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    Bioinformática I II

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    Bryan Steeven Delgado Lopez
    Este resumen describe los pasos para diseñar primers y simular una electroforesis para identificar una mutación en el gen GALT. Se diseñaron primers que amplifican un fragmento de 584 pb. Los primers tienen 20 pb, 55% GC, Tm de 62°C y 64°C. La temperatura de anelling sería de 57°C. El programa UCSC In-Silico PCR verificaría si los primers producen el amplicón esperado. La enzima de restricción HinfI corta el amplicón una vez. La simulación incluye un marcador de peso molecular, un control sin

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    Bryan Steeven Delgado Lopez
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    Este resumen describe los pasos para diseñar primers y simular una electroforesis para identificar una mutación en el gen GALT. Se diseñaron primers que amplifican un fragmento de 584 pb. Los primers tienen 20 pb, 55% GC, Tm de 62°C y 64°C. La temperatura de anelling sería de 57°C. El programa UCSC In-Silico PCR verificaría si los primers producen el amplicón esperado. La enzima de restricción HinfI corta el amplicón una vez. La simulación incluye un marcador de peso molecular, un control sin

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    de 4

    7.

    En el software Primer3Plus
    (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi) pegar la secuencia
    del gen GALT desde el nucleótido 541 hasta el 1020:
    AGATTTTCCAGCGGATCCCCCGGTGGCCTCATGTCGCGCAGTGGAACCGATCCTCAGCAACGCCAGCAGGCGT
    CAGAGGCGGACGCCGCAGCAGCAACCTTCCGGGCAAACGACCATCAGCATATCCGCTACAACCCGCTGCAGG
    ATGAGTGGGTGCTGGTGTCAGCTCACCGCATGAAGCGGCCCTGGCAGGGTCAAGTGGAGCCCCAGCTTCTGA
    AGACAGTGCCCCGCCATGACCCTCTCAACCCTCTGTGTCCTGGGGCCATCCGAGCCAACGGAGAGGTGAATCC
    CCAGTACGATAGCACCTTCCTGTTTGACAACGACTTCCCAGCTCTGCAGCCTGATGCCCCCAGTCCAGGACCCA
    GTGATCATCCCCTTTTCCAAGCAAAGTCTGCTCGAGGAGTCTGTAAGGTCATGTGCTTCCACCCCTGGTCGGAT
    GTAACGCTGCCACTCATGTCGGTCCCTGAGATCCGGGCTGTTGTTGATGCATGGGCCTCAGTCACAGAGGAGC
    TGGGTGCCCAGTACCCTTGGGTGCAGATC[TTTGAAAACAAAGGTGCCATGATGGGCTGTTCTAACCCCCACC
    CCCACTGCCAGGTATGGGCCAGCAGTTTCCTGCCAGATATTGCCCAGCGTGAGGAGCGATCTCAGCAGGCCTA
    TAAGAGTCAGCATGGAGAGCCCCTGCTAATGGAGTACAGCCGCCAGGAGCTACTCAGGAAGGAACGTCTGGT
    CCTAACCAGTGAGCACTGGTTAGTACTGGTCCCCTTCTGGGCAACATGGCCCTACCAGACACTGCTGCTGCCCC
    GTCGGCATGTGCGGCGGCTACCTGAGCTGACCCCTGCTGAGCGTGATGATCTAGCCTCCATCATGAAGAAGCT
    CTTGACCAAGTATGACAACCTCTTTGAGACGTCCTTTCCCTACTCCATGGGCTGGCATGGGGCTCCCACAGGAT
    CAGAGGCTGGGGCCAACTGGAACCATTGGCAGCTGCACGCTCATTACTACCCTCCGCTCCTGCGCTCTGCC]AC
    TGTCCGGAAATTCATGGTTGGCTACGAAATGCTTGCTCAGGCTCAGAGGGACCTCACCCCTGAGCAGGCTGCA
    GAGAGACTAAGGGCACTTCCTGAGGTTCATTACCACCTGGGGCAGAAGGACAGGGAGACAGCAACCATCGC
    CTGACCACGCCGACCACAGGGCCTTGAATCCTTTTTTGTTTTCAACAGTCTTGCTGAATTAAGCAGAAAGGGCC
    TTGAATCCTGGCCTGGAATTTGGGCAGATATAGCATTAATAAAACTGTGCATCTCAAACTTTTATCACATACTC
    TAATATCAGAGGAGTGTGAACCTTCAGAGATCTAGGGTTAAAAGCTAAAGGCATAGCTCCAGCTACAACTTTT
    CTTTGTCTACAGATGTGTAAAATCTTGATGCAAAAATCTACCCCAAATTTCTGAACAAAATTAATATTCAGTATT
    ATATCTAGCCTATAGATTCTCTTACTCTTGGTGTAATGACAGCATTCCCAGTTTAGGAAACTGTTTTAAAATCTT
    GTGTCTTGGTTGTGGCTGAGGCTTTGGGAAGGCCAGAGCCCCCTTTGCCACCACCCCTAGGGTGTCAGCTCCA
    AGCCTGGGCCTGAGGGTTTGATGGGGAGCGGGTGAGCTGGATCCTGATCCCAGTGGTCAGTGGCCAGATCCT
    GGGCTGCTGGCCAGAACCCTGGCTTTGTGAGTGGCTGCAGCTTGGCTCTGCTCCAGCCCACAGGGGCTAAAG
    GG

    a) Indique la secuencia del primer foward y reverse, del primer par de primers diseñados por
    el programa.

    Primer Foward: CAGTACCCTTGGGTGCAGAT

    Primer Reverse: AGTCTCTCTGCAGCCTGCTC

    b) Indicar el tamaño del fragmento amplificado (amplicon)

    584 pb

    c) De los primers indicar: su tamaño, Tms y contenido de GC en %

    Primer Foward Primer Reverse


    Tamaño de los primers 20 pb 20 pb
    Tms del Software 60.0°C 60.0°C
    GC en porcentaje % 55% 55%
    d) Calcular las Tms de los primers con la fórmula, Tm: 2(T+A) + 4(G+C) y compararla con los
    que arroja el programa Primer3Plus.

    Primer Foward Primer Reverse


    Tm: 2(T+A) + 4(G+C) Tm: 2(T+A) + 4(G+C)
    Tm: 2(5+4)+4(6+5) Tm: 2(6+2)+4(4+8)
    Tm: 2(9)+4(11) Tm: 2(8)+4(12)
    Tm: 18+44 Tm: 16+48
    Tm: 62°C Tm: 64°C

    e) ¿Qué temperatura de anneling (Ta) utilizarían en la PCR?

    El límite de una Tm es de 65°C para que la hibridación de los primers sea capaz de unirse al ADN
    diana, de modo que en esta ocasión se usa una Tm de 62°C

    Ta  Tm – 5°C

    Ta: 62°C – 5°C  57°C

    La fórmula a desarrollar nos indica que; no se debe exceder de 5°C a la Tm.

    f) ¿Con cuál programa podemos utilizar para verificar que los primers diseñados, producirán
    el amplicon que estamos esperando?

    El programa que ayuda a verificar si los primers diseñados anteriormente produzcan el amplicón
    esperado es el UCSC In-Silico PCR.

    Éste programa se caracteriza por buscar en una base de datos de secuencias con un par de
    cebadores de PCR, utilizando una estrategia de indexación para un rendimiento rápido.

    8. En el software Restriction Mapper version 3 (http://www.restrictionmapper.org/)


    a) Escoja una enzima de restricción, con una diana de 4 nucleótidos, que nos permita identificar la
    mutación seleccionada y que sólo corte el amplicon una vez
    Nombre Secuencia Longitud de Sobresalir Frecuencia Posición de
    sitio corte
    HinfI GANTC 4 Cinco_prima 1 120
    (Haemophilus influenzae)

    9. Simular una electroforesis en un gel de agarosa:

    a) Incluir en el 1er carril: el marcador de peso molecular InvitrogenTM Estándar de ADN de 50


    bp TrackItTM, indicar los ul a cargar en el gel
    https://assets.fishersci.com/TFS-Assets/LSG/manuals/trackit_50bp_man.pdf?
    _ga=2.266086735.1769875469.16591088211677353011.1658272471

    b) Incluir en el 2do carril: un control sin digerir.


    c) En los siguientes carriles deben colocar los fragmentos obtenidos después de realizar el análisis de
    restricción en: una muestra

    sin la mutación, una muestra heterocigota y otra muestra homocigota para la variante escogida.

    d) Elegir la concentración de agarosa óptima para separar los fragmentos obtenidos, calcular la
    cantidad de agarosa, buffer y SyBr Safe 10.000X, que se necesitan para preparar un gel de 100 ml.

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