Aislamiento de Linfocitos Mediante Centrifugación

Aislamiento de linfocitos mediante centrifugación en gradiente de densidad
Introducción
Para muchas pruebas inmunológicas in vitro se requieren preparaciones purificadas o

enriquecidas de linfocitos de la sangre periférica. Algunos ejemplos son la enumeración o
recuento de linfocitos T y B por métodos manuales, las pruebas de respuesta proliferativa
hacia mitógenos en cultivo, la determinación de antígenos HLA, la respuesta al cultivo
mixto de linfocitos, y otros procedimientos de utilidad tanto en el laboratorio clínico de
rutina como en el de investigación.
Las primeras técnicas empleadas para aislar los linfocitos sanguíneos consistían en
mezclar la muestra con un agente aglutinante de eritrocitos, con el fin de que estos se
separaran debido a la sedimentación de los grumos. Sin embargo, estas técnicas son lentas,
dan un bajo rendimiento final y una baja pureza. Posteriormente se desarrollaron las
técnicas de centrifugación en gradientes. Bøyum (1958) ideó un método basado en la
centrifugación de la muestra sobre un gradiente de densidad discontinuo, cuyo medio
original consistía en una mezcla de ficoll y metrizoato de sodio, con densidad de 1,077
g/ml. Este método es rápido y simple, por lo que se utiliza muy comunmente para obtener
preparaciones enriquecidas de linfocitos sanguíneos. Aunque estrictamente esta técnica
resulta en la separación de los leucocitos mononucleares, que incluyen tanto a los
linfocitos como a los monocitos, los primeros superan ampliamente en número a los
segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre periférica.
El medio de separación
El medio de separación para purificar linfocitos sanguíneos consiste en una mezcla

de dos componentes. El ficoll 400 es un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina, de
400.000 daltons, soluble en agua. Por otra parte, el diatrizoato de sodio (que ha sustituído
al metrizoato de la fórmula original de Bøyum ) es un compuesto que, al ser mezclado con
el ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad. La función del diatrizoato es
proveer la densidad óptima para la separación y a la vez la osmolaridad adecuada para
mantener la viabilidad de las células. Además, el ficoll causa la aglutinación de los
eritrocitos, lo cual facilita aún más su sedimentación. Es recomendable que el medio de
separación se mantenga en envases protegidos de la luz, debido a la fotosensibilidad del
diatrizoato. La mezcla de ficoll-diatrizoato está disponible comercialmente, estéril y lista
para su uso, por una variedad de fabricantes (ejs. Ficoll-Paque®, Lymphoprep®, etc.).
También puede prepararse esta mezcla a partir de sus dos componentes, ajustando la
densidad final a 1,077 ± 0,001 g/ml (ver Apéndice: Reactivos).
B. Lomonte 2
Fundamento de la separación
Al estratificar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las

células mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. Como se
mencionó, el ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a través del medio y
sedimentan al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño y densidad, y
por su tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su
menor densidad, se quedan en la interfase entre el plasma y el medio (Figs.1.1 y 1.2), con
una contaminación relativamente baja de plaquetas y otros tipos celulares. Al final de la
centrifugación, los leucocitos mononucleares se recogen del anillo blanco que se forma en
la interfase entre el plasma y el ficoll-diatrizoato. Este procedimiento permite recuperar
alrededor de un 50% de los linfocitos presentes en la muestra, con una viabilidad mayor
del 90% (determinada mediante exclusión del azul tripán, ver abajo). Por ejemplo, el
fabricante del Ficoll-Paque® describe los resultados obtenidos con su medio de la siguiente
manera:
linfocitos: >90% de las células de la fracción obtenida

>90% viabilidad
50 ± 15% rendimiento (recuperación de linfocitos de la muestra)
otras células: <5% granulocitos
<10% eritrocitos
plaquetas en cantidades bajas
Los mononucleares que se obtienen por esta técnica (>90% linfocitos) deben ser
lavados con una solución balanceada de sales (SSB) o con el medio que se va a utilizar en
la prueba particular, con el fin de eliminar restos del reactivo, de plasma y de plaquetas.
Factores que afectan el procedimiento
La cantidad de sangre a procesar debe guardar proporción con el volumen y la altura
del medio de separación. Al aumentar la altura del estrato de sangre con respecto a la altura
del medio, se aumenta la contaminación con eritrocitos en la interfase. Por esto, el
diámetro del tubo es un factor importante para establecer el volumen de sangre óptimo para
fraccionar. Para aumentar el tamaño de la muestra, es preferible aumentar el diámetro del
tubo, tratando de no variar la altura de las capas de medio y de sangre.
El rendimiento y la pureza de los linfocitos dependen en gran parte de la eficiencia
en la remoción de los eritrocitos. Cuando estos son aglutinados por el ficoll, algunos
linfocitos son atrapados dentro de los grumos, y por lo tanto se pierden. Este fenómeno se
reduce diluyendo la sangre 1:2 antes de fraccionarla, usando una solución salina
balanceada, con el fin de mejorar el rendimiento final de los linfocitos.
La aglutinación de los glóbulos rojos se favorece conforme aumenta la temperatura,
con lo cual se acelera la separación, pero se disminuye el rendimiento (ej. a 37°C). En
Técnicas de Laboratorio en Inmunología Clínica 3
bajas temperaturas (4°C) se disminuye la velocidad de agregación, por lo que hay que
prolongar el tiempo de separación. Una temperatura de alrededor de 18°C da resultados
óptimos en cuanto al balance entre tiempo y rendimiento.
Procedimiento
1.Colocar 3 ml de F-D (ficoll-diatrizoato) en un tubo de 10-15 ml.
2.Diluir 2 ml de sangre (anticoagulada1

o desfibrinada) con 2 ml de solución salina
balanceada (SSB) o con solución salina amortiguada con fosfatos (PBS) pH 7,2.
3.Estratificar cuidadosamente 4 ml de la sangre diluída sobre el F-D (¡no mezclar!).
4.Centrifugar a 400 xg durante 20 min, a temperatura ambiente, en un rotor de ángulo

libre.
5.Con cuidado de no mezclar las capas, sacar el tubo de la centrífuga y aspirar el plasma
(capa superior) con una pipeta, delicadamente, dejando intacto el anillo blanquecino de
células mononucleares en la interfase.
6.Aspirar el anillo de células mononucleares, sin recoger demasiado2

plasma, ni F-D.
Depositar las células en un tubo limpio.
7.Lavar las células agregando ~8-10 ml de SSB y resuspendiendo suavemente con una
pipeta. Recuerde que está trabajando con células vivas que son sensibles a fuerzas
mecánicas, así como a la osmolaridad y todos los componentes de la solución en que se
encuentran suspendidas.
8.Centrifugar a 100 xg por 5 min. Botar el sobrenadante mediante la inversión rápida del
tubo (las células se quedan adheridas al fondo, formando un botón) y repetir el lavado.
9.Después del segundo lavado, los linfocitos pueden ser resuspendidos suavemente en el
medio apropiado que se va a utilizar para cada propósito.
10.Para comprobar el porcentaje de viabilidad celular, mezclar partes iguales de la

suspensión de células y de azul tripán, por ejemplo 100 μl + 100 μl, y cargar una cámara
de recuento (Figs. 1.3 y 1.4). Observar inmediatamente al microscopio y contar las células
viables (claras), distinguiéndolas de las dañadas (azules). Calcular la concentración de
células en la suspensión original, tomando en cuenta cualquier dilución realizada
previamente al recuento.
Referencias
Bøyum, A. (1964) Separation of white blood cells. Nature 204, 793.
Bøyum, A. (1976) Isolation of lymphocytes and macrophages. En: Lymphocytes, isolation,
fractionation and characterization, p 9. (Natvig, J.B., Perlmann, P. y Wigzell, H., Eds.) Supl.
No. 5, Scand. J. Immunol. 5, 9.
Ficoll-Paque for in vitro isolation of lymphocytes (1975). Folleto de Pharmacia Fine Chemicals
Co., Uppsala, Suecia.
Hudson, L. y Hay, F.C. (1989) Practical Immunology, 507 pp. Oxford: Blackwell Scientific
Publications.
Mishell, B.B. y Shiigi, S.M. (1980) Selected Methods in Cellular Immunology, 486 pp. San
Francisco: W.H. Freeman & Co.

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Para muchas pruebas inmunológicas in vitro se requieren preparaciones purificadas o

El medio de separación para purificar linfocitos sanguíneos consiste en una mezcla

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4.Centrifugar a 400 xg durante 20 min, a temperatura ambiente, en un rotor de ángulo

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10.Para comprobar el porcentaje de viabilidad celular, mezclar partes iguales de la

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