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    Manual de Práctica Ix - 2022-I Cal

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    CESAR AUGUSTO CHAMPI PALOMINO
    Este documento presenta un manual de prácticas sobre el reconocimiento y observación de flagelos en células procariotas. Explica la estructura y función de los flagelos bacterianos, y proporciona un procedimiento para teñir flagelos usando el método de Leifson para hacerlos visibles al microscopio óptico. El objetivo es reconocer los flagelos de diferentes bacterias móviles a través de esta técnica de tinción especializada.

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    CESAR AUGUSTO CHAMPI PALOMINO
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    Este documento presenta un manual de prácticas sobre el reconocimiento y observación de flagelos en células procariotas. Explica la estructura y función de los flagelos bacterianos, y proporciona un procedimiento para teñir flagelos usando el método de Leifson para hacerlos visibles al microscopio óptico. El objetivo es reconocer los flagelos de diferentes bacterias móviles a través de esta técnica de tinción especializada.

    Descripción original:

    biologia

    Título original

    Manual de Práctica Ix- 2022-i Cal (1)

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    Este documento presenta un manual de prácticas sobre el reconocimiento y observación de flagelos en células procariotas. Explica la estructura y función de los flagelos bacterianos, y proporciona un procedimiento para teñir flagelos usando el método de Leifson para hacerlos visibles al microscopio óptico. El objetivo es reconocer los flagelos de diferentes bacterias móviles a través de esta técnica de tinción especializada.

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    Este documento presenta un manual de prácticas sobre el reconocimiento y observación de flagelos en células procariotas. Explica la estructura y función de los flagelos bacterianos, y proporciona un procedimiento para teñir flagelos usando el método de Leifson para hacerlos visibles al microscopio óptico. El objetivo es reconocer los flagelos de diferentes bacterias móviles a través de esta técnica de tinción especializada.

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    Universidad Nacional Mayor de San Marcos

    Universidad del Perú. Decana de América

    Facultad de Farmacia y Bioquímica

    Escuela Profesional de Ciencia de los Alimentos

    Departamento Académico de Microbiología y Parasitología

    Básica y Aplicada

    MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA CELULAR

    Responsable:

    Dra. María Elena Salazar Salvatierra

    Colaboradores:

    Mg. Julio Reynaldo Ruiz Quiroz

    MSc. Edwin Hualpa Cutipa

    Mg. Jannelle Cindy Mendoza León

    D.A.M.P.B.A BIOLOGÍA CELULAR 2022 -I


    PRÁCTICA 9: RECONOCIMIENTO Y OBSERVACIÓN DE FLAGELOS
    EN CÉLULAS PROCARIOTAS
     Introducción
     Objetivos
     Materiales
     Procedimiento
     Cuestionario

    INTRODUCCIÓN
    Los flagelos son estructuras, cuyo diámetro no excede de los 30 mm, lo cual esta
    muy por debajo del poder de resolución del microscopio óptico. Para hacer
    visibles a los flagelos se requiere aumentar su grosor, para lo cual se emplea una
    suspensión de ácido tánico que al precipitarse sobre su cubierta forman una capa
    que aumenta aparentemente su diámetro. Lo que propicia que al ser
    posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposición con respecto al
    bacilo se hagan visibles al microscopista.

    Muchos microorganismos son móviles, desplazándose de un lugar a otro para


    obtener nutrientes, crecer y reproducirse.

    Muchas de las bacterias poseen esta capacidad, debido a la presencia de unos


    órganos de locomoción denominados flagelos.

    Estos son filamentos simples químicamente compuestos de una proteína conocida


    como flagelina. Tienen su origen en el protoplasma de la célula bacteriana y su
    espesor es de 0,01 micrones.

    El número y disposición de los flagelos es variable en las diferentes bacterias, pero


    generalmente es constante para cada especie. Algunas tienen solamente un
    flagelo, otras dos o más y pueden ser polares o peritricos – alrededor del cuerpo
    de la célula. (fig. 1)

    D.A.M.P.B.A BIOLOGÍA CELULAR 2022 -I


    Figura 1: Clasificación bacteriana por disposición de los flagelos

    Las bacterias flageladas cuando están suspendidas en una gota de líquido son
    activamente móviles. Sin embargo, es muy importante distinguir entre el
    movimiento real debido a los impulsos originados por los flagelos permitiendo el
    desplazamiento de la bacteria dentro del campo microscópico y el llamado
    movimiento browniano que se produce siempre que se suspenden en un líquido,
    partículas pequeñas y que presentan las bacterias inmóviles debido al bombardeo
    molecular sobre la superficie de la célula.

    Para tener una mejor idea de la ultraestructura de los flagelos, se observa en la


    figura 2 el detalle de las diferentes partes del flagelo que son: el filamento, el
    gancho y el cuerpo basal.

    D.A.M.P.B.A BIOLOGÍA CELULAR 2022 -I


    Figura 2. Estructura del flagelo

    Los flagelos pueden ser teñidos, pero debido a su diámetro tan pequeño, se
    requieren técnicas especiales.

    Los flagelos de organismos eucariotas, como algas y protozoarios, son mucho más
    gruesos y pueden observarse en preparaciones en fresco ó con tinciones simples.

    D.A.M.P.B.A BIOLOGÍA CELULAR 2022 -I


    OBJETIVOS
     Reconocer los flagelos de una bacteria

    EXPERIMENTO 1. TINCIÓN DE FLAGELOS POR EL MÉTODO DE LEIFSON


    Materiales

     Portaobjetos y cubreobjetos limpios y secos


     Cultivo joven de bacteria en caldo nutritivo o similar de las siguientes bacterias:
    o Pseudomonas aeruginosa
    o Vibrio cholerae
    o Proteus vulgaris
    o Spirilum serpens
    o Spirilum volutans
     Colorante de Leifson
     Pipetas Pasteur estériles
     Gradilla
     Asa bacteriológica
     Lápiz graso
     Mechero Bunsen
     Cerillos o encendedor
     Aceite de inmersión
     Microscopio

    Colorantes

    Colorante de Leifson

     Disolución acuosa saturada de AIK(SO4)2*12H2O o AINH4(SO4)*12H2O 20 mL


     Disolución acuosa al 20% de ácido tánico 10 mL
     Agua destilada 40 mL
     Alcohol etílico al 95% 15 mL
     Disolución saturada en alcohol etílico al 95% de fucsina básica 3 mL

    Preparación del colorante de Leifson:

    - Mezclar los ingredientes en el orden citado.

    D.A.M.P.B.A BIOLOGÍA CELULAR 2022 -I


    - Guardar en un frasco bien tapado.

    Colorante alternativo de Leifson

    Solución A:

    Fucsina básica 1.2 g

    Etanol (95%) 100 mL

    - Disolver el colorante.

    - Filtrar y tapar perfectamente para evitar la evaporación.

    Solución B:

    Acido tánico 3 g

    Agua destilada 100 .mL

    - Disolver el reactivo.

    Si la mezcla no se usa pronto adicionar fenol al 0.2% para prevenir el desarrollo de


    hongos.

    Solución C:

    Cloruro de sodio 1.5 g

    Agua destilada 100 mL

    - Disolver el reactivo.

    Esta solución es estable a temperatura ambiente.

    Preparación del colorante alternativo:

    - Mezclar cantidades iguales de las soluciones A, B YC.

    - Guardar en frasco de vidrio y mantener bien tapado.

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    NOTA:

    La solución es estable por 5 semanas a temperatura ambiente y en refrigeración


    dura varios meses.

    Colorante de contraste.

    p-rosa anilina o azul de metileno 1 g

    Agua destilada 100 mL

    Preparación:

    - Disolver el colorante en el agua.

    Requisitos a tener en cuenta

    Para que la tinción de los flagelos sea efectiva se requiere cumplir con los
    siguientes requisitos:

     Los medios de cultivo empleado para el desarrollo de las cepas deben ser
    adecuados.
     Los cultivos tienen que ser jóvenes.
     Las láminas portaobjetos y cubreobjetos deben estar escrupulosamente
    limpias sin el más mínimo vestigio de grasa.
     Las láminas a emplear deben calentarse previamente y enfriarse a la
    temperatura corporal, para que los frotis se sequen con rapidez.

    Procedimiento

    1. Hacer un círculo en un portaobjetos perfectamente limpio y seco.


    2. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces.
    3. Colocar dentro del círculo, con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensión
    bacteriana e inclinar el portaobjetos a uno y otro lado para extender la
    muestra.
    4. Fijar la preparación al aire ya que si esta operación se hace usando la flama del
    mechero se pueden destruir los flagelos.
    5. Humedecer la preparación con el colorante de Leifson y dejarla en reposo a
    temperatura ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso, o en la
    incubadora en tiempo frío.
    6. Lavar con agua corriente.

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    7. Secar y observar con objetivo de inmersión.

    Interpretación:

    Los flagelos se tiñen bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan
    flagelos extremadamente delicados.

    Videos

     Tinción de Flagelos. Disponible en:


    https://www.youtube.com/watch?v=JVCtNsmWstc
     Tinción de flagelos - Método de Leifson. Disponible en:
    https://www.youtube.com/watch?v=Pqvj3jUdlxs

    CUESTIONARIO
    1. ¿Cuál es el fundamento de la tinción alternativa de Leifson?
    2. Haga un listado de 5 bacterias móviles indicando que tipo de flagelos tienen
    según su posición.
    3. Explique e indique mediante una figura cómo es el movimiento en las
    espiroquetas.
    4. Explique la estructura de los cilios y flagelos en los eucariotas.
    5. Explique de qué forma obtienen energía para el movimiento las bacterias.

    BIBLIOGRAFÍA
    1. Castañeda M. Microbiología Aplicada Manual de Laboratorio. Azcapotzalco:
    Universidad Autónoma Metropolitana; 2004.
    2. Harley P, Prescott LM. Laboratory Exercises in Microbiology. Fifth Edition. New
    York: The McGraw−Hill Companies; 2002
    3. Madigan T, Martinko J, Bender K, Buckley D, Stahl D. Brock Biología de los
    Microorganismos. 14va Edición. Madrid: Pearson Educación; 2015.
    4. Tortora GJ, Funke BR, Case C. Microbiology : an introduction. Description:
    Thirteenth edition. Boston: Pearson Education; 2019.
    5. Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ. Prescott’s microbiology. Tenth
    edition. New York: McGraw-Hill Education; 2017.

    D.A.M.P.B.A BIOLOGÍA CELULAR 2022 -I

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