Método CTAB

Extraction buffer 1: 2% (w/v) CTAB; 0.1 M Tris-HCl (pH 8); 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA (pH 8); 2% (w/v) PVPP. Add β-
mercaptoethanol to a final concentration of 10% (v/v) just before use.

1. Tomar aproximadamente 250 mg de tejido vegetal macerado con nitrógeno líquido y

colocar 900 µL de Buffer de extracción y 100 µL de B-mercaptoetanol en un tubo de
2mL. Mezclar por inversión durante 30 segundos e incubar a 65°C por 10 minutos.
Invertir el tubo de 3-4 veces durante el tiempo de incubación.
2. Agregar 800µL de Cloroformo. Mezclar por inversión por 30 segundos.
3. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
4. Tomar el sobrenadante y transferirlo a otro tubo.
5. Agregar 800µL de Fenol-Cloroformo (1:1), mezclar por inversión por 30 segundos.
6. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C. Tomar el sobrenadante y transferir a un
nuevo tubo.
7. Añadir Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) v/v en relación al volumen de muestra
recuperada en el paso 6. Mezclar por inversión por 30 segundos.
8. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
9. Tomar el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo que contenga 500 µL LiCl (8M).
10. Mantener en -2’°C por al menos 4 horas
11. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4°C.
12. Eliminar el sobrenadante y lavar con 500 µ de etanol Absoluto
13. Centrifugar 10000rpm por 3 minutos a 4 °C, descartar el sobrenadante.
14. Lavar con 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10000rpm por 3 minutos a 4°C.
15. Eliminar el Etanol y dejar secar a temperatura ambiente por 5 minutos.
16. Disolver el pellet en 250µL de Agua grado BM.
17. Agregar 25 µL de acetato de sodio (3M) y 500µL de etanol
18. Precipitar en frío a -20°C por 2 horas.
19. Centrifugar a 13000rpm por 15 minutos a 4°C.
20. Lavar con etanol al 70% dos veces como en el paso 14.
21. Secar a temperatura ambiente.
22. Resuspender en 20-50µL de agua grado BM.
Método SDS
3% SDS (w/v); 0.5 mM EDTA (pH 8); 0.1 mM Tris-HCl (pH 8); 2% (w/v) PVPP. Add β-mercaptoethanol to a final
concentration of 10% (v/v) just before use.

1. Tomar aproximadamente 250 mg de tejido vegetal macerado con nitrógeno líquido y

colocar 900 µL de Buffer de extracción y 100 µL de B-mercaptoetanol en un tubo de
2mL. Mezclar por inversión durante 30 segundos e incubar a 65°C por 10 minutos.
Invertir el tubo de 3-4 veces durante el tiempo de incubación.
2. Agregar 800µL de Cloroformo. Mezclar por inversión por 30 segundos.
3. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
4. Tomar el sobrenadante y transferirlo a otro tubo.
5. Agregar 800µL de Fenol-Cloroformo (1:1), mezclar por inversión por 30 segundos.
6. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C. Tomar el sobrenadante y transferir a un
nuevo tubo.
7. Añadir Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) v/v en relación al volumen de muestra
recuperada en el paso 6. Mezclar por inversión por 30 segundos.
8. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
9. Tomar el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo que contenga 500 µL LiCl (8M).
10. Mantener en -2’°C por al menos 4 horas
11. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4°C.
12. Eliminar el sobrenadante y lavar con 500 µ de etanol Absoluto
13. Centrifugar 10000rpm por 3 minutos a 4 °C, descartar el sobrenadante.
14. Lavar con 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10000rpm por 3 minutos a 4°C.
15. Eliminar el Etanol y dejar secar a temperatura ambiente por 5 minutos.
16. Disolver el pellet en 250µL de Agua grado BM.
17. Agregar 25 µL de acetato de sodio (3M) y 500µL de etanol
18. Precipitar en frío a -20°C por 2 horas.
19. Centrifugar a 13000rpm por 15 minutos a 4°C.
20. Lavar con etanol al 70% dos veces como en el paso 14.
21. Secar a temperatura ambiente.
22. Resuspender en 20-50µL de agua grado BM.
 Extracción a partir de muestras con Trizol (1mL)

1. Colocar el Lisado con Trizol a T.A. por 5 minutos.

2. Agregar 200µL de cloroformo y mezclar vigorosamente durante 15 s.
3. Incubar a T.A 2-3 minutos
4. Centrifugar 1200 g x 15 minutos a 4°C
5. Transferir la parte superior a un nuevo tubo (600uL)
6. Tomar aproximadamente 600µL de Lisado y colocar 900 µL de Buffer de extracción y
100 µL de B-mercaptoetanol en un tubo de 2mL. Mezclar por inversión durante 30
segundos e incubar a 65°C por 10 minutos. Invertir el tubo de 3-4 veces durante el
tiempo de incubación.
7. Separar la mezcla en 2 tubos de 800 µL
8. Agregar 400µL de Cloroformo por tubo. Mezclar por inversión por 30 segundos.
9. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
10. Tomar el sobrenadante y transferirlo a otro tubo.
11. Agregar 400µL de Fenol-Cloroformo (1:1), mezclar por inversión por 30 segundos.
12. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C. Tomar el sobrenadante y transferir a un
nuevo tubo.
13. Añadir Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) v/v en relación al volumen de muestra
recuperada en el paso 6. Mezclar por inversión por 30 segundos.
14. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
15. Tomar el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo que contenga 500 µL LiCl (8M).
16. Mantener en -2°C por al menos 4 horas
17. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4°C.
18. Eliminar el sobrenadante y lavar con 500 µ de etanol Absoluto.
19. Centrifugar 10000rpm por 3 minutos a 4 °C, descartar el sobrenadante.
20. Lavar con 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10000rpm por 3 minutos a 4°C.
21. Eliminar el Etanol y dejar secar a temperatura ambiente por 5 minutos.
22. Disolver el pellet en 250µL de Agua grado BM.
23. Agregar 25 µL de acetato de sodio (3M) y 500µL de etanol
24. Precipitar en frío a -20°C por 2 horas.
25. Centrifugar a 13000rpm por 15 minutos a 4°C.
26. Lavar con etanol al 70% dos veces como en el paso 20.
27. Secar a temperatura ambiente.
28. Resuspender en 20-50µL de agua grado BM.
Protocolo modificado CTAB modificado (manglar + Blueberry)

Extraction buffer 1: 3.65% (w/v) CTAB; 0.1 M Tris (pH 8); 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA (pH 8); 5% (w/v) PVPP. Add β-
mercaptoethanol to a final concentration of 10% (v/v) just before use.

SSTE: SDS 0,5%; NaCl 1M; Tris 1 mM; EDTA 100µM

1. Tomar aproximadamente 250 mg de tejido vegetal macerado con nitrógeno líquido y

colocar 1875 µL de Buffer de extracción y 37.5 µL de B-mercaptoetanol en un tubo de
2mL. Mezclar por inversión durante 30 segundos e incubar a 65°C por 10 minutos.
Invertir el tubo de 3-4 veces durante el tiempo de incubación.
2. Agregar 800µL de Cloroformo. Mezclar por inversión por 30 segundos.
3. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
4. Tomar el sobrenadante y transferirlo a otro tubo.
5. Añadir Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) v/v en relación al volumen de muestra
recuperada en el paso 6. Mezclar por inversión por 30 segundos.
6. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
7. Tomar el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo que contenga 1/3 del volumen
tubo “500 µL” LiCl (8M)- sin precipitado.
8. Precipitar a -2°C overnight
9. Centrifugar a 10300rpm por 15 minutos a 4°C.
10. Eliminar el sobrenadante y lavar con 500 µ de etanol Absoluto
11. Centrifugar 10300rpm por 3 minutos a 4 °C, descartar el sobrenadante.
12. Lavar con 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10000rpm por 3 minutos a 4°C.
13. Eliminar el Etanol y dejar secar a temperatura ambiente por 5 minutos.
14. Disolver el pellet en 100 µL de buffer SSTE y agregar 250 µL de etanol absoluto.
15. Precipitar en frío a -20°C por 2 horas.
16. Centrifugar a 13000rpm por 15 minutos a 4°C.
17. Eliminar sobrenadante
18. Lavar con 700 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10300 rpm por 10 minutos a 4°C.
19. Eliminar el Etanol y dejar secar a 37°C por 5 minutos.
20. Precalentar el Agua grado Biología molecular a 37°C y disolver el pellet en 30µL de
agua grado BM caliente.
21. Hidratar el pellet a 37°C por 15 minutos, mezclar por pipeteo e incubar a 4°C por 20
minutos.
22. Homogenizar la muestra antes de la cuantificación.
Protocolo modificado CTAB modificado (manglar + Blueberry) PROBADO 15-17/06/2021

Extraction buffer 1: 3.65% (w/v) CTAB; 0.1 M Tris (pH 8); 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA (pH 8); 5% (w/v) PVPP. Add β-
mercaptoethanol to a final concentration of 10% (v/v) just before use.

SSTE: SDS 0,5%; NaCl 1M; Tris 1 mM; EDTA 100µM

1. Tomar aproximadamente 250 mg de tejido vegetal macerado con nitrógeno líquido y

colocar 900 µL de Buffer de extracción y 100 µL de B-mercaptoetanol en un tubo de
2mL. Mezclar por inversión durante 30 segundos e incubar a 65°C por 10 minutos.
Invertir el tubo de 3-4 veces durante el tiempo de incubación.
2. Agregar 800µL de Cloroformo. Mezclar por inversión por 30 segundos.
3. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
4. Tomar el sobrenadante y transferirlo a otro tubo.
5. Añadir Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) v/v en relación al volumen de muestra
recuperada en el paso 6. Mezclar por inversión por 30 segundos.
6. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos a 4 °C.
7. Tomar el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo que contenga 1/3 del volumen
del tubo “500 µL” LiCl (8M)- sin precipitado.
8. Precipitar a -2°C overnight
9. Centrifugar a 10300 rpm por 15 minutos a 4°C.
10. Eliminar el sobrenadante y lavar con 500 µ de etanol Absoluto
11. Centrifugar 10300rpm por 3 minutos a 4 °C, descartar el sobrenadante.
12. Lavar con 500 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10300rpm por 3 minutos a 4°C.
13. Eliminar el Etanol y dejar secar a temperatura ambiente por 5 minutos.
14. Disolver el pellet en 100 µL de buffer SSTE y agregar 250 µL de etanol absoluto.
15. Precipitar en frío a -20°C por 2 horas.
16. Centrifugar a 13000rpm por 15 minutos a 4°C.
17. Eliminar sobrenadante
18. Lavar con 700 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10300 rpm por 10 minutos a 4°C.
19. Eliminar el Etanol y dejar secar a 37°C por 5 minutos.
20. Precalentar el Agua grado Biología molecular a 37°C y disolver el pellet en 30µL de
agua grado BM caliente.
21. Hidratar el pellet a 37°C por 15 minutos, mezclar por pipeteo e incubar a 4°C por 20
minutos.
22. Homogenizar la muestra antes de la cuantificación.