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    Informe Cuantificacion Microorganismos

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    Natalia Rengifo
    Este documento describe varios métodos para cuantificar microorganismos, incluyendo métodos directos como el recuento en cámara de Petri y métodos indirectos como la turbidimetría y las escalas de McFarland. Explica cómo realizar diluciones seriadas y el conteo de colonias para determinar el número de unidades formadoras de colonias. Además, detalla los materiales y equipos necesarios para aplicar estas técnicas de cuantificación microbiológica.

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    Informe Cuantificacion Microorganismos

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    Este documento describe varios métodos para cuantificar microorganismos, incluyendo métodos directos como el recuento en cámara de Petri y métodos indirectos como la turbidimetría y las escalas de McFarland. Explica cómo realizar diluciones seriadas y el conteo de colonias para determinar el número de unidades formadoras de colonias. Además, detalla los materiales y equipos necesarios para aplicar estas técnicas de cuantificación microbiológica.

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    INFORME CUANTIFICACION MICROORGANISMOS (1) (1)

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    Informe Cuantificacion Microorganismos

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    Este documento describe varios métodos para cuantificar microorganismos, incluyendo métodos directos como el recuento en cámara de Petri y métodos indirectos como la turbidimetría y las escalas de McFarland. Explica cómo realizar diluciones seriadas y el conteo de colonias para determinar el número de unidades formadoras de colonias. Además, detalla los materiales y equipos necesarios para aplicar estas técnicas de cuantificación microbiológica.

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    METODOS PARA CUANTIFICAR MICROORGANISMOS

    JOHANN FELIPE GONZÁLEZ CALVO,


    DUVAN FELIPE RAMIREZ QUINTERO,
    NEIDER SMITH RUIZ GUZMAN,
    BRAYAN HERNANDO BRAVO BURGOS,

    INGENEÍIA AGROINDUSTRIAL

    MICROBIOLOGÍA
    KAREN SANDOVAL

    COORPORACION UNIVERSITARIA DEL META


    VILLAVICENCIO-META
    2022
    1. INTRODUCCIÓN

    Para la cuantificación de microorganismos en un cultivo se emplean métodos directos

    (número) e indirectos (peso). Dentro de los indirectos sobresale la centrifugación y dentro

    de los directos el conteo de células viables en caja de Petri empleando ya sea el vaciado en

    placa o el extendido. La técnica de conteo de células viables, se basa en el supuesto de que

    cada bacteria en el medio de cultivo se multiplicará y producirá una colonia visible, por lo

    tanto, el número de colonias visibles será igual al número de bacterias viables o unidades

    formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución


    2. OBJETIVOS
    • conocer las distintas metodologías empleadas en la microbiología para la
    cuantificación directa e indirecta de los microorganismos.
    3. MATERIALES Y REACTIVOS ( O DE CONSUMO)

    Cant. Materiales y Equipos Cant. Reactivos o de Consumo


    3 Pipeta Pasteur 500 gr Gasa
    Cubreobjetos o laminillas 200 ml Hipoclorito
    1 Microscopio 1 Cultivo de E. coli en caldo
    nutritivo
    1 Cámara de Neubauer 100 ml Agua destilada
    1 Asa microbiológica 100 ml Agua peptonada
    1 Tubo de rosca con tapa
    4. MARCO TEÓRICO
    Los métodos se dividen en directos e indirectos

    METODOS DIRECTOS
    Son aquellos que requieren preparaciones puras, no incluyen ningún tipo de
    sustancia que altere los resultados. Haciendo referencia a la masa celular o al
    número de individuos presentes en una muestra.

    Incluyen:

     Determinación del peso húmedo: mediante el cual se determina el peso del


    sedimento (microorganismos)
     Determinación del peso seco: para este el sedimento se seca antes de ser
    pesado.
     Determinación del nitrógeno total: se calcula mediante la técnica micro –
    kjeldahl.
     Recuento en cámara de Petroff-Hauser: Cámara de Neubauer o
    Hemacitómetro. La metodología se desarrolla sobre un portaobjetos en el
    cual se deposita la muestra; este portaobjetos tiene impresa una cuadrícula
    graduada y con medidas exactas: Profundidad de 0.02mm, área 1 mm2,
    dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes (cada uno de ellos
    subdividido en 16 cuadrados más pequeños, en un arreglo de 4x4); entonces,
    cuando la muestra a cuantificar es depositada entre el portaobjetos calibrado
    y el cubreobjetos, se distribuye en 400 celdas (16 x 25 = 400).

    Ya la muestra depositada y reposada, se procede a contar las células en 16


    celdas (aunque las áreas contadas son variables), se registra el número
    contado en estas y se calcula la población de células de la siguiente forma:
    Concentración en células/mL = n x 25 x 50 x 1000 Donde n = número de
    células contadas en las 16 celdas.
    La ventaja de este método está dada por la rapidez para el cálculo del
    número de células, pero solo debe ser utilizado en muestras con poblaciones
    concentradas de células (>10 x 106 células/mL), pues con menores
    poblaciones, la observación al microscopio es poco significativa
    estadísticamente. Para obtener resultados más exactos, es recomendable
    tener un conteo entre 200 y 300 células por muestra.

     Contadores electrónicos de partículas Coulter: El fundamento del método, es


    la interrupción de corriente por el paso de una célula. Con esta metodología
    se requieren muestras totalmente puras, pues cada partícula presente que no
    sea una célula, es registrada por el equipo o puede ser la causante de un daño
    del mismo.

    METODOS INDIRECTOS

    Hace referencia al consumo de nutrientes o producción de metabolitos / tiempo.


    Como por ejemplo la medición del consumo de oxígeno, consumo de gas
    carbónico, producción de ácidos y otros metabolitos, etc.

     Métodos ópticos de turbidimetria: Es la medición de la cantidad de luz


    dispersada o transmitida a través de un cultivo microbiano (efecto Tyndall).
     Escalas o patrones de McFarland: Técnica basada en turbidimetría; La escala
    se basa en la capacidad de precipitación del Cloruro de Bario en presencia
    de Ácido Sulfúrico y su utilidad, es la poder elaborar suspensiones
    bacterianas ajustadas a un patrón y valorando su concentración; para esto, se
    toma una alícuota de la muestra de bacterias y se inocula en un tubo
    conteniendo solución salina fisiológica (0,85%). El objetivo es lograr ajustar
    una concentración de bacterias a uno de los patrones señalados en la Tabla 1
    ó determinar la concentración de una muestra.
    Imagen 1. Escala de McFarland

    Los patrones de McFarland, permiten establecer una relación entre una


    precipitación química y una suspensión de bacterias (imagen 2). Se elaboran 10
    estándares (imagen 1), y por espectrofotometría se crea una recta patrón con la cual
    se va a poder determinar la concentración de las diluciones bacterianas elaboradas.
    La información arrojada es aproximada, ya que la lectura depende de factores como
    el tamaño de la bacteria y la formación de agrupaciones.

    Imagen 2. Esquematización de los patrones de McFarland

     Recuento en placa estándar o recuento de microorganismos viables: con este


    método se puede distinguir entre células viables y no viables, esto se logra
    sembrando diluciones de las muestras que contienen los microorganismos en
    medios de cultivos solidos dispensados en cajas Petri, incubando y
    posteriormente realizando el conteo de las colonias visibles.

     Preparación de diluciones: La fracción de la muestra destinada para el


    análisis microbiológico, debe ser representativa de la población y constituida
    normalmente por 200 gramos o mililitros (esto dependiendo del análisis).
    Para la puesta en marcha, se utilizan 100 g o mL y el resto se almacena
    como reserva, por si se hace necesario repetir el recuento. Si la muestra está
    constituida por distintos componentes, se tomarán fracciones representativas
    de cada una de ellas en la superficie y en la profundidad de la misma. Para
    casi todos los análisis, se parte de una suspensión líquida de concentración
    conocida, que se denomina suspensión madre y que tiene una dilución 1:10
    (10-1). Para conseguir este factor de dilución, se mide una cantidad de
    muestra (en gramos o mililitros), y el resultante, se multiplica por 9 (nueve).
    Este nuevo resultado serán los mililitros de diluyente que se debe añadir a la
    muestra para lograr la dilución decimal. A partir de esta dilución, se
    preparan las siguientes (1:100 ó 10-2, 1:1000 ó 10 -3, etc.), hasta el factor
    requerido y establecido por el analista; recuerde que siempre se debe tener la
    precaución de cambiar la pipeta entre la realización de cada una de las
    diluciones y de mantener en frío, los tubos de la serie de diluciones, hasta el
    comienzo de los análisis, pero sin prolongar por más de dos horas esta
    refrigeración. Con la finalidad de realizar las diluciones con diferentes
    volúmenes o pesos de las muestras y obtener diferentes factores de dilución,
    se puede hacer uso de la siguiente fórmula:
    soluto
    factor de diclucion=
    solvente +soluto

    Donde, el soluto es la muestra (sólida o líquida), y el solvente es el diluyente


    utilizado. Tenga en cuenta que para el cálculo de la segunda dilución y
    posteriores, debe multiplicar el resultado por el factor de dilución, de la
    dilución inmediatamente anterior. Para la pesada de la muestra, aplique la
    técnica mencionada a continuación:
     Tarar el recipiente estéril que se vaya a utilizar para triturar la muestra.
     Introducir asépticamente, la porción de un volumen adecuado en dicho
    recipiente.
     Pesar de nuevo para determinar el peso neto de la muestra.
     Con una probeta graduada estéril, añadir la cantidad de diluyente estéril,
    para obtener la dilución deseada.
     Para el caso de muestras líquidas, utilizar pipetas de volumen adecuado y
    estériles.
    La característica principal de un buen diluyente, es que no produzca
    modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la microbiota de la muestra que
    van a ser analizada, sin suprimir ni favorecer su desarrollo. En microbiología, se
    utilizan varios diluyentes, pero habitualmente se usan los siguientes: Agua de
    Triptona con Sal, Solución de Ringer 1⁄4 y/o Agua de Peptona Tamponada. El
    diluyente utilizado para la solución madre se suele emplear posteriormente, para
    efectuar las diluciones decimales. La trituración de la muestra, es una operación
    muy importante, pues en esta se debe evitar la destrucción de los gérmenes
    presentes, ya sea por rotura de su membrana o por un calentamiento excesivo.
    Además de una trituración perfecta de la muestra, es necesario obtener una
    mezcla homogénea para lograr la distribución equilibrada de los
    microorganismos. Para la homogenización de la muestra, existen varios tipos de
    trituradores, como:
     Jarra o licuadora, que consiste en un envase de vidrio o acero provisto de
    una hélice que funciona cuando se adapta a un motor.
     Vástago, provisto de una hélice en su extremo que se introduce en la
    mezcla que se va a triturar. Funciona eléctricamente y necesita de un
    envase de vidrio acero estériles, que se adapten especialmente al vástago.
     Triturador de paletas o Stomacher, que actúa golpeando rítmicamente la
    mezcla de la muestra y diluyente, que han sido previamente introducidos
    en una bolsa de plástico estéril; los choques producidos por las paletas
    disgregan la muestra y ponen a los microorganismos en suspensión.
     Para las muestras líquidas, posterior a la realización de la dilución, se
    debe agitar suavemente de forma manual o en vórtex, con el objetivo de
    homogenizar los microorganismos en todo el diluyente.

    5. PROCEDIMIENTO

    1. monte la cámara de Neubauer en el microscopio, localice la cuadricula para


    conteo y lleve a aumento de 10x. en este momento, debe observarse
    correctamente la cuadricula y comprender la distribución y las áreas a contar.

    2. Coloque el cubreobjetos de la cámara al borde de la misma y cubra la cuadricula


    de conteo.

    3. Homogenice la muestra y con una pipeta Pasteur estéril, tome una alícuota de la
    misma permitiendo que por capilaridad la cámara absorba la muestra.

    4. Observando verifique que la distribución de las células en la cámara sea


    homogénea, de no ser así se debe realizar de nuevo el montaje de la cámara.

    5. Proceda a realizar el conteo, registre los datos obtenidos y calcule la


    concentración de células/mL.
    6. RESULTADOS

    N° Conteo A B C D E SUMA
    1  37 64  63  91  65   320
    2 50 30  60  20  30  190
    3  20 20 30  10  20  100 
    4            
    5            
    6            
    TOTAL 13220
      PROMEDIO  200.33

    13220
    0,1
    25
    528,8 52,88
    7. CUESTIONARIO
     Que es cámara de Neubauer y su fundamento: también llamada hematimetro o
    hemocitometro, es un instrumento de laboratorio que está formada por una placa
    de vidrio grueso, utilizada para realizar conteos celulares. La cual está
    constituida por 3 zonas, una central que es la usada para el recuento y dos de
    soporte las cuales están ubicadas en la parte superior e inferior.

    Imagen 3. Esquema grafico de la cámara de neubauer


    Cada uno de esos retículos son una zona pulida que contiene grabada la zona de conteo.
    Que está conformado por una superficie de 9mm2 y dividido internamente en 9 cuadros con
    1mm2 de superficie cada uno; los otros cuatro cuadros de las esquinas están divididos en 16
    cuadriculas de 0,0625mm2 de superficie.

     Qué ventajas tiene la escala de Mac Farland: esta es utilizada como patrón de
    turbidez en la preparación de suspensiones de microorganismos. El patrón 0,5
    tiene una aplicación especial en la preparación de inóculos bacterianos para la
    realización de pruebas de sensibilidad antimicrobianas.
     Cuál es la ventaja del recuento en placa en superficie: es muy eficaz ya que es
    uno de los métodos más utilizados por que permite determinar cuál es el número
    de microorganismos retenidos en la membrana se desarrollaran formando
    colonias, permitiendo su cuantificación

    8. BIBLIOGRAFÍA
    Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. CDC/NIH. U.S.
    Department of Health and Human Services, Public Health Service (4ª ed.). USA

    Organización Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio.


    Ginebra: OMS; 2005

    Mahon, Conni and Manuselis, George. 2000. Textbook of Diagnostic Microbiology.


    Second edition. W.B.Saunders Company. USA.

    Baker, F. J., y Breach, M. R. 1990. Manual de técnicas de Microbiología Médica.


    España. Editorial Acribia.

    Cowan & Steel´s. 1999. Manual for identification of medical bacteria. 3 ed.
    Cambridge: University Press,

    Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J. Brock. 2003. Biología de los


    Microorganismos. España. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10a Ed.

    Manual de medios de cultivo Merck. 1994.Editorial Merck Alemana.

    Ortega Y, Quevedo F. 1991. Control de la calidad en los laboratorios de


    microbiología sanitaria. 1 ed, México.

    OXOID. 1995. Manual. Barcelona. España. Ed UNIPATH.

    Pareja, E.I.2006. Microbiología y Biotecnología [en línea]. España: Universidad de


    Granada. Departamento de Microbiología, Instituto de Biotecnología. [consultado
    ene., 2011]. Disponible en Internet: < http://www.ugr.es/~eianez/>

    Rodríguez C. 2001. Manual de medios de cultivo. 2 ed, La Habana: BIOCEN.

    Snell JJS. Quality control in microbiology. En: Barrow GI., Feltham RKA, eds.

    The World Health Organization (WHO). 2004. Laboratory biosafety manual. 3a


    Edición. Geneva.

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