JRoabrea Brinesto P a v s i r 'forren

Hotrfaular 78214750
4 Carrera: i n g e n i e r í a Bioquímioa i r d u a t f i e i
Area d e concsntr8ci6ni BiOteOnOlQgfE
Lugar donde se l i e d a oabor L a b o r a t o r i o 8-157 de l a
UU- I
Fecha d e i n i o i o : lo. de Agosto de lgül
/Peeha de t e w i n a c i d n : 26 de Ootubre de 19%
J Nombre & e l tutor: W. en C . S e r g i o Re-vah #. Profesor
Titular d e l Departmanto de in-
g s n í e r f a y Procesos H i d r i u i i c o a de
l a UN-I
<f t u l o : P3R!MiNTACION SOLIDA DEL L LRIO ACUHTICO

a
 ..

I N D I C E P69,
I 1NTW)DUCCION. 3

I1 AmEcEDENTEs. 9

I11 OBJETIVOS. 13
r
IV -DOS AMILITICOS. 14

1.- Detenninación de proteina.

2.- Deteminaci6n de actividad c e l u i o l í t i c a .

3.- Deteiminacián de azdcares reductores.

V METODOS EXPERIMENTALES. 18

1.- Aislamiento de los hongos.

1.1 kedios de cultivo.

1.2 Aislamiento

2.- Mantexiimiento de l a s cepas.

3.- Estudios comparativos de l a s cepas aisladas y x.

viride.
- .
4.- Fermentaciones en medio lfqüido.

4.1 Medios de cultivo.

4.2 Cinética de producci6n de p r o t e h a y de a c t i

viciad c e l u l o l f t i c a .

4.3 Efecto de l a esterilizaci6n y e l pH sobre e l

crecimiento de X.viride,
r;
5.- Fermentaciones en medio sólido.

5.1 Medios de cultivo.

5.2 Equipo.

...
 5.3 Preparación del inoculo.

5.4 Medicibn de 0 0 2 6

5.5 Tratamiento de l a muestra.

5.6 Efecto de l a humedad del medio de cultivo #o-

--
b r e e l crecimiento de T.viride en l i r i o a d -
tico. i
.

5.7 Efecto de l a relación C:N y del tipo de inocg

lo sobre e l crecimiento de 2.viride en l i r i o
acuático.

VI RESULTADOS Y DISCUSIONES. 28

- VI1 .
C O N C L U S I O ~ S' 43

c
VI11 BIBLIOGRAFIA. 44
W
* * * * * * * * * *

' h

*-

r- 1

L
CL
P

-
 3.
. . ...
. .. . ...
I H T R O D U C C I O N

E l l i r i o acuático (Eicñornia crassiDi,& conocido tam-

b i b como l i r i o de agua, jacinto, huachinango y cucharilla,

-,una planta acuática que debido a su acelerado crecimiento a

y resistencia a l o s métodos de exterminio usados, representa

un grave problema en l a s vlaa pluviales donde crece!’Obstrg

ye l a navegación, remeacion y generacidn de energía hidro-

eléctrica, aumenta en 1 . 5 veces l a evaporation de los lagos

L

debido a l a traspiraci6n de l a plaata.

E l l i r i o acudtico es un factor blótico que reduce Ea tea

si6n de oxígeno-para l a vida subacu&ica, limita l a insala-

ci6n a unos cuantos milímetros de l a superficie del agua, -

Y
impidiendo a s í l a microoxigenaci6n del agua, propiciada por

los organismos fotosintéticos.

c Las técnicas empleadas para e l control d e l l i r i o acudtL .

-
*_

co en nuestro pais incluyen el uso de peces y patos, cuya

?-

I
alimentaci6n consiste de esta planta: esta técnica. y e l -
r control con productos quknicos han resultado inefectivas y
L_

1 nocivas, ya que los pebticidas no son selectivos: y otras -

P

L- formas de vLda qua,no tienen l a a l t a productividad d e l li-

r-
r i o pueden desaparecer antes que éste.

En caso de que e l l i r i o fuera destruido en grandes caa

r-
tidades, dejaría une gran camtidad de nutrientes y de - Is
,.

. ..
. . . .

materia org6nica que daría lugar a que otra planta companri=

r a l a productividad neta d e l sistema. Por otra parte, si=

p r e &=&ría algo de l i r i o vivo, y ee ha dcmomtrado que con

solo 30 g de l i r i o s e pueden producir hasta 106 toneladas de

l i r i o seco en un año.

De los métodos empleados en l a recolección d e l l i r i o -

acuático, e l m á s eficiente ha resultado ser e l arrastre de

esta planta h a c i a - l a o r i l l a de ríos, lagos y presas empiean

do cosechadoras mecánicas, sin embargo, debido a l o costoso

de este procedi&iento no s e cuenta con e l n h r o de m&qui-

nas necesarias para controlar l a proliferación de esta plan

t a , y además implicaría costos de recolección muy elevados,

ya que e l producto s e r í a tan solo l a recolecci6n de l a plaz

ta.
.
Sin embargo, en cierto sentido e l l i r i o acuático const& .di
v
tnya un cultivo gratuito de g r m valor potencial, ~;n c u l t i -

vo altamente productivo que no necesita mano de obra, ferti

d
F
i

lizante o temporada de cosecha. Por todo lo anterior se -

r
plantean diferentes. axterna'tivas para l a utilización d e l l i

r i b acuático, con e l f i n de erradicar los graves problemas

de contaminación provocados por e l acelerado crecimiento de

..
 Fr
B
5.

esta planta, as$ ronri para e l aprovechamiento de eete racua

so potencialmente valioclo. -
mere l a s alternativas para su utilización figuran l a

p d u c c i b n de campoetas, producción de p m t e h UniCelUiar,

extracción de p r o t e h a (ya que tiene e l 23.4% de prote* -

16
bruta en peso seco), obtencien por fermentaci6n de algunos

productos d e l metabolismo de los microorganisms íenzimas,

biogas, etanol, e t c . ) . De igual manera, en este trabajo se

planbea l a fermentación d l i d a del l i r i o acuático como una

soiucidn rentable a los graves problemas de e~ntamiiación

Y
ocasionados por e$ crecimiento desproporcionado de esta -
- planiza, ya que con.este tipo de f~rmentacidnse podría ob-

tener alimento ganadero de buena digestibilidad y con una -

elevada ooncentracián de proteína de buena calidad.

ES importante considerar l a s ventajas y desventajas -

que ofrecen 10s procesos de fermentacidn s6lida sobre las

femnantaciones oonveacionados en mdio liquido .

E l témino "fermentación sólida" ha sido aplicado a -
diferentes tipos de procesos, por l o que su significado se

ha hecho dudoao. E l significado exacto de este término se

r e f i e r d a i crecimiento microorgarrismos en material- sa

...
 a

li&e s i n presencia de liquido libre. Ya que l a humedad en

l a fennentación s6lida es necesaria, €eta ae encuentra ab-

sorbida en e l substrat0 &lido. La fonwmtación solida no

se refiere a l a fennantacibn de subatrafoii a0iidos en me-

dios llcfufdos, n i a líquidos cop altoa nivelea de sblidos

4
i,nexaublaa.

?&cistennmerosas ventajas en loa procesos de fermenta

ci$n s6lida tanto en laboratorio como a nivel industcial:

1.- Debido a l a naturaleza del substrat0 hay que ad&

ciorar muy pocas cantidades de nutrientes.

2.- Debido a que no hay agua l i b r e , e l volumen de me-

dio por -amo de substrato es drfisticamer.?e re&-

cido, esto trae como consecuencia las siguientes

ventajas :

- El espacio ocupada por e l equipo de fermentaci6n

requerido es pequeño en relación a l rendimiento

del producto, ya que se usa menos agua y el pro

ducto está mds concentrado. La aapplejidad del

equipo 110 es mayor que l a del equipo empieads -

en fermentaciones convencionales.

- No hay enomes cantidades de líquido de deseoho.

k
...
 7.

- ñu muchos casos no es necesario filtrar, ya que

e l product@ se ancuentra concentrado en e l suba

trato y p u d e ser usado directirmants.

- En caso de ser necesario e x t r a e e l producto del
sub4trato se requerirá usax mucho menor cantidad

solvente que en e l caso de l a s fermentadones

en medio liquido.

- E l &ea d% almacenamiento d e l producto deepu6s -

O
de l a f-tacián s e v e g r a n w t e reducida.
.

3 . - Ya que l a mayoría de las bacterias requieren altos

niveles de humedad para sobrevivir. l a fennentaci6n

sdlida excluye considerablemente e l problema de lu

contaminaci6n bacterial, por lo que. l a mayoría de

estos procesos no requieren de esteriiizacián.

4.- La aereaci6n se logra f a c i h e n t e debido a los ecpg

cios existentes entre l a s particulas del substrato,

c
par LO qye xi0 es necesario tener una agitacibn cons
L

tante.

5.- Las condiciones en l a s cuales crece e l hongo son - %

muy paecidas. a las de su habitat n e u r a l .

Sin embargo existen ciertas desventajas que no de-

pqgk s~ pasadas pox altos

...
a) En una ogeraci6n a gran escala, e l calor.-
. 0.

nerado por l a respiración del microorgania- ’ E

Ii
nm debe ser ranovido, esto puede irex nibs d i

f í c i l en fenmmtaciones sólidas que en far-

mentacionea en medio líquia0.

b) Con la tecnología actual, l a transfatencia -

de masa i n t e r p a r t h a l a es d i f í c i l de contro-

l a r durante l a fennentacián, por i o qua en -

fermentaciones sdlidas l a etapa limitante -
es l a transferencia de y.asa.

c?j La rn&$da de niveles de humedad, pH, oxíge-

M. didxido de carbono, etc. y rendktiento

del producto son mbs d i f í c i l e s de lograr en

fermentaciones sólidas.

* * * * *

,
 Loa procegoe de fennentacionae ~ O l i d a ahan sido wados'

desde hace varios miles de años. En e l libip de Chau-hi -

b o de los 13 cldsiaO8 de Confucio) escrito8 antes de año -

1000 a . de C . uno Quede ver como para prepaxar l a comida del

rey usaban 2 0 jarras de pulpa de soya para los r i t o s ceremo

1

niales de l a dinastfa Chau, Cia primera etapa en l a prepara

cidn de l a pulpa de soya es l a fermentación s6lida de arroz

1
8

cocido). Por e l a.?o 500 a . de C . los chinos haclari Chiartg,

Y

de forma muy parecida a l Miso, e l cual es un proddcto obte

9
nido por fermentaci6n cblida.

de los productos que se .obtienen 'por fermenta-'

i.,
i*,

ción sólida en l a actualidad en e l Oriente son: Koji,' e3 cual

es bdsicantente un preparado enzimático creciendo &Deruillus

. . i

,I ---ae
c L- en arroz cocido u otros cerealis; e l liana.
.~ :.,

7.i'

un Ijrodu~ctoobtMia0 a p a r t i r de l a soya y es llamado Tu Su ..., 1

$
. I:
por los chinos y Tau S i por los f i l i p i n o s , 6 s t e . e s usado c~

m saborizante. E l T+eh es un alimento indonesio obteni-. .. . . ,. I

ha*a
&.de l a fermt?ntac,i6nde l a saya con Rhizorius olisospourus
g
por 24 horas. E l Sufu o queso chino es otro producto fermen $!
ia,
y
tad0 de l a soya y es amplianente ccnsmido en China, su prc-
"
 10.

ducción data de antes de l a dinastía Ching.

En l a actualidad han sido publicados numerosos trabajos

relacionados con l a s fermentaciones sólidas y con l a produc-

wL€&ll
v t%
ción de enzimas celulolíticas. En 1977 s e hizo un trabajo -
con e l cual aumentan l a concentración de proteína de l a alfa&
t
f a fermentándola con Chaetomium cellulolvticum. Se describe

un nuevo método para e l crecimiento de Aspergillus niger en

w
harina de yuca en estado sólido: a l igual que los anteriores,

los siguientes autores son solo unos cuantos de una gran lis
t a de personas interesadas en los procesos de fermentación -
sólida y en e l aprovechamiento de desperdicios agrícolas y -

de deshechos de naturaleza ceiuiósica. Algunos autores men-

cionan diferentes procedimientos para incrementar l a produc-

%
ción de enzimas celulolíticas. Se describe un proceso para
Y
l a producción de Tempeh. Igualmente se han hecho estudios

para optimizar l a productividad de enzimas celulolíticas a-

dicionando diferentes fuentes de nitrógeno a l medio de cul-

*
tivo.

En cultivos donde los microorganismos utilizan un subs-

trato sólido, los procesos para l a degradación del subatrato

pueden ser de dos formas en cuanto a l a relación célula - f

 11.. -
en contacto directo con l a s partículas de substrato, por 10

tanto, unicamente tienen enzimas extracelulares que se d i f q

den en e l medio, degradando e l substrato, y los productos sg

lubles son finalmente metabolizados por l a célula.

Entre los microorganismos celulolíticos podemos encon-

t r a r ambos tipos de mecanismos. En Thermoactvnomvces las

celulasas están ligadas a l a célula, por l o que e l rompi-

miento de l a celulosa se l l e v a a cabo siempre y cuando l a c&

l u l a y e l substrato estén en contacto; por otro lado, se re-

porta un experimento con Svorotrichw wkerulentum em e3:

cual l a s células y l a celulosa están totalmente separadas -
por una membrana de nylon, y vieron que l a tasa de crecimien

t o d e l microorganismo no s e vi6 afectada por l a presencia de

esta membrana, l o cual indica que e l rompimiento de l a celu-

e
losa €u6 llevado a cabo por enzimas extracelulares.

E l homgo Trichoderma Vi&& es conocido como un gran -

productor de enzimas ceiuioiíticas extracelulares, s i n embax

go un examen microsc6pico de un cultivo de T. v j r i a e e r e c i w

en celulosa, muestra que l a s partículas de miceiio y e l sub&

trato están en contacto durante l a degradación. Se reporta

un experimento con T. viride en e l cual hacen notar que ea

. ..
I -
12. -
1 -
i
ir-
a
t e microorganismo es un gran productor de celulasas extracs

lulares, sin embargo, l a formación de celulasas no se l l e v a

a cabo a menos que l a c6iuia esté en contacto con l a s p a r t i

2
culas de substrato.

******

I- C

c
 13.

'O B J E T I V O S

Las principales opciones para l a utilización bioldgica

del l i r i o acuático por fennentaci6n son l a producci6n de a

zimas, de proteína unicelular, de biogas, composleo y ensila

dos. En este trabajo se pretende hacer un análisis d e l efeg

t o de algunos pardmetros físicos, qu!Únicos y biológicos (hu-

medad, temperatura, pH, composicidn del medio de cultivo, n=

turaleza del in6cul0, etc.) en l a produckividad de eneahae -

celulollticas y protehas empleando celulosa Avicel y papel

f i l t r o como fuentes de carbono y l i r i o acugtico COBK) princi-

pal fuente de nutrientes, utilizando un hongo c e l u l o l í t i c o -

en condiciones de cultivo sólido.

*******
r- 14.
I

c
ME1coms ANAL!I T I C O S
L

c
1.- Dett-adones de p r o t e h .
..
Se hicieron por loa m&o&a de Iowry y Biutcrt.15
c

1.8. MBtoao de roWry (modifica&).

Reactivos :

(1) NaOH lM.

(2) Na2C03 2%.

(3) CuSü4,.5H$ 0.125% en Sal Rocheiie (0.25%).

r-
(4) Mezcla de (2) y (3) en una proporción 5012
Y
I
preparados e l d í a de l a determinación.

(5) Reactivo Folin - Ciucalteu (fenol).

Procedimiento:

A 1.0-mi üB suspensión de células (100-400 g (peso 1"

seco/ml)) adicionar 1 mi de NaOH lM y calentar l o s

tubos a bailo maría durante 15 minutos, enfriar y 3 I

dicionar 4 m l del reactivo ( 4 ) e incubar 30 minutos

en oscuriühd a temperatura ambiente.

I

L. Adicionar 1 m l del reactivo ( 5 ) e incubar 30 minu-

F
tos en oscuridad a temperatura ambiente. Medir ad
L_

sorbancia a 750 nm contra un reactivo blanco.

c

c
...
h

._
 i

1.b MdtoaO de Biuret. ..

L
Reactivos:
. .
1
1

(1) Nao" lM .
(2) CuS04 2.5% w/v .
(3) Caaeina, 20 mg/ml en NaOH 5 mM.

Procedimiento:
c
Resuspender una concentración de calulas mayor a -
I

10 mg/ml en NaOH Ud, calentar a ebullici6n en b a o

maría durante 15 min . Enfriar y adicionar un vo-

I
!
?

lumen i g u a l de CuC04 2 . 5 % y mezclar fuertemente.

Y 1

Después de 5 minutos centrifugar y leer absorban-

P

L c i a 550 nm contra un blanco: comparar con los es-

i
P

tdndares de proteína que ha sido calentada en Sic2

c

L
li de l a misma forma que l a s pruebas.
.
2.- Actividad c e l u l o l í t i c a .
. i
A 5 m l de una solucidn de citratps 0 . 0 5 K pil 5 "con ce-
lulosa A v i o e l 1-3% s e l e adiciona 1 m l de l a s u m -

sidn de enzimas. La suspensión obtenida se divide en

dos partes iguales una de l a s cuales se incuba a 5OoC

... durante 1 hr l a otra parte s e refrigera durante 1 hr.

c
Se hace e l análisis de azúcares reductores por e l &todo
2 -

1-

C.

+ .-
f-
- 16.
.
c

d e l ácido 3-5 d i n i t r o s a l i c f l i c o y l a diferencia de aeGc=

7
L

.
c
rea.entre.ainbas
. . muestras corresponderá a los azúcares -

$1,
producidos por l a actividad e n z i d t i c a .
. .

En e l caso de l a s fermentaciones líquidas la actividad

:bi
ccilulolltica se reporta como Unidades (U) que equivalen ?

1
a holes de glucosa producidos por minuto a 50°C y pa

r a l a s fermentaciones en medio sólido l a actividad e e l s

1

l o l f t i c a se reporta como Unidades de Actividad .(üñ) -

que equivalen it g d e gluaosa producidos en una hora

c
a 5OoC. cc
L
V

t- 3.- Determinación de azGcares reductores.- Se hizo por e l

I2
método del &ido 3-5 dinitrosalicflico.. -
r
- ReactivOs:
r-
(1) Acido 3-5 dinitrosalicílico 1%.
L

P
(2) Fenol 0.2%.

& ( 3 ) B i s u l f i t o de Sodio 0.05%.

(4) NaOH 1%.

L

r ( 5 ) Sal Rochelle 40%. h

prepmaci6n de los reactivos.

&

.-. ( 6 ) Se mezclan l o s reactivoa s6lidos a excepción de l a

r s a l Rochelle en un matraz y se adiciona l a sosa.

L

c
 17.

Procedimiento:

A 3 m l de mumtra se l e adicionan 3 m l del reactivo ( 6 )

y ne pone en baño marfa durante 5 minutos, inmadiatamq

te dsepu6s se adiciona 1 m l d e l reactivo (5) y aa enfría

con agua corriente, leer absorbancia a 575 r m ~contra un

blanco.

******

.
 f.- Aislamiento de los hongos. , * , -
,
1.1 Medios de ,cultivo.
.
1.i.a. L i r i o acuático (S0-8os6 humedad).
. TABLA I 1.l.b.
._
%Ween 80 l g
I Celulosa avicel 10 9
I
m
Extracto de levadura 0.5 g
.-
=%Po4 2.0 g

.- (=4)2 so4 1.4. g

- -
Urea 0.3 g
 ..
1.2 Aislamiento:

fueron incubadas a temperatura ambiente -

_-
hailta l a aparición de colonias de hongos,

las cuales fueron aisladas posteriormente

"I- utilizan& e l medio 1.1-b.

%-

1.2 b Cajas p e t r i conteniendo e l medio 1.l.b -

fueron inoculadas con porciones de suelo

y con material vegetal en descomposici6n

e incubadas a temperatura ambiente haat

-.- 9 l a aparición de colonias de hongos, las -
cuales fueron aisladas empleando e l m i
L

2.- Mantenimiento de cepas:

s e utilizaron tubos inciinados conteniendo agar de -

papa'- dextrosa.

petri conteniendo el medio de cult

ceiulosa Avicel
 : . ',

I'

. --*...
.,, ~3-2. Determinaciones de producción de proteina y: de a c t i v i
I
-I*- ' . dad c e i u i o l í t i c a .

La fermentación se l l e v ó a cabo en matraces agitados

..
conteniendo 50 m l del medio de cultivo 1.l.b. con ca

lulosa Avicel y papel f i l t r o como fuentes de carbono.

La temperatura se control6 durante l a fennktación a

- 3OoC. E l pH i n i c i a l se ajustó a 5. Al
7
i- fementación e l contenido de los matrac
- ,
neiz6 mecánicamente y se centrifug6 a 5000 rpm dura0

.- minutos. Se hicieron aildl

I-.

geneizado por e l método de Lowry y en e l sedk

.-
- Grito
I
por e l método de Biuret, de actividad celu-

I,- l í t i c a en e l homogeneizado y
*-

diendo los aeficares reductores & del ADNS.

.-
4.- Fermentaciones en medio líquido
-- 4.1. Medios de cultivo.- Aparte del m e d i o 1.l.b. se u t i l i
c

L
los siguientes medios:
 4.2. Cin€tica de producción de. proteína y de actividad

ceiuioiítica .
La fementacidn se 1 1 4 a cabo en matraces a g i t s
-1

a dos conteniendo 75 ml d e l medio de cul

s
I
-- con celulosa Avicel como fuente de carbono; La

,T- temperatura se control6 durante l a fermentación a

"
-
3OoC. y e l pH i n i c i a l se ajust6 a 5.
p.x
I
-
4.3. Efecto de l a estariiizaci6n y e l pE sobre e l c r e c i
-3- . miento de las bacterias presentes el lirio
c

3.
u=,
c
~a fenuentaci6n se iiev6 a cabo en matraces a g i t q
+7 - dos conteniendo 100 ml d e l medio de cultivo 4.1.a.
-,

J La temperatura se control6 durante fe-tación

F
a 3OOC. y e l pH s e a j w t 6 a 3 . Se hicieron 4 tr
3
c
tamientos diferentes a los medios de cultivo:

2 ESTE~ILIZACXON - p R
c
TABLA I11 (12OOC. 30 min.) (

I 3
If 1
P 11 1
I
ív O

DespueS de esterilizados
i
c . 1 W ) , s e inocularon con

-rf
r

4
- ...
t
 22.

__ 4.4. Efecto de l a relación C:N sobre e l crecimiento de

>.
n1

T virj.de.
... -0

.-* La fermentación se 11-6 a cabo en matraces agita-

dos conteniendo 450 m l de los medios de cultivo -

I-
4.l.b, 4.l.c, 4.1.6 y 4.1.e. La temperatura cre

control6 durante l a fermentación a 3 0 V . y e l pH

C
cre ajusto a 3.5 cada 24 horas.

-ués de esterilizados los matra con l o s me-

dios de cultivo se inocularon %on

p a i 6 n de esporas de 2. v i r i d e que contenfa 8.5

”I
i-
i
L
a?Lp*5 eap/ml. . ..

Fermentaciones en medio solido.

.-I TABLAIV 5.1. dios de cultivo (en dit).
I
I
c

4
- i --
NEDID LIRIO CELWSA
AVICEL
(m4)2c04

a 5.i.a 5.76 -- 1.28

- 5.1.b
5.l.c
5.32
2.21
1.83
0.61
0.24
0.10
.10.134
10.93
’
”
i
cJ
5.l.d
5,l.e
6.0
2.8
- 9
9
5.1.f 2.2 9 da5
+. 5,l.g 6 6
+i 5.1-h. 6 9
5.l.i 6 14
4 . 22
-1
*

i
-I
...
I
ci’

4
*i I .
 24,

L U

i_.

J-
con e l sustrato inoculado fueron.monta*s en un e-
*_
guipo (pis. 2) que cuenta con los sigaientes adits
"I.

c
maltos :
I

a) Bomba de aire.

b) F i l t r o de aire.

c) Válvula de caída de presión.

d) P r e h d d i f i c a d o r con NaüH fM.

a) ManbFaetm.
f
.. f ) Válvulas de distribuci6n y control de a i r e . E
g) Humidificador -
Y
h) Fennentador.
?J-
h
--L- i) Absorbedor de CO2-

-- j) muipo de temperatura constante

-L

,
P-
k) Controlador de pH.
'
ri 1) Rotamatro: -
A-
c
* I 5.3. Preparacidn del indculo.

5.3.a. 8uspansi6n de esporarr.

En matraces Erlempeyer cont

papa-dextrosa s e inoculaban con espora8

2. viride y se incubaban a temperatura

iente basta tener una

amporas, l a s cuales s e suependian

BT
-
rar

d V
Y
&T
 .. ,.. . i

. 3
L
ic" /1
i
.A-. üestilada con un tensoactivo, se filtraban
..<I

L y posteriormente se inoculaban.
1
.
i
5 -3. b .Micelio

Esporas producidas en agar de papa-dextrosa

-r-
I
fueron inoculadas en matraces agitados con -
e l medio 1.l.b. con glucosa como fuente de d
J-
r-
carbono, a los dos días de incubación e l -
'-
J
contenido de los matraces fu6 f i l t r a d o y -
c
-7 lavado con %O destilada. E l micelio lava
-+- V I
$
do se empleó como inóculo. i a

r
5.4. Medición de c02.. Ii
I
2 La solución alcalina (pEI 11) conteni en 10s ab-

-r
I aorbedores de C02
/
se t i t u l ó cada 24 horas con - ._
di
BaOH IM.
4-
J-
5.5. Tratamiento de muestra:
-r
& 1 mestreo se hizo sobre todo e l conten
P 1
dor de l a siguiente manera:

F- Se mezcla con una v a r i l l a de v i

&-
c
e l análieis de a c t i v i

e l resto de l a muestra se se
F
#e l e hace e l a n á l i s i s de proteína.

e ...
i
 h

REGVLTAMiS Y DISCUSIONES

Corpo reaultado d e l aislamiento de cepailr ne obtuvieron

!
-
5

&a grua08 de hongos. E l primer grupo consistid de cepas

1
aialadas üei l i r i o acuático a diferentes niveles de humdad. L7
-
Ir
L Este grupo está constituído por l a s cepas A-O, A-1, A-2 y
I
c
A-3. Las cepas que forman parte del 2do. grupo fueron ais-
-L
das en platos p e t r i con e l medio 1.l.b con celulosa avicel
r
L y papel f i l t r o como h i c a s fuentes de carbono, inoculando -
'
P
porciones de s u P o y material biol6gico por las cepas A-4,
t
L
A-5, A-6, A-7 y A-8. Además de estos hongos s e trabajo con
-
T-

I i
una cepa de colección de Tzichoderma viride. Una vez que s e
c
obtuvieron l a s cepas puras, y que se comprobó que crecsan en
L

-c medios con aalulosa como m i c a fuente de carbono, se proce-

i
IL
di6 a hacer dos estudios comparativos de las cepas aislada y
e

- si

*-

- E l primer estudio comparativo, consisti6 en determinar

c

c
l a velocidad aparente de crecimiento r a d i a l ( v a ) de las ce- 8
L- y& f:
- - pas aisladas y 2. v i r i d e en elmedio 1.L.b coa celulosa av&

E
L ce&como fuantF 6 carbono. Em l a Figs 3 se presentan los -
.-
i
resultados de a t e estudio., en donda w s a l t a una mayor velo- i
... I
r-

11
b--

x -

."- ~ I
 ! :?

c m 8.0.
1 - ..> ..

. . 3.0.

1,

I
> -
6.0.

>-'- 4.0,
&)I .,
'1
4
- *
, I

30.
).I

..- .
7
, A-O
I-

cidad aparente de crecimiento de l a s cepas A-1, T v.

.-
.
a

. r- Y A-7 S i n enbargo es necesario hacer notar que e l incremen-

i_-
i

to d e l diámetro de l a s colonias respecto a l tiempo no r e f l e j a

I F -

- en realidad l a velocidad de crecimiento. debido a que l a den-

aidad de l a s colonias es diferente para cada una de la

-\ '-
1.-
por l o que fué necesario hacer observaciones con e l microsco-

I
c

I- pi0 estetoac6pico, para podar hacer cons nes acerca de

1-
I
l a densidad de l a s colonias. De esta m observ6 que -
- 1 L
la única cepa que r e f l e j a b a una densidad notoriamente
j a era l a cepa ~
R-i. Por. i o que se consider6 una mayor veloc.&

crecimiento de l a s cepas T. v , A-

m
E l segundo est- consisti6 en determinar e l

dos fuentes de carkeno 'celul6sicas sobre e l crecimiento y so

bre l a actividad ceiuloiática de iaa cap

a.En este estudio se usaron ceiulos

tro como fuentes de carbono.

ecto a l a ptoducci6n de protefna (Pig. 41, se o b s q

l a mayvria de las cepas eatudiadas tienen mayor pro- T

r
L de proteína c

a tixcepcibn de l a s cepas T.V, A-

-r
-
7- ”
&- .
m-

a
600
nen una mayor conversión sustrato - proteína.que e l reato F
. ' 1
,L
.. . .
de l a s cepas. - ,... ~
~

~ .
,,,.

En lo que se r e f i e r e a l a actividad c e l u l o l í t i c a . (Fig.5),

me r e f l e j a una mayor actividad en iaa cepas que fu&n creci-

das en medio con papel f i l t r o .

%te experimento muemtza una ividad eneimatica

de laa cepas T-v, A-5, A 4 YA-7, siendo

A-5 las que presentan una mayor capacidad

.
I
crecidas en medios con papel fuente de carbono.

Em necesario hacer notar que l a act l o l l t i c a de

2- y&&& (Fig.5b) es hasta 5 veces r que l a de l a cepa

A-5, que ea l a que l a sigue en magnitud de tividad enzimd,

tica .
kateriormente se h b o un eatudio seguir l a cen6-

t i c a de producción de proteína, y de actividad c e l

sobre celulosa

Los dates cene

este estu
 P
- 5.0
I

'I 0.0
I
-4.0
P.

- 0.6
-3-0 !

-2.0

- 1.0

t
ir-
2 4 6 8 io
"-
 35. i

Conw, se puede observar en l a E&. 6, l a actividad enzi-

i
m a i c a sobre celulosa avicel es mayor que sobre l a celulosa 1

d e l l i r i o acuático; ésto se puede debar a diferentea factores:

a) E l sistema enzhdtico €u6 producido enmedio con cela

losa avicel como fuente &a carbono.
i
b) La concentraci6n de celulosa en e l sustrato fu6 ma-

r-
yor en e l caso de l a celulosa avicel, ya que se u t i
I-
1126 l a misma cantidad de sustrato para cuantificar
.-
.- . ambas actividades

c) En e l caso del l i r i o acuático existen mas barreras

u
naturales, para m e ge l l e v e a cabo l a actividad en

z imat ica .
-
c

L
Debido a que se habían h&ho una s e r i e de experknentos
c
con l i r i o acuático fuente de carbono en medio líquido y
L

se observaba e l crecimiento de.bacterias durante e l cultivo,

c

a pesar de haber esterilizado los medio8 de cultivo, s e pro

cedi6 a hacer un estudio del efecto de l a esterilización y

del pH sobre e l crecimiento de bacterias en medios con l i r i o

acuático inoculados con l a cega A-O.

'z

Como se obs-a en l a Fig. 7, y a n ayuda de oñservacig

nea hechas periodicamente a l microfcogio, durante e l cultivo

r- se suscitan dos etapas con diferente predominancia de micro-

L-

c
...,
 . , .

'd P
i

e6ntro3ado -
------
' A C T I V I O U ? CELULOLITICA
controlado
controlado ......

rfg.7 . EFECTO'D
 1
i -
-.
r
r i

,.
....

organismos. A l principio del cultivo ee.nota un aumento em -.

7
. . , - e1 crecimiento de l a cepa A-O, pero a l cabo del segundo día

b-.
&I cultivo se un decremento en i a proteína t o t a l y ea l a

actividad c e l u l o l í t i c a . Esto se pudo haber debido a que da-

,da l a a l t a concentración de proteína s e p m c a r o n fen6menos

.- de proteolisis, i o cual es confirmado por el.aumento del pH
!
-
, %

en esta etapa del cultivo. ~n i a segunda etapa, se dá un

" !

-.
I

i. e.gmio incrceDBnto & ' i a proteína t o t a l y tie l a actividad cg

.
- luioiítica, debidos e a a un a c e i e r a b . & t c i m i e n t
'
1, i
.- bacterias present- en e l medio.'
L
Y , . . ,' i

PO Fomente a e estudi6 e l o de l a relación C:N

del medio de cultivo sobre e l crecimiento de g. en-

medio llquido.

.
crecida a C:N altos, sin &.argo

do l a s ,poblacion

-+.
t

. .. . .
 38.

P-

i-

L_

r-

..
 ,-.

.... 39.
9 ' ,..

-*
-
I-

P e a dedmmminar las wndifiiones' óptimas de' cultivo en -

.. , .

.. .

se hizo un primau: errtudio para ver e1 efecto -

.C
,.

.,
- medio sdlido,

-i de l a humedad d e l medio sobre e l crecimient? de g. ttid.de,

L

u t i i i z a m i o ' i i r i o acuático única fuente de nutrient-.

c
.., . .es

Como se puede observar en l a Fig.'9, lam k0ndicion.s en

. .
c

L_
que se tiene una myor producción de COZ son con e l 80% de
c

I
humedadsin embargo bajo estas condiciones se favorece e l - ..

cr
.crecimiento de b a c t d i a s en e l l i r i o acuático, de t a l manera

que a l reducir l a humeda& del meBio se controla e l crecjmiea t

to dq bacteria% favorecihdonos e l crecimiento del honpb. 4

t

En le midma f i g u r a se pugde observar una mayor actbfi-

dad snzimbtbica cuando e l hongo crece en e l medio con 60%bcr

~

humead. y no se obqgrva actividad c e l u l o l í t i c a con e l nidi0

a l 50% da humadaC, sin embargo bajo estas condiciones ea &a
de se alcanza un mayor incremento en e l contenido t o t a l d. - t
pnotecpa del producto.

Una uez que se estudió e l efecto de l a himisdad del madlo.

se proeedi6 a estudiar e l ef-to de la relacidn C r N del &o I

en e l crecimiento
- . __ de T. viride_an.condicionss de cultivo adl&
- - =* ._ ._II

-
.
r
c

..% ,
. ,.
r' - ' . . . .... . . - . .. ~
I
i
P

40.

10

6
4

30C

2ou

11

/O

%
Y

z
I

c
Fig. 9
..
c
 Simpl$;Bcuaaocmte ne estudio e l efecto de l a adición de - ,.
I i
I nuttimites y de l a naturaleza del in&ula sobre e l p e r f i l da c

tran en l a Fig. 10. Los resultadoe mu-tran mayor pso&rcción

-1- d e l Coz, mayor actividad ceiuioiítica y un incremento mayor -
-
b

en e l contenido de proteína t o t a l del sistema para'los 0.BiOs

k
,,

e
de cultivo, enriquecidos con saleta minerales e inoculados con
c
micaie fre(rco. Y tanto en eit& medios c ~ aaquellos
, ~ r r sno
P-
tae en5iqueciaron con saleta mineralea y que hemn inocariaea
*
c con auspensi& de esporas se nota un mayor crecimiento en los r*
Y
medio. con r44rci6p C;N a$ta.
L

r"-

- f
- Es naces-io haeer notal; que los dop -went06 88 que

L
se entudi6 e l efecto de l a relación C:N

de COZ
haystapr pradusrci6n

cuando se, l e adiciona a l medio mayor aantidad de -

i
5
-
r_

( % ) ~ C O ~ io
, que implica que bajo estas mndiciones, a- g.
r

- & aprovecha mejor como- feente de NitrBgeno e l (-)eq

que
P l a proteína presente en e l l i r i o acuático.
L
 -.
: . . r r13%

c a iJCLUSI0

i í t i c a , a i ser crecida en medios con fuente de casbono -

celuibaica.

3.- 2. psOgitce M cciatam crirtlabt&z&.qt& hidroliea -

l a celuinaa d e l l b i o acuático.
Y

4.- En cuitivoe sépticoa em l i r i o a&ico jamcub&, con hoz

gds al&i€tiCba l a dinhtna ~ l p i c i o r $ r l . s e m a e l v ecom-

p l e j a a l cabo del tercer dSa de fermentación W i d 0 a l a

prQdaninancia de &pos baeteriegos.

5.- Be epcontzá que l a s condicioa.ri ripaapiadaa para iLp -_

fex!wmtaciom aglida de lirio acutitdca inoculado coa &
!
y&$&& eon:

a) Cazpcmo/Wtr&epo 14 - 20

b) Humedñd 50 - O0 %
c 44. -
I

..- , I

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