UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Perú, Decana de América

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

E.A.P. GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR

Práctica Nº6: CICLO CELULAR

Práctica Nº7: ACTIVIDAD CITOSTÁTICA
EN EL MERISTEMO RADICULAR DE Allium cepa

Horario : Miércoles de 8:00 a 10:00 (G2)

Fecha de realización de la práctica: 22 de mayo de 2019 - 29 de mayo de 2019

I. INTRODUCCIÓN

La característica principal de las células y de los organismos es la capacidad para reproducirse. El

tipo de reproducción más simple implica la división de una célula progenitora en dos células hijas,

esto lo logra duplicando primero su contenido y luego dividiéndose en dos. Esta división ocurre

como parte del ciclo celular que se puede definir como una serie ordenada de acontecimientos

macromoleculares que preparan a la célula para dividirse seguido por el proceso real de división,

denominado mitosis. El ciclo celular de las eucariotas se divide en cuatro fases principales:

 G1 = Período que sigue la mitosis y precede a la síntesis de ADN, las células sintetizan ARN

y proteínas durante esta fase.

 S = Período durante el cual ocurre la síntesis de ADN y de histonas

 G2 = Período posterior a la síntesis de ADN y precedente a la mitosis. Ocurren procesos de

reparación del ADN recién replicado y la célula prepara la maquinaria celular para la mitosis.

 M = Mitosis. Incluye las siguientes fases: profase, metafase, anafase y telofase.

Un agente citostático es cualquier sustancia química (como iones metálicos, fármacos o extractos

vegetales) que interfiere con el funcionamiento normal del ciclo celular en alguna(s) de sus fases.

Un método relativamente sencillo y de bajo costo para evaluar la actividad citostática de una

sustancia es el ensayo Allium test. Consiste en medir los índices de fases mediante un recuento de

las células en el meristemo de la raíz de cebolla sometida a un tratamiento con la sustancia.

Posteriormente se comparan los índices del ensayo con los índices de fase medidos en una cebolla

de crecimiento normal, con el fin de determinar la actividad citostática.

II. OBJETIVOS

- Identificar las distintas etapas del ciclo celular

- Determinar el índice mitótico y el índice de cada fase

- Determinar el efecto de los agentes citostáticos en el ciclo celular mediante el Allium test
III. MATERIALES

- Láminas portaobjeto y cubreobjeto - Vidrio de reloj, mechero y gotero

- Raíces de Allium cepa - Pinzas finas

- Orceína aceto-clorhídrica 2 % - Papel filtro

- Extracto de valeriana 0.5 % - Microscopio

IV. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

A. CONTEO DE CÉLULAS EN MERISTEMO DE RAIZ DE Allium cepa

Las células en el meristemo de raíz se encuentran en constante división celular y por ello son

idóneas para el análisis de cada etapa del ciclo celular:

o Las células en INTERFASE presentan la cromatina dispersa en el núcleo y los

cromosomas no están completamente diferenciados. En la interfase temprana se puede

observar claramente el nucleolo.

 o En la PROFASE la cromatina se condensa y permite observar los cromosomas

engrosados. El nucleolo ha desaparecido y la membrana nuclear se disgrega, lo que da

la apariencia de un núcleo agrandado.

o En la METAFASE los cromosomas claramente diferenciados se ubican en la zona

ecuatorial de la célula unidos al huso acromático.

o En la ANAFASE se aprecia la disyunción o separación de las cromátidas hermanas,

dirigiéndose cada una a un polo de la célula.

o En la TELOFASE, los cromosomas se dispersan y empieza la formación de los

núcleos de cada célula hija. Inicia la citocinesis con la formación de una delgada pared

celular entre las células hijas.

El conteo de células en cada etapa se realizó en tres campos con un aumento total de 400X. Los

resultados se observan en la Tabla N.º 1. Los índices se calcularon sobre el total de células

observadas en los tres campos.

Tabla N. º1: Conteo de células en meristemo de raíz de Allium cepa

CAMPO #1 CAMPO #2 CAMPO #3 TOTAL

INTERFASE 76 65 81 222

PROFASE 18 14 19 51

METAFASE 0 6 2 8

ANAFASE 1 3 2 6

TELOFASE 1 0 1 2

289

El cálculo de los índices se realizó de la manera siguiente:

ÍNDICE MITÓTICO (IM)

 Total de células en mitosis 51+8+6+ 2 67
ℑ= ×100 %= ×100 %= ×100 %
Total de células 289 289

ℑ=23.18 %

ÍNDICE DE FASES

Total de células en profase 51

 PROFASE: IP= × 100 %= ×100 %=76.12 %
Total de células en mitosis 67

Total de células en metafase 8

 METAFASE: IMe= ×100 %= × 100 %=11.94 %
Total de células en mitosis 67

Total de células en anafase 6

 ANAFASE: IA= ×100 %= × 100 %=8.86 %
Total de células en mitosis 67

Total de células en telofase 2

 TELOFASE: ¿= ×100 %= × 100 %=2.98 %
Total de células en mitosis 67

B. CONTEO DE CÉLULAS EN MERISTEMO DE RAIZ CON EXTRACTO VEGETAL

Las raíces de cebolla fueron sumergidas en un extracto de valeriana al 0.5 % durante 4h 15min.

Posteriormente, las raíces se fijaron con solución de Carnoy y se realizó el mismo proceso con

orceína aceto-clorhídrica de la experiencia anterior.

Los resultados del conteo de células se observan en la Tabla N.º 2:

Tabla N. º2: Conteo de células en meristemo de raíz de Allium cepa con extracto de valeriana

0.5%

CAMPO #1 CAMPO #2 CAMPO #3 CAMPO #4 TOTAL

INTERFASE 77 224 211 199 711

PROFASE 22 15 15 16 68

METAFASE 4 1 1 0 6

ANAFASE 0 1 1 0 2
 TELOFASE 0 2 1 0 3

790

ÍNDICE MITÓTICO (IM)

68+6+2+3 79
ℑ= ×100 %= ×100 %=10.0 %
790 790

ÍNDICE DE FASES

68
 PROFASE: IP= ×100 %=86.08 %
79

6
 METAFASE: IMe= × 100 %=7.59 %
79

2
 ANAFASE: IA= ×100 %=2.53 %
79

3
 TELOFASE: ¿= ×100 %=3.80 %
79

RESUMEN DE ÍNDICE MITÓTICO Y DE FASES

Índice Mitótico en Allium cepa Índice de Fases en Allium cepa

sin extracto de valeriana sin extracto de valeriana

8.862.98%
%
PROFASE
MITOSIS 11.9
23.18% INTERFASE 4% METAFASE
MITOSIS ANAFASE
TELOFASE

INTERFASE
76.82%

76.1
2%

Índice Mitótico en Allium cepa Índice de Fases en Allium cepa

con extracto de valeriana con extracto de valeriana
7.
5 3.80%
9 2.53%
%

MITOSIS PROFASE
10.00%
INTERFASE METAFASE
MITOSIS ANAFASE
 INTERFASE
90.00%
8
6.
0
8
%

C. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Respecto al resultado obtenido en las raíces de cebolla sin tratamiento de extracto de valeriana,

los valores del índice mitótico y de fases muestran diferencias significativas con los valores

teóricos esperados (Gonzáles, 2017): IM = 14.6 %; IP = 44.6 %; IMe = 15.4 %; IA = 9.2 % ; IT =

30.8 %. Este error puede atribuirse a errores en la observación de las distintas fases en el

microscopio, a una mala elección de muestras representativas (solo se escogieron tres campos

visuales) o a las condiciones de crecimiento de las raíces.

Sin embargo, los resultados coinciden en indicar que el índice mitótico es menor a 25 %, es decir,

que la mitosis tiene una menor duración que la interfase. Dentro de las fases de la mitosis, la

etapa con mayor índice (y por tanto, mayor duración) es la profase. Los resultados difieren para

las otras tres fases. Teóricamente la telofase es la fase con el siguiente mayor índice, pero en la

práctica fue la que presentó menor índice.

Respecto a las raíces tratadas con el extracto de valeriana 0.5%, se observa que la sustancia

estudiada disminuye significativamente el índice mitótico, lo que evidencia su actividad

citostática, quizás porque presenta en su composición alcaloides y otras sustancias similares que

han demostrado actividad citostática en otros estudios. La causa de esta disminución de las

células en mitosis puede deberse a que la sustancia interfiere con el factor promotor de la mitosis

(MPF) que promueve el paso de G2 a la profase.

 También se observa una disminución en el índice metafásico, probablemente debido a una

inhibición de un complejo ciclina-CDK encargado de promover el ensamblaje del huso

acromático y la unión a cinetocoros, o al impedimento de la disgregación de la envoltura nuclear;

todo lo cual reduce el tránsito de la profase a la metafase.

Asimismo, la disminución en el índice anafásico puede ocurrir debido a que el extracto interfiere

con el complejo promotor de la anafase (APC), lo cual produce una reducción de la actividad de

la separasa encargada de degradar las cohesinas que mantienen unidas a las cromátidas hermanas

V. CONCLUSIONES

 El tratamiento con orceína aceto-clorhídrica permite diferenciar la interfase y las fases de la

mitosis en el ciclo celular de las células meristemáticas del ápice radical de Allium cepa,

mediante la observación de la cromatina en distintos grados de condensación y disyunción.

 Los índices mitóticos y de fases sirven para estimar la proporción y duración relativa de una

etapa determinada del ciclo celular respecto al total de células en división.

 Un agente citostático afecta los mecanismo que regulan el ciclo celular, generando un

cambio en la duración y proporción de las fases y su respectivo índice. La actividad de un

agente citostático se evidencia en una variación de los índices mitóticos y de fases.

VI. CUESTIONARIO

1. ¿Están las células repartidas en forma homogénea en el preparado que Ud. ha realizado?

Explique.
No, porque la dispersión realizada con el lápiz y con el aplastamiento distribuye las células del

meristemo apical de raíz de manera heterogénea. Por esta razón, cuando se observa al

microscopio, no es común observar todas las fases en un solo campo visual, y tampoco es posible

verlas en la proporción global esperada. Ello explica porque es necesario trabajar con muestras

aleatorias de los campos visuales para hallar los índices mitótico y de fases.

2. Al comparar los índices mitóticos y de fases de sus compañeros, ¿qué conclusiones puede

obtener?

A pesar de que se trabajó con los ápices de raíces de un mismo bulbo de cebolla, sometidos a las

mismas condiciones de preparación y fijación, hubo variaciones importantes en los resultados de

los índices. Este error se puede atribuir a una mala elección de los campos (pocos o sesgados a una

fase). Sin embargo, el índice mitótico fue, en todos los resultados, menor a 40 %, lo que se explica

por su corta duración respecto a la interfase. Asimismo, también se observa que la profase es la

etapa más duradera dentro de la mitosis ( IP ≈ 80 %) y la anafase la más corta ( IA ≈ 4 % ).

3. ¿Por qué se emplea la raíz de cebolla?

Las células meristemáticas de los ápices de la raíz de la cebolla A. cepa constituyen un modelo

ideal para el estudio del ciclo celular debido a que se encuentran en equilibrio proliferativo, de esta

manera es como el número de células que se encuentran en una fase determinada es constante y

proporcional a la duración de tal fase. Además, el tamaño relativamente grande de sus

cromosomas facilita la observación de las distintas fases del ciclo celular.

 4. ¿Cuál es la fase que se halla en mayor proporción? ¿Por qué?

La fase que se presenta en mayor proporción en el ciclo celular es la interfase (76.82%) debido a

que es la etapa de mayor duración; esto significa que, al momento de realizar la fijación, la

mayoría de células estuvo en esta fase. Dentro de la mitosis, la fase más frecuente fue la profase

(76.12%), debido también a su mayor duración respecto a las otras fases de la mitosis.

5. ¿Qué fase o fases del ciclo celular han sido afectados por la sustancia evaluada?

A partir de los datos obtenidos, se observa que el extracto de valeriana produce una significativa

disminución en el índice mitótico. También hay un descenso en el índice metafásico y anafásico.

6. ¿Se podrían extrapolar los resultados obtenidos en células vegetales a una población animal?

¿Por qué?

Sí, la finalidad del Alium test es justamente determinar el efecto de una sustancia química

citotóxica sobre el ciclo celular de cualquier célula vegetal o animal. Esto es posible porque en

casi todos los organismos eucariotas ocurren similares mecanismos regulatorios del ciclo celular,

como los puntos de control del ciclo, las ciclinas y CDK, la elongación de los microtúbulos del

huso acromático, etc.

VII. FUENTES BIBLIOGRÁFICAS

 Beltrán R. & Beltrán P. (2016). Regulación del ciclo celular de Vicia faba L por el extracto

alcohólico de Annona cherimola Mill "chirimoya”. Scientia Agropecuaria, 7(SPE), 245-251.

 Gonzáles, L. (2017). Efecto bio-reparador de Piper aduncum L. en raicillas de Allium cepa

L. con aberraciones cromosómicas inducido por ciprofloxacina. SCIÉNDO, 18(2)

 Karp G (2008). Biología celular y molecular. Conceptos y experimentos. 5ª edición.

MacGraw Hill Interamericana Editores.

 Solomon E, Berg L, Martin D (2013). Biología. 9ª edición. Cencage Learning Editores,

México