INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE
POSGRADO E INVESTIGACIÓN

“ESTUDIO DEL EFECTO DE LA TIBOLONA SOBRE EL

DAÑO INDUCIDO POR LA OVARIECTOMIA EN EL
HIPOCAMPO DE LA RATA ADULTA”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN CIENCIAS
EN FARMACOLOGÍA

PRESENTA:

BIÓL. TERESA NERI GÓMEZ

DIRECTORES DE TESIS:
DR. CHRISTIAN HUMBERTO GUERRA ARAIZA
DRA. JUDITH ESPINOSA RAYA

MEXICO, D.F. 2011

1
2
 EL PRESENTE TRABAJO SE REALIZÓ EN EL LABORATORIO DE
FARMACOLOGÍA CONDUCTUAL DE LA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE
POSGRADO E INVESTIGACIÓN DE LA ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Y EN LA UNIDAD DE
INVESTIGACIÓN MÉDICA EN FARMACOLOGÍA DEL CENTRO MÉDICO
S XXI DEL INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL.

3
I HAVE LEARNED SO MUCH
DANIEL LADINSKY

I
Have
Learned
So much from God
That I can no longer
Call
Myself

A Christian, a Hindu, a Muslim

A Buddhist, a Jew.

The Truth has shared so much of itself

With me

That I can no longer call myself

A man, a woman, an angel
Or even pure
Soul.

Love has
Befriended Hafiz so completely
It has turned to ash
And freed
Me

Of every concept and image

My mind has ever known.

4
 AGRADECIMIENTOS

A DIOS

A MI FAMILIA, MI MAMÁ Y MI HERMANO POR SU AMOR,APOYO

Y POR SOPORTARME TANTO

A MIS TUTORES:

DR CHRISTIAN GUERRA Y DRA. JUDITH ESPINOSA POR SU

PACIENCIA, CONSEJOS Y BRINDARME SU AMISTAD.

A MI COMITÉ TUTORAL POR BRINDARME SIEMPRE NUEVOS

CONOCIEMIENTOS.

A MIS AMIGOS QUE SIEMPRE HAN ESTADO CONMIGO:

MARIBEL, ARTURO. GRACIAS

A MIMIS (MU) POR SOPORTARME DURANTE ESTOS 2 AÑOS DE

LA MAESTRIA, BRINDARME SU AMISTAD Y COMPARTIR
MUCHOS MOMENTOS.

A MIS COMPAÑEROS DEL LABORATORIO: RODOLOFO, CLAUS,

BERE, TOMAS, NICHE, DELIA. GRACIAS POR HACER AMENO EL
TRABAJO.

5
INDICE GENERAL
Pagina
I Resumen 13
II Antecedentes
2.1 Hormonas esteroides
2.1.1 Estructura y función de las hormonas esteroides 15
2.1.2. Receptores a hormonas esteroides 18
2.1.3 Efecto de las hormonas esteroides ene l Sistema 21
Nervioso Central
2.2 Climaterio y Menopausia 23
2.2.1. Endocrinología del climaterio, menopausia y 24
postmenopausia 26
2.2.2 Síntomas del Climaterio
2.2.3 Terapia de Reemplazo Hormonal 26
2.3 Tibolona 28
2.3.1 Propiedades químicas 29
2.3.2 Mecanismo de Acción 31
2.3.3 Absorción, Biotransformación y Excreción 32
2.3.4 Efecto de la Tibolona en Sistema Nervioso Central 33
2.4 Memoria y Aprendizaje 34
2.4.1 Aprendizaje: Modelos Conductuales 35
2.4.2 Condicionamiento clásico pavloviano 36
2.4.3 Condicionamiento instrumental operante 37
2.4.4 Transferencia pavloviana instrumental 38
2.4.5 Tipos y características de los sistemas de memoria 39
2.4.6 Tipos de memoria en función de la duración de la 42
experiencia
2.4.6.1 Memoria Sensorial o inmediata 42
2.4.6.2 Memoria a corto plazo o memoria de trabajo 43
2.4.6.3 Memoria a largo plazo 43
2.5 Hipocampo 44

6
 2.5.1 Vías aferentes del hipocampo 46
2.5.2 Vías eferentes del hipocampo 46
2.6 Acetilcolina 47
2.6.1 Vías cerebrales colinérgicas 48
2.7 Serotonina 50
2.7.1 Vías cerebrales serotoninérgicas 51
III Planteamiento del problema y Justificación 53
IV Hipótesis 54
V Objetivos 54
VI Material y métodos 55
VII Análisis estadístico 61
VIII Resultados 62
Pruebas de memoria y aprendizaje
Western Blot
Inmunofluorescencia y Detección de la apoptosis
IX Discusión 70
X Conclusiones 76
XI Bibliografía 77
XII Anexos 84

7
INDICE DE FIGURAS

No TITULO PAG
1 Síntesis de las principales hormonas esteroides. 16
2 Dominios funcionales de los receptores a 19
hormonas esteroides.
3 Mecanismo de acción genómico de las hormonas 20
esteroides.
4 Estructura química de la Tibolona. 28
5 Estructura química del noretinodrel y de la 29
noretisterona.
6 Estructura química de los metabolitos de la 30
Tibolona.
7 Tipos de memoria y estructuras cerebrales 44
relacionadas.
8 Esquema de la estructura del hipocampo. 46
9 Estructura química de la acetilcolina. 47
10 Síntesis de la Acetilcolina. 48
11 Distribución de las vías colinérgicas en el cerebro 49
12 Estructura quimica de la serotonina 50
13 Síntesis de la serotonina 51
14 Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre la 62
capacidad cognitiva de la rata ovariectomizada en
un modelo de automoldeamiento.
15 Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre la 63
capacidad cognitiva de la rata ovariectomizada en
la prueba de laberinto elevado en forma de T.
16 Índice de riesgo del laberinto elevado en forma de 63
T.
17 Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre la 64
actividad espontánea de la rata

8
18 Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre 65
el contenido de ChAT
19 Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre 66
el contenido de TPH
20 Detección de la dobleinmunofluorescencuia en el 67
hipocampo con los diferentes tratamientos de
Tibolona.
21 Detección de la apoptosis en el hipocampo con los 69
diferentes tratamientos de Tibolona

9
INDICE DE TABLAS

No. TÍTULO PAG

1 Función de las hormonas esteroides. 17
2 Cambios endocrinológicos durante la menopausia 25
3 Signos y síntomas del climaterio 27
4 Afinidad relativa para el RE y RP para Tibolona y 30
sus metabolitos
5 Anticuerpos utilizados 60

10
 ABREVIATURAS

3α–OH Tibo 3α-hidroxi-Tibolona

3β–OH Tibo 3β-hidroxi-Tibolona
5-HT 5-hidroxitriptamina
Ach Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterasa
AF-1 Función de activación 1
Akt Proteína cinasa B
BA Brazos Abiertos
CA Cuerno de Amón
ChAT Colinacetiltransferasa
DA Dopamina
DBD Dominio de unión al DNA
E2 Estradiol
EA Enfermedad de Alzheimer
EC Estímulo condicionado
EE Error Estadar
EI Estímulo incondicionado
EI Estímulo originario
ERK1 Cinasa regulada por señales
extracelulares 1
FSH Hormona folículoestimulante
GABAA Ácido γ-aminobutírico subtipo A
GnRH Hormona liberadora de gonadotropinas
HRE Elementos de respuesta hormonal
HSP Proteínas de choque térmico
IR Índice de Riesgo
LET Laberinto Elevado en T
LH Hormona luteinizante

11
MAPK Protein cinasa activada por mitogeno
MPA Medroxiprogesterona
NMB Núcleo basal magnocelular
OVX Ovariectomizadas
P4 Progesterona
PI3-K Inositol trifosfato cinasa
R Respuesta
RA Receptores de andrógenos
RC Respuesta condicionada
RE Receptores a estrógenos
Rf Reforzador
RI Respuesta incondicionada
RP Receptores a P4
SNC Sistema Nervioso Central
TPH Triptófano Hidroxilasa
TRE Terapia de reemplazo estrogénica
TRH Terapia de Reemplazo Hormonal

12
1. Resumen

Para prevenir los síntomas del climaterio se prescribe una terapia de reemplazo hormonal
(TRH), la cual puede tener componentes estrogénicos y/o progestágenos. Sin embargo, la
TRH aumenta la incidencia de cáncer de endometrio y mama. Una estrategia para disminuir
ésta incidencia es el uso de tibolona. Sin embargo, se desconoce el papel de ésta sobre los
procesos de memoria y aprendizaje. Con el fin de conocer dicho papel se evaluó el efecto a
largo plazo de diferentes dosis de tibolona en dos modelos de memoria y aprendizaje
(automoldeamiento y laberinto en T); así como el contenido de acetilcolintrasferasa
(ChAT) y de triptófano hidroxilasa (TPH) mediante la técnica de western blot en el
hipocampo de ratas Sprague-Dawley ovariectomizadas, que recibieron uno de los
siguientes tratamientos: 0 mg/Kg, 0.01 mg/Kg, 0.1 mg/Kg, 1.0 mg/Kg, 10 mg/Kg, dosis
diaria por vía oral durante 18 semanas. En el modelo de automoldeamiento y la prueba de
actividad espontánea, no se observaron cambios significativos con ningún tratamiento.
Mientras que en el LET aumentó la latencia con la dosis de 10 mg/kg. El contenido de
ChAT disminuyó con las diferentes dosis de tibolona; mientras que para la TPH se observo
un aumento con las dosis de 1 y 10 mg/Kg. En el caso de la detección de la apoptosis se
observo una menor inmunoreactividad para anexina V en CA3 del hipocampo con las
diferentes dosis de Tibolona. Estos datos sugieren que la tibolona, a dosis alta, mejora el
aprendizaje de una tarea con componente emocional, efecto que no se relaciona con alguna
alteración en la capacidad motriz de la rata. Además, sugieren una regulación de la
expresión de ChAT y TPH y una diminución de la apoptosis en el hipocampo de la rata
ovariectomizada.

13
Abstract

To prevent symptoms of menopause, hormone replace therapy (HRT) is prescribed. This

may have estrogenic and/or progestin components. HRT increases the incidence of
endometrial and breast cancer. A strategy to reduce this impact is the use of tibolone, which
also has estrogen and progestin components. However, the role of tibolone in the process of
learning and memory is unknown. The aim of this study was to evaluate the long term
effect of different dosis of tibolone (0 mg/Kg, 0.01 mg/Kg, 0.1 mg/Kg 1.0 mg/Kg and 10
mg/Kg orally daily for 18 weeks) on the memory and learning of ovariectomized rats. For
this purpose, two behavioral animal models (autoshaping and T maze) were employed, as
well as a direct measurement of the content of acetyl choline transferase (ChAT) and
tryptophan hydroxylase (TPH) by Western blot in the hippocampus. In the autoshaping
model and in the spontaneous activity test, no significant changes were observed. In the T
maze there was an increased latency with the doses of 1 and 10 mg/Kg. Whereas the ChAT
content decreased with increasing doses of tibolone, the TPH content increased with the
doses of 1 and 10 mg/Kg of tibolone. These data suggest that high doses of tibolone
improve the results of an emotional learning task, an effect that depends on the modular
effect in cholinergic and serotonin systems.

14
II ANTECEDENTES

2.1 Hormonas Esteroides

2.1.1 Estructura y función de las hormonas esteroides

Las hormonas esteroides son lípidos no saponificables hidrofóbicos, solubles en disolventes

orgánicos y cuya estructura consiste en un núcleo tetracíclico al cual se le denomina ciclo
pentanoperhidrofenantreno debido a que presenta tres anillos de seis átomos de carbono
(perhidrofenantreno) y un anillo de cinco átomos de carbono (ciclo pentano) (Knobil y
Neil, 1988).

Las hormonas esteroides regulan múltiples procesos biológicos en los mamíferos, entre los
que destacan la homeostasis hidroelectrolítica, las respuestas al estrés y la función
reproductiva; además de regular distintas conductas. Todas las hormonas esteroides, con
excepción del ácido retinoico, se derivan del colesterol, a partir del cual se forma la
pregnanolona el principal intermediario para la síntesis de la mayoría de las hormonas
esteroides. Los esteroides con 21 átomos de carbono se dividen en pregnanos,
glucocorticoides y mineralocorticoides, mientras que los de 19 y 18 átomos se denominan
androstanos y estranos respectivamente (Knobil y Neil, 1988; González-Arenas et al.,
2001) (Fig. 1).

La corteza adrenal es la principal responsable de la producción de los glucocorticoides, que

regulan el metabolismo de carbohidratos y las respuestas al estrés, y los
mineralocorticoides, que regulan los niveles de sodio y potasio. La progesterona (P4) y el
estradiol (E2) son producidos principalmente en el ovario, mientras que los andrógenos en
su mayoría son sintetizados por los testículos. Estas hormonas regulan principalmente las
funciones reproductivas de los mamíferos por lo que son conocidas como hormonas
sexuales (González-Arenas et al., 2001) (Tabla 1).

15
Fig. 1 Síntesis de las principales hormonas esteroides. 1) 20,22 desmolasa, 1´) 3β -OH-
esteroide deshidrogenasa 2) 17α-hidroxilasa, 3) 17,20 liasa, 4) 21 hidroxilasa, 5) 11β
hidroxilasa, 6) 18 hidroxilasa, 7) 18 hidroxiesteroide oxidasa, 8) aromatasa (Tomado de
Eckert,1990).

16
Tabla 1. Función de las hormonas esteroides.

Hormona Lugar de síntesis Función

Progestinas Ovario, Placenta y Preparación del
(P4) Sistema Nervioso endometrio para la
Central implantación del óvulo
fertilizado,
mantenimiento del
embarazo, desarrollo
de la glándula
mamaria, conducta
sexual y excitabilidad
neuronal.
Glucocorticoides Corteza adrenal Regulación de las
(Cortisol) respuestas al estrés,
modulación del
metabolismo de
glucosa y la
gluconeogénesis
Mineralocorticoides Corteza adrenal Metabolismo
(Aldosterona) hidroelectrolítico.
Retención de sodio y
excreción de potasio.
Andrógenos Testículos Conducta sexual y
(Testosterona) fenotipo masculino,
espermatogénesis
Estrógenos Ovario, placenta Diferenciación sexual
(E2) del cerebro, conducta
sexual femenina,
maduración ósea

17
Las hormonas esteroides tienen una velocidad de recambio elevada y no se almacenan, una
vez que son secretadas pasan al torrente sanguíneo donde pueden circular libres o unidas a
proteínas plasmáticas, tales como albúmina (cuando el enlace es inespecífico y poco afín) o
las globulinas (cuando el enlace es de gran especificidad y de gran afinidad) (Wilson y
Foster, 1992). El hígado es el órgano involucrado en el metabolismo de las hormonas
esteroides (Greenspan y Strewler, 1998).

Los efectos de las hormonas esteroides ocurren a corto, mediano y largo plazo debido a que
éstas tienen diversos mecanismos de acción (Camacho-Arroyo et al., 1995). Las hormonas
esteroides ejercen sus efectos a través de mecanismos genómicos y no genómicos. Los
mecanismos genómicos involucra la unión de la hormona esteroide con su receptor
intracelular específico para regular la transcripción de genes específicos. El mecanismo no
genómico involucra la acción de las hormonas esteroides sobre las bicapas fosfolipídicas de
la membrana celular, sistemas de segundos mensajeros, su interacción con receptores
membranales específicos e interacción con receptores a neurotransmisores como el del
ácido γ-aminobutírico subtipo A (GABAA) (Prieto et al., 2003).

2.1.2 Receptores a hormonas esteroides

Los receptores a hormonas esteroides son proteínas nucleares que actúan como factores de
transcripción inducidos por ligando que regulan específicamente la expresión de genes
blanco involucrados en el metabolismo, desarrollo y reproducción. Estos receptores
pertenecen a una familia de proteínas entre las que también se encuentran los receptores a
vitamina D3, y las hormonas tiroideas y el ácido retinoico (9-cis y all-trans) (Burris y
McCabe, 2003).
Estos receptores contienen seis dominios: en el extremo N-terminal se encuentra el dominio
A/B, la región de mayor variabilidad entre los diferentes receptores, tanto en secuencia
como en longitud. El dominio A/B permite diferenciar entre isoformas del mismo receptor
y tiene también la función de activación 1 (AF-1), que es una de las regiones con actividad
transcripcional del receptor. En la región C se encuentra el dominio de unión al DNA
(DBD), el cual es altamente conservado y está constituido por dos dedos de zinc. El
dominio D presenta una secuencia variable conocida como bisagra y contiene una señal de
localización nuclear. El dominio E está localizado hacia el extremo carboxilo terminal de la
18
región D; es relativamente largo y funcionalmente diverso ya que participa en: la unión con
el ligando, con proteínas de choque térmico, la dimerización y la interacción con los
cofactores. Esta región contiene también una señal de localización nuclear y la función de
activación 2 (AF-2) que juega un papel importante en la regulación de la transcripción
(Tata, 2002; Prieto et al., 2003). En cuanto al dominio F, existen estudios que muestran
que participa en la función transcripcional del receptor y en su unión con agonistas y
antagonistas (Schwartz et al., 2002) (Figura 2).

Fig. 2. Dominios funcionales de los receptores a hormonas esteroides. A-E dominios

funcionales de los receptores a hormonas esteroides. AF: función de activación, DBD:
dominio de unión al DNA, LBD: dominio de unión al ligando (Tomado de: Prieto et al.,
2003).

Las hormonas esteroides atraviesan las membranas celulares por difusión simple y en el
núcleo se unen a sus respectivos receptores que se encuentran principalmente asociados con
proteínas de choque térmico (HSP70, HSP90 y HSP56).

La unión con el ligando provoca un cambio estructural en el receptor que le permite la

disociación de las HSPs y que activa al receptor exponiendo la región que le permite
dimerizarse, resultando en una estructura con alta afinidad por secuencias específicas en el
DNA llamadas elementos de respuesta hormonal (HRE, por sus siglas en ingles); éstas son

19
 secuencias palindrómicas separadas por tres nucleótidos en donde dos receptores se unen
simétricamente a cada mitad de la secuencia como un homodímero cooperativo. Una vez
unido al HRE, el complejo ligando-receptor facilita el ensamblaje y la estabilización del
complejo de pre-iniciación de la transcripción en los promotores de genes regulados por
hormonas esteroides, favoreciendo así la transcripción de genes blanco. Recientemente se
ha observado que estos receptores interactúan con cofactores que: 1) pueden aumentar o
disminuir la transcripción y 2) unir al receptor con los factores generales de transcripción y
la RNA polimerasa II (Prieto et al., 2003; Burris y McCabe, 2001) (Fig. 3)

MECANISMO DE ACCION CLÁSICO DE LA PROGESTERONA

H D
H Período A/B E hsp70
H H de inactivación C hsp90

H H

Unión de la hormona D Hsp70

y liberación de A/B
las proteínas de choque E
térmico C Hsp90

Cambio conformacional
dimerización y D D
fosforilación del A/B E E A/B
receptor C C
C

Reclutamiento
Cc
de la maquinaria A/B E E A/B
transcripcional
O TFII Pol II
C

ERH TATA
Región promotora

Fig 3. Mecanismo de accción genómico de las hormonas esteroides. El receptor a hormonas

esteroides (A/B, C, D, E) se encuentra en un estado de inactivación, unido a proteínas de choque
térmico (Hsp). La hormona (H) atraviesa la membrana plasmática y la envoltura nuclear e
interactúa con su receptor, se liberan las Hsp, el receptor se dimeriza, se une a elementos de
respuesta hormonal (ERH) y recluta a cofactores y a la maquinaria basal de transcripción.
20
Además de los efectos genómicos, las hormonas esteroides son capaces de inducir la
activación de diversas rutas de señalización celular que puede ocurrir en segundos o
minutos después de la administración de las mismas (Díaz, 2001; Heldring, et al,. 2007).
Estos mecanismos no genómicos pueden iniciarse en la membrana o en el citoplasma e
incluyen activación de cinasas y fosfatasas que incrementan el flujo de iones a través de la
membrana plasmática. Los receptores de membrana producen efectos no genómicos
inmediatos desencadenando diferentes cascadas de señalización, de tal forma que las
modificaciones en la transcripción moduladas por los receptores nucleares, puede ser
regulada positiva o negativamente por los segundos mensajeros dependientes de la
activación de receptores membranales (Díaz, 2001). Los más conocidos de estos
mecanismos son: la activación de la vía de señalización de la protein cinasa activada por
mitogeno (MAPK) y la vía de la proteína cinasa B (Akt, por sus siglas en inglés)/Inosito
trifosfato cinasa (PI3-K, por sus siglas en inglés). La primera conduce a un incremento en
la fosforilación de la cinasa regulada por señales extracelulares 1 (ERK1, por sus siglas en
inglés) importante para regular la supervivencia celular (Díaz, 2001). La segunda vía
implica la fosforilación de Akt por medio de PI3-K, cuya activación es crucial para el
efecto protector del estradiol contra excitotoxicidad por glutamato, así como protección de
muerte celular inducida por acumulaciónβ de -amiloide en células de hipocampo
(Dhandapani y Brann, 2002).

2.1.3 Efecto de las hormonas esteroides sobre el Sistema Nervioso Central

El E2 y la P4 están involucradas en la regulación de la morfología y la función neuronal en

el Sistema Nervioso Central (SNC). Se ha observado que durante el ciclo estral, el número
de espinas dendríticas presenta una disminución del 30% en el día del estro respecto al día
del proestro en la región CA1 del hipocampo de la rata, cuando las concentraciones de E2 y
P4 son mayores durante el ciclo (Gould y Woolley, 1990). Estas modificaciones específicas
en la morfología neuronal, involucran cambios en las proteínas de citoesqueleto que se
conoce tienen una participación importante en la formación de axones y dendritas como son
las proteínas Tau y MAP2. Estudios in vitro utilizando cultivos primarios de neuronas de
hipocampo han mostrado que el E2 aumenta el número de ramificaciones dendríticas

21
(Audersik et al., 2003) así como se ha observado un aumento en la expresión de MAP2
(Shah et al., 2003). En cultivos primarios obtenidos de neuronas de la amígdala de la rata,
se ha observado que el E2 aumenta la inmunopositividad a MAP2 (Lorenzo et al., 1992).

Se han propuesto varios mecanismos para explicar la neuroprotección inducida por

estrógenos. Los más conocido de estos mecanismos son la activación de la vía de
señalización MAPK y la vía de Akt, /PI3-K.

El E2 y el receptor del factor de crecimiento parecido a la insulina (IGF-I) cooperan en el

SNC para regular el desarrollo y la plasticidad neuronal, eventos neuroendocrinos y
respuestas a daños en tejidos neuronales. Se ha observado que en el hipocampo de ratas
hembras la expresión y función de los receptores a estrógenos y del receptor de IGF-I en
el cerebro, es por medio de regulación cruzada (Cardona-Gomez et al., 2004).

Los hallazgos en investigación básica que proveen la relación más fuerte de un efecto
benéfico de los estrógenos sobre las capacidades cognitivas en mujeres, incluyen su
habilidad para incrementar las espinas dendríticas en el hipocampo, su habilidad para
incrementar la concentración de colin-acetil-transfersa (ChAT) y sus numerosos efectos
neurotróficos (Sherwin, 2006), así como su capacidad para proteger contra un amplio
rango de daños tóxicos incluyendo la producción de radicales libres (McEwen, 1999; Díaz,
2001; Dubal, 2001), excitotoxicidad y toxicidad generada por β-amiloide (Díaz, 2001;
Villarroya-Pastor, 2001; Wise et al, 2001) e isquemia.

Diferentes ensayos clínicas han sido desarrollados (Díaz, 2001; Sherwin, 2006;
Vearcombe, 2009). El más conocido es la iniciativa de salud de la mujer de los institutos
nacionales de salud (WHINIH, por sus siglas en inglés), la cual evalúa el papel de la terapia
de reemplazo hormonal (TRH) a largo plazo (con seguimiento a seis años) sobre los
síntomas y la progresión de la Enfermedad de Alzheimer (EA) en mujeres de 50-79 años;
sus resultados permitieron concluir que los estrógenos son neurotróficos y
neuroprotectores contra daños tóxicos asociados con EA en neuronas del cerebro basal
anterior, hipocampo y corteza (Díaz, 2001).

22
Por otra parte se sabe que la P4 y sus metabolitos regulan el desarrollo sináptico, plasticidad
y función del cerebelo (Smith et al., 1987; Smith, 1989, 1991; Sakamoto et al., 2001, 2002;
Tsutsui et al., 2004) del hipotálamo (Perez et al., 1993; Garcia-Segura et al., 1994) y del
hipocampo (Woolley y McEwen, 1993), así como otras zonas cerebrales. Además, están
involucrados en la diferenciación de neuronas y células gliales y en la formación de mielina
(Baulieu y Scumacher, 2000; Tsutsui et al., 2004; Schumacher et al., 2004; Ghoumari et al.,
2005). La P4 y sus metabolitos también tiene efectos analgésicos (Patte-Mensah, et al.,
2005) y anestésicos (Selye, 1941) e influencia en el sueño y en el hambre (Engel y Grant,
2001).

En explantes corticales de cerebro de ratón, la P4 aumenta la fosforilación de Akt y de ERK

(Singh, 2001). En cultivos de neuronas del hipocampo, la P4 promueve una activación
rápida y transitoria de ERK e induce su translocación al núcleo de la célula con lo cual
atenúa la exotoxicidad producida por el glutamato (Nilsen y Brinton, 2003). La activación
de PI3K y la señalización de MAPK son necesarias para la manifestación de efectos
neuroprotectores de la P4 in vitro (Nilsen y Brinton, 2003; Kaur et al., 2007).

2.2 Climaterio y Menopausia

El climaterio o perimenopausia comienza varios años antes de que se produzca la

menopausia, incluye el período inmediatamente anterior a la menopausia (cuando
comienzan las manifestaciones endocrinológicas, biológicas y clínicas), y como mínimo se
prolonga hasta el primer año siguiente a la menopausia (Genazzani et al., 1996).

La Organización Mundial de la Salud define a la menopausia como “el cese permanente de

la menstruación", se debe a la pérdida de la función folicular ovárica y el diagnóstico se
hace en forma retrospectiva después de un período de amenorrea de 12 meses (Trevoux, et
al., 1986).

El momento de presentación de la menopausia está determinado genéticamente y ocurre a

una edad promedio de 51 años. Por lo que, tomando en cuenta la esperanza de vida de la

23
población, significaría que este periodo puede constituir más del 33% del promedio de vida
de la mujer debido al incremento de la longevidad (Trevoux et al., 1986). Durante este
periodo las mujeres son vulnerables a trastornos por deficiencia de estrógenos (Hurd et al.,
2004), los cuales tienden a ser crónicos más que agudos. Por este motivo, la TRH es una de
las preocupaciones primarias de muchos servicios de atención médica.

2.2.1 Endocrinología del climaterio, la menopausia y la postmenopausia

Durante la transición de la etapa reproductiva a la no reproductiva, la mujer experimenta

una serie de eventos, los cuales se inician varios años antes de que ocurra la menopausia.
Alrededor de los 35 años, antes de cualquier alteración del ciclo menstrual y de las
variaciones detectables en las concentraciones de E2, comienza a elevarse la hormona
folículoestimulante (FSH) en la fase folicular temprana (Oldenhave et al, 1994).
Generalmente después de los 40 años la fase folicular del ciclo se acorta, los niveles de E2,
inhibina y de folículoestatina disminuyen y los de la FSH comienzan a elevarse.
Posteriormente los niveles de la hormona luteinizante (LH) también aumentan aunque en
menor proporción que la anterior (Al Azzawi, 1992; Khaw, 1992; Rozenberg et al., 1988).
Los folículos disminuyen y es más frecuente la ovulación prematura y la fase lútea
insuficiente con disminución de la producción de P4, lo que produce un exceso de
estrógenos en relación a la hormona anterior (Rozenberg, et al.; 1988). Cerca de la
menopausia, los ciclos menstruales a menudo presentan anovulación intermitente, los
niveles de las gonadotrofinas son erráticos y es frecuente el hiperestrogenismo relativo con
disminución de la P4. Clínicamente esto se manifiesta con sangrados vaginales irregulares,
pueden existir períodos de amenorrea con valores de FSH y LH elevados, similares a los
hallados en la menopausia, pero cuando se produce la ovulación, los niveles hormonales
pueden volver a límites normales (Rozenberg et al., 1982; Dawood, 1993; Upton, 1982;
Metcalf et al., 1982).

Finalmente, los folículos ováricos dejan de responder a las FSH y LH; el E2 desciende a
menos de 20 pg/mL, la P4 es indetectable y clínicamente hay cese de la menstruación.

24
Algunos autores consideran que estos cambios corresponden a tres fases caracterizadas por
una serie de cambios hormonales (Sowers et al.; 1995) (Tabla 2).

Tabla 2 Cambios endocrinológicos durante la menopausia (Tomado de: Canto de Cetina et

al; 1996)

Después de la menopausia los valores de LH y FSH permanecen elevados, aunque siempre

con predominio de la segunda, cuya concentración puede ser hasta 10 a 15 veces mayor que
la reportada en una fase folicular normal, en tanto que la LH se eleva en menor grado y más
tardíamente ya que generalmente alcanza su pico 2 a 3 años después del cese de la
menstruación (Vegakis, 1989; Chakravarti, 1976). Ambas permanecen elevadas por un
tiempo variable que puede ser hasta de 20 años (Oldenhave et al., 1994). Después de la
menopausia cambia el origen y la naturaleza del estrógeno circulante, ya que durante la
vida reproductiva predomina el E2 y en la postmenopausia la estrona. El primero es
producido por el ovario y la segunda proviene en su mayoría de la conversión periférica de
los precursores androgénicos en el tejido adiposo, músculo e hígado (Al Azzawi, 1992;
Nordin et al., 1981; Speroff et al., 1989).

El ovario postmenopáusico no es un órgano inactivo ya que continúa produciendo tanto

estrógeno como androstendiona, aunque en cantidades mínimas. Estudios clínicos sugieren
que del 20 al 50 % de las mujeres postmenopáusicas tienen niveles de estrógenos
indicativos de actividad folicular durante los primeros 6 a 12 meses después del cese de la

25
menstruación (Al Azzawi, 1992; Khaw, 1992) y se estima que el 10% de las mujeres
pueden continuar presentando frotis estrogénico hasta 10 años después de la menopausia
(Grattarola et al., 1969). La androstendiona disminuye y los niveles circulantes de esta
hormona se reducen casi a la mitad. Por el contrario, la testosterona plasmática varía poco.
De hecho, el ovario postmenopáusico, en la mayoría de las mujeres, secreta más
testosterona, ya que con la desaparición de los folículos y del estrógeno, las gonadotrofinas
elevadas estimulan el estroma ovárico para aumentar la secreción de testosterona
(Oldenhave, 1994; Speroff, 1989).

2.2.2 Sintomas del Climaterio

El climaterio se asocia con signos y síntomas típicos relacionados con la deficiencia de

estrógenos (Jazsman et al., 1969; Semens, 1982), tales como amenorrea, bochornos,
períodos de sudoración y sequedad vaginal. Pueden presentarse otras condiciones como
alteraciones psicológicas, emocionales y psicosomáticas, no asociadas al hipoestrogenismo
(Greene, 1984).

Se ha sugerido que existe una variación cultural en la presencia de estos síntomas, ya que
se han reportado en el 75 a 80% de las mujeres occidentales, en tanto que en otras culturas
la frecuencia es mucho menor. No se sabe si esta variación se debe a diferencias en la
fisiología o en la percepción que tienen las mujeres de sus síntomas (tabla 3).

2.2.3 Terapia de Reemplazo Hormonal

Algunos investigadores han considerado la deficiencia de estrógenos como un estado

fisiológico más que patológico, probablemente porque la insuficiencia ovárica es un
problema que se encuentra establecido de manera genética. Sin embargo, al aumentar la
esperanza de vida de las mujeres, el impacto negativo de la deficiencia prolongada de
estrógenos se vuelve más importante. Además de tener amplia aplicación en la terapéutica
de síntomas asociados con este proceso tales como osteoporosis, síntomas vasomotores y
prevención de la enfermedad cardiovascular, algunos estudios retrospectivos han sugerido

26
que los estrógenos ejercen efectos benéficos en la esfera cognitiva y en el retraso del inicio
de la EA (Loose y Stancel, 2003).

Tabla 3. Signos y síntomas del climaterio

En la actualidad se recomienda la TRH tanto con un estrógeno como con un progestágeno

para la mayoría de las mujeres posmenopáusicas (Loose y Stancel, 2003). Se han utilizado
varios regímenes de reposición de hormonas el más utilizado actualmente es el denominado
cíclico, con la administración de un estrógeno durante 25 días, la inclusión de
medroxiprogesterona (MPA) durante los últimos 10 -13 días del tratamiento con estrógenos
y 5-6 días sin hormonoterapia, durante los cuales normalmente sobreviene hemorragia por
supresión. La inclusión del progestágeno que se administra sólo durante un segmento de
cada ciclo terapéutico disminuye eficazmente la hiperplasia endometrial y la incidencia de
carcinoma endometrial (Loose y Stancel, 2003; Singh, 2005). Cabe señalar que la MPA
antagoniza los efectos de los estrógenos sobre el endometrio mientras que la P4 no lo hace
(Singh, 2005).

Otra consideración farmacológica es la vía de administración de los hormonales. La

administración oral expone al hígado a concentraciones altas de estrógenos por medio de la
circulación porta y causan conversión más rápida del estradiol o estrógenos conjugados
equinos. Además, los estrógenos por vía oral pueden incrementar la globulina
transportadora de esteroides sexuales. Esos dos efectos se aminoran con el estradiol por vía
transdérmica (Loose y Stancel, 2003).

27
En general, se consideran más los beneficios que los riesgos por lo que se ha continuado la
búsqueda por crear regímenes que proporcionen las acciones benéficas de los estrógenos
sin sus efectos colaterales que pueden limitar el apego a la prescripción por parte de
algunas pacientes (Loose y Stancel, 2003).

2.3 Tibolona

La Tibolona (Fig. 4) es un fármaco usado como tratamiento completo de primera elección

para el alivio de los síntomas climatéricos y la prevención de la osteoporosis en mujeres
posmenopáusicas.

Fig 4. Estructura química de la Tibolona

Este fármaco fue sintetizado por primera vez a finales de los 1960s y sus propiedades
probadas a principios de los 1970s. Varias pruebas biológicas, basadas en su estructura,
revelaron que posee propiedades estrogénicas, progestagénicas y androgénicas. Sin
embargo, su actividad estrogénica no era esperada por la falta de características
estructurales esenciales, como un anillo aromático A y un grupo de compuesto fenólico C3
(Reed y Kloosterboer, 2004).

Este fármaco, principio activo del medicamento Livial®, tuvo su desarrollo clínico en los
tardíos 1970s e inicialmente enfocado a la prevención de pérdida ósea. El primer estudio
clínico en mujeres posmenopáusicas por Lindsay y cols. (1981) demostraron el efecto

28
positivo en los huesos pero, adicionalmente, parecía que, si bien la Tibolona alivia síntomas
climatéricos, los efectos estrogénicos sobre el endometrio no se observaron. Estos hallazgos
iniciaron nuevas investigaciones en el campo de los síntomas climatéricos y la prevención
de la osteoporosis (Reed y Kloosterboer, 2004).

A la fecha, la Tibolona está registrada en 89 países para aliviar los síntomas del climaterio
y en 45 para la prevención de la osteoporosis.

2.3.1 Propiedades químicas de la tibolona

La Tibolona [(7α, 17α)-17-hidroxi-7-metil-19-norpregn-5(10)-en-20-in-3-ona] es un
esteroide estructuralmente relacionado con derivados de la 19-nortestosterona como el
noretinodrel y la noretisterona (Fig. 5) que tiene una ligera afinidad a los receptores a
estrógenos (RE), a los receptores de andrógenos (RA) y a los receptores a P4 (RP), y por
ello presenta triple actividad hormonal (Blom, M.J. et al., 2001).

A B

Fig.5. Estructura química del noretinodrel (A) y de la noretisterona (B)

Estructuralmente es diferente a los moduladores selectivos del receptor a estrógenos,

(SERMs por sus siglas en inglés), con una configuración 3-ceto-Δ5-10 con dos
substituyentes, un grupo α metilo en la posici
ón 7, así como unα17 -etilo (Reed y
Kloosterboer, 2004).

α 3 -hidroxi-Tibolona
El metabolismo de la Tibolona se realiza rápidamente originándose
(3α–OH Tibo) y 3β-hidroxi-Tibolona (3β–OH Tibo) en las formas sulfatadas e inactivas; a
partir de ellas o directamente de la Tibolona se produce un tercer compuesto que es el Δ4

29
isómero (Blom et al., 2001). Los isómeros α y β tienen una gran afinidad por los RE
mientras que el Δ4 sólo tiene afinidad por el RA y el RP (Figura 6).

Fig. 6. Estructura química de los metabolitos de la Tibolona

La Tabla 4 nos muestra la afinidad relativa de la Tibolona y sus metabolitos con los RE y
RP.
Tabla 4. Afinidad relativa para el RE y RP para Tibolona y sus metabolitos. Adaptado de
Markiewicz y Gurpide, 1990

Afinidad relativa (%)

Esteroide RE RP
(E2=100%) (Org 2058=100%)
Tibolona <1 1
Δ4 Tibolona <1 10
3α– OH Tibolona 2 No unión
3β–OH Tibolona 2 No unión

El efecto biológico de la Tibolona se determina directamente por la característica y

capacidad química de cada tejido, así como con el contenido de RE, RP y RA. Es decir los

30
SERMs regulan la actividad de los RE, en cambio la acción de la Tibolona se modula
específicamente en los tejidos (Blom et al., 2001).

2.3.2 Mecanismo de acción de la tibolona

La Tibolona tiene efectos estrogénicos, progestagénicos y androgénicos. Además, reduce a

nivel central, los niveles de la FSH y la LH (Reed y Kloosterboer, 2004).

El efecto hormonal que produce este esteroide depende del tejido en el que actúe, es decir
en unos tejidos actuará como un estrógeno y producirá efectos agonistas estrogénicos, y en
otros actuará como un progestágeno o como un andrógeno y producirá los correspondientes
efectos hormonales. Su perfil de acción resultará de la suma de sus distintos efectos
hormonales en los diferentes órganos y tejidos en los que actúa. Es por esto por lo que se
dice que la Tibolona es una molécula de acción tejido específica. De este modo, su acción
es estrogénica en el hueso, la vagina y el cerebro; por otra parte el efecto es progestacional
sobre el endometrio y androgénico sobre el hígado.

La Tibolona tiene un efecto similar a los estrógenos al disminuir los bochornos y otros
trastornos climatéricos. Además, ejerce efectos similares a los estrógenos sobre la vagina y
los huesos. Debido a sus efectos progestagénicos, no estimula el endometrio. Por lo tanto
si se produce sangrado, éste por lo general se debe a un endometrio atrófico (Reed y
Kloosterboer, 2004).

En el caso de la mama, se reportó que la Tibolona aumentó la expresión de los RP A y RP

B sin afectar al REα y al REβ en los senos de macacos. Estos resultados indican que los
efectos de la Tibolona en el tejido mamario puede ser mediada a través de la regulación
diferencial de las isoformas del RP-A y RP-B y por lo tanto distintas de las observadas con
la TRH convencional (Ma et al., 2008).

Se tenía evidencia de que la Tibolona aumenta la densidad ósea (Bjarnason et al., 1996),
pero se tenía duda si reducía el riesgo de fracturas atribuibles a osteoporosis. Gallagher

31
(2001) reportó que el uso de Tibolona en dosis de 2,5 mg produjo un aumento de la
densidad ósea en columna lumbar de 2,6% respecto al basal y en cadera total aumentó más
de 2% con Tibolona 2,5 mg, en tanto que con placebo se redujo 1,5. Lamentablemente no
se mencionó la precisión de los resultados (IC 95%) y a pesar del seguimiento
relativamente breve se perdió el 20,8% de la muestra. Por otro lado, en un estudio aleatorio
de 4538 mujeres, que estaban entre las edades de 60 y 85 años, la Tibolona redujo el riesgo
de fracturas y de cáncer de mama y cáncer de colon, pero aumentó el riesgo de accidente
cerebrovascular en mujeres ancianas con osteoporosis (Cummings et al., 2008).

Por último, la Tibolona tiene efectos sobre algunos parámetros metabólicos y

hematológicos, tales como una disminución plasmática del colesterol en lipoproteínas de la
sangre. La implicación clínica del efecto de la Tibolona sobre el metabolismo de los lípidos
y la hemostasia no está clara. Hasta la fecha no se han podido obtener conclusiones
definitivas con respecto a los riesgos de enfermedad cardiovascular o tromboembolismo
venoso así como los efectos a largo plazo (Garefalakis et al., 2008).

2.3.3 Absorción, biotransformación y excreción

Después de la administración oral, la Tibolona es rápidamente absorbida y distribuida.

Debido a su rápido metabolismo en el intestino los niveles plasmáticos de Tibolona son
muy bajos (Verheul et al., 2007).

Los datos farmacocinéticos indican cinéticas lineales. Los niveles plasmáticos máximos se
alcanzan después de 1-4 horas, posteriormente se metaboliza en el hígado y no se produce
acumulación. La Tibolona y el Δ 4 isómero sólo están presentes durante las primeras 6 horas
tras la ingesta oral (Verheul et al., 2007).

En mujeres posmenopáusicas se reportó que el 98% de los metabolitos con actividad

estrógenica se encuentran en forma disulfurada en suero y tejidos. De los metabolitos
conjugados, el 3α-hidroxi-Tibolona predomina en el suero, mientras que el Δ4 Tibolona
predomina en miometrio y la vagina. Los niveles de metabolitos disulfatados en el suero y

32
tejidos son de 3 a 5 veces más altos después de dosis múltiples que después de una dosis
única (Verheul et al., 2007).

La excreción de Tibolona se produce principalmente en la forma de metabolitos polares.

Una pequeña cantidad del compuesto administrado es excretada en la orina, pero la mayor
parte es eliminada vía biliar y por las heces. En total la vida media de depuración es cercana
a 48 horas. (Verheul et al., 2007).

2.3.4 Efectos de la Tibolona en Sistema Nervioso Central

Como se hizo referencia anteriormente, el primer estudio clínico en mujeres

posmenopáusicas por Lindsay y cols (1981) demostró además del efecto positivo en los
huesos, la propiedad de aliviar síntomas climatéricos (Reed y Kloosterboer, 2004). Los
efectos sobre el hueso, las sudoraciones y los bochornos son similares a los observados para
los tratamientos con estrógenos, por el contrario la Tibolona puede mejorar la libido de
manera más eficaz que la terapia de reemplazo estrogénica (TRE) (Garefalakis y Hickey,
2008).

En otro estudio, animales ovariectomizados en la misma especie, los niveles cerebrales de

los metabolitos de la Tibolona se midieron tras recibir Tibolona durante 36 días. En
comparación con el suero, se encontraron altos niveles de los metabolitos estrogénicos así
como del Δ4-Tibolona y menores niveles de metabolitos sulfatados en diversas regiones
cerebrales. Los altos niveles de metabolitos estrogénicos en el hipotálamo podrían explicar
la reducción de sofocos (Verheul y Kloosterboer, 2006).

En cuanto a la memoria, se reporto que ratas viejas ovariectomizadas (OVX) tratadas con
una dosis de 1 mg/kg de Tibolona y evaluadas en la prueba del laberinto elevado, pasaron
más tiempo en los brazos abiertos que los animales tratados con placebo. Por otro lado las
ratas con OVX simulada y tratadas con una dosis de 0.5 mg/kg de Tibolona, así como las
ratas jóvenes OVX tratadas con Tibolona tuvieron un peor desempeño comparados con los
otros grupos en el laberinto de agua (De Aguilar et al., 2006).

33
Se ha reportado que el tratamiento crónico (dos años) con Tibolona a monos
Cynomologous OVX produjo reducciones significativas tanto en la acetilcolintransferasa
(ChAT) y acetilcolinesterasa (AChE) en el septo medial / banda diagonal de Broca, y este
efecto fue dosis-dependiente (Gibbs et al., 2002). Eso nos indica que los efectos en los
procesos cognoscitivos de la Tibolona, probablemente no sean debido a un efecto sobre la
ChAT y AChE (Qiu et al., 2008).

En estudios hechos en humanos, se ha reportado que en mujeres premenopáusicas, la

administración de Tibolona revierte el daño sobre la cognición que es causado por el
acetato de leuprolide, y mejora el humor y la calidad de vida en pacientes que reciben este
agonista de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) para el tratamiento de
leiomiomas uterinos (Palomba et al., 2008).

Por otra parte, se ha reportado en estudios donde se analizaron efectos cognitivos después
de 10 años de tratamiento con diferentes TRH, que después de la exposición a una prueba
de estrés leve, el grupo control se sentía más ansioso que el grupo tratado con Tibolona. El
grupo que tomaba Tibolona tuvo mejor respuesta en las pruebas de memoria semántica
(memoria para los hechos), evaluados en una tarea de la generación de categoría, pero que
no difirieron en las pruebas de memoria episódica (memoria de eventos). En ese mismo
estudio se reporto que el grupo de Tibolona tuvo peores resultados en una tarea de atención
sostenida y una tarea de planificación, tareas que están asociadas con la función del lóbulo
frontal (Fluck et al., 2002).

2.4 MEMORIA Y APRENDIZAJE

El aprendizaje y la memoria son procesos correlacionados capaces de sufrir modificaciones

en función de los estímulos ambientales (Machado et al., 2008).

El aprendizaje se define como el proceso por el cual los organismos modifican su conducta
para adaptarse a las condiciones ambientales del medio que los rodea, puede considerarse
como una cambio en el sistema nervioso que resulta de la experiencia y que origina

34
cambios duraderos en la conducta de los organismos (Tulving, 2000; Correa, 2007). No se
consigue separar el aprendizaje de la memoria, ni resulta posible realizar dicha distinción
dentro del circuito neuronal. La medida de lo aprendido se relacionaría con la memoria,
siendo ésta la expresión de la capacidad de retener y posteriormente recuperar
informaciones adquiridas. Así, un recuerdo sería un patrón de actividad de un gran número
de neuronas evocado por un estímulo. Se puede definir el concepto de memoria como “la
retención a largo plazo de representaciones internas dependientes de la memoria”. Desde
una descripción de la organización de la memoria, ésta representa el conjunto de estructuras
y procesos cognitivos que permite fijar, guardar y recuperar diferentes tipos de información
(Correa, 2007; Machado et al., 2008; Navarrete, 2008; Llorente-Vizcaíno et al., 2001).

Todo proceso mnemónico comienza con la adquisición, que consiste en la entrada de un

suceso en el circuito neuronal ligado a la memoria. Tras la adquisición estos sucesos se
almacenan por un tiempo, que puede oscilar entre algunos segundos a varios años. Este
fenómeno se denomina retención (Machado, 2008).

2.4.1 APRENDIZAJE: Modelos condicionantes.

El aprendizaje no es un proceso único, sino que tiene dos formas principales: una forma
explícita que se relaciona con los procesos cognitivos y una forma implícita relacionada
con los procesos motores o el aprendizaje verbal, sin ser dependiente de los procesos
cognitivos. La forma implícita puede ser no asociativa o asociativa. En la primera, la
respuesta a un estímulo se produce en función del tiempo y se observa a través de
comportamiento. Existen dos tipos de aprendizaje no asociativo: habituación y
sensibilización. La habituación se entiende como la reducción de la eficiencia del estímulo
que, por no ser significativo, conduce a ignorarlo. Se supone que tal fenómeno es el
resultado de la disminución de la cantidad de glutamato liberado y la reducción de la
capacidad de las vesículas. La sensibilización es la intensificación de la respuesta en
función de un fuerte estímulo capaz de producir incluso la percepción de estímulos que,
anteriormente al hecho, se consideraban débiles. Esta última puede durar minutos, días o
incluso semanas y se considera modulada por un reforzamiento en la liberación de

35
neurotransmisor en las neuronas facilitadoras (algunas de las cuales son serotoninérgicas)
(Machado et al., 2008).

El aprendizaje asociativo, se denomina como la forma en que los seres vivos adquieren
conocimiento acerca de la causalidad de un evento, es decir, la relación entre estímulos y
respuestas (Correa, 2007). Se caracteriza por asociaciones entre hechos (Machado, 2008).
En términos simples, dentro de este contexto se encuentran tres variantes experimentales:
condicionamiento clásico, condicionamiento instrumental (operante) y transferencia
pavloviana-instrumental (Correa, 2007).

2.4.2 Condicionamiento clásico pavloviano.

En el condicionamiento clásico se produce la relación estímulo-respuesta, donde el primer

estímulo evoca una respuesta que se puede medir de forma diferente a aquella que se
produce como resultado de la aplicación del segundo estímulo. El primero es el estímulo
incondicionado (EI), que no requiere entrenamiento o preparación anticipada a la respuesta;
el segundo es la estimulación condicionado (EC) que necesita del entrenamiento específico
sobre la acción motora pretendida (Machado, 2008). Este tipo de condicionamiento fue
originalmente descrito por Pavlov: la presentación de un EI que produce una respuesta
refleja, típica de la especie o respuesta incondicionada (RI), con un estímulo neutro que
más tarde será el EC, hace que éste vaya adquiriendo propiedades condicionadas por
asociación y así el EC produce, con el tiempo, el mismo tipo de respuesta refleja, ahora
condicionada (RC), que el estímulo originario (EI). La RC es ahora una respuesta
anticipada a la presentación del EI, dado que el organismo es capaz de determinar una
relación predictiva entre el EC y el EI. Asimismo, cuando ya se ha establecido el
condicionamiento, la presentación repetida del EC sin que éste baya seguido del EI tiene
como consecuencia la desaparición gradual de la RC, fenómeno conocido como “extinción”
(Correa, 2007)

Las bases neuroanatómicas propuestas para este tipo de aprendizaje son las estructuras que
componen el haz prosencefálico medial, un conjunto de axones que, partiendo del
mesencéfalo, proyectan a lo largo del eje rostro-caudal hasta el prosencéfalo basal rostral
(Correa, 2007)

36
En el tipo de aprendizaje pavloviano con componente emocional se sabe que depende de
la amígdala. Para que se produzca este tipo de condicionamiento, las vías que transmiten la
información del EC tienen que converger en los núcleos basolaterales y núcleo central de
dicha estructura, implicando también a los núcleos geniculados mediales e interlaminares
del tálamo. El núcleo central, con sus proyecciones colinérgicas hacia la corteza, facilita el
establecimiento de circuitos neurales sensibles al EC (Correa, 2007).

2.4.3 Condicionamiento instrumental u operante.

El condicionamiento instrumental u operante se describe por “la ley del efecto” (Correa,
2007), es la asociación de un comportamiento particular a un estímulo significativo, una
relación estímulo-comportamiento orgánico donde el acto motor es consecuencia de una
respuesta neurofisiológica a un suceso (Machado, 2008). La concepción de aprendizaje
instrumental de Skinner también implica un reforzamiento pero en este caso, de las
relaciones entre la respuesta y sus consecuencias. Skinner definió un reforzador (Rf) como
una consecuencia (estímulo o actividad), que al seguir a la conducta instrumental, aumenta
la probabilidad de que dicha conducta se repita en el futuro y, por tanto, el refuerzo
aumentará la probabilidad de ocurrencia de cualquier respuesta instrumental que se dé justo
antes de que aparezca el reforzador. Así pues, el condicionamiento instrumental es una
forma de aprendizaje asociativo entre la realización de una conducta o respuesta (R) que,
operando con el ambiente, sirve como el instrumento para la obtención de un Rf. Un Rf es
un estímulo o actividad que incrementa la probabilidad de que se dé la R asociada a él, éste
puede ser aversivo (Rf negativo) o apetitivo (Rf positivo). Se trata de un condicionamiento
flexible (a diferencia del clásico pavloviano) en el cual el individuo actúa en función de las
consecuencias de su conducta. La adquisición de una conducta instrumental dirigida a una
meta (que es el Rf) implica dos formas de aprendizaje: el primero, aprender sobre la
relación instrumental entre R-Rf y el segundo, aprender el valor del incentivo del propio Rf.
(Correa, 2007).

Las diferencias más claras entre el condicionamiento clásico y el instrumental radican en

que la RI, que más tarde se condiciona, en el clásico es una respuesta automática (refleja),

37
mientras que en el condicionamiento instrumental el organismo emite una respuesta
voluntaria para conseguir un Rf (Correa, 2007).

El sustrato neural que se ha estudiado en relación con el proceso de refuerzo se ha centrado

en las estructuras que comprenden el haz proscencefálico medial, un grupo de axones que
partiendo del mesencéfalo, proyectan a lo largo del eje rostro- caudal hasta el prosencéfalo
basal rostral. Estas neuronas dan lugar a los sistemas dopaminérgicos mesolímbicos (Área
Tegmental Ventral-núcleo acumbens/amígdala/hipocampo, entre otros), mesocortical (Área
Tegmental ventral-neocórteza prefrontal/corteza cingulada/hipocampo) y nigroestriatal
(sustancia negra compacta-neoestriado). Se ha sugerido que la transmisión dopaminérgica
en la corteza prefrontal-medial y en el núcleo acumbens es crucial para la adquisición de
conductas instrumentales ya que la presentación de reforzadores primarios elevan los
niveles de dopamina (DA) en ambas regiones (Correa, 2007).

2.4.4 Transferencia pavloviana instrumental.

Dado que una R automática puede conllevar a una consecuencia positiva o negativa para el
sujeto, todos aquellos estímulos asociados pavlovianamente (EC) a la emisión de la R
también quedarán asociados a la consecuencia de la emisión de ésta. Esta asociación llevará
a que, en sucesivas ocasiones, el sujeto, ante la presencia de los EC, además de realizar la R
refleja, llevará a cabo respuestas aproximatorias a éste en un intento por acercarse hacia la
obtención del Rf y de las consecuencias emocionales que éste produce. Así, estos EC se
convierten en incentivos que también son capaces de actuar como Rf secundarios
promoviendo la R instrumental.

Las bases neuroanatómicas implican redes neurales corticosubcorticales que incluyen la

corteza cingulada anterior, la parte central del núcleo acumbens, el núcleo central de la
amígdala y el sistema mesolímbico de la dopamina (DA) (Correa, 2007).

Otros tipos de aprendizaje también implicados en este estudio son el aprendizaje motor y
de destrezas y el aprendizaje de hábitos.

38
2.4.5 Tipos y características de los sistemas de memoria.

La memoria es un proceso que depende de diferentes sistemas cerebrales. La distinción

principal habría que hacerla entre la capacidad de recuperar conscientemente hechos
(memoria declarativa o explícita) y un conjunto heterogéneo de capacidades de aprendizaje
no conscientes (memoria no declarativa o implícita) que sólo se expresan a través de la
ejecución (Correa, 2007; Navarrete, 2008). La memoria declarativa es accesible a múltiples
sistemas de respuesta, por lo tanto es más flexible mientras que la no declarativa es más
encapsulada y tiene menos acceso a los sistemas no involucrados en el aprendizaje inicial
(Squire, 1996).

A su vez, la memoria declarativa está compuesta por la memoria semántica y la memoria

episódica (memoria de los eventos en tiempos y lugares específicos) (Roediger, 2001);
Tulving (2000) ha descrito a la memoria semántica como aquel conocimiento organizado
que un individuo posee acerca de palabras y otros símbolos verbales, sus significados y
referencias, además de las reglas, fórmulas o algoritmos para la manipulación de conceptos
y sus relaciones entre sí. La memoria semántica se refiere al conocimiento relativamente
permanente del mundo o al conocimiento en general (Roediger, 2001).

La memoria episódica se define como la memoria de los acontecimientos y eventos la cual,

como requisito indispensable, debe ser evocada junto con las circunstancias y el lugar de
dicho acontecimiento. Incluye los mecanismos cognitivos y neurológicos implicados en el
recordar dichos eventos por lo tanto, entre más significancia tenga la información, más fácil
será el recordarla (Roedinger, 2001; Kapur, 2008). Muchos investigadores indican que
este tipo de memoria se ve favorecidas notablemente cuando existe una fuerte motivación y
un estado emocional adecuado (Almaguer, 2002).

La adquisición de la memoria explícita o declarativa es un proceso que requiere de tres

fases (Navarrete, 2008):

Codificación: Captación de detalles sobre los estímulos y el entorno para su posterior

consolidación (procesamiento de la información para almacenarla).

39
Almacenaje: Retención de la información a largo plazo de tiempo.

Recuperación: Utilizar la información retenida para crear una representación consciente del
suceso o para ejecutar una respuesta motora aprendida.

Dado que la memoria declarativa puede adquirirse rápidamente, también se puede olvidar
con la misma velocidad. Por esta razón, provoca cambios poco significativos en las
conexiones sinápticas que se distribuyen por toda la corteza. En la región del lóbulo
temporal se localizan las principales estructuras nerviosas implicadas en este tipo de
memoria tales como el hipocampo y la corteza entorrinal. Existen regiones denominadas
“moduladoras”, que actúan en la formación de la memoria declarativa. Entre otras
estructuras se encuentra la amígdala, la sustancia negra, los núcleos del rafe y el nucleo
núcleo basal magnocelular (NMB) (Machado, 2008). Las otras regiones reguladoras de los
estados de ánimo, la ansiedad, la alerta y las emociones son responsables de la liberación de
los neurotransmisores DA, noradrenalina (NA), serotonina y acetilcolina (ACh). Este
proceso se lleva a cabo mediante el contacto de sus axones con el hipocampo, la amígdala y
las cortezas entorrinal, cingulada y parietal (Machado, 2008). La memoria declarativa, a
diferencia de la no declarativa, requiere vínculos asociativos entre varios tipos de
información que son almacenados en múltiples regiones. Posee conexiones recíprocas
(directas e indirectas) con el área visual y otras regiones sensoriales equivalentes (Squire,
1996).

La memoria no declarativa es la resultante de procesos de aprendizaje no consciente

realizados a través de hábitos y habilidades, mediante estimulación o sensibilización previa,
y en los que interviene la musculatura esquelética o bien, respuestas emocionales y el
aprendizaje no asociativo (Navarrete, 2008).

La memoria no declarativa se denomina también memoria procedimental (Machado, 2008)

y se revela cuando experiencias previas facilitan la ejecución en una tarea que no requiere
del recuerdo consciente o intencionado de dichas experiencias, son nuestros recuerdos no
conscientes en los cuales están basados nuestros hábitos perceptivos y motores (Correa,
2007). Se encarga de informaciones más subjetivas así como del aprendizaje de las
habilidades motoras, los hábitos y comportamientos (Machado, 2008). La formación de este

40
tipo de memoria requiere cambios duraderos en las conexiones sinápticas y se adquiere
mediante la práctica y repetición de los hechos que deben aprenderse, dando lugar a un
aprendizaje de larga duración, que difícilmente falla y sufre modulación por variables
emocionales. Las regiones responsables son, básicamente el núcleo caudado (inervado por
la sustancia negra) y el cerebelo (Machado, 2008).

La memoria no declarativa involucra un amplio rango de experiencias y habilidades

humanas: condicionamiento clásico, experiencia de aprendizaje motor, fenómeno de
preparación sobre ciertas pruebas, resolución de fenómenos complejos (basado en la
experiencia) y más. Todas ellas podrían representar subcategorías de dicha memoria
(Roediger, 2001).

Se ha propuesto que la memoria no declarativa es más antigua en términos evolutivos y

forma parte de todos los animales, por otro lado, la memoria declarativa es de más reciente
aparición durante la evolución del cerebro y los sistemas neurocognitivos, el subtipo
episódico quizá sea única en los humanos (Roediger, 2001; Machado, 2008).

Una forma de memoria implícita es la denominada “priming” o sistema de representación

perceptivo que se expresa en la identificación realzada de los objetos como entidades
físicas y perceptivas estructuradas, por lo que la exposición perceptiva a un objeto en una
ocasión primaria facilita la percepción del mismo objeto en ocasiones posteriores.
Fenomenológicamente, se describe como la “huella” inconsciente de ciertos estímulos que
facilitan diferentes procesos mentales, incluida la memoria (Llorente-Vizcaíno, 2001).

Los efectos de facilitación o “priming” están conservados en todas las alteraciones de la

memoria excepto en la Enfermedad de EA. Los resultados indican que la afectación del
priming es específica en la EA, lo cual permite que algunos autores lo consideren como un
marcador cognitivo de la EA (Llorente-Vizcaíno, 2001)

Las pruebas de memoria declarativa miden recolección de consciencia, mientras que las de
memoria implícita reflejan la retención que ha sido descrita como automática, incidental o a
nivel inconsciente. Algunas de las pruebas directamente relacionadas con el estudio de la
memoria explícita incluyen: evocación libre, evocación seriada, evocación de pares

41
asociados, reconocimiento de objetos, pruebas de estimación de la frecuencia absoluta,
entre otras (Roediger, 2001).

La afectación en las pruebas precedentes, permite definir el síndrome amnésico retrógrado

de la EA en fases iniciales y leves. Algunos autores han atribuido tal síndrome a una falla
en el proceso de fijación así como una alteración en los procesos de recuperación (Llorente
–Vizcaíno, 2001).

Recientes observaciones han señalado la degradación en la organización de la memoria

semántica como uno de los signos prominentes a medida que progresa la enfermedad; así
en las fases iniciales y leves no es tan grave como la memoria episódica aunque está
presente pero se infravalora por la afectación de esta última (Llorente-Vizcaíno, 2001).

2.4.6 Tipos de memoria en función de la duración de la experiencia.

La memoria puede ser ordenada generalmente por su persistencia, iniciando con la

memoria sensorial efímera y posteriormente a la memoria a corto plazo o memoria de
trabajo (almacenando la información en la mente y trabajando con ésta) y memoria a largo
plazo. Debido a que no existen límites marcados, un tipo de memoria puede mezclarse con
otro (Roediger, 2001).

2.4.6.1 Memoria sensorial o inmediata

Las sensaciones de los órganos de los sentidos no son codificadas inmediatamente en el

cerebro, sino se almacenan en el sistema nervioso como información hasta ser procesadas
por centros corticales superiores. Esta persistencia sensorial refleja una memoria efímera
del mundo exterior. Aunque la memoria sensorial parece existir para todos los sentidos, la
más estudiada es para la visión y la audición.

La memoria sensorial para la visión se refiere como memoria icónica y para la audición es
llamada ecoica. Ambas presentan dos formas de persistencia, una más corta que la otra. La

42
forma más corta dura solo cientos de milisegundos, pero la más larga puede durar entre 2-
10 segundos (Roedinger, 2001).

2.4.6.2 Memoria a corto plazo o memoria de trabajo.

Información almacenada inicialmente de forma lábil y transitoria (<4hr) (Almaguer, 2002).

El término memoria de trabajo es usado para describir un sistema de memoria temporal
donde la información es mantenida y manipulada por un periodo breve de tiempo
(Roedinger, 2001). La información puede ser transferida a depósitos a largo plazo
mediante un proceso de consolidación, dependiendo de qué tan extensamente ésta fue
procesada mientras existe retenida en el sistema a corto plazo (Almaguer, 2002). Debido a
que solo una pequeña cantidad de información puede mantenerse en el depósito a corto
plazo en un momento dado, nueva información entrante reemplaza la información vieja en
el depósito (Roedinger, 2001). Se ha propuesto que la memoria a corto plazo está integrada
por tres componentes básicos: el centro ejecutivo, vía fonológica y el componente
visoespacial (Baddeley y Hitch, 2000).Varios estudios han observado una afectación de la
memoria de trabajo desde el inicio de la EA (Llorente-Vizcaíno, 2001).

2.4.6.3 Memoria a largo plazo

Todo lo que recordamos y no ocurrió en los minutos previos se considera memoria a largo
plazo (Roedinger, 2001) por un periodo mayor de 4hr (Almaguer, 2002). Designa una serie
de propiedades extensas y difusas de la capacidad de retención de un conocimiento por
tiempo prolongado. Se encuentra organizada por significados más que por características
perceptuales. Pueden ser hechas dos distinciones importantes: declarativa y no declarativa
o implícita, ambas tratadas en la sección previa (Squire, 1996; Roedinger, 2001). En el
siguiente esquema (Fig. 7) se muestra la subclasificación de la memoria a largo plazo antes
descrita así como las estructuras de las cuales depende este tipo de memoria.

43
 MEMORIA A LARGO PLAZO

EXPLÍCITA IMPLÍCITA
(declarativa) (no declarativa)

Condicionamiento Aprendizaje
PROCEDIMIENTOS “Priming” clásico simple no asociativo
(habilidades hábitos)

Respuesta Musculatura
emocional esquelética

Lóbulo temporal Neocorteza Amígdala Cerebelo

Estriado Vías
medio del diencéfalo
reflejas

Fig. 7. Tipos de memoria y estructuras cerebrales relacionadas. En función de cómo se

recibe y almacena la información, cabe distinguir dos grandes tipos de memoria: la
implícita, que no requiere un aprendizaje consciente y la explícita, producto de un esfuerzo
cognitivo consciente. Modificado de Navarrete, 2008.

2.5 Hipocampo

El hipocampo es una de las partes del cerebro que más se ha estudiado. El interés hacia él
se debe tanto a su papel funcional (implicación en procesos de memoria y aprendizaje),
como a las peculiaridades únicas de la organización del hipocampo y de su desarrollo, pues
contiene varias subregiones con diferente organización y ritmo de desarrollo. Su ordenada
organización estructural en capas y la elevada capacidad de reinervación, hacen del
hipocampo el modelo experimental más empleado para el estudio del funcionamiento de los
circuitos neuronales y la plasticidad y capacidad regenerativa del cerebro (Reznikov, 1991).
Conviene distinguir entre los términos región hipocampal, formación hipocampal, e
hipocampo. En el cerebro de mamíferos la región hipocampal es el componente central del
sistema límbico. Este se compone de una porción cortical y una porción subcortical. La

44
porción cortical está constituida por la circunvolución límbica, la cual es parte de la corteza
cerebral, tiene forma de anillo, está situada en la cara interna de cada hemisferio, separa la
neocorteza del hipotálamo y del tronco encefálico, e incluye el giro parahipocampal,
cingulado y subcalloso. La porción subcortical incluye la región hipocampal, la corteza
olfatoria medial a la fisura rinal, la amígdala, el septum, los cuerpos mamilares, y el núcleo
talámico anterior (Reznikov, 1991; Cardinali, 1992). La región hipocampal se subdivide en
dos partes (Ramón y Cajal, 1911; Lorente de Nó, 1934; Blacjcstad, 1956; Angevine, 1965,
1925; Isaacson, 1987): a) la formación hipocampal, consistente en el hipocampo
propiamente: el Cuerno de Ammon, el giro dentado, y el subículum (incluyendo el
prosubiculum), y b) la formación parahipocampal, consistente en el presubiculum, el
parasubículum (incluyendo el área retroplenial) y la corteza entorrinal. Sin embargo, el
término hipocampo es empleado a menudo para designar la formación hipocampal
(Isaacson, 1987).

El hipocampo representa una continuación de la corteza cerebral que se enrolla, mientras

que el giro dentado representa su final libre. La formación hipocampal está curvada a lo
largo de su eje longitudinal (septo-temporal), de manera que la parte dorsal posee una
orientación casi horizontal, y la porción ventral desciende a la base cerebral (Blackstad et
al, 1970; Hjorth-Simonsen, 1972; Kalhe, 1988), es decir, posee forma de “C”.

El hipocampo se ha subdividido en diversas regiones o áreas. Ramón y Cajal (1911)

distinguió en los roedores dos regiones, una inferior, que comprende la zona de células
piramidales grandes, y otra superior, que comprende el resto del hipocampo. Un análisis
morfológico más detallado permitió a Lorente de Nó (1934) subdividir el hipocampo en
cuatro campos: CAl, CA2, CA3 y CA4 (Fig. 8). El área CAl corresponde a la mayor parte
de la región superior, CA2 está situada cerca de la curva del arco del hipocampo, CA3
ocupa la mayor parte de la región inferior, y CA4 se encuentra dentro de la apertura del
arco que forma el giro dentado, en la región del hilus.

45
Fig 8. Esquema de la estructura del hipocampo. CA: Cuerno de Amón.

2.5.1 Vías aferentes del hipocampo

La información llega al hipocampo a través de diferentes vías que son las cortezas
entorrinal, parahipocámpica posterior y prepiriforme, y del núcleo central de la amígdala, y
van al subículo, el cuerno de Amón y el giro dentado. También hay información que llega
de la corteza cingular y va al subículo, y de los núcleos del septum, el hipotálamo y la
corteza entorrínica, por la comisura del trígono, al hipocampo contralateral. Además, del
septum y los núcleos de la banda diagonal de Broca llegará información por el fórnix al
cuerno de Amón, el giro dentado y el subículo (Ottersen y Storm-Mathisen, 1989). Otras
aferencias al hipocampo provienen de la parte rostral del mesencéfalo, el núcleo
interpeduncular y el locus coeruleus, así como del núcleo reticular superior central dorsal
del rafé y dorsal tegmental (Shepherd, 1979).

2.5.2 Vías eferentes del hipocampo

El fórnix que, en su contingente retrocomisural, llevará 56% del total de las fibras, es una la
via eferente principal de la formación hipocampal. Después de su conexión con el cuerpo

46
mamilar ipsilateral, y por medio del haz mamilotalámico de Vicq d’Azyr, descargará en los
núcleos talámicos anteriores. El contingente fornical precomisural irá hacia áreas y núcleos
septales, nucleus accumbens, núcleo olfatorio anterior y núcleos preópticos. El contingente
supracomisural irá a la corteza ístmica y la corteza cingular, y las áreas y los núcleos
septales. El subículo se proyectará a las cortezas frontal, entorrínica, perirrínica, temporal
media, retroesplenial, cingular y prefrontal, así como a los núcleos amigdalinos (Andersen,
et al., 2007)

2.6 Acetilcolina

La ACh (Fig. 9) fue el primer neurotransmisor en ser descubierto. Fue aislado en 1921 por
un biólogo alemán llamado Otto Loewi, quien ganó posteriormente el premio Nobel por su
trabajo. La ACh tiene muchas funciones: es la responsable de la estimulación de los
músculos, incluyendo los músculos del sistema gastro-intestinal. También se encuentra en
neuronas sensoriales y en el sistema nervioso autónomo, y participa en la programación del
sueño REM (Perry et al., 1999).

Fig. 9. Estructura química de la acetilcolina (ACh).

En el cerebro de los mamíferos, el efecto fisiológico más importante de la ACh es una

reducción de la permeabilidad a K+, de tal forma que las neuronas sensibles a esta son más
susceptibles a otras influencias excitatorias (Perry et al., 1999).

Todas las regiones de la corteza cerebral están inervadas por ACh, por lo que no es de
extrañar que influya sobre la función cortical. Por ello, varios grupos neuronales están
relacionados esencialmente con fenómenos de activación cortical, el paso de sueño a vigilia

47
y también con la memoria. Así, la actividad colinérgica es esencial para mantener el ritmo
hipocampal (Díaz Hernández et al., 2000).

Por otra parte, las lesiones en el núcleo basal de Meynert en animales de experimentación
provocan pérdida de memoria, que se revierte tras la administración de agonistas
colinérgicos. Las vías corticales procedentes de este núcleo juegan un papel preponderante
en los procesos de aprendizaje mediante cambios en la liberación cortical de ACh, que
modulan la respuesta cortical a un determinado estímulo (Mesulamm, 1995).

Las vías colinérgicas del hipocampo parecen estar también involucradas en procesos de
memoria y asociación. El conjunto, la inervación colinérgica de áreas corticales y límbicas,
sugiere su participación en procesos de consolidación de la memoria y de componentes
emocionales (Perry, et al., 1999).

La ACh se sintetiza a partir de la colina, cuyo origen generalmente es la dieta, y de la

acetil-coenzima A, que proviene de la glucosa a través de varios pasos metabolicos que
ocurren en las mitocondrias. La enzima responsable de esta reacción es la ChAT
(Massoulie y Bon, 1982) (Fig 10).

Fig. 10. Síntesis de la Acetilcolina. Colin Acetil Transferasa (ChAT)

2.6.1 Vías cerebrales colinérgicas

Muchas de las evidencias sobre la localización de las vías colinérgicas en el cerebro han
sido obtenidas por estudios inmunohistoquímicos, por lo que se han utilizado anticuerpos
específicos para la ChAT, así como la aplicación de técnicas inmunohistoquímicas para la
localización de estructuras colinérgicas, lo que ha hecho posible desarrollar un mapeo sobre

48
la distribución de las neuronas y fibras colinérgicas con un alto grado de precisión (Oda,
1999).

También gracias a los estudios de hibridación in situ con sondas para los RNAm de la
enzima de síntesis, se ha logrado definir con mayor claridad los cuerpos neuronales, y de
este modo se dispone hoy en día de un mapa colinérgico cerebral (Perry et al., 1999) (Fig.
11).

Fig 11. Distribución de las vías colinérgicas en el cerebro

La distribución y morfología de las neuronas colinérgicas es muy variada. Las que tienen
axones cortos se pueden considerar como interneuronas, son muy abundantes en el estriado,
donde establecen una estrecha relación funcional con las neuronas dopaminérgicas, cuyas
terminales son muy abundantes en esta zona. Los núcleos de los pares craneales tienen
también abundantes interneuronas colinérgicas, lo mismo que toda la médula espinal. Otras
interneuronas colinérgicas se encuentran en la corteza cerebral de los roedores, pero no
tienen su equivalente en primates (Mesulman, 1995).

Las vías cerebrales colinérgicas con axones largos tienen una localización más difusa que
las aminérgicas, y no siempre sus cuerpos celulares se corresponden con núcleos definidos.
La vía colinérgica que sale de la base del cerebro anterior, cuyos cuerpos celulares se
encuentran en el septum, la banda diagonal de Broca, pallidum ventral y, sobre todo, el
núcleo basal de Meynert, se extiende hasta el bulbo olfativo, corteza, amígdala y/o

49
hipocampo, quedando toda la vía del sistema de recompensa cerebral bajo su influencia
(Gotti et al., 1997)

Una disminución de la funcionalidad de esta vía parece ser el origen de disfunciones

cerebrales, como el Alzheimer, la demencia asociada con aparición de cuerpos de Lewy,
incluso alguna variante de Parkinson. Es de destacar que el núcleo basal de Meynert, que
consta de unas 200,000 neuronas de cada lado del cerebro del individuo sano, suele perder
hasta 90% de sus neuronas en enfermos de Alzheimer (Perry et al., 1999).

2.7 Serotonina

En el año 1930, Vally y Erspamer demostraron la existencia de una sustancia en las células
enterocromafines de la mucosa digestiva a la que denominaron enteramina, que tenía la
propiedad de estimular la contracción de la musculatura lisa del sistema gastrointestinal.
Unos años más tarde, en 1948, Rapport y cols. aislaron del suero sanguíneo una sustancia
vasoconstrictora a la que denominaron serotonina, que identificaron como 5-
hidroxitriptamina (5-HT) (Fig 12) y que era la misma molécula que la enteramina
(Gronstad et al,. 1985; Wade et al., 1994).

Fig 12. Estructura quimica de la serotonina

En la actualidad se sabe que la serotonina es una sustancia perteneciente a las aminas

biógenas que actúa como neurotransmisor y como neuromodulador, y que juega un papel
importante en el humor, ansiedad, sueño y que se distribuye por todo el organismo
ejerciendo múltiples funciones. Está presente en la mayoría de las especies animales y
vegetales, localizándose en el caso de los mamíferos, en un 95% en el sistema

50
enterocromafín del tracto gastrointestinal, y el resto en las plaquetas y neuronas
triptaminérgicas del sistema nervioso central y del sistema nervioso entérico (Ahlman et al.,
1981; Gershon, 2004).

La síntesis de la 5-HT se inicia a partir del triptófano (Figura 13), que es oxidado en
posición 5 del anillo pirrólico, mediante la enzima triptófano-5-hidroxilasa (TPH) dando
como producto el 5-hidroxitriptófano. Esta molécula, tras descarboxilación de la cadena
lateral por la 5-OH-triptamina descarboxilasa da lugar finalmente a la 5-HT. La enzima
triptófano-5-hidroxilasa ha mostrado ser el factor limitante de la síntesis de la serotonina
(Camilleri et a., 1994).

Fig 13. Síntesis de la serotonina

2.7.1 Vías cerebrales serotoninérgicas

Por medio de técnicas inmunohistoquímicas se han podido identificar núcleos

serotoninérgicos en el interior del sistema nervioso. Se ha observado que las células
serotoninérgicas se concentran en la parte media del tallo cerebral, agrupándose en nueve
núcleos principales, conocidos como complejo nuclear del rafé. A partir de estos núcleos

51
nacen fibras que llegan a prácticamente todo el sistema nervioso (ganglios basales,
hipotálamo, tálamo, hipocampo, sistema límbico, corteza cerebral, cerebelo y médula
espinal). Los núcleos más anteriores (en animales) proyectan hacia las partes más rostrales
(hacia adelante), mientras que las más posteriores envían sus fibras hacia las áreas del tallo
cerebral y la médula. A través de estas proyecciones, la serotonina participa en el control de
los estados de sueño y vigilia, el ánimo, las emociones, el control de la temperatura, la
dieta, la conducta sexual, algunos tipos de depresión, conducta suicida, memoria y ciertos
estados alucinatorios inducidos por drogas (Daubert y Condron, 2010)

52
III PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Se sabe, que el E2 es un factor que promueve la supervivencia y diferenciación de

diferentes poblaciones neuronales en cultivo, como células hipotalámicas, células de la
amígdala o células hipocampales. Además, se ha demostrado que protege de la muerte
neuronal inducida por multitud de agentes estresantes como los radicales libres, el péptido
β-amiloide, y los aminoácidos excitadores glutamato, AMPA, kainato y NMDA.

La información derivada del estudio Women’s Health Initiative en 2002, acerca del
incremento en los riesgos de accidente vascular cerebral, enfermedad tromboembólica y de
cáncer mamario en las usuarias de la combinación de estrógenos conjugados de origen
equino y acetato de medroxiprogesterona, durante el climaterio y la posmenopausia a partir
del quinto año de administración, ha generado cambios y controversias sobre los criterios e
indicaciones para la prescripción del tratamiento hormonal de sustitución en estas etapas de
la vida. Esta situación ha provocado un renovado interés acerca de las posibles ventajas del
empleo de hormonas sintéticas como la Tibolona, la cual no tiene efectos estrogénicos en el
endometrio, por lo que su uso es seguro.

Existen diversos estudios de los efectos de la Tibolona en el hueso, en el músculo cardiaco

y en el endometrio. Sin embargo no hay estudios acerca del efecto de esta hormona
sintética en el Sistema Nervioso Central. Por lo que en este trabajo se analizaran los efectos
de la Tibolona a diferentes dosis en un modelo animal de menopausia para determinar si
presenta efecto neuroprotector y evaluar su capacidad para contrarrestar el déficit cognitivo
inducido por la ovariectomía a largo plazo.

53
IV HIPÓTESIS

Si la Tibolona tiene efectos neuroprotectores entonces la administración crónica disminuirá

el déficit cognitivo que se presenta en las ratas con ausencia prolongada de hormonas
esteroides.

V OBJETIVO
 Determinar la dosis efectiva de Tibolona en la que se observa neuroprotección en
ratas con ausencia prolongada de hormonas esteroides.

OBJETIVOS PARTICULARES

 Evaluar el efecto de diferentes dosis de Tibolona sobre la capacidad cognitiva de la

rata ovariectomizada y observada a largo plazo.
 Determinar el efecto de diferentes dosis de Tibolona sobre el contenido de ChAT y
TPH en el hipocampo de la rata ovariectomizada a largo plazo.
 Determinar por medio de la técnica de TUNEL la muerte neuronal en el hipocampo
de la rata ovariectomizada a largo plazo.

54
VI. Materiales y Métodos

ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

Se utilizaron ratas hembras de la cepa Sprague-Dawley de 250g de peso, las cuales se

ovariectomizaron bilateralmente bajo anestesia. Después de la cirugía se dejaron descansar
por dos semanas para iniciar la administración de la Tibolona como se describe a
continuación:

Grupo 1: Vehículo (agua)

Grupo 2: Tibolona 0.01 mg/kg
Grupo 3: Tibolona 0.1 mg/Kg
Grupo 4: Tibolona 1 mg/Kg
Grupo 5: Tibolona 10 mg/kg

La administración de la Tibolona y del vehículo fue por vía esofágica, por 18 semanas.
Cada grupo tuvo una n=8. Cada grupo de tratamiento se utilizó para las dos pruebas de
memoria y aprendizaje.

PRUEBAS DE MEMORIA Y APRENDIZAJE

PRUEBA DE AUTOAPRENDIZAJE

Una vez que se cumplió el tiempo post-ovariectomía se evaluó la capacidad cognitiva de las
ratas en el modelo de aprendizaje de tipo automoldelamiento. El entrenamiento se realizó
en una caja de Skinner. El procedimiento consiste en que el animal se “auto enseña” a
presionar una palanca y para que ocurra esto se le dio una serie de ensayos que consistieron
en una presentación de una palanca y el encendido de un foco que ilumina la palanca por un
minuto (EC); al termino de este periodo la luz se apaga y se entrega un trozo de comida
(EI), inmediatamente después se da inicio a otro ensayo. Si la rata recibe puntualmente
comida cuando presiona la palanca, su tasa subsiguiente de presión de la palanca durante el

55
EC (RC) aumenta por encima de la tasa espontánea. Después de un número de secuencias,
el animal experimenta el EC y presenta la RC, tal como tocar o presionar la palanca. El
incremento o decremento de RC se considera como una mejoría o deterioro del aprendizaje,
respectivamente. Cada animal se colocó en la cámara experimental por un periodo de
habituación de 20 min. Se dieron tres sesiones: 20 ensayos las dos primeras y 10 ensayos en
la última sesión, con 24 h de diferencia entre cada una (Meneses, 2003).

La caja de Skinner se encuentra conectada a un sistema de cómputo, el cual posee un

software que permite, automáticamente suministrar una esfera de alimento cada vez que el
animal presenta una RC. Asimismo, permite visualizar el número total de RC durante cada
ensayo (Navarrete, 2008). Se registraron los resultados obtenidos en la tercera sesión, se
promediaron y se expresaron como la media ± Error Estándar (EE).

LABERINTO ELEVADO EN FORMA DE T

Se utilizó un laberinto en forma de T (LET) elevado 50 cm del piso, con dos brazos
opuestos abiertos (50x10 cm) y un brazo cerrado sin techo (50x10x40 cm) todos
extendiéndose de una plataforma central (10x10 cm). Los brazos abiertos tienen una orilla
de plástico para evitar la caída de las ratas. Cada sesión se grabó con una videocámara.
Después de cada ensayo el aparato se limpió con solución de etanol al 10%.

Sesión de entrenamiento. Cada rata se colocó inicialmente al final del brazo cerrado del
LET. Al animal se le permitió explorar el brazo cerrado por un máximo de 300 s (criterio
de evitación). Si la rata dejó el brazo cerrado colocando sus cuatro extremidades en uno de
los brazos abiertos, el ensayo se terminó y el animal se regresó a su caja por 30 s. Después
de este tiempo, la rata se volvió a someter a tantos ensayos como fueron necesarios para
alcanzar el criterio de evitación, en otras palabras debió permanecer en el brazo cerrado
durante 300 s.

Además, cuando la rata exploró alguno de los brazos abiertos (BA) colocando 1, 2 ó 3 de
sus extremidades fuera del brazo cerrado y regresó a su posición original, esto se registró

56
como un intento, mismo que sirvió para calcular el índice de riesgo (IR) a través de la
siguiente fórmula:

Frecuencia de intentos
IR =
Entradas en el BA + frecuencia de intentos

Este parámetro permite eliminar la posibilidad de que el animal permanezca en el brazo

cerrado por habituación o por una falta de motivación. Así, un valor de IR = 0 implica una
incapacidad de asociación de la rata, mientras que un IR = 1 implica una respuesta máxima
de aprendizaje en este modelo.

Sesión de prueba. Setenta y dos horas después de la sesión de entrenamiento las ratas
fueron colocadas en el brazo cerrado y se registró la latencia para entrar a alguno de los
brazos abiertos solo una vez (De-Mello y Carobrez, 2002).

PRUEBA DE ACTIVIDAD ESPONTÁNEA

Con el fin de descartar cualquier alteración motora que pudiera afectar el desempeño de los
animales en las pruebas de memoria y aprendizaje, se monitoreó la actividad espontánea de
las ratas. Para ello, cada animal se colocó durante 5 minutos dentro de una caja de acrílico
de 10 x 20 x 40 cm la cual contiene sensores que permiten contabilizar automáticamente la
actividad general del animal (Opto-Varimex; Ugo Basile Italia). Esta prueba detecta tanto
la movilidad total que tenga el animal durante el tiempo de experimentación así como la
actividad ambulatoria y vertical. Los resultados se presentaron como la media ± EE del
número de cuentas en 5 minutos de la actividad ambulatoria

57
OBTENCION DEL TEJIDO

Una vez realizadas las pruebas conductuales se tomo una n=4 para la realización de las
técnicas de inmunofluorescencia y detección de la apoptosis y una n=4 para la realización
del western blot, que se describirán a continuación.

INMUNOFLUORESCENCIA

Después de realizar las pruebas conductuales, las ratas se anestesiaron y se perfundieron

con 200 mL de PBS seguidos por 250mL de paraformaldehído al 4% en solución de
fosfatos 0.1M pH 7.4. Los cerebros se removieron, post-fijaron en paraformaldehído al 4%
y posteriormente se crioprotegieron en una solución de sacarosa al 20% por 24 horas e
inmediatamente después se colocaron en una solución de sacarosa al 30%. Posteriormente,
se obtuvierón los cortes coronales del hipocampo, de 40 µm cada uno, por medio de un
criostato.

La doble inmunofluorescencia se realizó por el método de flotación, en donde los cortes

coronales se pusieron en cajas de 24 pozos a los cuales se incubaron por una hora en
agitación con una solución de PBS con Tritón al 0.3% para evitar uniones no específicas.
Una vez realizado el bloqueo se incubo con los aniticuerpos primarios para ChAT y TPH
toda la noche a 4°C. Se realizaran lavados con PBS 3 veces por 5 minutos. A continuación,
los cortes se incubaron con el anticuerpo secundario acoplado a un fluoróforo en una
dilución 1:1000-1:2000. Nuevamente se realizaron lavados con PBS 3 veces por 5
minutos. Finalmente, se montaron los cortes en laminillas cargadas y se les pondrá un
medio de montaje especial para fluorescencia.
Se tomaron fotos en un microscopio de epifluorescencia para su análisis cualitativo.

WESTERN BLOT

Una vez realizadas las pruebas conductuales se tomo una n=4 para realizar la técnica de
western blot, y se disecó el hipocampo.

58
Se homogenizaron los tejidos en buffer de lisis con un cóctel de inhibidores de proteinasas
(Tris-HCl 10 mM, ditiotreitol 1mM, glicerol al 30%, tritón al 1%, azida de sodio 15 mM,
EDTA 1mM, leupeptina 4 µg/ml, aprotinina 22 µg/ml, PMSF 1mM, ortovanadato de sodio
1mM), en una relación de 1 ml de buffer/1 g de tejido a 4ºC.

Las muestras homogenizadas fueron centrifugadas a 15,000 rpm, durante 15 min, a 4°C
para obtener en el sobrenadante las proteínas totales. La concentración de proteínas se
determinó por el método de Bradford.

Las proteínas totales obtenidas de los tejidos (30 µg) se separaron por electroforesis en
geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 10% a 75 volts durante 2 horas. Cada muestra
se preparo con Buffer de carga (Tris 0.5 M pH 6.8, glicerol 10%, SDS 2%, β-mercapto-
etanol 5%) en un volumen 1:1 y se hirvieron durante 5 min para depositarse en los geles
antes mencionados.

Las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa (Amersham) a 20 volts,

durante 1 hora en una cámara semihúmeda. Las membranas fueron bloqueadas por 2 horas
a temperatura ambiente con una solución de leche descremada en polvo al 5% en TBS 1X.
Las membranas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con los siguientes
anticuerpos monoclonales anti ChAT (Millipore) o anti TPH (Sigma) en una dilución
1:1000. Las membranas fueron lavadas con PBS-Tween 3 veces por 5 minutos.

Para detectar ChAT y TPH, las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario
anti-cabra o anti-ratón (IgG-HRP) conjugado a peroxidasa en una concentración de 0.24
µg/ml. Se utilizó un método de detección de alta sensibilidad por quimioluminisencia
(ECL), (Amersham Pharmacia Biotech) para determinar la presencia de las proteínas
estudiadas. Con este sistema, el peróxido de luminol y un potenciador son sustrato de la
peróxidasa acoplada al anticuerpo secundario y se genera una señal de quimioluminiscencia
al exponer las membranas a placas radiográficas.

Para corregir las posibles diferencias en la cantidad de proteína total cargada en cada pozo,
se lavarón las membranas con TBS-Tween para posteriormente incubarlas con un

59
anticuerpo primario anti-α Tubulina en una diluci
ón 1:10, 000 (Sigma) o anti -GAPDH
(MIllipore) toda la noche a 4°C.

Las membranas fueron lavadas con TBS-Tween 3 veces por 5 minutos. Se incubaron 1
hora con un anticuerpo secundario anti-mouse acoplado a peroxidasa en una concentración
de 0.24 µg/ml (Santa Cruz) y posteriormente se utilizo el método de detección de alta
sensibilidad descrito anteriormente.

Cada placa fue sometida a un análisis densitométrico para cuantificar la expresión de

ChAT, TPH, α.Tubulina y GAPDH de acuerdo a la intensidad de cada banda, utilizando el
programa ChemiImager 4400.

Tabla 5. Anticuerpos utilizados.

Anticuerpo Marca

ChAT AB144P, Millipore

TPH SAB4503028, Sigma

GAPDH MAB374, Millipore

α-Tubulina T9026, Sigma

DETECCIÓN DE LA APOPTOSIS

Una vez realizadas las pruebas conductuales se tomo una n=4 para realizar la técnica de
detección de la apoptosis.

Se utilizaron cortes del hipocampo medial para realizar la técnica de apoptosis por medio
del kit APOAC de Sigma.

Los cortes se bloquearon por 45 minutos con PBS+BSA al 10% y Triton al 0.3% por una
hora, se lavaron 3 veces con Buffer de Binding 1X y se dejaron con Anexina-V, 6-CFDA y
Buffer de Binding por toda la noche.

Se realizaron 5 lavados con PBS+BSA al 10% y se contratiño con Hoesch en una dilución
1:100 por 5 minutos.

60
Se montaron los cortes en laminillas cargadas de la marca BIOCARE y se observaron en un
microscopio de epifluorescencia, detectando una inmunotinción en color rojo de la anexina-
V, en color verde 6-CFDA y en azul Hoesch. Se tomaron fotografías para su posterior
análisis cualitativo

VII ANÁLISIS ESTADISTICO

A los datos obtenidos se les aplicó un análisis de varianza y una prueba post hoc de
Tukey. Se utilizó el programa Prism 2.01 (Graph Pad, CA) para calcular los valores de
probabilidad.

61
VIII RESULTADOS

PRUEBA DE AUTOAPRENDIZAJE
Una vez que se cumplió el tiempo de tratamiento, se evaluó la capacidad cognitiva de las
ratas en el modelo de aprendizaje de tipo automoldeamiento. Al realizar el análisis
estadístico no se encontraron diferencias significativas entre los diversos tratamientos
administrados (Fig. 14).

10

VEH
Número de respuetas condicionadas

0.01 mg/kg
8 0.1 mg/kg
1.0 mg/kg
10.0 mg/kg

Fig. 14. Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre la capacidad cognitiva de la rata
ovariectomizada en un modelo de automoldeamiento. Cada columna representa la media ±
EE; n=8, Veh: vehículo.

LABERINTO ELEVADO EN FORMA DE T (LET)

Los resultados de esta prueba se muestran en la figura 15, en donde al realizar el análisis
estadístico se observo una diferencia significativa con la dosis de 1 mg/Kg con respecto al
vehículo y la dosis de 10 mg/Kg con respecto a todos los grupos.

62
 VEH
350
0.01 mg/kg
* 0.1 mg/kg
1.0 mg/kg
300
10.0 mg/kg

250
Latencia (seg)

200

150

+
100

50

Fig. 15. Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre la capacidad cognitiva de la rata
ovariectomizada en la prueba de laberinto elevado en forma de T. En este modelo, una
mayor latencia se interpreta como un aumento del aprendizaje Cada columna representa la
media ± EE; n=8; *p<0.05 vs los demás tratamientos; + p<0-05 vs vehículo. Veh:
vehículo.

El índice de riesgo se muestra en la figura 16. Se obtuvieron valores cercanos a 1 conforme

aumentan las dosis de Tibolona.

VEH
1,0 0.01 mg/kg
0.1 mg/kg
1.0 mg/kg
10.0 mg/kg
0,8
Ìndice de riesgo

0,6

0,4

0,2

0,0

Fig. 16. Índice de riesgo del laberinto elevado en forma de T. En este modelo, un
incremento en el índice de riesgo se asocia con una mejoría en el aprendizaje. Cada
columna representa la media ± EE; n=8, Veh: vehículo.

63
ACTIVIDAD ESPONTÁNEA

Los resultados de la actividad espontánea de las ratas se presentan como la media ± EE del
número de cuentas en 5 minutos (fig. 17). El análisis estadístico de los datos indica que
ninguna de las dosis de Tibolona administradas afectó las habilidades motoras de las ratas.

1600 VEH
0.01 mg/kg
0.1 mg/kg
1400
1.0 mg/kg
10.0 mg/kg
1200
Actividad total

1000

800

600

400

200

1400

1200

1000
Ambulación

800

600

400

200

350

300

250

200
Vertical

150

100

50

Fig. 17. Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre la actividad espontánea de la rata.
Cada columna representa la media ± EE; n=8, Veh: vehículo.

64
WESTERN BLOT

Para determinar el contenido de ChAT y TPH con las diferentes dosis de Tibolona en el
hipocampo se realizó la técnica de Western blot. En la Fig. 18 se muestra la detección de
ChAT en el hipocampo. Se muestra una banda de 75 KDa correspondiente a ChAT y como
se observa hay una disminución significativa del contenido con las dosis de 0.1, 1.0 y 10
mg/Kg

mg/Kg de Tibolona
V 0.01 0.1 1.0 10

ChAT 75 KDa

α-Tubulina 50 KDa

Fig 18. Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre el contenido de ChAT. Se
realizaron 4 experimentos independientes en los hipocampos de la ratas tratadas con:
Vehículo (V), 0.01 mg/Kg de Tibolona, 0.1 mg/Kg de Tibolona, 1.0 mg/Kg de Tibolona y
10 mg/Kg de Tibolona. El contenido de ChAT se cuantifico por medio de un análisis
densitometrico y los valores obtenidos se corrigieron respecto a los obtenidos de tubulina.
P<0.05 vs Vehículo

65
En la figura 19 se muestra el contenido de TPH con los diferentes tratamientos de Tibolona,
se observo un incremento significativo del contenido de TPH con las dosis de 1.0 y 10
mg/Kg de Tibolona.

Fig 19. Efecto de las diferentes dosis de Tibolona sobre el contenido de TPH. Se
realizaron 4 experimentos independientes del hipocampo de la rata tratada con: Vehículo
(V), 0.01 mg/Kg de Tibolona, 0.1 mg/Kg de Tibolona, 1.0 mg/Kg de Tibolona y 10 mg/Kg
de Tibolona. El contenido de TPH se cuantifico por medio de un análisis densitometrico y
los valores obtenidos se corrigieron respecto a los obtenidos de GAPDH. P<0.05 vs
Vehículo

Inmunofluorecencia

La inmunofluorescencia se realizo usando dos fluroforos alexa fluor 486 y 686 , el primero
da una fluorescencia roja y el segundo una fluorescencia verde. La doble
inmunoflusorescencia se observa en la figura 20, en donde se muestra la región CA3 del
hipocampo.

66
 ChAT TPH

VEH

0.01 mg/Kg

0.1 mg/Kg

1 mg/Kg

10 mg/Kg

67
Fig 20. Detección de la dobleinmunofluorescencia en el hipocampo con los diferentes
tratamientos de Tibolona. Se realizo la detección de ChAT (rojo) y TPH (verde) en el CA1
del hipocampo de la rata tratadas con diferentes dosis de Tibolona, Vehículo (V), 0.01
mg/Kg de Tibolona, 0.1 mg/Kg de Tibolona, 1.0 mg/Kg de Tibolona y 10 mg/Kg de
Tibolona.

Detección de la apoptosis

La detección se realizó utilizando un marcador de la apoptosis, anexina-V, por medio de un

kit comercial, el cual marca a esta proteína de color rojo en la membrana de la célula si esta
entra en apoptosis, mientras que por otro lado el 6-CFDA marca a las células vivas en color
verde. En la figura 15 se muestran la detección de anexina-V rojo y 6-CFDA en verde, en
CA3 del hipocampo. En donde se observa una disminución con el marcaje rojo, indicando
que hay menor cantidad de células inmuno-reactivas a anexina-V.

68
 Anexina-V 6-CFDA

VEH

0.01mg/Kg

0.1mg/Kg

1.0 mg/Kg

10 mg/Kg

69
Fig 21. Detección de la apoptosis en el hipocampo con los diferentes tratamientos de
Tibolona. Se realizó la detección de anexina-V y 6CFDA en el CA3 del hipocampo de la
rata tratadas con diferentes dosis de Tibolona, Vehículo (V), 0.01 mg/Kg de Tibolona, 0.1
mg/Kg de Tibolona, 1.0 mg/Kg de Tibolona y 10 mg/Kg de Tibolona. La línea continua
muestra el marcaje con anexina-V, la flecha punteada muestra el marcaje con 6-CFDA.

70
IX DISCUSIÓN

MEMORIA Y APRENDIZAJE

Los resultados obtenidos nos indican que el tratamiento a largo plazo con Tibolona a
diferentes dosis tiene diferentes efectos con respecto a las pruebas de memoria y
aprendizaje que se realizaron.

Se ha observado que cuando los estrógenos disminuyen, después de la menopausia y por la

OVX en modelos animales, empieza un déficit de la memoria y la cognición. Se sabe que
los estrógenos tienen la capacidad de mantener o aumentar la función cognitiva, memoria
de trabajo y semántica (Genazzani et al., 2007).

El aprendizaje de tipo automoldeamiento requiere una red neuronal intacta en el

hipocampo, septum y corteza, así como la participación de las vías de transducción
colinérgica en la integración de las habilidades cognitivas autoaprendidas (Meneses, 2003).
En la prueba de autoaprendizaje, el incremento o disminución en el número RC fue
considerado como indicador del aumento o disminución del aprendizaje, respectivamente.
Considerando esto y el análisis estadístico de los datos, no se observaron cambios
significativos en el desempeño de los animales con ninguno de los diferentes tratamientos
con Tibolona. Además, estos resultados no fueron enmascarados por alguna alteración en la
actividad ambulatoria de los animales, ya que no se encontraron diferencias significativas
entre los grupos de tratamiento en la prueba de actividad locomotriz.

En un trabajo previo de nuestro laboratorio, se encontró que en ratas OVX tratadas a corto
plazo con E2 (40 µg/Kg ) aumentó el número de RC’s, y en el grupo tratado con E2
(40µg/Kg) más P4 (4mg/Kg) no se observó cambios en las RCs (Farfán-García, 2010;
Espinosa-Raya, et al 2011). En el mismo trabajo, pero con el tratamiento a largo plazo, se
observó que tanto el tratamiento con E2 como con P4 aumentó el número de RC’s (Farfán-
García, 2010). Con lo anterior y debido a que los metabolitos hidroxilados de la Tibolona
tienen efecto estrógenico en el SNC, esperábamos un aumento en las RCs. Sin embargo, no
observamos tal efecto. Con lo anterior y tomando en cuenta nuestros resultados, podríamos

71
sugerir que se está generando el isomero delta 4 de la Tibolona, el cual se sabe que tiene
efecto progestagénico y atenué el efecto estrogénico de la misma (Verheul et al., 2006).

El condicionamiento al miedo es un modelo de memoria y aprendizaje de tipo “evitación

pasiva” (De-Mello y Carobrez, 2002). Aunque hay diferencias en la naturaleza de las
características neurofisiológicas subyacentes en los modelos de evitación activa o pasiva la
evaluación general de aprendizaje y memoria es una constante. El LET fue descrito por
primera vez por Graeff y cols. (1993) y deriva del laberinto elevado, un modelo animal de
ansiedad. Exposiciones repetidas al LET induce en el animal el aprendizaje de una
evitación inhibitoria (pasiva) a los brazos abiertos (por ejemplo, aumento de latencia para
dejar el brazo cerrado en varios ensayos consecutivos), la cual está etológicamente basada
en la aversión experimentada en estos animales cuando se exponen a lugares no protegidos
(respuesta de evitación inhibitoria pasiva aprendida). La adquisición de la evitación
inhibitoria en el LET está representada por una curva de aumento de aprendizaje hasta que
el criterio de evitación es alcanzado. La presencia de la conducta de evaluación de riesgo
hacia los brazos abiertos estando en los brazos cerrados en la sesión de entrenamiento,
indica una creciente reunión de información para disminuir los conflictos o vacilaciones
con respecto al ambiente. Esto sugiere que el tiempo gastado dentro del brazo cerrado no
representa habituación o pérdida o falta de motivación para explorar, sino una respuesta de
evitación inhibitoria aprendida.

A diferencia de la prueba de automoldeamiento, en el LET se observo un aumento

significativo en la latencia en la sesión de prueba, con las dosis de 1 mg/Kg y de 10 mg/Kg
respecto al grupo tratado con vehículo, esto nos indica que las ratas aprendieron la
respuesta de evitación inhibitoria pasiva. Al realizar el cálculo del índice de riesgo se
obtuvo que este fue aumentando conforme aumentó las dosis de Tibolona, acercándose a la
unidad, lo que sugiere que el tiempo que estuvieron los animales en el brazo cerrado no
representa una falta de motivación para explorar o por alguna alteración en su actividad
locomotriz.

Esta prueba, al derivar del laberinto en elevado en forma de cruz, de manera indirecta
valora los niveles de ansiedad en las ratas. Así, al evaluar el tiempo que los animales

72
pasaron en los brazos abiertos respecto al brazo cerrado y el índice de riesgo, pueden dar un
acercamiento de los niveles de ansiedad de los animales. Los datos obtenidos sugieren un
efecto ansiolítico de las dosis de 1 y 10 mg/kg. Se sabe que las hormonas ováricas como el
estradiol tienen efectos ansiolíticos ya que se ha observado que en ratas en proestro
disminuyen sus niveles de ansiedad, esto debido a los altos niveles de estradiol, mientras
que ratas en diestro tiene altos niveles de ansiedad, debido a los bajos niveles de estradiol y
al tratar a las ratas durante esta etapa del ciclo con estradiol se observa que los niveles de
ansiedad disminuyen; en el caso de la Tibolona se ha observado que con una dosis de 1
mg/Kg hay una disminución de la ansiedad; sin embargo no se sabía si otras dosis tenían un
efecto o no en esta conducta.

Es bien conocido que la amígdala, la neocorteza y el hipocampo son regiones meta del
sistema cerebral basal anterior colinérgico, que se relaciona estrechamente con diversas
funciones del aprendizaje y la memoria (Van der Zee y Luiten, 1999). La prueba de
autoaprendizaje se sabe es hipocampo-dependiente (Meneses, 2003). Los resultados de las
pruebas conductuales muestran que en una prueba de autoaprendizaje el tratamiento de
Tibolona a las diferentes dosis no fue efectiva, una posible explicación podría ser una
reducción en la actividad de las neuronas colinérgicas del cerebro basal anterior (CBA) que
proyectan a la corteza frontal e hipocampo, principalmente en CA1, donde estas juegan un
papel importante en la función cognitiva, debido a que dos núcleos del CBA que son el
núcleo basal magnocelular y la banda diagonal de Broca responde de manera selectiva a la
estimulación visual o auditiva, las cuales están asociadas al reforzamiento de la comida, el
cual es importante en esta prueba (Wilson, 1990). Sin embargo no se sabe el mecanismo de
acción de la Tibolona en cuanto a otros sistemas de neurotransmisión implicados en este
tipo de prueba.

En contraste con lo anterior, el LET es una prueba en la que se aprende una respuesta de
evitación inhibitoria pasiva y la estructura neuroanatómica que regula la entrada de la
información es la amígdala. Se sabe que el sistema serotoninérgico, juega un papel
importante en la adquisión y consolidación en este tipo de aprendizaje (Graef et al, 1998).
Nuestros datos muestran que el tratamiento con Tibolona mejora el aprendizaje en una tarea
de asociación con componente emocional. Esto sugiere que posiblemente la Tibolona este

73
ejerciendo su efecto sobre el sistema serotoninérgico, dato que coincide con lo observado
en estudios clínicos en los cuales una dosis de 2.5mg al día disminuye los niveles de
ansiedad en mujeres menopáusicas (Jacobsen et al., 2008).

WESTERN BLOT

Cuando los estrógenos declinan después de la menopausia, un amplio rango de

neurotransmisores, incluyendo el sistema monoaminérgico y colinérgico, así como la
cognición y otros procesos que dependen de ellos se ven afectados (McEwen,1999). Para
determinar si el efecto del tratamiento hormonal sobre la cognición se encuentra
relacionado con cambios en los sistemas colinérgicos o serotoninérgicos, se midieron los
niveles de ChAT y TPH por Western blot.

Los datos muestraron que el contenido de ChAT disminuyó con las dosis de 0.1. 1.0 y
10mg/Kg de Tibolona. Por lo que, la regulación a la baja de la ChAT nos sugiere el porqué
los animales no tuvieron un buen desempeño en la prueba de autoaprendizaje, ya que para
realizar esta prueba es necesario tener un sistema colinérgico estable para que puedan
realizar la tarea asociativa (Meneses, 2003). Se ha observado que en monos hembras
ovariectomizadas y tratados con dosis de 0.2 y 1.0 mg/Kg de Tibolona, a largo plazo,
disminuye la actividad de la ChAT en el hipocampo, lo cual concuerda con lo observado
con la dosis de 1.0 mg/Kg (Gibbs et al., 2002).

Por otra parte, este efecto en la disminución del contenido de ChAT también se ha
observado en monos hembras ovariectomizadas y tratadas con estrógenos conjugados de
equinos y/o acetato de medroxiprogesterona (Gibbs, et al., 2002). Además, se ha observado
que el efecto positivo del E2, sobre diferentes parámetros bioquímicos y conductuales, no se
mantienen en respuesta al tratamiento a largo plazo (Gibbs, 2010) y que este hallazgo
puede deberse a niveles reducidos de RE (Blaustein, 2003; Brown, 1996). Con lo que
podemos sugerir que el efecto observado sobre el contenido de ChAT se debe a un efecto
estrogénico la Tibolona.

74
Para TPH se observa un incremento en su contenido con las dosis de 1.0 y 10 mg/Kg de
Tibolona. Datos previos indican que esto se puede deber al efecto estrogénico de la
Tibolona ya que se ha observado que la administración crónica de estradiol (10µg/Kg),
aumenta la expresión de la TPH en el hipocampo y corteza frontal, así como una
disminución de los niveles de ansiedad (Pandaranandaka et al., 2006, 2009). Como se
menciono en la introducción, la TPH es la enzima más importante para la síntesis de
serotonina, la cual es un neurotrasmisor que juega un papel importante en la ansiedad y
depresión así como también participa en la modulación de la memoria y aprendizaje. Se ha
observado que en mujeres durante la fase premenstrual disminuyen los niveles de
serotonina plasmáticos y se ha correlacionado con cambios de humores negativos como
ansiedad (Sigmon, 1996).

En cuanto al LET y la TPH se ha observado que ratas OVX y tratadas con E2 tienen un
mejor desempeño en esta prueba, aprendiendo la tarea de evitación pasiva inhibitoria y con
disminución de la ansiedad. Nuestros resultados sugieren que la Tibolona puede ejercer un
efecto estrogénico sobre la regulación de la TPH y la síntesis de serotonina en el
hipocampo, lo cual se puede ver reflejado en un mejor desempeño en la prueba de LET en
las dosis de 1 y 10 mg/kg de Tibolona.

INMUNOFLUORESCENCIA Y DETECCIÓN DE LA APOPTOSIS

En el caso de la Inmunofluorescencia se analizo de manera cualitativa el área CA1 del

hipocampo, esta área es importante ya que es influenciada principalmente por las vías
colinérgicas. Se observo una disminución en la inmunoreactividad de ChAT y un aumento
en la inmunoreactividad de TPH conforme aumentaban las dosis de Tibolona, lo cual
concuerda con lo observado previamente en el western blot.

Los resultados de la prueba de detección de apoptosis, nos sugieren que la OVX a largo
plazo desencadena procesos apoptóticos en el hipocampo de la rata hembra. Esto lo
observamos al encontrar un gran número de células inmunoreactivas para la anexina V en
las ratas tratadas con vehículo. Por el contrario, al realizar el análisis de la detección de la

75
apoptosis, observamos que la administración de Tibolona disminuyó el número de células
inmunoreactivas para la anexina-V. Lo anterior sugiere que al dar tratamiento con
Tibolona, sobre todo a dosis altas, disminuyó el proceso apoptótico en el hipocampo,
principalmente en la región CA3. Por datos de la literatura, se sabe que esta región es
regulada por hormonas esteroides ya que se reportado que el tratamiento con E2regula
diferentes vías apoptoticas y anti-apoptoticas; por ejemplo, se sabe que E2 aumenta la
expresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia de Bcl-2, mientras que cuando hay un
daño por la ausencia prolongada de estradiol hay un aumento de células apoptóticas así
como un aumento en el contenido de Bax (Sales et al., 2010). Nuestros resultados sugieren
que la administración de Tibolona ejerce un efecto neuroprotector similar al del E2 sobre
los cambios por su ausencia prolongada, así como también que una de las vías probables de
este efecto sea a través de la activación de vías antiapoptoticas y la inactivación de vías
apoptoticas, aunque esto último requiere posteriores análisis.

Todos estos datos indican que la Tibolona tiene efecto en procesos de aprendizaje de tipo
emotivo, como lo es la prueba del LET, no así en un proceso de aprendizaje de tipo
automoldeamiento. A su vez, es capaz de modular las enzimas involucradas en estos
procesos, regulando hacia arriba la expresión de TPH con las dosis de 1 y 10 mg/Kg y la de
ChAT a la baja de manera dosis dependiente. Lo anterior nos sugiere que la Tibolona al
estar modulando los neurotransmisores está modificando la capacidad cognitiva de as ratas.
Sin embargo falta determinar qué pasa con los receptores de estos neurotransmisores en el
hipocampo y también determinar el contenido de estas enzimas en otras regiones
involucradas en las pruebas como lo son el CBA, la corteza y la amígdala.

Observamos que la Tibolona es capaz de prevenir la neurodegeneración ya que conforme

aumentan las dosis de Tibolona se observa menos inmunoreactividad de anexina V y un
mayor marcaje con 6CFDA, lo cual indica que hay más células vivas, sin embrago falta
determinar cómo se da esta regulación de la neurotprotección

76
X. CONCLUSIONES

• El tratamiento a largo plazo con diferentes dosis de Tibolona mejoro la capacidad

cognitiva de la rata ovariectomizada en un modelo de evitación pasiva inhibitoria,
pero no en un modelo de aprendizaje de tipo automoldeamiento.
• Las diferentes dosis de Tibolona no afectan la actividad espontánea de la rata
ovariectomizada.
• El contenido de ChAT disminuye de manera dosis dependiente.
• Aumenta el contenido de TPH con las dosis de 1 y 10 mg/Kg
• Disminuye la muerte celular por apoptosis con las dosis de 0.1,1.0 y 10 mg/Kg de
Tibolona en el hipocampo de la rata.

77
XI BIBLIOGRAFÍA

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83
  BUFFER DE TBS 1X, pH 7.5 BUFFER TRANSFERENCIA 1X
Tris-Base 50mM Tris Base 24 mM
NaCl 150mM Glicina 19.2 mM
Se pone en agitación con agua destilada y se SDS 0.37%
ajusta el pH con HCl. Se afora a 1L. Se pone en agitación con agua destilada y se
afora a 1L.
 BUFFER DE CORRIDA 1X SOLUCION DE BLOQUEO
Tris-Base 25 mM Leche descremada en polvo al 5% en TTBS 1X

Glicina 192 mM
SDS 10% BUFFER LISIS PROTEÍNAS (PIK)
Se pone en agitación con agua destilada y se NaCl 150mM
afora a 1L. Tris HCl 20mM
 TBS TWEEN (TTBS) EDTA 5mM
TBS 1X 1000 mL Glicerol 10%
TWEEN 20 0.1%
 BUFFER DE CARGA 5X (LB5X) NP 40 1%
SDS 20% Se ajusta el pH a 7.4
Glicerol 10% Se afora a 200 mL con agua desionizada.
Dithiothreitol(DTT) 7.7% Se agrega una pastilla de inhibidores complete
Tris 0.5M pH 8.5 de roche por cada 10ml
Azul Bromofenol 0.1%
Poner en agitación y aforar con agua destilada a
200 mL.
SOLUCIÓN ROJO PONCEAU
Ácido Acético 5%
Rojo Ponceau 0.1%

 PERSULFATO DE AMONIO
Persulfato de 0.1%

84
amonio(APS)
 GEL DE POLIACRILAMIDA
El gel tiene dos partes: Stacking (concentrante) y Resolving (separador)
RESOLVING (100mL) dependiendo el tamaño de las proteínas
Tamaño de la proteína 14 15-70 20-100 50-250 >250
(Kda)
% Gel 14% 12% 10% 8% 7%
Glicerol 50% 20mL 20mL 20mL 20mL 20mL
H2O 8.33mL 15mL 21.68mL 28.33mL 31.66mL
Tris 1,5M pH 8,8 25mL 25mL 25mL 25mL 25mL
Bisacrilamida 30% 46.66mL 40mL 33.32mL 26.66mL 23.33mL
SDS 10% 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

STACKING (100 mL)

H2O 61mL
Tris 0,5M pH 6,8 25mL
Bisacrilamida 30% 13mL
SDS 10% 1mL
RESOLVING (para dos geles) STACKING (para dos geles)
Resolving 15 mL Resolving 7 mL
APS 150 μl APS 90 μl
TEMED 15 μl TEMED 9 μl

85