero de metilmetacrilato a 4°C, para permitir que dicha
sustancia se introduzca en todos los espacios, y en una
segunda inmersión en monómero de metilmetacrilato a 32°C
en estufa durante la cual se va polimerizando y
endureciendo paulatinamente. El proceso completo de
inclusión suele durar seis o siete días.
Técnicas en microscopía
electrónica
 Microscopía electrónica de transmisión

Para observar una muestra de tejido con el

microscopio electrónico de transmisión se
necesitan cortes ultrafinos (30-120 µm de grosor)
que se obtienen en unos aparatos especiales
denominados ultramicrótomos. Las cuchillas
utilizadas son de vidrio y los soportes de las
muestras son rejillas metálicas por lo general
recubiertas de carbono o películas sintéticas.
Como medios de inclusión se utilizan resinas
polimerizadas, tanto insolubles (araldita, epon,
etc.), como hidrosolubles (lovicryl); esta última se
utiliza especialmente para realizar técnicas
histoquímicas. Al exponerse los cortes a haz de
electrones del microscopio electrónico se produce
una imagen en diferentes tonos de grises
dependiendo de la densidad de la materia. Los
electrones que atraviesan la muestra impresionan
la pantalla fluorescente o la placa fotográfica
dando un color blanco.
Los electrones que no atraviesan el corte, al incidir
con los átomos presentes en la muestra, no
impresionan la pantalla fluorescente o la película
fotográfica y dan por lo tanto color negro. En
consecuencia en microscopía electrónica de
transmisión, a diferencia de la microscopía óptica,
los cortes deben de ser extremadamente delgados
y para la observación no se utilizan colorantes. El
fijador suele ser glutaraldehído al 2,5-4% en
tampón fosfato o tampón cacodilato y el agente
deshidratante la acetona o el etanol.
Además se realiza una postfijación con tetróxido de
osmio a 2% y los cortes se contrastan con acetato de
uranilo y/o citrato de plomo. Debido a la escasa
capacidad de penetración del glutaraldehído y del
tetróxido de osmio, los bloques de tejido no deben
superar el volumen de un milímetro cúbico. Para el
estudio de los tejidos duros con microscopía
electrónica de transmisión se utiliza tampón cacodilato
y cuchillas de diamante, pero, en ocasiones, no se
utiliza tetróxido de osmio ni se contrastan los cortes
con soluciones de metales pesados.
Para detectar calcio se utilizan técnicas de
precipitación o de competencia por el calcio,
como, por ejemplo, la técnica del piroantimoniato
potásico o del cloruro de lantano, por lo general
en asociación con técnicas de microscopía
electrónica analítica.
 Microscopía electrónica de barrido
La microscopía electrónica de barrido constituye
un método esencial para el estudio tridimensional
de la superficie de las muestras. Dicha técnica se
basa en la interacción de un haz de electrones
sobre la superficie del espécimen. El haz realiza un
barrido sobre la superficie y origina, al incidir en la
misma, electrones secundarios que son captados
por un detector, dando lugar a una señal eléctrica
que es ampliada y más tarde transmitida a un
monitor de televisión.
Para observar las muestras con el microscopio
electrónico de barrido los especímenes se fijan
preferentemente en glutaraldehído a 2,5% en
tampón fosfato y una vez fijados se lavan en el
tampón con anterioridad utilizado. Es conveniente
realizar una postfijación con tetróxido de osmio a 2%
en tampón fosfato con el fin de evitar la extracción
de lípidos de las membranas durante el desarrollo
posterior de la técnica.
Las muestras postfijadas son deshidratadas, utilizando para ello
soluciones crecientes de acetona o etanol y desecadas,
mediante la técnica del punto crítico, que consiste en sustituir el
líquido presente en la muestra por dióxido de carbono líquido
que luego se transforma en gas y se elimina lentamente. Las
muestras desecadas se montan sobre portamuestras de
aluminio usando como adherente y como conductor plata
coloidal. Para su observación con el microscopio es necesario
como último paso realizar el recubrimiento de la muestra a fin de
asegurar la conductividad eléctrica de la misma. El método más
utilizado es la metalización con oro.
 Microscopía electrónica analítica
La microscopía electrónica analítica es una técnica
«no destructiva» que permite conocer in situ y
simultáneamente, en un corto período de tiempo
-segundos-, la morfología y la composición química
de una muestra.

El desarrollo de esta técnica ha sido posible aplicando

distintos tipos de detectores al microscopio
electrónico de transmisión y al microscopio
electrónico de barrido.
La técnica de microscopía electrónica analítica más
desarrollada y utilizada es la denominada
microanálisis por energía dispersiva de rayos X. Esta
técnica se basa en la producción de rayos X
«característicos» que se originan cuando un haz de
electrones incide sobre los átomos de la muestra y
colisionan con los electrones de los orbitales que se
encuentran alrededor del núcleo.
 Métodos y
técnicas en
ingeniería tisular
 Técnicas de cultivo celular

Gran parte de las células que tienen

capacidad de proliferación, especialmente las
células madre, pueden ser mantenidas y
cultivadas en el laboratorio. Para ello, en
primer lugar, se requiere contar con una
adecuada fuente de células a partir de la cual
se aislan las células a cultivar
Así, las células pueden obtenerse a partir de muestras
de biopsia obtenidas de los tejidos de un individuo
(células adultas), del cordón umbilical de un recién
nacido (células del cordón) o de un embrión en
desarrollo (células embrionarias).

En cada caso, las muestras que contienen las células a

aislar habrán de ser tratadas en el laboratorio utilizando
diferentes métodos de aislamiento. Los métodos de
aislamiento más utilizados son los métodos
enzimáticos y las técnicas de explante.
Una vez extraídas, las células se mantienen en
cultivo en el laboratorio utilizando diferentes
medios específicos que permiten el crecimiento y
la proliferación de dichas células. Las células en
cultivo se pueden almacenar en estado vital
utilizando cámaras de cultivo a 37°C y una
atmósfera enriquecida en C02 o bien pueden
congelarse y mantenerse en estado quiescente en
bancos de tejidos hasta el momento de su
utilización.
 Biomateriales

Los biomateriales son compuestos de origen

natural o sintético que se utilizan con
frecuencia en ingeniería tisular para sustituir
la matriz extracelular del tejido a reproducir.

La utilización de cualquier tipo de biomaterial

en terapéutica ha de estar sometida a una
serie de estrictos controles que garanticen el
cumplimiento de una serie de indicadores de
calidad.
 Los más importantes son los que se señalan a
continuación:

1 Biocompatibilidad o aceptación por el organismo receptor.

2 Ausencia de toxicidad o efectos secundarios indeseables.

3 Ser químicamente estable e inerte.
4 Cumplir los requerimientos biomecánicos necesarios.
5 Facilidad de producción y procesamiento.
 Técnicas de ensamblaje y asociación
de componentes tisulares
Para el ensamblaje y el mantenimiento
de los distintos componentes tisulares, lo
más habitual es utilizar biorreactores. Los
biorreactores son sistemas que
mantienen un ambiente biológicamente
activo y que, por tanto, permiten el
cultivo y el desarrollo de estructuras
biológicas complejas, incluyendo los
tejidos generados mediante ingeniería
tisular.
Entre éstos, destacamos los insertos porosos, en los que una membrana
sintética porosa permite el paso de nutrientes desde un compartimento acelular
hacia el compartimento en el que se cultiva el tejido. Estos insertos, además,
permiten el cultivo diferencial de distintas zonas del tejido, manteniendo unas
zonas en cultivo sumergido y otras zonas en exposición directa al aire. Este
método, denominado aire-líquido, favorece la estratificación y la maduración del
epitelio de los tejidos generados mediante ingeniería tisular.