DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA

MÉTODO DE CIANOMETAHEMOGLOBINA
La determinación de Hemoglobina es fundamental para el diagnóstico de una
anemia. Para ello se requiere de una metodología muy fiable y basada en las
propiedades físico- químicas de la Hemoglobina. Desde 1.967 el ICSH (Comité
Internacional para la Estandarización en Hematología) y el NCCLS (Comité
Nacional para la elaboración de Patrones de Laboratorio Clínico) recomiendan
emplear el método colorimétrico de la cianometahemoglobina. Este es el
método más adecuado para la determinación de hemoglobina, porque permite
valorar todas sus formas, como: hemoglobina, oxihemoglobina,
carboxihemoglobina y metahemoglobina.
Solo la sulfahemoglobina no es evaluada, la cual se encuentra muy rara vez en
cantidades significativas.

Fundamento:
La hemoglobina es trasformada en metahemoglobina por acción del
ferricianuro de potasio la cual se combina con el cianuro para formar
cianometahemoglobina, un compuesto de color estable que se compara
fotocolorimétricamente con soluciones patrones.
La transformación de la hemoglobina a cianometahemoglobina tiene lugar
según el siguiente proceso:
1- Hemoglobina + Ferricianuro de potasio: Metahemoglobina.
2- Metahemoglobina + Cianuro de potasio: Cianometahemoglobina
La máxima transformación de hemoglobina a cianometahemoglobina se realiza
en 10 minutos y el color es estable.

Materiales y Reactivos:
Pipetas de 5 ml.
Tubos de ensayo de 13 x 100
Pipeta de Sahli (pipetas capilares de 20 l ó 0,02 ml de capacidad) ó pipeta
automática de 20 l (0,02 ml)
Tubos para la lectura colorimétrica.
 Solución de Drabkin
Patrón de referencia: Son patrones estándar de cianometahemoglobina, se
consiguen comercialmente y su concentración viene expresada en g/dl, (Ej.:
14 g/dl)
Solución de Drabkin:
Bicarbonato de Sodio (Na HCO3)................... 1,0 g.
Cianuro de Potasio (KCN)............................. 0,05 g.
Ferricianuro de Potasio (K3Fe (CN) 6)........... 0,20 g.
Agua destilada c. s. p. . . . . . . . . . . . . .1000 ml.
La solución es de color amarillo pálido y transparente, debe mantenerse en
frasco ámbar y preferiblemente en nevera. Si se vuelve turbia debe
descartarse.
El Cianuro de Potasio es tóxico y aunque la concentración en la solución es
insignificante, la sal debe ser manejada por personal responsable.
Si accidentalmente se esparcen pequeñas cantidades de los compuestos
con cianuro durante el proceso de pesada, debe limpiarse el polvo, primero
con un paño seco y luego con uno húmedo.
Debe evitarse descartar las soluciones o polvo de cianuro en lavadores donde
se botan ácidos, ya que al reaccionar con éstos se forman vapores de ácido
hidrociánico cuya aspiración es tóxica.

Procedimiento:
Puede emplearse sangre capilar o sangre venosa con EDTA o con
heparina.
a) Marcar dos tubos: “D” (desconocido) y “B” (blanco) y colocar en cada
uno 5 ml. de reactivo de Drabkin.
b) Medir con la pipeta de Sahli 20 l (0,02 ml) de sangre, mezclada
previamente por inversión para homogeneizarla. La sangre debe llegar
exactamente a la marca de enrase de la pipeta (Sahli), si se pasa
ligeramente, se puede ajustar tocando la punta de la pipeta con una
gasa. Nunca se debe pasar más de 1 mm por encima del enrase, ya
que aunque se limpia el exceso, siempre queda sangre adherida a las
paredes, aumentando la concentración de la solución.
 Una vez enrasada la pipeta, se limpia la sangre del exterior de la misma,
sin tocar la sangre ya enrasada. Se lleva la pipeta al fondo del tubo
marcado “D” y se sopla, enjuagándola unas tres veces en el reactivo,
homogenizar la solución bien sea con ayuda de la pipeta o por inversión
del tubo tapándolo con un papel parafilm. Si se utiliza una pipeta
automática para medir la muestra en primer lugar se debe graduar
correctamente en el volumen a medir (20 l ó 0,02 ml), colocar punta
amarilla, medir la sangre previamente mezclada, limpiar el exterior de la
punta con gasa seca evitando absorber con ésta la muestra medida,
agregar la sangre al tubo con el reactivo y enjuagar la punta varias veces
con el reactivo, finalmente tapar tubo con parafilm y mezclar por
inversión.
c) Esperar por lo menos 10 minutos antes de efectuar la lectura para que
se forme la cianometahemoglobina.
d) Transferir la mezcla a un tubo de fotometría al igual que el blanco (“B”).
e) Hacer la lectura colorimétrica a una longitud de onda de 540 nm
ajustando previamente el cero con el blanco (blanco reactivo).
f) La lectura se multiplica por el factor de calibración o se lleva a una
curva de calibración obteniéndose los resultados, que se expresan en
gr/dl.

Valores Normales:
Los valores normales adoptados por la Organización Mundial de la Salud son:
Hombres: 13 g/dl con un rango de 13 a 18 g/dl

Mujeres: 12 g/dl con un rango de 12 a 16 g/dl.

Mujeres embarazadas: 11 g/dl con un rango de 9 a 12 g/dl
Niños de 6 meses a 6 años: ....................... 11 g/dl
Niños de 6 a 14 años:................................. 12 g/dl
Sangre del cordón: 16.5 g/dl con un rango entre 13.6 a 19.6 g/dl.

Al segundo o tercer día de nacido la hemoglobina comienza a descender hasta

llegar a las cifras señaladas anteriormente.
Causas de error en la determinación:
1) Errores al tomar la muestra
a) Sangre capilar:
El no tener un flujo libre de sangre, pues si se hace demasiada
presión se liberan líquidos tisulares que diluyen la sangre.
Presencia de coágulos dentro de la pipeta, si el enrase no se hace
con rapidez.
Presencia de burbujas de aire al enrasar la pipeta.
b) Sangre venosa:
Mezcla inadecuada de la sangre.
Aglutinación o coagulación de la sangre por tardanza en mezclar
con el anticoagulante.
Hemólisis de la sangre.
Empleo de anticoagulantes no recomendados.
2) Errores inherentes a las características peculiares de la muestra:
Sangres lipémicas que pueden dar valores de hemoglobina mayores al
real, este resultado puede corregirse si se agregan 0,02 ml de plasma
del paciente a 5 ml del reactivo de cianometahemoglobina y se usa esta
solución como blanco del reactivo.
Un recuento leucocitario alto (mayor de 50 x 109 /L), puede causar
turbidez y un resultado elevado falso. En este caso puede centrifugarse
la solución y medirse la absorbancia del sobrenadante.

2) Errores técnicos:
a) Pipetas sucias y/o mojadas.
b) Mal enrase de la pipeta de Sahli
c) El uso de pipetas automáticas mal calibradas.
d) No limpiar el exceso de la sangre en el exterior de la punta.
e) Deben descartarse las pipetas con las puntas rotas, pues esto
disminuye el volumen a medir.
f) Uso de los tubos para colorimetría sucios o rayados.
g) El reactivo de Drabkin no debe utilizarse si no se conserva de color
amarillo pálido. La exposición prolongada a la luz lo decolora.
 h) Si el reactivo de Drabkin se conserva en nevera, hay que dejar que
tome la temperatura ambiente antes de medirlo.
i) Las lecturas deben realizarse esperando el tiempo necesario para que
se desarrolle completamente el color.
j) El fotocolorímetro o espectrofotómetro debe calentarse alrededor de 10
minutos antes de efectuar la lectura.

Variaciones Fisiológicas:
En el recién nacido los valores de hemoglobina son más elevados que en
cualquier otro período de la vida.
En las mujeres, los valores son más bajos que en el hombre después de la
pubertad, debido a factores hormonales y la pérdida de sangre por la
menstruación.
La actividad muscular eleva los niveles de la hemoglobina por estimulación
de la eritropoyesis.
En el embarazo hay disminución de la hemoglobina (anemia hipocrómica).
La exposición a bajas presiones atmosféricas, como ocurre en las grandes
alturas, se acompaña de aumento en los niveles de hemoglobina.
En personas que fuman, los valores están elevados.

Variaciones Patológicas:
Valores disminuidos en casos de anemia. Esta puede ser definida como
reducción de la hemoglobina circulante, ella ocurre siempre que hay
trastornos en el equilibro hematopoyético y cuando la pérdida de
hemoglobina o glóbulos rojos de la circulación, excede a la producción. La
reducción de ambos valores es generalmente pareja, pero a veces hay
disminución más marcada de la cifra hemoglobina: es el caso de las
anemias hipocrómicas, como la que ocurre por deficiencia de hierro, la
cual es común en la infancia y en el embarazo. La causa más frecuente de
este tipo de anemia, tanto en el hombre como en la mujer, es la pérdida
crónica de sangre.
En el varón adulto la anemia por deficiencia de hierro es casi
siempre el resultado de la pérdida crónica de sangre por el tracto
 gastrointestinal: úlcera esofágica, gástrica o duodenal; lesiones benignas
y malignas del estómago, del intestino delgado o del colon, hemorroides,
etc.
La pérdida de pequeñas cantidades de sangre en menstruaciones
normales, puede producir severa anemia en mujeres con bajas reservas de
hierro.
La causa menos común de deficiencia de hierro es el trastorno en su
absorción. Se observa en pacientes con:
- gastrectomía parcial
- gastrectomía total, si sobreviven algún tiempo.
- diarreas severas prolongadas
- síndromes de mala absorción.

Valores aumentados pueden observarse en los casos de policitemia.

BIBLIOGRAFÍA

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Sanguínea. U.C.V. Caracas, 1986

va
2.- Wintrobe M.M. Clinical Hematology. 8 . Edición norteamericana. Lea &
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3.- Vives Joan LL. (2.001). Manual de técnicas de Laboratorio en

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