Tesis

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
Se presenta esta Tesis como parte de los requisitos de la Universidad Nacional del
Litoral para obtener el grado Académico de:
DOCTOR EN TECNOLOGÍA QUÍMICA
DESINFECCIÓN DE AGUAS, UTILIZANDO UN AGENTE

OXIDANTE Y SU COMBINACIÓN CON UV. ESTUDIO
CINÉTICO
Autora
Lic. Marina J. FLORES
Realizada en
INTEC (UNL-CONICET)
Directora: Dra. Marisol D. LABAS Co-Director: Dr. Alberto E. CASSANO
Miembros del Jurado

Dr. Roberto CANDAL
Dr. Juan Carlos BASÍLICO
Dra. Fabiana LO NOSTRO
SANTA FE, 2014

A mi querida Tata y su luminoso recuerdo.
A mis Papás
A mi hermana Vero.
AGRADECIMIENTOS
A mi directora, Marisol, por estar siempre dispuesta a tenderme una mano, por su
forma de enseñar y trasmitir conocimientos, no sólo académicos. Por muchos
buenos momentos pasados aun en momentos duros de trabajo, por el apoyo que
me brindó y me sigue brindando y por todo el tiempo que dedicó para poder lograr
esta tesis.
A mi codirector Alberto, por exigirme a dar siempre un poco más, por haber puesto un
voto de confianza en mí sin conocerme y por alentarme a que siga investigando.
A los miembros del Jurado por su interés y participación en la evaluación de la presente

Tesis.
A Rodolfo Brandi, por su ayuda invaluable durante la realización de esta tesis doctoral,
su dedicación, paciencia, amistad y por las charlas de cine y libros compartidas
entre modelos cinéticos.
A Pablo Nieres, con quien realicé los primeros trabajos experimentales, gracias por
estar, por tu empuje y por tu amistad.
A Agustina Dalla Fontana y Pato Galvez, quienes me ayudaron (y ayudan) con la

preparación del material y los ensayos experimentales durante este último año.
Con ustedes comparto muy buenos momentos y muy malos mates.
A los que colaboraron con su granito de arena para que esta tesis sea posible:
bajándome papers, instalando programas, con aportes valiosos: Ale Ontiveros,
Fernando Herrera, Mario Barbaglia, Maria Benzzo, Roy. Aconsejándome y
acompañándome en el trabajo: Villa, Chely.
Al Departamento de Microbiología de la Facultad de I ngeniería Química, por su buena

predisposición y ayuda durante la realización de la tesis doctoral, salvando dudas,
ayudando con la conservación de la cepas. Especialmente mi gratitud con la
Profesora Laura Frison, quien siempre estuvo dispuesta a responder mis consultas.
A los que empezaron siendo compañeros de doctorado y terminaron siendo mis

queridos amigos: Ale Ontiveros, Agus Manassero, Angie Sosa, Eva Luengo, Gise Di
Luca, Maia Lezcano, Meli Mariani y Marugenia Martinez.
A mi familia de acá y de allá, que siempre me apoyó en mis decisiones, especialmente a
mis papás, a quienes dedico esta tesis y a mi hermana, mi roca.
A los de siempre, que tantas, tantas veces escucharon y entendieron “no puedo, estoy
con la tesis, no puedo tengo que estudiar”: Sebas, Vero, Yami Yoli, Fernandatus,
Sofi, Cintia, Franco, Lito, Tomy, Claudia
A mis amigos de Dignidad Animal, con quienes lucho a diario, Cintia, Franco, Gise,
Pao, Mica, Ale, Sole Flaca, Sole R, Joan, Agos y Jose, gracias por trabajar para
lograr un mejor lugar, gracias por saberme esperar.
A Nora, por estar y por cuidarme, a Juan por enseñarme a ser valiente.
A mi abuela I nés, que nunca pudo aprender a decir: Doctorado en Tecnología Química-
Beca de CONI CET y lo tenía escrito en un papel, en su cartera, en el bolsillo de los
caramelos frutales y a mi Padrino, siempre viviendo, los dos, en mi corazón.
A Greta, Galadriel y Leono, por su amor infinito, fidelidad eterna y compañía, quienes
sin duda merecían a alguien mucho mejor.
Al personal del I nstituto de Desarrollo Tecnológico para la I ndustria Química (I NTEC)

y del CCT CONI CET Santa Fe.
Al Consejo Nacional de I nvestigaciones Científicas y Técnicas (CONI CET), Universidad

Nacional del Litoral (UNL) y Agencia Nacional de Promoción Científica y
Tecnológica por el apoyo financiero.
Finalmente, quisiera extender mi agradecimiento a todas esas personas, que aún no

estando presentes en esta lista, han aportado su granito de arena, contribuyendo
así a la finalización de este trabajo.
RESUMEN
El agua es fundamental para todas las formas de vida conocidas. El acceso al agua
potable es primordial para la salud, uno de los derechos humanos básicos y un
componente de las políticas eficaces de protección de la salud. Uno de los principales
problemas de la humanidad en pleno siglo XXI es el acceso al agua potable y a medios
adecuados de saneamiento. Esta problemática influye de manera directa sobre la salud
de una gran parte de la población mundial e indirectamente repercute en el desarrollo
de los países más desfavorecidos. La falta de agua potable afianza el ciclo de la pobreza,
dado que las regiones pobres se encuentran en condiciones de mayor desventaja para
afrontar éste y otros muchos problemas.
El tratamiento de los efluentes y las aguas contaminadas mediante procesos
adecuados es esencial para evitar este problema. Hasta el presente, los efluentes son
principalmente desinfectados por derivados del cloro debido a su alto poder biocida. Sin
embargo, el cloro puede reaccionar con las sustancias orgánicas presentes en las agua
superficiales, como los ácidos húmicos, dando lugar a numerosos productos de
desinfección volátiles y no volátiles como son el vapor de cloro y los trihalometanos los
cuales, de acuerdo a numerosos estudios presentan propiedades mutagénicas,
carcinogénicas y/ o tóxicas. Un sistema de desinfección ideal debería garantizar la
eficiencia máxima para la remoción de microorganismos patógenos sin generar
subproductos tóxicos e indeseables. La solución correcta del problema de la
contaminación pasa por el uso de tecnologías limpias que en ninguno de sus pasos
i
afecten el medio ambiente. Dentro de estos procesos se ubican los Procesos Avanzados
de Oxidación (PAOs) y como caso particular, de indudable crecimiento en la
investigación de los últimos años, se destaca la aplicación de aquellas que emplean
radiación UV para llevar a cabo la tarea. Estas tecnologías pueden utilizarse sola o
combinadas entre ellas para producir especies altamente oxidantes como el radical
hidroxilo (OH˙) que reacciona con el contaminante logrando su destrucción.
En esta Tesis de Doctorado en Tecnología Química se aborda uno de los aspectos
vacantes como es la determinación de la cinética de la inactivación para un
contaminante microbiológico modelo (Escher ichia coli) en aguas claras con
desinfectantes alternativos amigables con el ambiente.
Se estudia inicialmente un proceso de desinfección pseudo heterogéneo
utilizando peróxido de hidrogeno como desinfectante. Se realiza la interpretación
química del posible mecanismo de daño celular. La hipótesis planteada es la existencia,
en la célula bacteriana, de sitios factibles (targets), de ser atacados por los ataque de los
radicales OH˙: la capa de peptidoglicano, la capa de lipopolisacáridos (que se encuentra
sólo en las bacterias Gram-negativas) y la bicapa fosfolipidica. La disrupción de la
membrana, la posterior lisis de los componentes de las bacterias y la oxidación del
lisado resultante, se modela como una secuencia de eventos en serie, seguidos de una
secuencia de eventos en paralelo, en el que el nivel de daño aumentará hasta que la
bacteria no sólo muere, o se ve gravemente afectada en sus funciones vitales, sino
también y dado el tiempo suficiente, los componentes químicos de la célula se oxidan
totalmente.
Como una segunda etapa, se lleva a cabo un extenso estudio experimental
utilizando la mezcla comercial de acido peracético (APA) como agente desinfectante. El
ii
acido peracético comercial es una mezcla cuaternaria de equilibrio entre: acido
peracético, peróxido de hidrógeno, acido acético y agua. En base a los estudios
experimentales, se postula un mecanismo de desinfección, nunca antes propuesto,
considerando el poder oxidante de cada uno de los agentes de la mezcla por separado y
el efecto sinérgico de estos. El mecanismo de este modelo comprende a través de
ecuaciones matemáticas simples, los procesos fisicoquímicos y enzimáticos
involucrados en la inactivación bacteriana, como oxidación de enlaces proteicos,
inhibición de mecanismos de defensa bacterianos y alteración en las funciones
metabólicas vitales en los microorganismos. Se obtienen las concentraciones de
desinfectantes ideales y las condiciones de trabajo optimas para lograr altas tasas de
inactivación (99.99%) en cortos períodos de tiempo.
Como complemento, se estudia la combinación de la solución comercial de APA
con la radiación UV, se modelan los resultados obtenidos con un M odelo de Eventos en
serie, donde, en este modelo, la bacteria, al ser expuesta a la radiación UV va sufriendo
daños a través de pasos consecutivos que se acumulan hasta que alcanzan un umbral
donde se produce la muerte del microorganismo. Se realizan análisis de recrecimiento y
fotoreparación bacterianos para evaluar el potencial uso de la combinación de ambos
oxidantes.
La elección del tema de tesis responde a una problemática actual del país: el
acceso al agua microbiológicamente segura. Además, realizará aportes para contribuir
con la solución del problema de tratamiento de aguas, en especial, con la ausencia de
subproductos de desinfección sin involucrar mayores costos adicionales.
iii
INDICE DE CONTENIDOS
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN 1
I.1 IMPORTANCIA DEL AGUA 1
I.2 IMPORTANCIA DEL AGUA DE CONSUMO. 2

I.3 DISTRIBUCION Y ACCESO DEL AGUA EN EL MUNDO 4
I.3.1 DISTRIBUCIÓN Y ACCESO AL AGUA EN LA ARGENTINA 7
I.4 MARCO LEGAL EN ARGENTINA 8
I.5 DESINFECCIÓN DE L AGUA 9

I.5.1 DESINFECTANTES ALTERNATIVOS 12
I.5.1.1 PROCESOS AVANZADOS DE OXIDACIÓN 13
I.5.1.2 DESINFECCIÓN CON UV GERMINICIDA 14
I.5.1.3 DESINFECCIÓN CON APA COMERCIAL 15
ACRONIMOS CAPÍTULO I 16
I.6 OBJETIVOS Y PLAN EXPERIMENTAL 17

I.6.1 OBJETIVO GENERAL 18
I.6.2 OBJETIVOS PARTICULARES 18
CAPÍTULO II. MÉTODOS DE DESINFECCIÓN 19

II.1 GENERALIDADES DE LOS MÉTODOS DE DESINFECCIÓN 19
II. 2 DESINFECTANTES QUÍMICOS 21

II.2.1 DESINFECCIÓN CON CLORO 22
II.2.2 DESINFECCIÓN CON CLORAMIDAS 23
II.2.3 DESINFECCIÓN CON OZONO 25
II.3 DESINFECTANTES QUÍMICOS UTILIZADOS EN ESTA TESIS DOCTORAL 26
II.3.1 ÁCIDO PERACÉTICO 26
II.3.2 CARACTERÍSTICAS GENERALES 27
II.3.2.1 QUÍMICA DEL ÁCIDO PERACÉTICO 27
II.3.2.2 PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS 28
II.3.2.3 ÁCIDO PERACÉTICO COMO DESINFECTANTE DE AGUAS NATURALES 30
II.3.2.4 FACTORES QUE AFECTAN LA EFICIENCIA DE LA DESINFECCIÓN 31
II.3.4 PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 32
II.3.4.1 QUÍMICA DEL ÁCIDO PERACÉTICO 33
II.3.4.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA 34
II.4 DESINFECCIÓN CON AGENTES FÍSICOS 36
IV
II.4.1 RADIACIÓN CON UV 36
II.4.1.1 CARACTERÍSTICAS DE LA RADIACIÓN UV 37
II.4.1.2 ACCIÓN DE LA RADIACIÓN UV 39
II.4.1.3 MECANISMOS DE FOTORREPARACIÓN 42
II.5 PROCESOS AVANZADOS DE OXIDACIÓN 44
II.5.1 FOTOOXIDACIÓN 47
II.6 CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS EN ESTUDIO 49
II.6.1 PARED CELULAR BACTERIANA 50
II.6.2 CITOPLASMA 57
II.7 MICROORGANIMO MODELO ESTUDIADO: Escherichia coli 57
II. 7.1 Escherichia coli CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS 57
II.7.1.2 HABITAD 60
II.7.1.3 PODER PATOGÉNICO DE Escherichia coli 61
II.8 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES 62
II.8.1 BIOCIDAS 62
II.8.2 REQUISITOS DE LOS BIOCIDAS 64
II.8.2.1 NIVELES DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA 65
II.8.3 MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS BIOCIDAS 67
II.8.4 MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIANA 70
ACRONIMOS CAPÍTULO II 73
CAPÍTULO III. MODELADO DE LOS PROCESOS DE DESINFECCIÓN 74
III.1 REACTORES Y REACCIONES FOTOQUÍMICAS 74

III.1.1 REACCIONES FOTOQUÍMICAS 74
III.2 DISEÑO DE REACTORES FOTOQUÍMICOS 75
III.2.1 BALANCE DE MATERIA 78
III.2.1.1 LA ECUACIÓN GENERAL DE CONSERVACIÓN DE MATERIA 78
III.2.1.2 REACCIONES HETEROGÉNEAS 79
III.2.2 CAMPOS DE RADIACIÓN 80
III.2.3 DEFINICIÓN DE LA INTENSIDAD DE RADIACIÓN 81
III.2.4 DEFINICIÓN DE LA VELOCIDAD DE ABSORCIÓN DE ENERGÍA 83
III.2.4.1 ECUACIÓN GENERAL DE TRASPORTE DE FOTONES 85
III.2.4.2 LA CONDICIÓN DE CONTORNO 88
III.2.4.3 EXPRESIÓN DE LA L.V.R.P.A UTILIZADAS EN UN MODELO DE EMISIÓN 91
III.2.5 MODELADO CINÉTICO DE REACTORES 93
III.3 MODELOS CINÉTICOS DE DESINFECCIÓN 94
V
III.3.1 MODELO DE CHICK 94
III.3.2 MODELO DE CHICK-WATSON 96
III.3.3 MODELO DE WICKRAMANYAKE Y SPROUL 97
III.3.4 MODELO DE GARD 98
III.3.5 MODELO DE COLLIN Y SELLECK 99
IIII.3.6 MODELO DE HOM 100
III.3.7 MODIFICACIÓN DEL MODELO DE HOM 101
III.3.8 MODELO DE MAJUNAR 102
III.3.9 MODELOS PROPUESTO POR BLAIR SEVERÍN 103
III.3.9.1 CINETICA DE SEGUNDO ORDEN DE MEZCLADO 104
III.3.9.2 CINETICA MULTI-TARGET 105
III.4 MODELO PSEUDO HETEROGÉNEO DE DESINFECCIÓN PROPUESTO

POR FLORES 106
III.4.1 INTRODUCCIÓN AL MODELO 106
III.4.2 MODELADO DE LA REACCIÓN PERÓXIDO-MEMBRANA CELULAR 108
III.4.3 LISIS DE LAS BACTERIAS MUERTAS 112
III.4.4 REPRESENTACIÓN MATEMÁTICA 114
III.4.5 DISCUSIÓN Y RESULTADOS 117
III.4.6 CONCLUSIONES DEL MODELO 124
ACRONIMOS CAPÍTULO III 126
CAPÍTULO IV. TÉCNICAS ANALÍTICAS. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 129
IV.1 DESARROLLO EXPERIMENTAL 129
132
IV.1.1 ACONDICIONAMIENTO DEL DISPOSITIVO EXPERIMENTAL
132
IV. 1.2 PREPARACIÓN DEL INÓCULO BACTERIANO
VI
IV.1.2.1 REACTIVACIÓN DE LA CEPA 132
IV.1.2.2 CONSERVACIÓN DE LA CEPA 133
IV.1.2.3 CONSERVACIÓN POR CONGELAMIENTO: FUNDAMENTOS 133
IV.1.3 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO PERACÉTICO Y

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN LA SOLUCIÓN COMERCIAL
135
IV.1.3.1 DETERMINACIÓN DEL TÍTULO DE LA SOLUCIÓN COMERCIAL DE ÁCIDO
PERACÉTICO AL 15%
136
IV.1.4 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO 139
IV.1.5 TOMA DE MUESTRA 139
IV.1.6 SIEMBRA DE LA MUESTRA 141
IV.1.7 INCUBACIÓN DE LAS PLACAS 143
IV.1.8 RECUENTO DE BACTERIAS 143
IV.1.9 DETERMINACIÓN DEL APA RESIDUAL 143
IV.1.9.1 CURVA DE CALIBRADO 144
IV.2 TÉCNICAS ANALÍTICAS COMPLEMENTARIAS 146
IV.2.1 MÉTODO DE ADICCIÓN DE CATALASA PARA LA ELIMINACIÓN DE 146

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
IV.2.1.1 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 146
IV.2.1.2 EFECTO DEL PH EN LA CATALASA 148
IV. 2.2 ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD DE LA SOLUCIÓN DILUIDA DE ÁCIDO

PERACÉTICO
149
IV.3 TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS 151
IV.3.1 PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: FUNDAMENTOS 151
IV. 3.2 MEDIO DE CULTIVO PARA ESCHERICHIA COLI 151
IV.3.3 MEDIO DE CULTIVO PARA PSEUDOMONAS AERUGINOSA 154
IV.3.4 MEDIO DE CULTIVO PARA REACTIVACIÓN Y CONSERVACIÓN 157
IV.3.5 MEDIO LÍQUIDO PARA DILUCIONES 159
IV.4 TRATAMIENTO DE LAS CEPAS EN ESTUDIO 159
VII
IV.4.1 TÉCNICA DE TINCIÓN DE GRAM 159
IV.4.2 PRUEBAS BIOQUÍMICAS 163
IV.4.2.1 PRUEBAS INVIC PARA Escherichia coli 163
IV.5 MEDIDA DE ABSORBANCIA 167
IV.5.1 ESTABILIDAD OPTICA DEL MEDIO DE CULTIVO 168
IV.6 ESTUDIO DEL CRECIMIENTO MICROBIANO 170
IV.6.1 DEFINICIÓN DE CRECIMIENTO 170
IV.6.2 CURVA DE CRECIMIENTO 170
IV.6.3 ETAPA EXPERIMENTAL 172
176
IV.6.3.1 MEDICIÓN DE LA ABSORBANCIA
CAPÍTULO V DESINFECCIÓN ACIDO PERACÉTICO COMERCIAL-UV
V.1 DESARROLLO EXPERIMENTAL 179
V.1.1 ANALISIS DE LAS CURVAS DE INACTIVACIÓN 186
V.2 MODELO CINÉTICO PROPUESTO. DESINFECCIÓN CON RADIACIÓN UV 191

SIN EL AGREGADO DE AGENTES OXIDANTES
V.3 SOLUCIÓN NUMÉRICA 196
V.4 ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS Y RESULTADOS DEL 196

MODELO
V.5 CONCLUSIONES DEL CAPÍTULO 198
ACRONIMOS CAPÍTULO V 200
CAPÍTULO VI PROCESOS DE DESINFECCIÓN CON ACIDO PERACÉTICO

COMERCIAL
VI. 1 MÉTODO EXPERIMENTAL 202
VI.2 RESULTADOS EXPERIMENTALES 203
VI.2.1 RESULTADOS EXPERIMENTALES CON ÁCIDO PERACÉTICO COMERCIAL 203
VI.2.2 RESULTADOS EXPERIMENTALES INHIBIENDO PERÓXIDO DE 213

HIDRÓGENO
VI.3 MODELO CINÉTICO 221
VIII
VI.3.1 MODELO CINÉTICO DE LA DESINFECCIÓN DE AGUA CON ÁCIDO
PERACÉTICO INHIBIENDO PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
222
VI.3.1.1 BALANCE DE MATERIA EN EL REACTOR 225
VI.3.1.2 ESTIMACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS Y RESULTADOS DEL

MODELO
227
V.3.2 MODELO CINÉTICO DE LA DESINFECCIÓN DE AGUA CON PEROXIDO DE
HIDROGENO
232
V.3.2.1 BALANCE DE MATERIA EN EL REACTOR 236

MODELO
238
VI.3.3. MODELO CINÉTICO DE LA DESINFECCIÓN DE AGUA CON ACIDO
PERACÉTICO COMERCIAL
241
V.3.3.1 BALANCE DE MATERIA EN EL REACTOR 243

MODELO
244
VI.4 CONCLUSIONES 248
ACRONIMOS CAPÍTULO VI 251
CAPÍTULO VII CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS
VII.1 CONCLUSIONES 252
VII.2 PERSPECTIVAS FUTURAS 254
APENDICE I DATOS EXPERIMENTALES Escherichia coli
AI. 1 GRILLAS EXPERIMENTALES ÁCIDO PERACÉTICO COMERCIAL 256
AI.2 GRILLAS EXPERIMENTALES UV Y UV/ ÁCIDO PERACÉTICO 260
AI.3 DATOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS EN EL MODELO CINÉTICO 265
APENDICE II. CATALOGO LAMPARA PHILIPS TUV 15
APENDICE II. CATÁLOGO LAMPARA PHILIPS TUV 15 268
APENDICE III. MODELADO MOLECULAR CON VMD
AIII.1 LECTURA DEL PROGRAMA VMD 270
IX
APENDICE IV Pseudomonas aeruginosa
AIV. CARACTERÍSTICAS DEL MICROORGANISMOS ESTUDIADO (2): 272

Pseudomonas aeruginosa. DATOS GENERALES. DESARROLLO EXP.
AIV. 1 HABITAD 272
AIV.1.1 PATOGENIA Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS 274
AIV.2 EXPERIMENTAL P. aeruginosa 276
276
AIV.2.1 ACTIVACIÓN DE LA CEPA ATCC 15442 P. AERUGINOSA
AIV.3 ENSAYOS EXPERIMENTALES CON P. aeruginosa 282
APENDICE V PUBLICACIONES
CHEMICAL DISINFECTION WITH H2O2-THE PROPOSAL KINETIC MODEL (JOURNAL:

CHEMICAL ENGEERING JOURNAL, 2012) 286
A NOVEL APPROACH TO EXPLAIN THE INACTIVATION MECHANISM OF

ESCHERICHIA COLI EMPLOYING A COMERCIALLY AVAILABLE PERACETIC ACID (JOURNAL: 295
WATER SCIENCE AND TECHNOLOGY, 2014)
WATER DISINFECTION WITH UVC AND/OR CHEMICAL INACTIVATION.

MECHANISTIC DIFFERENCES, IMPLICATION AND CONSEQUENCES (BOOK: SUSTAINABLE 302
ENERGY DEVELOPMENTS, SERIES, 2013)
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 329
X
INDICE DE FIGURAS
CAPITULO I
FIGURA I.1 PROPORCIÓN DE LA POBLACIÓN MUNDIAL QUE CONSUME AGUA DE
FUENTES MEJORADAS 5
FIGURA I.2 EVOLUCIÓN DE LA COBERTURA MUNDIAL DEL ACCESO AL AGUA POTABLE

EN ZONAS URBANES Y RURALES 6
FIGURA I.3 SUBPRODUCTOS DE DESINFECCIÓN 12
CAPITULO II
FIGURA II.1 FORMULA MOLECULAR DESARROLLADA DEL ÁCIDO PERACÉTICO 27
FIGURA II.2 FORMULA MOLECULAR DESARROLLADA DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 33
FIGURA II.3 ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO 35
FIGURA II.4 ESPECTRO ELECTROMAGNETICO 37
FIGURA II.5 ESPECTRO DE EMISIÓN TÍPICO DE LÁMPARAS DE BAJA Y MEDIANA

PRESIÓN 38
FIGURA II.6 DIMERIZACIÓN DEL ADN 41
FIGURA II.7 ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL ADN Y DE LA INACTIVACIÓN DE E. COLI 42
FIGURA II.8 a) b)FOTORREPARACIÓN 43
c) d) ESTRUCTURAS FADH MTHF 44
FIGURA II.9 DIFERENCIAS EN LA PARED CELULAR BACTERIANA 51
FIGURA II.10 UNIÓN DE LA N-ACETILGLUCOSAMIDA CON EL N-ACETILMURANICO 52
FIGURA II.11 a) y b) PARED CELULAR GRAM (+) Y GRAM (-) 56
FIGURA II.12 IMAGEN DE E.coli 58
FIGURA II.13 PODER PATOGÉNICO DE E. coli 61
FIGURA II.14 AGENTES CAUSALES DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS 66
CAPITULO III
FIGURA III.1 DEFINICIÓN DE INTESIDAD DE RADIACIÓN 81
FIGURA III.2 MODELO DE EMISIÓN PARA UNA LAMPARA TUBULAR 92
FIGURA III.3 RESULTADOS DE LA SIMULACIÓN CON EL MODELO DE 5 PARÁMETROS 119
FIGURA III.4 RESULTADOS DE LA SIMULACIÓN CON EL MODELO DE 4 PARÁMETROS 120
XI
FIGURA III.5 RESULTADOS DE LA SIMULACIÓN OMITIENDO LA ETAPA DE LISADO 121
FIGURA III.6 DESCRIPCIÓN GRÁFICA DE LA EVOLUCIÓN DEL PROCESO (185 ppm) 122
FIGURA III.7 DESCRIPCIÓN GRÁFICA DE LA EVOLUCIÓN DEL PROCESO (45 ppm) 123
CAPITULO IV
FIGRURA IV.1 DISPOSITIVO EXPERIMENTAL IRRADIADO

130
FIGURA IV.2 a) TITULACIÓN CON PERMANGANATO
139
b) TITULACIÓN CON IODURO
139
FIGURA IV.3 a) ACONDICIONAMIENTO DE LA MUETRA
142
b) SIEMBRA
142
FIGURA IV.4 a) MEDIOS DE CULTIVO

143
b) INCUBACIÓN DE PLACAS
143
FIGURA IV.5 a) DETERMINACIÓN DE APA EN EL ESPECTROFOTÓMETRO
144
b) DISTINTAS CONCENTRACIONES DE APA
145
c) CONSUMO DE APA DURANTE LOS ENSAYOS EXPERIMENTALES
145
FIGURA IV. 6 CRISTALES DE CATALASA
147
FIGURA IV. 7 a) y b) CRISTALES DE CATALASA LUEGO DE REACCIONAR CON UV
147
FIGURA IV.8 ACTIVIDAD DE LA CATALASA DE ASPERGILLUS NIGER A DIFERENTES
148
VALORES DE pH.
FIGURA IV.9 ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD DEL APA EN EL TIEMPO 149
FIGURA IV.10 COLONIAS CARACTERÍTICAS DE E. COLI EN EMB 154
FIGURA IV.11 COLONIAS CARACTERÍSTICAS DE P. aeruginosa EN AGAR CETRIMIDE 156
FIGURA IV.12 a) PREPARACIÓN DEL PORTA CON AGUA 162

b) TOMA DE MUESTRAS PARA LA TINCIÓN 162
c) FIJACIÓN A LA LLAMA. 162
162
FIGURA IV.13 a) E.coli GRAM NEGATIVA
162
b) P. aeruginosa GRAM NEGATIVA
FIGURA IV.14 PRUEBAS INVIC PARA E. coli 163
XII
FIGURA IV. 15 BARRIDO ESPECTRAL DEL MEDIO DE CULTIVO 168
FIGURA IV.16 ABSORBANCIA DEL CALDO DE CULTIVO IRRADIADO CON UV 169
FIGURA IV.17 FASES DE CRECIMIENTO BACTERIANO 172
FIGURA IV.18 CURVA DE CRECIMIENTO EXPERIMENTAL 174
FIGURA IV.19 CURVA DE ABSORBANCIA 176
CAPITULO V
FIGURA V. 1 ESQUEMA DEL REACTOR EXPERIMENTAL 180
FIGURA V.2 CORRIDA EXPERIMENTAL INACTIVACIÓN DE E.coli CON RADIACIÓN 181

UVC

UVC Y 1 ppm DE ACIDO PERACÉTICO COMERCIAL







FIGURA V.11 INACTIVACIÓN DE E.coli CON RADIACIÓN UVC Y DIFERENTES 185

CONCENTRACIONES DE ACIDO PERACÉTICO COMERCIAL
FIGURA V.12 a) E.coli PREVIO AL TRATAMIENTO UVC 188

b) E.coli POST TRATAMIENTO UVC 189
FIGURA V.13 EVOLUCIÓN DE LAS CONCENTRACIONES EXPERIMENTALES Y LA 197

SIMULACIÓN DEL MODELO
CAPITULO VI
FIGURA VI.1 INACTIVACIÓN DE E. coli UTILIZANDO SOLUCIÓN COMERCIAL DE APA

1 ppm
204
XIII
FIGURA VI.2 INACTIVACIÓN DE E. coli UTILIZANDO SOLUCIÓN COMERCIAL DE APA
1.5 ppm
204
FIGURA VI.3 INACTIVACIÓN DE E. coli UTILIZANDO SOLUCIÓN COMERCIAL DE APA 205

2 ppm

3 ppm

4 ppm

5 ppm

6 ppm

8 ppm
FIGURA VI.9 INACTIVACIÓN DE E. coli A DIFERENTES CONCENTRACIONES 208

SOLUCIÓN COMERCIAL DE APA
FIGURA VI.10 INACTIVACIÓN DE E. coli CON 4 ppm DE ACIDO PERÁCETICO 214

INHIBIENDO PERÓXIDO DE HIDRÓGENO


FIGURA VI.13 COMPARACIÓN DE LA VELOCIDAD DE INACTIVACIÓN DE E. coli CON 216

4 ppm DE APA COMERCIAL VERSUS 4 ppm DE APA INHIBIENDO PERÓXIDO


FIGURA VI.16 EL GRUPO HEMO 224
FIGURA VI.17 ESQUEMA DE REACCIÓN DEL ÁCIDO PERACÉTICO INHIBIENDO 225

PERÓXIDO
FIGURA VI.18 ESQUEMA PARA LA OBTENCIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS 228
FIGURA VI.19 EVOLUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN EXPERIMENTAL Y DEL 229

MODELO PARA UNA CONCENTRACIÓN DE APA DE 4 ppm INHIBIENDO PERÓXIDO
DE HIDRÓGENO

DE HIDRÓGENO
XIV
DE HIDRÓGENO
FIGURA VI. 22 COMPARACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES EXPERIMENTALES DE 230

E. coli DEL MODELO PROPUESTO VERSUS E. coli EXPERIMENTAL
FIGURA VI. 23 ESTRUCTURA EN FORMA DE DE CINTA DE LA ENZIMA CATALASA 234
FIGURA VI.24 MOLECULA DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO SOBRE EL GRUPO HEMO 235

PRESENTE EN LA ENZIMA CATALASA
FIGURA VI. 25 ESQUEMA DE ATAQUE DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 237

MODELO PARA UNA CONCENTRACIÓN DE 15 ppm DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
FIGURA VI.27 EVOLUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN EXPERIMENTAL Y DEL

MODELO PARA UNA CONCENTRACIÓN DE 25 ppm DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 238

MODELO PARA UNA CONCENTRACIÓN DE 33 ppm DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO

FIGURA VI. 30 ESQUEMA CINÉTICO: ATAQUE DEL ÁCIDO PERACÉTICO COMERCIAL 243

MODELO PARA UNA CONCENTRACIÓN DE APA COMERCIAL DE 5 ppm



APENDICE IV
AIV.1 ESTRIA DE P. aeruginosa 280
AIV.2 COMPARACIÓN DE PLACAS DE P. aeruginosa 280
AIV.3 P. aeruginosa BAJO LUZ UV 281
AIV.4 CONFECCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO 281
XV
INDICE DE TABLAS
CAPITULO I
TABLA I. 1: AGENTES PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR EL AGUA Y SU IMPORTANCIA EN LOS

SISTEMAS DE ABASTECIMIENTO DE AGUA 4
CAPITULO II
TABLA II. 1: MÉTODOS CLÁSICOS DE DESINFECCIÓN 19
TABLA II.2: CONSTANTES DE IONIZACIÓN DEL CLORO 23

TABLA II.3: POTENCIALES DE OXIDACIÓN DE DIFERENTES ESPECIES
45
TABLA II.4: CLASIFICACIÓN DE LOS PROCESOS AVANZADOS DE OXIDACIÓN 46
TABLA II.5: COMPARACIÓN DE LAS GRAM POSITIVIAS Y LAS GRAM NEGATIVAS 54
TABLA II.6: CLASIFICACIÓN DE LOS BIOCIDAS SEGÚN SU UTILIZACIÓN 65
TABLA II.7: MECANISMOS DE ACCION DE LA SOLUCIÓN COMERCIAL DE ÁCIDO PERACÉTICO 70
CAPITULO IV
TABLA IV.1: CARACTERÍSTICAS DEL DISPOSITIVO EXPERIMENTAL 131
TABLA IV.2 REACTIVOS UTILIZADOS DURANTE LA TITULACION 136
TABLA IV.3 DISEÑO EXPERIMENTAL SOLUCIÓN COMERCIAL DE APA+UV 140
TABLA IV. 4 DISEÑO EXPERIMENTAL SOLUCIÓN COMERCIAL DE APA 141
TABLA IV.5 FÓRMULA EMB AGAR 153
TABLA IV.6 MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS EN EMB AGAR 154
TABLA IV. 7 FÓRMULA DE AGAR CETRIMIDE 155
TABLA IV.8 MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS EN AGAR CETRIMIDE 156
TABLA IV.9 FORMULA DEL AGAR NUTRITIVO 158
TABLA IV.10 MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS EN CALDO NUTRITIVO 158
TABLA IV.11 VALORES DE CRECIMIENTO PARA E.COLI 175
TABLA IV.12 DATOS EXPERIMENTALES DE LAS ABSORBANCIAS MEDIDAS CURVA CRESC. 177
XVI
CAPITULO V
TABLA V.1 RECRECIMIENTO BACTERIANO 187
TABLA V.2 LOGARITMO DE LA INACTIVACIÓN DE E.coli A LOS 4 SEGUNDOS DEL ENSAYO

EXPERIMENTAL 190
CAPITULO VI
TABLA VI.1: TIEMPO NECESARIO PARA LOGRAR EL MISMO NIVEL DE INACTIVACIÓN(APA-HP) 217
TABLA VI.2: RESULTADOS DE INACTIVACIÓN EMPLEANDO PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Y ÁCIDO

PERACÉTICO COMERCIAL 220
TABLA VI. 3: ETAPAS DE REACCIÓN PROPUESTAS 221
APENDICE I
AI.1 TABLA 1: 1 ppm APA COMERCIAL/ E. coli 256
AI.1 TABLA : 1.5 ppm APA COMERCIAL/ E. coli 256
AI.1 TABLA 8: 8 ppm APA COMERCIAL / E. coli 259
AI.1 TABLA 9: FRACCIÓN DE REMOCIÓN/INACTIVACIÓN 260
AI.2 TABLA 1: UVC/ E. coli 260
AI.2 TABLA 2: UV/1 ppm APA COMERCIAL/ E. coli 261
XVII
AI.3.1 TABLA 1: ÁCIDO PERACÉTICO COMERCIAL INHIBINEDO PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 265
AI.3.2 TABLA 2: PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 266
AI.3.3 TABLA 3: SOLUCIÓN COMERCIAL DE ÁCIDO PERACÉTICO

267
APENDICE IV
AIV.1.1 MATERIALES NECESARIOS PARA LA ACTIVACIÓN DE P. aeruginosa 279
AIV.3 TABLA 1: 1 ppm ACIDO PERACÉTICO COMERCIAL/ P. aeruginosa 282
AIV.3 TABLA 2: 1.5 ppm ACIDO PERACÉTICO COMERCIAL/ P. aeruginosa 283
XVIII
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
CAPITULO I INTRODUCCIÓN
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN AL TEMA EN ESTUDIO
I.1. IMPORTANCIA DEL AGUA.
El agua es fundamental para todas las formas de vida conocidas. El acceso al

agua potable es primordial para la salud, uno de los derechos humanos básicos y un
componente esencial en las políticas eficaces de protección de la salud.
Uno de los principales problemas de la humanidad en pleno siglo XXI es el

acceso al agua potable y a medios adecuados de saneamiento. Esta problemática
influye de manera directa sobre la salud de una gran parte de la población mundial e
indirectamente repercute en el desarrollo de los países más desfavorecidos. La falta
de agua potable afianza el ciclo de la pobreza, dado que las regiones pobres se
encuentran en condiciones de mayor desventaja para afrontar éste y otros muchos
problemas.
La escasez de agua potable se ha convertido en la actualidad en una prioridad

para la comunidad internacional. Esto ha quedado reflejado en los documentos
finales de diversos foros internacionales sobre políticas de salud, entre los que cabe
mencionar: la Conferencia I nternacional sobre Atención Primaria de Salud que tuvo
lugar en Alma Ata, Kazajstán en 1978, conferencias sobre la importancia del agua,
como la Conferencia M undial sobre el Agua de M ar del Plata (Argentina) de 1977,
que dio inició al Decenio I nternacional del Agua Potable y del Saneamiento
Ambiental, así como los Objetivos de Desarrollo del M ilenio aprobados por la
Asamblea General de las Naciones Unidas (ONU) en 2000 y el documento final de la
Cumbre M undial sobre el Desarrollo Sostenible de Johannesburgo de 2002.
Uno de los objetivos principales de la Organización M undial de la Salud

consiste en garantizar el acceso a una fuente de agua potable segura a todas las
personas, cualquiera sea su nivel de desarrollo y su condición social o económica. En
este sentido, las Naciones Unidas proclamaron el periodo de 2005 a 2015 Decenio
I nternacional para la Acción: “El agua, fuente de vida”, y decidieron otorgar mayor
importancia en el plano mundial a las cuestiones relativas al agua.
1
La calidad del agua en los sistemas naturales depende de diversos factores

naturales, aunque, el factor más importante en la actualidad es la actividad
antrópica. El hombre ha utilizado las aguas continentales como fuente de recurso
para multitud de funciones, así como medio receptor y depurador de los residuos
generados por las mismas.
I.2. CALIDAD DEL AGUA DE CONSUMO
El Código Alimentario Argentino (CAA), la Organización M undial de la Salud

(OM S) en sus Guías para la calidad del agua potable, la Directiva 98/ 83 de la
Comunidad Económica Europea (CEE) y otras normas internacionales, instituyen o
recomiendan requisitos de calidad para el agua de consumo humano. En general,
estas normativas establecen que el agua es bacteriológicamente apta si se encuentra
exenta de microorganismos patógenos de origen entérico y de parasitarios
intestinales.
El agua de consumo humano ha sido definida en las Guías de Calidad del Agua
de Bebida de la Organización M undial de la Salud (WHO, 2004; OM S, 2003; OM S,
1995) como aquella: “inocua (potable) que no ocasiona ningún r iesgo significativo
par a la salud cuando se consume dur ante toda una vida, teniendo en cuenta las
difer entes vulner abilidades que pueden pr esentar las per sonas en las distintas
etapas de su vida (lactantes, niños y ancianos)”. El objetivo de las normas y
estándares es el de controlar la cantidad de un determinado microorganismo en el
agua, siendo este microorganismo la causa de una enfermedad específica o un
indicador de las condiciones dentro de las cuales podría transmitir enfermedad
(Jones, 1997). En el caso de los microorganismos patógenos no existe un límite
inferior tolerable, por lo que el agua destinada al consumo, la preparación de
alimentos y bebidas o la higiene personal no debe contener ningún agente patógeno
para los seres humanos.
En las guías para el control de la calidad de la OM S (2003) se postula que: “La

gar antía de la inocuidad micr obiana del abastecimiento de agua de consumo se
basa en la aplicación, desde la cuenca de captación al consumidor , de bar r er as
múltiples par a evitar la contaminación del agua de consumo o par a r educir la a
niveles que no sean per judiciales par a la salud”. La seguridad microbiológica del
agua se mejora mediante la implantación de barreras múltiples, como la protección
2
de los recursos hídricos, la selección y aplicación correcta de una serie de operaciones

de tratamiento, y la gestión de los sistemas de distribución (por tuberías. o sistemas
alternativos) para mantener y proteger la calidad del agua tratada. Esto se puede
conseguir seleccionando fuentes de agua de buena calidad, tratando y
descontaminando eficazmente el agua contaminada y protegiéndola para que no
haya contaminación durante la distribución al usuario.
No obstante, a pesar de los protocolos, guías y programas de organizaciones

gubernamentales y no gubernamentales para controlar la contaminación
microbiológica, aproximadamente un 80% de todas las enfermedades en los países
en desarrollo están asociadas a la utilización y al consumo de agua contaminada
(Rojas, 2002). Las enfermedades causadas por bacterias, virus, protozoarios
parásitos o helmintos son el riesgo más común que lleva consigo el agua de consumo
(OM S, 2004). El uso de la misma para beber o cocinar, el contacto durante baños o la
inhalación de pequeñas gotitas (aerosoles) pueden resultar en infecciones
(Guimarães, 2001). La gama de agentes patógenos cambia en función de factores
variables como el aumento de la población, el incremento del uso de aguas
residuales, los cambios poblacionales, las migraciones y viajes, y condiciones
ambientales de stress o selectivas que favorecen la aparición de agentes patógenos
nuevos o mutantes, o de la recombinación de estos agentes ya existentes.
La transmisión por el agua de consumo es sólo uno de los vehículos de

transmisión de los agentes patógenos transmitidos por la vía fecal-oral. Pueden ser
también vehículo de transmisión los alimentos contaminados, las manos, los
utensilios y la ropa, sobre todo cuando el saneamiento e higiene domésticos son
deficientes. Para reducir la transmisión de enfermedades por la vía fecal–oral es
importante mejorar la calidad del agua y su disponibilidad, así como los sistemas de
eliminación de excrementos y la higiene general. La tabla I .1 proporciona
información general sobre agentes patógenos importantes en la gestión de sistemas
de abastecimiento de agua de consumo.
3
Tabla I.1 Agentes patógenos transmitidos por el agua y su importancia en los

sistemas de abastecimiento de agua (modificado de OMS, 2005).
AGENTE IMPORTANCIA PERSISTENCIA EN INFECTIVIDAD

PARA LA SALUD EL AGUA RELATIVA
Campilobacter jejuni alta moderada moderada
Escherichia coli (patogena) alta larga moderada
Escherichia coli alta moderada moderada
(hemorrágica)
Legionella sp alta moderada moderada
Pseudomonas aeruginosa alta moderada baja
Salmonella thypi alta larga moderada
Shigella sp alta moderada baja
Vibrio cholerae alta prolifera alta
Adenovirus alta larga alta
Enterovirus alta larga alta
Virus Hepatitis A alta larga alta
Virus Hepatitis B alta larga alta
Acanthamoeba spp alta larga alta
Entamoeba histolytica alta larga alta
Giardia intestinalis alta larga alta
Toxoplasma gondii alta larga alta
Dranculus medienesis alta moderada alta
Schistostosoma spp alta moderada alta
I.3. LA DISTRIBUCIÓN Y ACCESO AL AGUA EN EL MUNDO
El total del agua presente en el planeta, en todas sus formas, se denomina

hidrósfera. Se estima que en la superficie terrestre hay unos 1.500 km 3 de agua que
cubren el 70% de la superficie mundial. De este porcentaje, el 97,5 % de ella es agua
salada. y del restante 2,5 %, que es agua dulce, casi las tres cuartas partes se
encuentran congeladas en forma de capas de hielo. El agua dulce accesible de los
lagos, ríos y mantos acuíferos es inferior al 0,1 % del total de agua de la Tierra. El
agua tiene su propia dinámica en el denominado ciclo hidrológico. A medida que el
hombre ha modificado el ciclo natural para poder utilizar el agua para su provecho,
se han generado diferentes ciclos artificiales o antrópicos del agua que no sólo
modifican su circulación, sino que implican una modificación de sus características,
ya que en estos nuevos ciclos el agua ve alterada su calidad (Fernandez Cirelli, 2009).
4
La distribución y el acceso al agua no son equitativos, se calcula que en el 2011, 768

millones de personas no consumían agua de una fuente mejorada, de las cuales 185
millones recurrían a aguas superficiales para satisfacer sus necesidades diarias de
agua (United Nations I nternational Childrens Emergency Fundation, UNI CEF,
2013), el 83% de la población sin acceso a una fuente de agua de consumo mejorada
vivía en zonas rurales, en países en desarrollo. La tasa de cobertura de agua en el
2011 puede observarse en la figura I .1.
Figura I.1. Proporción de la población mundial que consume agua de fuentes mejoradas.
(Modificada del Informe de Actualización de UNICEF, 2013)
En los países en desarrollo, cerca del 85% de la población cuenta con servicios
de agua potable, ya sea con conexión o con fácil acceso a una fuente pública. Estas
estimaciones de la cobertura sugieren que los niveles de servicio son relativamente
altos. Sin embargo, no hay equidad en el acceso y uso de estos servicios y se observan
grandes disparidades entre zonas urbanas y rurales, si bien esta diferencia ha
decrecido en los últimos 20 años. En la figura I .2 puede observarse la evolución de la
cobertura del acceso al agua potable en las zonas urbanas y rurales en el periodo
comprendido entre 1990 y 2011.
5
Figura I.2. Evolución de la cobertura mundial del acceso al agua potable en zonas urbanas
y rurales (Modificada del Informe de Actualización de UNICEF, 2013)
Dentro de las cuatro metas principales de las Naciones Unidas, UNI CEF y la
OM S para los próximos 20 años, tres de ellas hacen referencia al acceso al agua
segura, estas son:
 que en 2030 todas las personas dispongan en el hogar de una instalación

básica para lavarse las manos y obtener agua potable.
 que en 2040 todas las personas utilicen instalaciones de saneamiento

adecuadas en el hogar; que la proporción de la población sin un servicio de
abastecimiento de agua intermedio en el hogar se haya reducido a la mitad; que los
excrementos de al menos la mitad de las escuelas, centros de salud y hogares con
instalaciones de saneamiento adecuadas estén gestionados de forma segura, y que se
hayan reducido progresivamente las desigualdades en el acceso a todos estos
servicios.
6
 que todos los servicios de abastecimiento de agua, saneamiento e higiene se

proporcionen de una manera cada vez más accesible, responsable y sostenible
económica y medioambientalmente.
I.3.1. DISTRIBUCIÓN Y ACCESO AL AGUA EN ARGENTINA.
Existe en Argentina una amenaza creciente a la sostenibilidad de las fuentes

de aguas superficiales y subterráneas por la alteración antrópica del uso del suelo en
su cuenca de aporte. Las prácticas agrícolas no conservacionistas, la deforestación, el
uso de agroquímicos y los cambios en el uso del suelo, particularmente la
urbanización, perturban el balance hídrico y las condiciones de calidad de las
fuentes.
De acuerdo al Censo Nacional 2011 (I nstituto Nacional de Estadísticas y

Censos) el 96% de la población urbana del país está abastecida por sistemas de agua
potable por red, en tanto que el 4% de la población urbana se abastece por fuentes
alternativas, mientras que el 53.8% de esta población dispone de servicios de
evacuación de excretas por red. El 18% de la población urbana utiliza sistemas
individuales para la evacuación de efluentes cloacales, tales como cámara séptica y
pozo absorbente; por lo que la población urbana que tiene acceso a un sistema
cloacal seguro alcanza aproximadamente al 65%. No obstante estos valores, existe
una marcada disparidad en los niveles de cobertura de agua potable y saneamiento
entre provincias y entre áreas urbanas y rurales de éstas.
El 40% de la población rural dispone de agua potable por red mientras que
sólo el 1,6% evacua sus excretas a una red colectora domiciliaria, en tanto, el 48, 2%
de la población rural dispone de sistemas individuales de descarga de efluentes
(cámara séptica y pozo absorbente). De esta información se puede observar que en
Argentina, la presencia de microorganismos patógenos en el agua de bebida es un
riesgo que se incrementa en las aéreas marginales de mayor densidad poblacional
que no tengan disposición final de excretas o en zonas sin disponibilidad de agua
tratada (zonas rurales).
El promedio nacional de producción de agua por habitante servido se estima

en 380 litros/ habitantes/ día, con un rango amplio de variación entre las distintas
provincias, que oscila entre un máximo de 654 l/ hab/ día en la provincia de San Juan
y un mínimo de 168 l/ hab/ día en la provincia de La Pampa. El consumo medio real
7
sobre la base de los resultados de sistemas que operan con micro medición (Bahía
Blanca en la provincia de Buenos Aires y la provincia de Jujuy) es del orden de los
180 l/ hab/ día.
El vertido de las aguas residuales domésticas sin depurar a los ríos y lagos y la
infiltración de excretas provenientes de fosas sépticas y redes de alcantarillado mal
mantenidas, constituyen una de las principales fuentes de contaminación de las
aguas superficiales y subterráneas en el país, generando así un riesgo potencial para
la salud de la población. Sólo el 10% del volumen total de los efluentes domésticos
recolectados por los sistemas de desagües cloacales, son tratados por un sistema de
depuración.
Como complemento, se puede agregar que las enfermedades relacionadas con

el agua más frecuentemente desarrolladas en el país son las gastrointestinales
agudas, la paratifoidea, la fiebre tifoidea y las parasitosis intestinales. La diarrea es
uno de los problemas de salud más acuciante. La incidencia media anual en niños
menores de cinco años es de 3,5 episodios cada mil, uno de los cuales puede ser
prolongado y dar lugar a una deshidratación, cuya gravedad varía de acuerdo al
microorganismo infeccioso, la intensidad de la infección, la edad y el estado
nutricional e inmunidad del niño. La Hepatitis (“A” y las sin especificar) presentan
una fuerte incidencia, registrándose en 1997 en el ámbito nacional 39.000
notificaciones, evidenciando marcados incrementos en coincidencia con las áreas de
bajo nivel socioeconómico y carentes de servicios adecuados de saneamiento.
I.4. MARCO LEGAL DEL AGUA EN ARGENTINA:
A nivel nacional, se puede decir que no existe una ley nacional de aguas.
Numerosos proyectos sobre una ley nacional o federal de aguas fueron presentados
por el Poder Ejecutivo o por diversos legisladores a lo largo de los años, sin encontrar
el adecuado respaldo para su sanción. La actual legislación nacional está constituida
entonces por las normas contenidas fundamentalmente en el Código Civil, el Código
de Comercio, el Código de M inería, el Código Penal y leyes federales como las de
energía, navegación, transporte, puertos, protección del ambiente y de los recursos
naturales, etc., las que contienen disposiciones directa o indirectamente relacionadas
con el agua. A su vez la Nación ha ratificado tratados internacionales sobre aguas
compartidas; ingreso de buques nucleares en aguas argentinas; préstamos para obras
8
de abastecimiento de agua potable y saneamiento urbano y rural; construcción de

obras de uso múltiple; y otros cuya normativa involucra directa o indirectamente al
agua.
I.5. DESINFECCIÓN DEL AGUA
La desinfección del agua es un proceso que tiene como objetivo volver inactivo
al agente biológico contaminante, y generalmente es la etapa final de los
tratamientos de agua para consumo.
Según la Organización Panamericana de la Salud, OPS, (2004), la eficiencia

del proceso de desinfección dependerá de factores que se deberán tener en cuenta,
como son:
 La naturaleza y número de los organismos a ser destruidos.
 El tipo y concentración del desinfectante usado.
 La temperatura del agua a ser desinfectada. Cuanta más alta sea la

temperatura, más rápido es el proceso.
 El tiempo de contacto entre el desinfectante y el agua. M ientras mayor sea este

periodo, los resultados son mejores. La totalidad de muertes de microorganismos es
proporcional al tiempo de contacto.
 La calidad del agua a ser desinfectada. Si el agua contiene partículas,

especialmente de naturaleza coloidal y orgánica, la eficiencia de la desinfección es
menor. Es recomendable que la turbiedad del agua sea menor a 5 UNT.
 El pH del agua.
 Las condiciones de la mezcla. Se obtiene buenos resultados cuando la mezcla

del agua y el desinfectante es homogénea.
A su vez, un desinfectante ideal deberá reunir las siguientes características:
 Destruir o inactivar, dentro de un tiempo determinado, las clases y número de

microorganismos patógenos presentes en el agua.
 Ser fiable para usar dentro del rango de condiciones que podrían encontrarse
en el abastecimiento de agua.
9
 M antener una concentración residual adecuada en el sistema de distribución

de agua a fin de evitar la recontaminación.
 No introducir ni producir sustancias tóxicas o, en caso contrario, éstas deben

mantenerse por debajo de los valores guía.
 Ser seguro y conveniente de manejar y aplicar en las situaciones en que se

prevé su uso.
 El análisis para determinar la concentración de desinfectante en el agua debe

ser exacto, sensible, rápido y apropiado.
 El costo del equipo, instalación, operación, mantenimiento y reparación, así

como su adquisición y el manejo de los materiales requeridos para sustentar
permanentemente una dosificación eficaz, deben ser accesibles.
El agente desinfectante normalmente utilizado en América Latina y en la

mayoría de los países en desarrollo es el cloro, que continúa desempeñando una
función primordial en la reducción y el control de estas enfermedades que hoy día
siguen siendo una preocupación en muchos países. La dosificación de un agente
químico con fines de desinfección en el agua, puede traer como consecuencia que, al
reaccionar con ciertos compuestos orgánicos, se propicie la formación de productos
secundarios de la desinfección DBPs (disinfection by-products, por sus siglas en
inglés), muchos de los cuales se han identificado como potencialmente perjudiciales
para la salud humana. Rook (1974) detectó en el agua potable clorada la existencia de
subproductos generados por la reacción con el cloro y la materia orgánica natural,
NOM , (natural organic matter, por sus siglas en inglés). La materia orgánica natural
presente en el agua y el ión bromuro (u otros iones) se consideran como los
precursores orgánicos e inorgánicos, respectivamente para la formación de los DBPs
(Sadiq y Rodriguez, 2004).
Como se mencionó en el párrafo anterior, los precursores de los subproductos

de la desinfección pueden agruparse en dos grandes grupos, los precursores
orgánicos y los inorgánicos, la materia orgánica natural (NOM), en particular las
sustancias húmicas presentes en el agua no tratada (es decir, en aguas naturales),
constituye el grupo más abundante de precursores orgánicos que reaccionan con el
desinfectante en el proceso de desinfección, dando lugar a la formación de los
mencionados subproductos (Nikolaou et al., 2004; Singer, 1994, 1999; Christman et
10
al., 1983; M iller and Uden, 1983; Oliver, 1983; Johnson et al., 1982; Rook, 1976;
Bellar et al., 1974).
La NOM incluye una variedad de compuestos orgánicos, cuyas

concentraciones varían dependiendo de la vegetación próxima a la fuente hídrica, la
concentración de algas en el agua y la época del año (Singer, 1994; Kavanaugh et al.,
1980). Una fuente importante de NOM la constituyen las sustancias húmicas (ácidos
húmicos y fúlvicos), y las sustancias no húmicas, principalmente proteínas y
aminoácidos, azúcares y polisacáridos, ligninas, ceras y lípidos (Richardson, 2003).
Una característica de las aguas naturales es que el 90% de las sustancias húmicas
disueltas son ácidos fúlvicos y el 10% ácidos húmicos.
El otro grupo de precursores, los inorgánicos, está formado por los

componentes inorgánicos naturales y antropogénicos presentes en el agua,
procedentes de varios minerales y otras sustancias derivadas de fuentes abióticas,
como el desgaste geológico. El precursor inorgánico más común es el bromuro, cuya
concentración puede variar entre 10 y 100 µg/ L en aguas superficiales, pero es menos
frecuente en aguas subterráneas.
Estos productos secundarios pueden ser considerados como riesgos químicos

derivados del proceso de desinfección, al generarse exclusivamente por la reacción de
los desinfectantes con sustancias presentes naturalmente en el agua. Los DBPs están
constituidos principalmente por trihalometanos (THM ), ácidos haloacéticos (HAAs)
y los haloacetonitrilos. El Cloroformo, los bromodiclorometanos, los
dibromoclorometanos y el bromoformo, son todos componentes de los
trihalometanos totales (TTHM s), qué presente en el agua, puede causar problemas
en el hígado, riñón, o en el sistema nervioso y también incrementa el riesgo de cáncer
(Gehr et al., 2002.; Wagner et al, 2002; Colgan y Gehr, 2001). Algunos de los
subproductos de desinfección más usuales pueden observarse en la figura I .3.
11
Figura I.3 Subproductos de la desinfección (Cyprus University of Technology)
Cada desinfectante produce una gama de subproductos diferentes,

dependiendo de las características del agua, de las condiciones del proceso de
desinfección e incluso de la combinación de desinfectantes usados (desinfectante
primario y secundario). Por tanto, aunque la desinfección del agua es una barrera
contra los microorganismos que pueden originar enfermedades que en su momento
causaron grandes epidemias y que las siguen causando pero en menor medida;
también implica la presencia de compuestos potencialmente tóxicos y/ o genotóxicos,
a los que cualquier persona que consuma agua desinfectada estaría expuesto (M eier
et al., 1988; 1987; 1986).
La desinfección del agua potable es un proceso muy vinculado a la salud, que

si se lleva a cabo en forma confiable resulta en la disminución de la mayor parte de
las enfermedades de transmisión hídrica, pero debe hacerse en forma tal que no
introduzca riesgos adicionales por el uso inadecuado de los productos químicos
dosificados.
Actualmente, efectuar un balance entre los riesgos biológicos asociados a la

ingesta de agua, y los riesgos químicos que derivan del uso de los desinfectantes, es
una tarea necesaria y una nueva variable a tener en cuenta en el diseño y operación
de los sistemas de potabilización.
I.5.1 DESINFECTANTES ALTERNATIVOS.
Un sistema de desinfección ideal debería garantizar la eficiencia máxima para

la remoción de microorganismos patógenos sin generar subproductos tóxicos e
12
indeseables. La solución correcta del problema de la contaminación pasa por el uso

de tecnologías alternativas que en ninguno de sus pasos afecten el medio ambiente.
Es especialmente interesante concentrar el esfuerzo en nuevas tecnologías que

sean del tipo destructivo, permitiendo obtener como resultado medios purificados e
inocuos. Dentro de estos procesos se ubican las los Procesos Avanzados de Oxidación
(PAO) y como caso particular, de indudable crecimiento en la investigación de los
últimos años, se destaca la aplicación de aquellas que emplean radiación UV (en
algunos casos solar) para llevar a cabo la tarea.
La búsqueda de desinfectantes “verdes”, amigables con el ambiente, es un

desafío constante para las Organismos Nacionales, empresas y Organizaciones
Sociales que buscan minimizar el impacto ambiental de los productos químicos, el
ácido peracético comercial, se presenta como el desinfectante “verde” de esta última
década.
I.5.1.1. PROCESOS AVANZADOS DE OXIDACIÓN
Los Procesos Avanzados de Oxidación (PAOs o AOPs “Advanced Oxidation

Processes”, por sus siglas en inglés) son procesos fisicoquímicos capaces de producir
cambios profundos en la estructura química de los contaminantes químicos y
biológicos (Gogate et al., 2004; Legrini et al., 1993). El concepto fue inicialmente
establecido por Glaze y colaboradores quienes definieron los PAOs como procesos
que involucran la generación y uso de especies transitorias poderosas,
principalmente el radical hidroxilo (OH •). Este radical puede ser generado por
medios fotoquímicos (incluida la luz solar) o por otras formas de energía, y posee alta
efectividad para la oxidación.
Los PAOs se clasifican en procesos fotoquímicos y no fotoquímicos, en función

de la utilización o no de radiaciones luminosas en el proceso. (Labas et al, 2009). Los
PAOs más utilizadas en los últimos años son; dentro de los fotoquímicos: UV;
UV/ O3; UV/ H 2O2; Foto-Fenton (Fe+2/ +3/ H 2O2/ UV); Fotocatálisis H eterogénea
(TiO2/ UV) y dentro de los no fotoquímicos: ozonización (O3/ OH; O3/ H 2O2);
Reacción de Fenton (Fe+2/ +3/ H 2O2); oxidación electroquímica, tratamiento con haces
de electrones, ultrasonido, etc.
13
Las ventajas de los PAOs frente a los tratamientos tradicionales se pueden

resumir en:
 El contaminante se transforma químicamente, a diferencia de los sistemas de

separación de los contaminantes del agua.
 Se puede obtener una mineralización completa del contaminante.
 No se generan fangos que requieran un tratamiento posterior.
 Son de mucha utilidad frente a contaminantes tóxicos y/ o no biodegradables.
 Funcionan en el tratamiento de contaminantes hasta muy bajas

concentraciones (μg/L).
 No se forman subproductos de reacción, o se forman en baja concentración.
 Son ideales para disminuir la concentración de compuestos formados por

pretratamientos alternativos, como la desinfección.
 Generalmente, mejoran las propiedades organolépticas del agua tratada.
 En muchos casos, consumen mucha menos energía que otros métodos (por
ejemplo, la incineración).
 Permiten transformar contaminantes refractarios en productos tratables luego

por métodos más económicos como el tratamiento biológico.
 Eliminan efectos sobre la salud de desinfectantes y oxidantes residuales como

el cloro.
I.5.1.2. DESINFECCIÓN CON UV GERMICIDA
La inactivación por irradiación se debe a la absorción de radiación UV de alta

energía por los componentes fundamentales de la célula, causando reacciones
fotoquímicas que perjudican su funcionamiento normal (USEPA, 1999).
M ientras que la mayoría de los agentes desinfectantes normalmente utilizados

en aguas inactiva los microorganismos por una interacción (reacción) química, la
inactivación de los microorganismos por irradiación se debe a la absorción de
radiación ultravioleta (UV) de alta energía, que causa reacciones fotoquímicas de los
componentes fundamentales de las células, perjudicando así su funcionamiento
normal, interrumpiendo el mecanismo de duplicación o causando la muerte.
14
La desventaja que presenta la utilización de radiación UV es que, si el daño

producido al microorganismo no ha sido profundo, este puede volver a repararse.
(Labas et al, 2007).
I.5.1.3. DESINFECCIÓN CON ÁCIDO PERACÉTICO COMERCIAL
Dentro de los desinfectantes que se presentan como la más nueva alternativa

para la desinfección de efluentes se encuentra el Ácido Peracético (APA),
CH 3COOOH. Este desinfectante se encuentra en forma comercial como una solución
cuaternaria de equilibrio entre el ácido acético, el agua, el peróxido de hidrógeno y el
ácido peracético (40% agua, 23% de ácido acético, 22% peróxido de hidrógeno, 15%
de ácido peracético).
El ácido peracético (APA) y la combinación de APA/ UV se presentan como la

más novedosa alternativa para el tratamiento de aguas (muy poco aplicadas y
difundidas en países con economías emergentes)
El ácido peracético ha mostrado poseer un amplio espectro de ataque a

microorganismos como ser bacterias, virus, mohos y amplio poder ovicida y
esporicida, incluso a bajas temperaturas (Falsani et al, 2006; Kittis, 2004; Rutala et
al, 1999). El mecanismo de principal de acción del APA consiste en atravesar la
membrana citoplasmática de la célula, oxidando los componentes y destruyendo el
sistema enzimático, permitiendo además, el paso del peróxido de hidrógeno a través
de la membrana celular e inhibiendo la enzima catalasa (Kittis 2004). La
desinfección con APA tiene un gran beneficio adicional que es que no produce
subproductos de desinfección o lo hace en muy baja cantidad (Koivunen and
Heinonen-Tanski, 2005, M onarca et al 2002), por tal motivo se lo reconoce como
“amigable al ambiente”. Además los residuos del desinfectante se descomponen
rápidamente en compuestos inocuos tales como ácido acético y oxígeno.
Si bien en los últimos años se le ha dado mucha importancia al estudio de

diferentes tipos de PAO, el tratamiento de aguas con APA y con APA/ UVC no ha sido
estudiado profundamente.
15
ACRONIMOS CAPITULO I
UNT Unidad nefelométrica de turbidez
NOM Materia orgánica natural
DBPs Subproductos de la desinfección
THM Trihalometanos
TTHM Trihalometanos totales
HAAs Haloacéticos
PAO Procesos Avanzados de Oxidación
µg microgramos
hab habitantes
16
OBJETIVOS Y PLAN EXPERIMENTAL
I.6. OBJETIVOS Y PLAN EXPERIMENTAL
La elección del tema de tesis responde a una problemática actual del país:
el acceso al agua microbiológicamente segura. Además, realizará aportes para
contribuir con la solución del problema de tratamiento, en especial, con la
ausencia de subproductos de desinfección sin involucrar mayores costos
adicionales.
El trabajo de Tesis tiene como objetivos básicos la generación de

conocimientos científicos originales que aporten soluciones a problemáticas
ambientales reales.
Este trabajo de tesis pretende el desarrollo de un modelo cinético

detallado para la inactivación de dos contaminantes microbiológicos modelos
utilizando un agente oxidante y su posterior combinación con radiación UV, la
verificación experimental del mismo y la obtención de parámetros cinéticos. Se
buscará también analizar la generalidad de los resultados obtenidos con
distintos tipos de bacterias. Estos datos cinéticos serán luego empleados para
diseñar en forma predictiva reactores en escala mayor y formas operativas
diferentes a las de laboratorio.
Se puede establecer entonces, un objetivo general y objetivos

particulares:
I.6.1. OBJETIVO GENERAL:
Desarrollar una metodología general para el modelado cinético de la

desinfección de aguas empleando un agente oxidante químico (ácido peracético,
peróxido de hidrógeno) sólo y/ o combinado con radiación UV.
I.6.2. OBJETIVOS PARTICULARES:
1. Cuantificar, mediante modelos matemáticos el efecto de distintos

agentes oxidantes y de la adición de estos al proceso que emplea radiación UV
Página 17
OBJETIVOS Y PLAN EXPERIMENTAL
sola en la descontaminación microbiológica del agua. UVC sola, Oxidantes solos

y Oxidantes más UVC.
2. Obtener una cinética intrínseca general de descontaminación de aguas

con agentes oxidantes (con y/ sin UCV). Analizar su validez con diferentes
especies de bacterias sobre la base de la variación que se produce en los
respectivos parámetros cinéticos.
3. Dilucidar con datos cinéticos cuantitativos obtenidos el agente

oxidante más conveniente. Establecer las mejores condiciones de operación para
cada caso.
Página 18
CAPÍTULO II
MÉTODOS DE
DESINFECCIÓN
CAPÍTULO II. MÉTODOS DE DESINFECCIÓN
II.1. GENERALIDADES DE LOS MÉTODOS DE DESINFECCIÓN
La desinfección, en cuanto a su aplicación al tratamiento de agua, es el

proceso que se ocupa de la reducción del número de microorganismos. La
desinfección del agua es un proceso muy vinculado a la salud, que si se lleva a
cabo en forma confiable resulta en la disminución de la mayor parte de las
enfermedades de transmisión hídrica, pero debe hacerse en forma tal que no
introduzca riesgos adicionales por el uso inadecuado de los productos químicos
dosificados.
Los desinfectantes y el equipo de desinfección se deben seleccionar de

modo que satisfagan en lo posible las condiciones específicas de la aplicación a
que se destinen teniendo en cuenta todos los factores que influyen en la
fiabilidad, continuidad y eficacia de la desinfección. Los métodos de
desinfección clásicos se indican en la tabla I I .1
Tabla II.1. Métodos clásicos de desinfección de agua

FISICOS
QUIMICOS
Ultrafiltración
Cloro- Dióxido de Cloro-Cloramidas
Ultrasonido
Ozono
Osmosis inversa
Permanganato
Temperatura:
Peróxido de Hidrogeno(*)
i)Ebullición
ii)Congelamiento Ácido peracético(*)
Glutaraldehido
Radiación:
Plata
i)Ultravioleta(*)
ii)Gama Iodo
iii)Ionizante
(*) Se desar r ollar án en esta tesis doctor al.
19
Los procesos de tratamiento de aguas pueden reducir la concentración de

los contaminantes biológicos a través de dos mecanismos:
M eca nism os de r em oción: remover el contaminante biológico por

medios físicos tales como coagulación, floculación, sedimentación o flotación y
filtración.
M eca nism os de ina ctiva ción: volver inactivo el contaminante a

través de la acción de los desinfectantes físicos o químicos. El término
inactivación es sinónimo de desinfección, y debe distinguirse de esterilización,
que es la destrucción de todas las formas de vida.
El propósito de la desinfección de efluentes es proteger la salud pública

mediante la inactivación de microorganismos patógenos tales como entero
bacterias, virus y protozoarios y generalmente es la etapa final de de una serie
de procesos unitarios que tienen lugar en una planta potabilizadora
convencional de aguas superficiales (White, 1999).
En una planta potabilizadora convencional los procesos de remoción e

inactivación son complementarios, y la efectividad de cada uno depende
fuertemente del tipo de tratamiento utilizado, y del agente biológico que se
pretende eliminar.
La remoción o inactivación de un contaminante biológico se define como:
 N -N 
% ( R/I ) =  0 100 (II.1)
 N0 
(R/I)=Remoción y/o inactivación de microorganismos.
N0=Concentración inicial de microorganismos.
N=Concentración final de microorganismos.
La efectividad de los procesos de remoción y/ o inactivación se puede

evaluar a través de la cantidad x-Log removida y/ o inactivada.
20
N
Log(R/I)=Log (I I .2)
N0
 100 
Log(R/I)=Log   (I I .3)
 100-(R/I) 
 1 
%(R/I)=  1 − Log(R/I) 100 (II.4)
 10 
0,5 Log ≈ 68,38% de remoción y/o inactivación.
1,0 Log ≈ 90,0% de remoción y/o inactivación.
2,0 Log ≈ 99% de remoción y/o inactivación.
3,0 Log ≈ 99.9% de remoción y/o inactivación.
4,0 Log ≈ 99.99% de remoción y/o inactivación.
Si bien los tratamientos convencionales del agua pueden reducir hasta en

un 99,9% los microorganismos presentes, generalmente se requiere de la
desinfección para producir agua apta para el consumo humano desde el punto
de vista microbiológico (ENOHSA, 2000).
A continuación se presentará una breve descripción de los desinfectantes

más utilizados.
II.2. DESINFECTANTES QUÍMICOS:
Los agentes químicos utilizados en el campo de la potabilización de

aguas, pueden ser oxidantes químicos, tales como el cloro, el dióxido de cloro, el
ozono, el permanganato de potasio, o iones metálicos tales como los iones de
plata. Estos agentes químicos al introducirse en el agua producen la oxidación,
con posterior ruptura de pared celular, y la difusión del agente al interior de las
células, con la consecuente interferencia en la actividad celular. Por lo tanto la
capacidad de oxidación y de difusión son requisitos esenciales para que
cualquier agente desinfectante sea considerado eficiente (Asano et al., 2007).
21
El mecanismo por el cual se destruyen los organismos depende

principalmente del tipo de organismo y de la naturaleza del desinfectante. Si
bien los mecanismos de inactivación de bacterias, virus y protozoarios no están
completamente esclarecidos, se han propuesto cinco modos de acción
fundamentales:
1. daño de la pared celular,
2. alteración de la permeabilidad celular,
3. alteración de la naturaleza coloidal del protoplasma,
4. alteración del ADN o ARN celular y
5. inhibición de la actividad enzimática.
La eficiencia de los agentes químicos son afectadas por diversos factores

tales como: la concentración del desinfectante, el tiempo de contacto entre el
agua y el desinfectante, la temperatura, el pH, la concentración y el tipo de
microorganismos (Asano et al., 2007; M ontgomery, 1985).
II.2.1. DESINFECCIÓN CON CLORO:
El cloro se emplea en el tratamiento de agua:
1. Como desinfectante, para destruir o atenuar los microorganismos

patógenos
2. Como oxidante, con el objeto de modificar el carácter químico del

agua,
3. Para ambas aplicaciones simultáneas, tanto en la desinfección como

en la oxidación.
Cuando se adiciona cloro al agua, este se hidroliza rápidamente,

formándose ácido hipocloroso (HOCl)
Cl2 +H 2 O  HOCl+H + +Cl- (II.5)
22
HOCl+ Cl  Cl2 + OH - (II.6)
El ácido hipocloroso, formado por la hidrólisis del cloro, mantiene la

propiedad oxidante y es el principal responsable del efecto germicida de la
solución acuosa de cloro. Este ácido débil se ioniza o disocia en iones hidrógeno
e hipoclorito (ENOHSA, 2000).
HOCl  H + +OCl- (II.7)
El ácido hipocloroso (HOCl) y el ion hipoclorito OCl-, conforman lo que

denomina cloro residual libre. Para aguas con pH entre 6,5 y 8,5 la reacción es
incompleta y ambas están presentes en diferente porcentaje, dependiendo del
pH.
La constante de ionización es:
 H +   OCl-  (II.8)
Ki =
[ HOCl]
La Ki varía según la tabla I I .2:
Tabla II.2 Constante de Ionización del Cloro (White, 1992)

T (ºC) 0 5 10 15 20 25 30
Ki x 108 1.488 1.753 2.032 2.320 2.621 2.898 3.175

Mol/l
II.2.2. DESINFECCIÓN CON CLORAMINAS
Las cloraminas, si bien tienen menor poder desinfectante que el cloro

libre, se utilizan por su capacidad de persistir en el agua, proporcionando un
efecto residual “combinado” que actúa en las redes y depósitos de distribución.
Las prácticas de cloración “residual” combinadas tienen por objetivo la

formación de monocloraminas (NH 2Cl), por la adición de cloro y amonio al
23
agua, o por reacción del cloro dosificado y el amonio naturalmente presente en

la misma.
A los valores de pH que habitualmente se presentan las aguas naturales

predomina la monocloramina por sobre la dicloramina, y la tricloramina. Si
bien la dicloramina tiene un efecto germicida más potente que la
monocloramina, se debe evitar la formación ya que ambas confieren olor y sabor
desagradables al agua (ENOHSA, 2000).
Si la concentración de amoníaco en el agua es nula o escasa, se requiere la

adición de cloro y amoníaco, hasta lograr la concentración de cloro residual
combinado deseada. Si la concentración de amoníaco en el agua es suficiente
para lograr la concentración de cloro residual combinado que se requiere, solo
se dosifica cloro (ENOHSA, 2000).
Las cloraminas son una buena opción como desinfectante secundario por
los siguientes potenciales beneficios (EPA, 1999):
 No son tan reactivas como el cloro libre con los compuestos

orgánicos para formar trihalometanos.
 La monocloramina residual es más estable en el agua que el cloro

libre y el dióxido de cloro, proporcionando mayor protección contra
recrecimientos bacterianos en las redes de distribución y depósitos de
almacenamiento.
 Las monocloraminas son muy efectivas para controlar biofilms en

las redes de distribución
No obstante, pueden citarse las siguientes desventajas del uso de

cloraminas (EPA, 1999):
 El poder desinfectante de las cloraminas es menor que el de otros

desinfectantes tales como el cloro libre, el ozono y el dióxido de cloro.
 Las cloraminas no oxidan hierro, manganeso y sulfuros.
 Excesos de amonio en el sistema de distribución pueden conducir

a la nitrificación, especialmente en puntas de red.
24
 La formación de dicloraminas ocasiona problemas operativos.
 Las cloraminas deben ser generadas in-situ.
II.2.3. DESINFECCIÓN CON OZONO
El ozono, poderoso oxidante representado por el símbolo O3, es un

alótropo (alotropía: propiedad de algunos elementos químicos de presentarse en
dos o más formas diferentes, en un mismo estado físico) del oxígeno,
conformado por tres átomos de este elemento. Es un gas cuya densidad es 1,5
veces mayor que la del oxígeno, y 1,7 veces más pesado que el aire, y es solo
parcialmente soluble en agua, pero cerca de 10 a 20 veces más que el oxígeno.
A presión y temperatura ambiente es un gas inestable que se descompone

rápidamente generando la molécula de oxígeno. Por lo tanto no se puede
almacenar o envasar, se debe generar en el mismo sitio en donde se va a utilizar,
y se debe aplicar inmediatamente (ENOHSA, 2000).
El ozono es extremadamente corrosivo y ataca a la mayoría de los

metales, por lo que se deben seleccionar cuidadosamente todos los materiales de
las instalaciones (ENOHSA, 2000).
La formación del ozono se da a partir de la combinación de un átomo de

oxígeno y una molécula de oxígeno, según la siguiente reacción endotérmica,
que requiere de importantes imputs de energía:
3O 2  2O3 (II.9)
El ozono puede producirse a través de variados métodos, tales como la

irradiación con luz ultravioleta de un gas que contenga oxígeno, reacciones
electrolíticas y otros métodos emergentes (EPA, 1999).
El ozono tiene algunas limitaciones importantes como desinfectante

único: su vida media en el agua es corta (aproximadamente media hora),
reacciona con sustancias orgánicas para producir derivados de peso molecular
25
inferior, que son más biodegradables que sus precursores, y no deja efecto
residual (desinfectante residual) (ENOHSA, 2000).
El ozono es el desinfectante más potente que se utiliza en los sistemas de

potabilización de aguas, siendo los valores de C*T necesarios para inactivar la
mayoría de los microorganismos, la décima parte de los correspondientes al
ácido hipocloroso (HOCl) o al dióxido de cloro (ClO2) (ENOHSA, 2000).
La inactivación de microorganismos se puede producir por contacto físico

directo entre éstos y las burbujas de gas ricas en ozono (efecto aparentemente
más importante), y por acción del ozono disuelto y sus productos de reacción
(ENOHSA, 2000).
Si bien el tiempo de contacto del ozono con el agua tiene su importancia,

en la relación C*T, la dosis suministrada tiene mayor peso relativo, debido a su
elevado poder oxidante. Solo queda residual de ozono en el agua luego de que la
totalidad de la materia con alta capacidad de oxidación fue oxidada, en caso
contrario, es posible que no se haya satisfecho completamente la demanda de
ozono (Solsona y M éndez, 2002).
La inactivación de microorganismos por el ozono residual disuelto no se

ve afectada significativamente por las variaciones de pH (ENOHSA, 2000;
Solsona y M éndez, 2002).
II.3. DESINFECTANTES QUÍMICOS ESTUDIADOS EN ESTA TESIS

DOCTORAL
II.3.1. ÁCIDO PERACÉTICO
La elección del Ácido Peracético como agente desinfectante de aguas para

estudiar durante este trabajo de investigación doctoral, responde a varios
motivos: el ácido peracético es un poderoso desinfectante con un amplio
espectro de actividad antimicrobiana. Los atributos que hacen del ácido
peracético un potencial desinfectante de aguas residuales son: la facilidad de
aplicación del tratamiento (sin necesidad de costosas inversiones de capital), su
26
alto poder oxidante, incluso en presencia de materia orgánica heterogénea,

ausencia de subproductos o residuos tóxicos o mutagénicos persistentes, baja
dependencia con el pH, cortos tiempos de contacto y efectividad para efluentes
primarios y secundarios.
II.3.2. CARACTERÍSTICAS GENERALES
II.3.2.1 QUÍMICA DEL APA
El ácido peracético (CH 3COOOH) es un peróxido del ácido acético, otros

nombres por los cuales se lo conoce es hidroperóxido acético o hidroperácido
acético, (Block, 2001), su formula molecular desarrollada puede observarse en
la Figura I I .1.
Comercialmente, el APA, se encuentra disponible como una mezcla

cuaternaria en equilibrio de ácido peracético (15%( (APA), ácido acético (16%)
(AA), peróxido de hidrógeno (23%)(pH) y agua (45%) de acuerdo a la siguiente
ecuación (Alasri et al., 1992; Block, 2001; Gehr et al., 2002):
CH 3 COOH + H 2 O 2  CH 3 COOOH + H 2 O (II.10)
Figura II.1 Formula molecular desarrollada del APA
27
Las soluciones de APA se producen industrialmente por reacción del

ácido acético o anhidro acético con peróxido de hidrógeno en presencia de un
catalizador, generalmente ácido sulfúrico. Para evitar la reacción reversa, las
soluciones son suplementadas con ácido acético y peróxido de hidrógeno (Block,
2001). Una de las principales desventajas del ácido peracético es que las
soluciones diluidas son considerablemente inestables (Block, 2001).
El principal uso del ácido peracético es para la síntesis industrial de

epóxidos. Transfiere un átomo de oxígeno a dobles enlaces, por ejemplo en el
etileno y el propileno, para formar epóxidos y alcoholes (Ecuación I I .11). Puede
también ser usado para producir glicerol sintético a partir del propileno, y es
usado en la fabricación del nailon.
R-CH=CH-R 
+H 3CCO3 H
-H 3CCO3 H
→ R-CH −  CH-R ´ (II.11)
O
II.3.2.2. PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS
Las propiedades germicidas del APA fueron reportadas por primera vez
en 1902 por Freer y Novy, quienes notaron las excelentes acciones
desinfectantes del APA. Hutchings y Xezones (1949) evaluaron la acción
germicida de 23 desinfectantes contra esporas de Bacillus ther moacidur ans
siendo el APA el desinfectante más efectivo de los 23 evaluados.
Greenspand y M acKellar (1951) encontraron que el APA era bactericida a

una concentración de 0,001%, fungicida a 0,003%, y esporicida a 0,3%. La
eficiencia de desinfección del APA hacia los microorganismos puede ser
clasificada de la siguiente manera: Bacterias > Virus > Esporas Bacterianas >
Protozoarios. (Liberti y Notamicola, 1999; Rudd y Hopkinson, 1989).
A pesar de los pocos trabajos que se han realizado para determinar el

modo de acción del APA como agente antimicrobiano, se especula que funciona
como otros peróxidos y agentes oxidantes (Block, 2001). Su actividad
desinfectante está basada en la liberación de especies reactivas del oxígeno
(Liberti y Notarnicola, 1999).
28
El APA ataca las uniones sulfhídrilo (–SH) y di–sulfuro (S–S) de

proteínas, enzimas, y otros metabolitos. Se sugiere que produce la ruptura de la
pared celular afectando posteriormente la función quimiosmótica de las
lipoproteínas de transporte de la membrana citoplasmática (Baldry y Fraser,
1988; Leaper, 1984;). También sería eficaz contra lipoproteínas del exterior de
la membrana, lo que facilitaría su acción contra bacterias Gram negativas
(Leaper, 1984). Su acción como agente desnaturalizante de proteínas podría
ayudar a explicar sus características como esporicida y ovicida (Block, 2001).
Por otra parte, el APA intracelular también puede oxidar enzimas esenciales,
por lo tanto las vías metabólicas y mecanismos bioquímicos vitales, el
transporte activo a través de membranas, y los niveles intracelulares de soluto
se ven perjudicados (Fraser et al., 1984). Además, se demostró que el APA actúa
sobre las bases nitrogenadas de la molécula de ADN de las bacterias (Tutumi et
al., 1973). Una ventaja importante del APA es que puede inactivar la catalasa,
una enzima conocida por desintoxicar y eliminar los radicales libres hidroxilo
(Block, 2001). Aunque el peróxido de hidrógeno es un desinfectante por si solo
que contribuye al poder de la mezcla, el APA es un agente antimicrobiano más
potente que el H 2O2, siendo altamente efectivo a bajas concentraciones contra
un gran espectro de microorganismos (Baldry y French, 1989a; Fraser et al.,
1984; Baldry, 1983;). Diferentes estudios indican que se requieren dosis
mayores de H 2O2 para obtener el mismo nivel de desinfección que se alcanza
con APA (Wagner et al., 2002).
El APA puede dañar virtualmente todo tipo de macromoléculas asociadas

con un microorganismo: carbohidratos, ácidos nucleicos (mutaciones), lípidos
(peroxidación lipídica), y aminoácidos (por ejemplo, conversión de Phe a m-Tyr
y o-Tyr ). Esto lleva de manera final a la lisis celular y una verdadera muerte
microbiana.
29
II.3.2.3. ÁCIDO PERACÉTICO COMO DESINFECTANTE DE AGUAS

NATURALES
Debido a la eficacia contra bacterias y virus, demostrada en varias

industrias, el uso de APA como desinfectante para los efluentes de aguas
residuales se ha investigado a escala laboratorio y piloto desde los 90´ s (Gehr et
al., 2002; Wagner et al., 2002; Stampi et al., 2001; Liberti et al., 2000; M orris,
1993; Lefevre et al., 1992).
En los siguientes párrafos se resume algunos resultados relevantes (es

decir, dosis y tiempos de contacto frente a las reducciones microbianas y las
conclusiones de estos estudios):
Baldry & French (1989b) encontraron que el APA era un eficaz agente
desinfectante para efluentes secundarios y resaltaron la facilidad de aplicación
del tratamiento con APA sin necesidad de equipos costosos, el amplio espectro
de actividad, incluso en presencia de materia orgánica y la ausencia de
generación de subproductos indeseables para el medio ambiente, características
que hacen del APA un potencial agente desinfectante para el tratamiento de
aguas residuales (Baldry y French, 1989b; Block, 2001). Gehr et al. (2002)
encontraron que para efluentes municipales primarios tratados
fisicoquímicamente (con cloruro de aluminio o de hierro), se requerían dosis de
APA de 2 a 6 mg/ L para lograr 1.000 unidades formadoras de colonias (UFC) de
coliformes fecales por cada 100ml con un tiempo de contacto de 60 minutos.
Para los efluentes secundarios, se requerían dosis menores de APA (0,6 a 4
mg/ L) para alcanzar 1.000 UFC de coliformes fecales por cada 100ml.
En los estudios realizados para la planta de tratamiento de aguas

residuales de la Comunidad Urbana de M ontreal en Canadá, se encontró que
una dosis de de 1 a 2 mg/ L y un tiempo de contacto de 2 horas era suficiente
para alcanzar 10.000 UFC de coliformes fecales por 100ml en efluentes
provenientes del tratamiento primario (Colgan y Gehr, 2001), mientras que para
efluentes secundarios se recomendó una dosis de APA de 5 a 10 mg/ L y un
tiempo de contacto de 15 minutos (Poffe et al., 1978).
30
La eficacia de la desinfección con APA también ha sido evaluada en aguas

residuales crudas, donde mostró una amplia variabilidad. Factores que
influyeron en dicha variabilidad fueron: la naturaleza y concentración de
materia orgánica, la concentración de sólidos en suspensión, la concentración
inicial de coliformes, y, sobre todo, el valor del pH. La dosis óptima de APA para
aguas residuales sin tratar fue de aproximadamente 20 mg/ L con un tiempo de
contacto de unos 10 minutos. Dosis más altas o tiempos de contacto mayores no
mejoraron sustancialmente la eficiencia del APA contra coliformes totales
(Sánchez–Ruiz et al., 1995).
Estudios de laboratorio comparativos de los efectos del APA, el dióxido

de cloro y el cloro sobre bacterias indicadoras en efluentes secundarios de aguas
residuales mostraron que el APA podría ser una alternativa viable a estos
biocidas halogenados (Baldry y French, 1989a).
Ensayos de laboratorio y a gran escala, en Brasil e I talia mostraron que el

APA era mejor desinfectante que el hipoclorito de sodio para la desinfección de
aguas residuales en climas tropicales y cálidos. Su eficacia sobre Vibr io choler ae
sugirió que podía ser un elemento importante en el control del cólera.
Aproximadamente 5 mg/ L de APA y un tiempo de contacto de 10 minutos era
suficiente para eliminar prácticamente todas las bacterias coliformes (Baldry et
al. 1995).
II.3.2.4. FACTORES QUE AFECTAN LA EFICIENCIA DE LA

DESINFECCIÓN
El APA es efectivo en un amplio rango de temperaturas. Sin embargo, en

carácter general, similar a otros productos químicos desinfectantes, las
reducciones microbianas aumentan con el aumento de la temperatura del agua
durante la desinfección con APA (Stampi et al., 2001).
La efectividad del APA se ve afectada por el pH, siendo más activo a pH

bajo. Se considera que la forma con actividad antimicrobiana del APA es el ácido
no disociado (Colgan y Gehr, 2001). El APA tiene un pKa de 8.2, por lo tanto en
31
condiciones alcalinas (es decir, pH superior a 9), la especie predominante es la

forma disociada del ácido lo que resulta en una disminución de la eficiencia de
desinfección. La eficiencia de desinfección a pH 5 a 8 no varía demasiado para
bacterias, pero sí se encuentra una disminución significativa de la eficiencia de
desinfección cuando se trabaja a pH 9 (Tutumi et al., 1973; Baldry y French,
1989b; Baldry et al., 1991; Sánchez – Ruiz et al., 1995; Block, 2001).
Aunque se ha demostrado que el APA es un eficaz desinfectante para los

efluentes primarios de aguas residuales, en carácter general, se encontró que la
eficacia de la desinfección con APA aumenta con la disminución de los sólidos
suspendidos totales (SST) y la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) (M eyer,
1976; Poffe et al., 1978; Sánchez-Ruiz et al., 1995; Colgan y Gehr, 2001; Stampi
et al., 2001; Gehr et al., 2002).
II.3.4. PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
El peróxido de hidrógeno es una excelente fuente de oxígeno singlete,

radicales superóxido O2- e hidroxilo, que son altamente reactivos y muy tóxicos
para los microorganismos (Willson, R. 1979; Halliwell and Gutterid, 1984).
Aunque los mecanismos exactos por los cuales el H 2O2 genera productos letales
para muchos microorganismos no se encuentran clara ni completamente
dilucidados, si se sabe que las especies derivadas con propiedades oxidantes,
pueden producir daño en ácidos nucleicos, enzimas y constituyentes de
membrana (Schurman, J. 2001). No obstante, también ha sido reportado que
soluciones acuosas de H 2O2 solo, no causaría modificaciones en proteínas,
lípidos y ácidos nucleicos sin la presencia de catalizadores para la formación de
radicales (Juven and Pierson, 1996). Se considera que la inhibición del
crecimiento microbiológico por parte del peróxido de hidrógeno no es el
resultado de sus propiedades oxidativas en su estado molecular, sino la
consecuencia de las actividades de otras especies químicas oxidantes derivadas
del mismo.
32
II.3.4.1 QUÍMICA DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
El peróxido de hidrógeno (HP), también conocido como agua oxigenada,

dioxogen o dioxidano, es un compuesto químico con características de un
líquido altamente polar, fuertemente enlazado con el hidrógeno tal como el agua
(Figura I I .2), y se presenta como un líquido ligeramente más viscoso que ésta.
Es conocido por ser un poderoso oxidante. Líquido incoloro bastante estable. Se
comercializa como soluciones acuosas a concentraciones entre el 3 y el 90%. El
contenido en H 2O2 de dichas soluciones puede expresarse en porcentaje o en
volúmenes. La expresión en volumen se refiere al contenido en oxígeno y se
define como el número de veces que un determinado volumen de H 2O2 lo
contiene es soluble en agua y en éter; insoluble en éter de petróleo.
Figura II.2 Formula molecular del peróxido de hidrógeno
Hay varias vías donde el peróxido de hidrógeno puede ser transformado

para formar radicales hidroxilos, entre ellas pueden incluirse:
i. Descomposición espontánea de H 2O2 a •OH (Flores et al, 2012; Labas

et al, 2009)
ii. Reacción de Fenton, donde se genera •OH a partir de H2O2 gracias a

la presencia de un metal. Algunos de los metales que pueden
participar en esta reacción son hierro o cobre, entre otros:
Fe 2+ +H 2 O 2 → Fe3+ +OH • +OH - (II.12)
33
iii. Reacción de Haber-Weiss. Tiene lugar entre las formas oxidadas de

Fe3+ o Cu2+ y el anión superóxido, generando la forma reducida de los
metales; los que vía Fenton generan el • OH.
O 2- + H 2 O 2 
Fe/Cu
→ OH • +OH - +O 2 (II.13)
II.3.4.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Los efectos dañinos en los componentes celulares bacterianos aparentan

ser producidos por un fenómeno particular llamado estrés oxidativo. El mismo
se produce por la exposición de un organismo a oxígeno o a otras moléculas
altamente oxidantes, en ocasiones generadas por el propio metabolismo
El oxígeno es una molécula altamente reactiva que puede ser reducida

parcialmente para generar especies reactivas de oxígeno (ROS). Estas pueden
ser producidas por:
 Procesos metabólicos normales, como la respiración aeróbica o la

β-oxidación de los ácidos grasos.
 El sistema inmune para la destrucción de potenciales

competidores o patógenos.
 El agregado de sustancias químicas externas como el peróxido de

hidrógeno.
 La toxicidad de las ROS es debida a su capacidad de dañar

diferentes componentes celulares (Figura I I .3)
34
Figura II.3. Especies reactivas de Oxígeno
Como se ha mencionado, es el radical hidroxilo el agente que produce

mayor daño celular. Las proteínas son dañadas mediante una oxidación de los
aminoácidos tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina, metionina y cisteína
(Storz et al., 1987; Wolff et al., 1986). Algunos aminoácidos son oxidados a
derivados carbonilados, quedando así marcados para su eliminación y
renovación. Estas modificaciones producen la perdida de la función de la
molécula proteica. Durante el envejecimiento de la célula aumenta el nivel de
los derivados carbonilados, lo que relaciona el envejecimiento celular con la
oxidación proteica (Stadtman, 1992). Las enzimas que contienen centros Fe/ S
en su estructura son oxidadas por el anión superóxido, lo que provoca la
desintegración de los centros y, por tanto, la pérdida de la funcionalidad de la
enzima (Flint et al., 1993). Otra consecuencia de la destrucción de los centros
Fe/ S es que el hierro procedente de los mismos cataliza la oxidación del ADN
junto con el peróxido de hidrógeno a través de la reacción de Fenton (Keyer and
I mlay, 1996).
Sobre los lípidos, el estrés oxidativo causa peroxidación de los mismos, lo

que produce una pérdida de la integridad de la membrana celular (Coyle y
Puttfarcken, 1993). Una de las consecuencias de esta reacción es la perdida de
permeabilidad y otros cambios que producen el deterioro de la organización de
la membrana interna.
35
Sobre el ADN, las ROS, especialmente el radical •OH, producen roturas

en la doble cadena, así como la pérdida de las bases nitrogenadas por
modificaciones químicas (Storz et al., 1987).
II.4. DESINFECCIÓN CON AGENTES FÍSICOS
El método físico de desinfección más empleado a nivel comunitario, es la

inactivación de los microorganismos mediante radiación ultravioleta (UV). En la
industria de los alimentos se utilizan los métodos térmicos, no así en la
desinfección del agua. Actualmente, se está considerando el potencial del
ultrasonido como una alternativa a las técnicas más tradicionales de
desinfección de agua. La cavitación acústica, generada por ultrasonido, se
propone como una potencial herramienta para la desinfección. Dentro de los
métodos físicos, se pueden incluir también la sedimentación o la sedimentación-
floculación-coagulación, que pueden reducir patógenos, pero esta no es su meta
principal.
II.4.1. RADIACIÓN UV
La radiación UV es ampliamente difundida como desinfectante físico del

agua, ya que se disipa rápidamente en el agua para ser absorbida o reflejada, no
dejando por lo tanto efecto residual. La formación de subproductos luego de la
radiación ultravioleta es mínima en relación con los subproductos generados
por los desinfectantes químicos.
El efecto germicida de este tipo de energía fue reportado por primera vez
por Downs y Blunt en 1877 (USEPA, 1996; Groocock, 1984; Schenck, 1981), pero
seguramente por falta de desarrollo en el equipamiento y la escasa confiabilidad
del proceso, no fue utilizado sino hasta pasada la primera mitad del siglo XX
(Wright y Cairns, 2000). Se comprobó el efecto del UV con diferentes
microorganismos en numerosa bibliografía (Lawryshyn & Cairns, 2003; Labas
et al., 2005; 2006).
36
II.4.1.1. CARACTERÍSTICAS DE LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA:
La radiación ultravioleta pertenece al espectro electromagnético y está

situada en la faja de 40 a 400nm de longitud de onda, entre los rayos X y la luz
visible. La división de la radiación UV puede ser clasificada en UV vacío (40 –
200nm), UV–C (200 – 280nm), UV–B (280 – 315nm) y UV–A (315 – 400nm)
(Wright y Cairns, 2000, M eulemans, 1986). En términos de efecto germicida, el
rango óptimo de UV se encuentra entre 245 y 285nm (UV–C y UV–B) (Wright &
Cairns, 2000; M eulemans, 1986)(Figura I I .4).
Figura II.4. Espectro electromagnético
Si bien el sol es una fuente de luz ultravioleta, la absorción de la radiación

de onda corta por parte de la capa de ozono de la tierra impide que cantidades
significativas de UV–B y UV–C alcancen la superficie de la tierra. Por ello, las
aplicaciones prácticas de desinfección UV dependen de fuentes artificiales de
UV. Las fuentes de UV más comúnmente empleadas son lámparas de arco de
mercurio de baja y mediana presión que se encuentran disponibles
comercialmente y que emiten generalmente a una longitud de onda de 253.7nm.
(Wright y Cairns, 2000).
37
Una lámpara típica de arco de mercurio consiste de un tubo

herméticamente cerrado de sílica vitreosa o cuarzo (transmisores ambos de UV)
con electrodos a ambos extremos (Phillips, 1983). El tubo es llenado con una
pequeña cantidad de mercurio y un gas inerte, usualmente argón a presión de
algunos torricellis (torr). Los electrodos están compuestos usualmente de
tungsteno con una mezcla de metales de tierra alcalinos para facilitar la
formación del arco dentro de la lámpara. Una descarga de gas es producida por
un voltaje elevado a través de los electrodos. La luz UV es emitida desde la
lámpara cuando el vapor de mercurio excitado por la descarga, retorna a un
nivel menor de energía. El argón presente ayuda para el arranque de la lámpara,
extender la vida del electrodo, y reducir las pérdidas térmicas. El argón no
contribuye al espectro de rendimiento de la lámpara.
En una lámpara de arco de mercurio la radiación UV se produce como

resultado de la corriente de electrones a través del vapor ionizado de mercurio
entre los electrodos de la lámpara produciendo la mayor parte de su emisión a
253.7 nm. Esta longitud de onda es muy cercana a la mayor actividad germicida,
motivo por el cual se utilizan para los procesos de desinfección. En la figura I I .5
se muestra el espectro de emisión de las lámparas de mercurio de baja y
mediana presión.
Figura II.5. Espectro de emisión típico de lámparas de baja y mediana presión (Wright y
Cairns, 2000)
38
En el campo de las ciencias experimentales y en el comercial se prefiere

las lámparas de baja presión de mercurio que emiten únicamente UV-C de neto
poder germicida a una sola longitud de onda y además se evitan las altas
temperaturas de las lámparas de mediana presión. El espectro de rendimiento
de una lámpara de mediana presión consiste en numerosos picos con un
continuo de UV por debajo de los 245 nm. M ientras que las lámparas de baja
presión son eléctricamente más eficientes que las de mediana presión, estas
últimas producen una potencia UV mayor por lámpara, que se puede traducir a
mayor poder germicida, sin embargo operan a temperaturas altas con mucho
consumo de energía. Por lo tanto, la decisión de elegir un sistema de irradiación
apropiado para una aplicación específica, ya sea un sistema de baja o mediana
presión o una combinación de los dos dependerá de los factores específicos del
sistema en estudio. Estas lámparas UV son similares en el diseño a las lámparas
fluorescente estándares con unas pocas diferencias notables. Las lámparas UV
típicamente se fabrican con cristal duro de cuarzo a diferencia del cristal suave
encontrado en las fluorescentes. Este cuarzo permite una transmisión de
energía radiante UV del 90%. Las lámparas fluorescentes contienen un
revestimiento delgado de fosforo que convierte el UV a luz visible (González
Garrido, 2001).
Dado que este mecanismo de desinfección consiste en energía bajo forma

de ondas electromagnéticas, su eficiencia no está limitada por la mayoría de las
variables que definen la calidad del agua. Esto implica que parámetros tales
como temperatura, alcalinidad, carbono inorgánico total y pH no interfieren con
la radiación ultravioleta. En cambio, el material orgánico y la turbiedad pueden
proteger a los microorganismos de las radiaciones, bajando la eficiencia del
proceso, y con aguas duras puede ocurrir que sales poco solubles se depositen
en el tubo que reviste las lámparas lo cual puede ser sumamente perjudicial
(Wolfe, 1990).
II.4.1.2. ACCIÓN DE LA RADIACIÓN UV
La radiación UV a pesar de no tener actividad ionizante, provoca cambios

químicos en las moléculas absorbentes. Las moléculas alteradas por este tipo de
39
radiación se denominan fotoproductos. De todas las moléculas biológicas, los

ácidos nucleicos son los más importantes absorbentes de radiación UV en
células pequeñas (como bacterias).
Los microorganismos son inactivados por la luz UV como resultado del

daño fotoquímico a sus ácidos nucleicos. La radiación UV es absorbida por los
nucleótidos, promoviendo la formación de enlaces entre nucleótidos adyacentes,
por lo que se generan dímeros (Jagger, 1967). Si bien la formación de dímeros
de timina – timina son los más comunes, también suelen ocurrir dímeros de
citosina – citosina, citosina – timina, y dimerización del uracilo (Figura I I . 6).
Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células
vegetativas bacterianas. Esta “dimerización” se trata de aductos (uniones) entre
pirimidas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un
anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la
configuración de la doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de
bases complementarias, ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos
de replicación y transcripción y secundariamente en el crecimiento y
respiración.
40
Figura II.6. Dimerización del ADN. (figuras creadas con RasMol del Protein Data Bank)
En la figura I I .6, La enzima del extremo superior (PDB) entrada) es una

fotoliasa que rompe directamente los enlaces que conectan el dímero,
corrigiendo el error en su lugar. I rónicamente, las fotoliasas utilizan la luz
41
visible para alimentar este proceso. Esta estructura captura el ADN después que
el dímero de timina se ha solucionado. Observe que las dos bases de timina
(color magenta) se volcaron fuera de la hélice de ADN normal y están unidos en
la superficie de la enzima, la figura del extremo inferior representa la misma
enzima desde otro ángulo.
La formación de un número suficiente de dímeros en un microorganismo

impide que este replique su ADN, lo que impide su reproducción. La absorción
de radiación UV por el ADN depende fuertemente de la longitud de onda. En la
figura I I .7 se observa que para E. coli, el punto máximo de inactivación se
alcanza con una longitud de onda de 265nm (Wright y Cairns, 2000).
Figura II.7. Espectro de absorción del ácido nucleico y de la inactivación de la Escherichia

coli (Wright y Cairns, 2000)
II.4.1.3. MECANISMOS DE FOTOREPARACIÓN
M uchos microorganismos que tienen un sistema metabólico funcional

tienen varios mecanismos de reparación de los ácidos nucleicos dañados
(Jagger, 1967). El mecanismo de reparación que es único a la desinfección UV es
el de fotorreactivación. La fotodimerización de timinas adyacentes resultantes
de la absorción UV de los ácidos nucleicos puede ser invertida por una enzima
fotorreactiva que usa luz entre 300 y 500nm para activar la partición del dímero
(Wright y Cairns, 2000). Otras transformaciones inducidas por UV en los ácidos
nucleicos incluyendo dímeros que se componen de citosina no pueden ser
42
reparados excepto por mecanismo de reparación oscuro en el cual segmentos

enteros de ácido nucleico son extraídos y el segmento complementario sin dañar
es usado como molde para reparar y reemplazar el segmento dañado (Wright &
Cairns, 2000). Los virus no tienen mecanismos de reparación para invertir el
daño creado por la luz UV. La habilidad de la bacteria para fotorrepararse está
relacionada directamente a la extensión del daño UV, la exposición a la luz
reactivadora entre 300 y 500nm y al pH y temperatura del agua. Debe ocurrir
exposición a luz entre 300 y 500nm dentro de dos a tres horas para que pueda
propiciarse el efecto fotorreparador (Groocock, 1984). De acuerdo con ello, el
tiempo de residencia dentro de un sistema de tratamiento de agua reducirá el
potencial de fotorreparación. En las figuras I I .8 a)b)c)d) se puede observar
claramente el mecanismo de fotorreparación para E.coli, las imágenes fueron
obtenidas del Protein Data Bank ( DOI :10.4236/ abb.2012.33025)y realizada con
simulación molecular
Figura II.8. a) b) Fotorreparación. Estructuras en cinta de una proteína fotoliasa ADN (a)
Vista superior; (b) Vista lateral) con dos cofactores y la cadena de ADN. El FADH-(centro;
FAD) y MTHF (arriba; MHF) cofactores y ADN (derecha) se muestran como bolas esféricas.
43
Figura 8 c) y d). Las estructuras de FADH-MTHF y se muestran por separado (c) y (d). E. coli
fotoliasa se compone de dos dominios bien definidos: un N-terminal (residuos 1-131) y un
C-terminal (residuos 204-471), que están conectados entre sí con un bucle de interdominio
largo (residuos 132 - 203).
II.5. PROCESOS AVANZADOS DE OXIDACIÓN
Como se ha señalado, la conciencia sobre la importancia del adecuado

manejo de los recursos del agua ha aumentado de manera notable en los últimos
años. Debido a ello, los controles en la calidad del agua se han vuelto más
estrictos y la investigación en el campo de nuevas tecnologías para la
purificación del agua ha crecido considerablemente (Pera Titus et al., 2004). En
muchos casos, los métodos convencionales resultan insuficientes para alcanzar
el grado de pureza requerido por ley o por el uso posterior del efluente tratado.
Dentro de las tecnologías alternativas que se han desarrollado en los últimos 20
años, se encuentran los “Procesos Avanzados de Oxidación” (PAO es común
también encontrar la abreviatura AOP “Advanced Oxidation Processes” por sus
siglas en inglés),una breve introducción al tema fue presentado en el Capítulo I .
I ntr oducción.
44
Los PAO han demostrado ser efectivos en el tratamiento tanto de agua

como de suelo y aire contaminados. Estos procesos involucran la generación y el
uso de especies oxidantes poderosas y poco selectivas, siendo el radical hidroxilo
( ·OH) el principal agente oxidante.
En la Tabla I I .3 se muestran los potenciales de oxidación de distintas

especies en agua (Litter, 2005).
Tabla II.3. Potenciales de Oxidación de diversas especies

ESPECIE E° (V, 25° C)
Flúor 3,03
Radical hidroxilo 2,80
Oxígeno atómico 2,42
Ozono 2,07
Peróxido de hidrógeno 1,78
Radical perhidroxilo 1,70
Permanganato 1,68
Dióxido de cloro 1,57
Ácido hipocloroso 1,49
Cloro 1,36
Bromo 1,09
Yodo 0,54
Según se observa en la tabla, luego del flúor, el radical hidroxilo es el

oxidante más enérgico. Cabe mencionar además que la mayoría de los
contaminantes ambientales reacciona con el ●OH entre 10 6–10 12 veces más
rápido que con un oxidante convencional como el O3.
45
Según el mecanismo de generación del radical hidroxilo, los PAO pueden

clasificarse en procesos fotoquímicos y no fotoquímicos, de acuerdo a si se usa o
no radiación UV, tal como se muestra en la Tabla I I .4
Tabla II.4. Clasificación de Procesos Avanzados de Oxidación

PROCESOS NO FOTOQUÍMICOS PROCESOS FOTOQUÍMICOS
 Ozonización  Ultravioleta de vacío

 Ozonización con H2O2/O3  UV/H2O2
 Procesos Fenton (Fe2+/H2O2) y  UV/O3
relacionados  Foto – Fenton y relacionadas
 Oxidación electroquímica  Fotocatálisis heterogénea
 Radiolisis y tratamiento con  Con semiconductores.
haces de electrones  Con sensibilizadores orgánicos o
 Plasma no térmico complejos de metales de
 Descarga electrohidráulica y transición
ultrasonidos
 Oxidación en agua sub y
supercrítica
Los PAO presentan numerosas ventajas sobre los métodos

convencionales para el tratamiento de aguas contaminadas. Dentro de ellas,
podemos citar las siguientes:
 logran la mineralización completa de la mayoría de los

contaminantes orgánicos, o su transformación en compuestos inocuos;
 no generan residuos peligrosos que requieran tratamiento

posterior, como la ósmosis inversa o la adsorción con carbón activado
 no producen subproductos tóxicos disueltos como en el caso de la

desinfección con cloro;
 como procesos de post-tratamiento, pueden disminuir la

concentración de compuestos indeseables generados por otros métodos de
purificación;
46
 como procesos de pre-tratamiento, permiten incrementar la

biodegradabilidad de contaminantes refractarios inicialmente al tratamiento
biológico.
Debe señalarse que los PAO, a pesar de mostrar altas eficiencias en la

degradación de sustancias orgánicas, sólo resultan adecuados para tratar
volúmenes pequeños o medios y muestras con bajas concentraciones de
contaminantes. De lo contrario, los costos de su aplicación resultarían
extremadamente elevados.
La combinación de los agentes oxidantes + radiación UV estudiados en

esta tesis doctoral se desarrollaran en los siguientes capítulos.
Los procesos fotoquímicos, que emplean radiación UV (o visible, en el

caso de la fotosensibilización) para generar las especies reactivas, presentan una
velocidad de reacción apreciablemente mayor que la misma tecnología en
ausencia de radiación. Esta característica permite ahorrar energía y reactivos, y
construir sistemas de tratamiento más compactos. Además, la posibilidad de la
utilización de radiación solar como fuente primaria de energía (si bien la
radiación UV representa sólo un 3–5 % del espectro solar), otorga a estos
procesos un significativo valor medioambiental y económico.
II.5.1. FOTO-OXIDACIÓN.
La luz promueve reacciones de oxidación iniciadas por la presencia de

radicales libres. Para que estos procesos se lleven a cabo es necesaria la
presencia de agentes oxidantes, los que permiten la formación de dichos
radicales, de los cuales los más reconocidos y utilizados son el peróxido de
hidrógeno, el ozono, etc. Entre los distintos procesos de aplicación para el
tratamiento de aguas, la combinación de radiación ultravioleta y el peróxido de
hidrógeno es muy interesante cuando se desea un agua con un alto grado de
pureza. Este PAO implica la formación de radicales hidroxilo. Como se
mencionó anteriormente, el peróxido de hidrógeno es un potente agente
oxidante no selectivo y una excelente fuente de radicales libres; es además un
47
aditivo deseable ecológicamente ya que durante su descomposición únicamente

se genera agua y/ o oxígeno. Desde finales de los años sesenta muchos autores
han demostrado el éxito de la fotooxidación con peróxido de hidrógeno. El éxito
del proceso radica en la formación estequiométrica de radicales hidroxilo (OH •)
a partir de la descomposición fotocatalítica del H 2O2.
El mecanismo más normalmente aceptado para la fotólisis de H 2O2 es la

ruptura del enlace O-O por la acción de la luz ultravioleta.
H 2 O 2 +hν → OH - +OH  (II.14)
El rendimiento cuántico de este proceso es muy elevado, formándose

como máximo dos radicales hidroxilo, e invariable con la longitud de onda
aplicada. Al igual que en la fotólisis, a partir de los (OH •) se forman los radicales
C-centrados que en presencia de oxígeno forman radicales peroxilo intermedios,
claves en las reacciones de oxidación y la completa mineralización de los
compuestos. Los radicales reaccionan con la materia orgánica según las
reacciones de abstracción del hidrógeno (reacción 15), adición (reacción 16) y
por las reacciones de transferencia de electrones (reacción 17).
OH  +RH → R  + H 2 O (II.15)
X 2 C=CX 2 +OH • → X 2 C(HO)-CX 2 (II.16)
OH  +RX → OH+RX (II.17)
Si bien en los últimos años se le ha dado mucha importancia al estudio de

diferentes tipos de PAOs (UV/ H 2O2, O3/ H 2O2, O3/ UV, TiO2/ UV), el tratamiento
de aguas con APA/ UV no ha sido ampliamente estudiado. En este trabajo de
investigación, se propondrá un mecanismo para explicar como la luz UV
produce la ruptura homolítica en la unión O-O de la molécula de APA, con la
subsecuente formación del radical hidroxilo (Capítulo V. Desinfección APA
comer cial-UV).
48
II.6 CARACTERISITICAS DE LOS MICROORGANISMOS EN ESTUDIO.
Para comprender el mecanismo de acción de los diferentes

desinfectantes, es importante conocer el “objetivo” del ataque de estos, los
microorganismos. En este apartado se estudiaran las características generales
de las bacterias Gram negativas y Gram positivas y se analizarán en detalle las
características particulares del microorganismo estudiado en esta tesis doctoral:
Escher ichia coli. Además en el Apéndice I V, se detallan las características de
Pseudomonas aer uginosa, otro microorganismo utilizado en los ensayos
experimentales.
Una vez estudiados los microorganismos se describirán los mecanismos

de acción que exhiben los agentes desinfectantes químicos sobre estos, para ello
es necesario antes, conocer los principales sitios de ataque que presentan los
microorganismos.
Un biocida debe llegar e interactuar con su(s) sitio(s) objetivo(s) o

“target” microbiano para ser eficaz. La penetración de un agente químico dentro
de la célula puede ser una condición importante para la mayoría, pero no para
todos los biocidas, algunos menos reactivos necesitan penetrar la célula
bacteriana y recién dentro de esta comienzan a estar activos, sin causar daños
en la membrana externa. La reacción inicial de un biocida con una célula
microbiana implica como primer medida, una unión o contacto con la superficie
celular, aunque su target pueden encontrarse dentro de la célula. El mecanismo
global(es) de la acción de un biocida químico puede ser definido de acuerdo con
la estructura bacteriana sobre la cual ejerce su actividad principal. Por lo tanto,
tres niveles de interacción pueden describirse:
i. la interacción con componentes celulares exteriores
ii. interacción con la membrana citoplasmática y
iii. la interacción con los componentes del citoplasma
49
Sin embargo, es posible que un biocida actúe en uno o en los tres niveles
de interacción ejerciendo su actividad antimicrobiana. Como primera medida se
desarrollaran entonces, los sitios targets principales.
II.6.1. PARED CELULAR BACTERIANA.
La pared celular es una estructura crítica para las células bacterianas de

modo que la mayoría no puede vivir sin ella. La alta concentración interna de
solutos en las células bacterianas en relación con el medio externo desarrolla
una considerable presión de turgencia (cercana a 2 atmósferas en Escher ichia
coli). La pared celular bacteriana facilita la resistencia de esta presión evitando
una lisis osmótica y además otorga la forma y la rigidez de la célula (si bien
existen bacterias que pierden su pared celular y se vuelven amorfas). La pared
celular no se visualiza fácilmente en el microscopio óptico, pero se observa con
claridad en cortes finos en el microscopio de trasmisión electrónica (M ET).
(Naab, 2005).
Las bacterias se dividen en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram

negativas. La distinción inicial entre estos dos tipos se llevó a cabo gracias a un
tipo de tinción diferencial denominado tinción de Gram (con esta tinción, las
Gram positivas aparecen en color púrpura, mientras que las Gram negativas
presentan color rojo), esta tinción es detallada en el “Capítulo I V M ater iales y
M étodos”, existen claras diferencias estructurales que sustentan esta
clasificación. I ncluso el aspecto de las paredes celulares es muy distinto entre
ambos tipos. La pared celular de las Gram negativas está compuesta por varias
capas y es bastante compleja, mientras que la pared de las Gram positivas está
formada fundamentalmente por un tipo de molécula y es mucho más ancha
(Figura I I .9).
50
Figura II.9. Diferencias en la pared celular de las bacterias Gram (+) y Gram (-)
En más detalle, se considera a la membrana externa como un esqueleto

macromolecular rígido, llamado peptidoglucano (= mucopéptido o mureína),
que en Gram-positivas se encuentra inmerso en una matriz aniónica de
polímeros azucarados; y en Gram-negativas está rodeada por una membrana
externa, e inmersa en un espacio periplásmico.
En las bacterias Gram-positivas el peptidoglucano representa el

componente mayoritario de la pared celular (50-80% en peso), mientras que en
Gram-negativas supone sólo del 1 al 10%. Como el peptidoglucano es el
componente común y más complejo de ambos tipos de bacteria, será
desarrollado en detalle. El peptidoglucano está formado por repeticiones de una
unidad disacárida fundamental unida a su vez a un tetrapéptido. Distintas
cadenas (formadas por el esqueleto de azúcares) se unen entre sí por
determinados enlaces peptídicos entre tetrapéptidos de cadenas diferentes.
La unidad disacárida repetitiva: consiste en N-acetilglucosamina (NAG)

unida por enlace ß(1→4) a N-acetilmurámico (NAM ). Se debe observar que el
NAM es el 3-O-D-lactil-éter de la NAG (o sea, se deriva de unir el ácido D-láctico
con el OH del C-3 de la NAG). Las distintas unidades disacáridas se van uniendo
51
entre sí por enlaces ß(1→4) entre el NAM de una unidad y la NAG de la

siguiente. Este enlace es susceptible a la rotura catalizada por el enzima
lisozima. El número de repeticiones (n) puede oscilar entre 10 y 100 (Figura
I I .10).
Figura II.10 Unión de la N-acetilglucosamina con el N-acetilmurámico
Desde el grupo carboxilo de cada ácido NAM , y mediante un enlace

amida, se encuentra unido el tetrapéptido. Un tetrapéptido típico de muchas
bacterias es: L-alanina-glutámico-meso-diaminopimélic--D-alanina.
Los resultados de la difracción de rayos X parecen indicar que las

unidades disacáridas de las cadenas están giradas unas respecto de otras,
formando una estructura helicoidal, como resultado de esto los péptidos se
desplazan alternativamente: hacia arriba, a la izquierda, hacia abajo, a la
derecha, y así sucesivamente. Esta organización permite que una cadena de
peptidoglucano, PG, se pueda unir con cadenas cercanas de su mismo nivel, así
como con cadenas por encima y por debajo de su nivel, formando un perfecto
entramado tridimensional (característico de las Gram-positivas).
52
La orientación de las cadenas azucaradas en relación con la superficie

celular está aun en debate, se ha sugerido que se disponen casi paralelas a la
superficie celular, con una tendencia a adquirir forma de espiral por encima de
la membrana citoplasmática. Los grupos tetrapéptidos salen
perpendicularmente de los NAM , en sentido vertical hacia la membrana. Sin
embargo, cuando dos tetrapéptidos de un nivel se unen entre sí, forman un
puente casi horizontal, formando ángulos de unos 90º respecto de los
esqueletos carbonados, y siguiendo el eje longitudinal de la célula.
Esta estructura confiere una serie de importantes propiedades:
1) Gran rigidez, que contrarresta las fuerzas osmóticas a las que está
sometido el protoplasto (soporta presiones de unas 5 a 15 atmósferas).
Esta rigidez depende de:
i. el grado de entrecruzamiento;
ii. el hecho de que el enlace ß(1→ 4) es muy compacto. La alternancia

regular entre anillos piranósicos de NAG y de NAM genera uno de los
polisacáridos más estables desde el punto de vista termodinámico,
que recuerda en su forma a la quitina y a la celulosa;
iii. la alternancia de aminoácidos, en configuraciones D y L en el

tetrapéptido, esto supone un factor adicional que confiere aún más
fuerza estructural, y además permite que todas las cadenas laterales
de estos aminoácidos se dispongan hacia el mismo lado, facilitando la
formación de puentes de H.
2) La estructura permite una notable flexibilidad, esto colabora, junto

con su rigidez, a soportar variaciones amplias de la tensión osmótica
del protoplasto.
3) Condiciona la forma celular. Aunque la química del PG, por sí misma,

no determina la forma, es su disposición espacial la responsable
principal de esta forma.
53
Un resumen comparativo de las paredes bacterias Gram (+) y Gram (-)

puede representarse según la tabla I I .4
Tabla II.5 Comparación pared Gram(+)-Gram(-)

PARED GRAM NEGATIVAS PARED GRAM POSITIVAS
Membrana externa Peptidoglucano
Lipoproteinas Matriz (polímeros)
• Ácidos teicoicos
• Ácidos teicurónicos
• Ácidos lipoteicocios
Espacio periplasmático Proteínas asociadas a membrana
Peptidoglucano
Membrana interna
Los ácidos teicoicos de la pared Gram negativa:
 Presentes en muchas bacterias Gram+, pero no en todas.
 Son polímeros de glicerol-fosfato o ribitol-fosfato
 Pueden ser de hasta 30 unidades.
 Están unidos covalentemente al peptidoglucano
 Es variable según las especies
 No se sintetizan en limitación de fosfato.
Los Ácidos Lipoteicoicos de la pared Gram negativa
 Presentes en todas las bacterias Gram +
 Aun en condiciones de carencia de fosfato
 Variación de los Ac. Teicóicos (ácidos glicerol-teicoicos)
 Se encuentran unidos a la membrana citoplásmica.*
54
 Su extremo terminal queda expuesto al exterior
 Suministran especificidad antigénica
Las lipopolisacáridos en la pared Gram (+)
 Papel estructural: Le da menor fluidez y mayor resistencia física

(Lípido A)
 Poco permeable a muchas moléculas hidrofóbicas incluyendo

antibióticos.
 Se une a cationes divalentes (como M g+2 o Zn +2)
 Endotoxina de las bacterias Gram-negativas (Lípido A) - productor

de síntomas
 Efectos beneficiosos: Estimula algunos mecanismos defensivos del

hospedador.
 Antígeno somático O: Especificidad y virulencia
En la figura (I I .11 a) y (I I .11.b) se pueden visualizar las diferencias estructurales

entre ambas paredes bacterianas.
55
Figura II. 11.a) Pared GRAM positiva
Figura II.11.b) Pared GRAM negativa
56
II.6.2 CITOPLASMA
El citoplasma celular está limitado por la membrana citoplasmática, y en

él se encuentran las inclusiones celulares. En un principio considerado una
"solución" homogénea de proteínas, los métodos de fraccionamiento acoplados
a los estudios bioquímicos y de microscopía electrónica mostraron la
complejidad del sistema. En realidad está atravesado por numerosas
membranas que lo compartimentalizan, si bien esta compartimentalización no
es tan desarrollada como en eucariotas.
Si se homogeneízan células bacterianas y luego se las centrifuga a

100.000 g se separa en el fondo del tubo de centrifuga una fracción
"particulada" que contiene los ribosomas y las membranas con los ácidos
nucleicos, y una fracción "soluble" que contiene proteínas, y los ácidos
ribonucleicos solubles ( tARN y mARN).
Los ribosomas son las estructuras celulares donde se sintetizan las

proteínas. Se encuentran en el citoplasma bacteriano y al microscopio
electrónico se presentan como partículas de unos 16 x 18 nm. Un ribosomas de
E. coli es una ribonucleoproteina con una masa de 2700 kd, un diámetro
aproximado de 200 Å. Los 20,000 ribosomas de una célula bacteriana
constituyen cerca de una cuarte parte de todo su volumen. Los ribosomas no
disociados tienen una velocidad de sedimentación en una ultra centrífuga de 70
S. Los ribosomas pueden disociarse en una subunidad grande (50S) y una
subunidad pequeña (30S) que unidas forman el ribosoma 70 S.
II.7. MICROORGANISMO MODELO ESTUDIADO: Escherichia coli.
II.7.1. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
La definición de Escher ichia coli de acuerdo al M anual Bergey de

bacteriología sistemática es: bacteria Gram negativas cilíndricas con 1,1 – 1,5 µm
de diámetro por 2,0 – 6,0 µm de largo que se disponen aisladas o en parejas.
(Figura I I .12)
57
Figura II.12. Imagen de Escherichia coli (Intitud Recerca Biomedica-Barcelona)
Conforme a la definición general de la familia Enter obacter iaceae a la

que pertenecen, son bacterias quimioheterótrofas facultativas teniendo los
metabolismos fermentativo y respiratorio, no forman esporas, están
desprovistas de oxidasa, producen catalasa y β-galactosidasa, pueden ser
móviles por flagelos peritricos o inmóviles y normalmente reducen nitrato a
nitrito. E. coli es una de las especies bacterianas más minuciosamente
estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como
sustrato y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de
diversa índole (Neidhardt, 1999. Esta está integrada por bacilos Gram negativos
no esporulados, móviles con flagelos peritricos o inmóviles, aerobios-anaerobios
facultativos, capaces de crecer en agar M acConkey y en medios simples con o sin
agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros
carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a
nitritos, y poseedores de una proporción G+C de 39 a 59% en su DNA. Se trata
de bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, el agua,
vegetales y gran variedad de animales. En conjunto, la importancia de las
Enter obacter ias en patología humana puede cuantificarse constatando que
58
constituyen el 50% aproximadamente de todos los aislamientos clínicamente

significativos en los laboratorios microbiológicos, y hasta el 80% de todos los
bacilos Gram negativos identificados.
E. coli es la especie tipo del género Escher ichia. Produce reacción

positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por
KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como única fuente de carbono y
energía, pero sí en caldo acetato. Son H 2S, ureasa y fenilalanina negativos, pero
en general son indol positivos y decarboxilan la lisina. Se clasifican en más de
170 serogrupos O según las características antigénicas de su LPS, y en serotipos
por la combinación de antígenos O y H flagelares. Otros antígenos presentes en
distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su
clasificación o identificación.
El género Escher ichia comprende cinco especies distintas: E. coli, E.

her manni, E. fer gusonii, E. vulner is y E. blattae La especie tipo es E. coli,
además es la única de las cinco con significación clínica. No obstante, E.
her manni, y E. vulner is han sido involucradas en infecciones de heridas aunque
de manera muy ocasional (Blanco et al., 2002), las imágenes se pueden observar
en la figura I I .13
59
Figura II.13. Fotomicrografias electronicas de E. blattae (A), E. coli (B), E.fergusonii (C), E.
Herman (D) y E. vulneris (E). Barra = 1 μm. (Scheutz y Strockbine, 2005).
El estudio de distintas reacciones bioquímicas puede ayudar en la

diferenciación entre las especies. Las principales pruebas fisiológicas que
distinguen E. coli de las demás especies son producción de indol, reacción
negativa para el citrato de Simmons, producción de lisina descarboxilasa, y
fermentación de glucosa, lactosa y D-manitol (Scheutz y Strockbine, 2005),
estas reacciones fueron desarrolladas en Capítulo I V. M ater iales y M étodos.
II.7.1.2. HÁBITAT
E. coli es la especie predominante de la microbiota aerobia y facultativa

del tracto gastrointestinal de los animales de sangre caliente y se elimina por las
60
heces al exterior. A pesar de ser el microorganismo facultativo predominante

representa una muy pequeña proporción del contenido total de bacterias en este
sitio anatómico (Todar, 2008; Blanco et al., 2002). Algunos anaerobios como
Bacter oides spp. son, al menos, veinte veces más abundantes que E. coli en el
intestino grueso. Sin embargo por su presencia regular en el intestino y en las
heces, E. coli es utilizada como indicador de contaminación fecal. Se puede
encontrar en el ambiente ya que es capaz de sobrevivir algunos días en el agua y
los alimentos, de manera que su aislamiento es un indicador de contaminación
fecal reciente (Todar, 2008, Blanco et al., 2002)
El intestino humano es colonizado por E. coli en las primeras 40 horas

tras el nacimiento, siendo la bacteria ingerida en agua y alimentos u obtenida
directamente de otros individuos en contacto con el recién-nacido. La bacteria
se adhiere al moco que recubre el intestino grueso y una vez establecida una
misma cepa puede persistir indefinidamente, aunque constituya solo
aproximadamente el 0,1% de la población total (Todar, 2008; Prescott, 2002).
II.7.1.3. PODER PATOGÉNICO DE LA Escherichia coli
E. coli es una especie bacteriana de considerable importancia científica,

económica y médica. Están incluidas en esta especie cepas no patógenas y otras
que son capaces de causar enfermedades entéricas y diversos tipos de
infecciones extraintestinales en humanos y animales (Johnson, 2002a). La
mayoría de las cepas intestinales de E. coli no son patógenas y coexisten en
armonía con el hospedador, algunas incluso lo benefician sintetizando
cofactores y hasta lo protegen de la invasión por microorganismos patógenos
(Todar, 2008). No obstante, algunas cepas son patógenas y pueden producir
infecciones entéricas (diarrea, disentería, colitis hemorrágica, síndrome urémico
hemolítico) o extraintestinales (infecciones urinarias, bacteriemias o
septicemias, meningitis, peritonitis, abscesos, mastitis, infecciones pulmonares
y de heridas). E. coli provoca en seres humanos del orden de 630 millones de
casos de diarrea en el mundo y aproximadamente 775.000 muertes al año,
afectando fundamentalmente a la población infantil de países en desarrollo.
61
Además, es el patógeno oportunista más frecuentemente asociado con

infecciones urinarias y septicemias en humanos (Blanco et al., 2002). Por lo
general las cepas de E. coli patógenas utilizan múltiples mecanismos de manera
similar a las otras bacterias que infectan mucosas, con las etapas de adhesión y
colonización de la mucosa, evasión de los mecanismos de defensa,
multiplicación y daño tisular (Kaper et al., 2004). El tipo de interacción
resultante entre microorganismo y hospedador, permite clasificar las cepas de
E. coli como comensales avirulentos, como patógenos oportunistas o altamente
especializados, que a su vez son frecuentemente clasificados en patotipos de
acuerdo con el tipo de enfermedad que causan y por su conjunto de factores de
virulencia (Sousa, 2006). Se han descrito un gran número de patotipos de E.
coli. La similitud de los nombres dados a los diferentes tipos, las inconsistencias
en el uso de una única nomenclatura en la literatura, el avance en los
conocimientos de la patogénesis y la emergencia de nuevos patotipos han
contribuido a la complejidad de la nomenclatura de estas cepas.
Caracterizado el microorganismo en estudio, es importante ahora

conocer como actúan los agentes desinfectantes.
II.8. MECANISMOS DE LOS AGENTES DESINFECTANTES
En este apartado, se detallan los mecanismos de los biocidas ante los

diferentes microorganismos, resistencia, destacándose los agentes biocidas
utilizadas en los ensayos experimentales: Ácido peracético, Peróxido de
Hidrógeno y Ácido Acético.
II.8.1. BIOCIDAS
Los biocidas provienen de una amplia gama de químicos diferentes,

también pueden ser agentes físicos (radicación UV, temperatura), el
mecanismos de acción del biocida refleja esta gran diversidad, aunque el daño
62
final que causan en el microorganismo muestra una considerable similitud para

cada uno.
M uchos de los productos biocidas utilizados hoy en día ya eran conocidos

por griegos y romanos, mientras que otros fueron introducidos durante la Edad
M edia. Sin embargo, el auge de estos productos se produjo durante el siglo XI X
y primeros años del XX, por el desarrollo de la cirugía, el interés médico y social
en reducir el elevado número de infecciones hospitalarias, mejorar la curación
de las heridas, el conocimiento científico sobre los microorganismos y su
relación con ciertas enfermedades. No obstante, la revolución terapéutica que
acompañó la introducción de los antibióticos en medicina hizo que los biocidas
fueran olvidados y permanecieran en la sombra, pero la aparición en las últimas
décadas de bacterias resistentes a los antibióticos, la emergencia de patologías
fúngicas y víricas nuevas y para las que existían limitaciones terapéuticas hizo
imponer y actualizar los métodos preventivos para reducir el riesgo de
adquisición de las infecciones.
Con ello los antisépticos y desinfectantes volvieron a adquirir

importancia, no solo en medicina, sino también en otros campos como el
veterinario, el industrial y en la conservación de los alimentos.
Aunque los antisépticos y desinfectantes empezaron a ensayarse in vitro

desde los albores de la M icrobiología, los procedimientos para su evaluación no
están tan bien definidos como las pruebas para la determinación de la actividad
antimicrobiana de los antibióticos.
Originalmente, los ensayos se dirigieron al estudio de la cinética de la

desinfección, determinándose si los microorganismos eran destruidos por una
determinada concentración de desinfectante en un determinado tiempo de
contacto. Estudios reseñables en los inicios de los ensayos de evaluación de la
actividad antimicrobiana de los biocidas fueron los realizados por Bucholtz en
1875, para determinar la CM I del fenol para inhibir el crecimiento de las
bacterias; también por Robert Koch, que hizo mediciones del poder inhibitorio
del cloruro de mercurio frente a las esporas de Clostr idium anthr acis, y por
Geppert en 1889, que utilizó el sulfato amónico como neutralizante del cloruro
63
de mercurio con resultados más realistas que los obtenidos con anterioridad por
Koch.
II.8.2. REQUISITOS DE LOS BIOCIDAS
No todas las propiedades que debería poseer idealmente un biocida las

cumplen todos los productos o procesos; además éstas pueden variar
dependiendo del uso específico del biocida dispositivos médicos, superficies
medioambientales y piel. Preferentemente, los biocidas deben poseer un amplio
espectro de actividad microbiológica, deben ser bactericidas frente a todas las
bacterias vegetativas no esporuladas, incluyendo micobacterias. Actualmente,
existe un mayor conocimiento sobre la adquisición de infecciones nosocomiales
de origen vírico, por lo que se recomienda incluir a los virus en el espectro de
actividad de los biocidas de uso más común. Los desinfectantes utilizados en
superficies tanto inanimadas como sobre la piel deben poseer una acción
microbiocida rápida, al producirse un descenso de actividad bactericida cuando
se seca la superficie. Por otro lado, los desinfectantes no deberían ser
inactivados por la materia orgánica presente habitualmente en los dispositivos
médicos y superficies medioambientales, y por los jabones y el agua corriente
empleados durante el proceso de desinfección.
Existen otras características de operatividad y seguridad no menos

importantes, y que deben tenerse en cuenta a la hora de seleccionar los biocidas.
Los efectos tóxicos deben ser mínimos para asegurar la protección de la salud.
Sin embargo, muchos de los desinfectantes utilizados hoy en día de forma
rutinaria para la desinfección medioambiental y de dispositivos médicos son
tóxicos y corrosivos, lo que exige unas condiciones de almacenamiento y uso
cuidadosas. En el caso de los antisépticos, éstos no deben dañar la piel por lo
que se pueden incorporar aditivos que lo eviten.
Los biocidas pueden ser clasificados según su utilización de acuerdo a la

tabla I I .6
64
Tabla II.6.Clasificación de los biocidas según su utilización:

ANTISEPTICOS DESINFECTANTES CONSERVANTES
Compuestos Compuestos Compuestos

fenólicos: fenólicos fenólicos: parabenos
hexaclorobenceno
QACs QACs QACs
Clorados Clorados: dióxido de
cloro, hipoclorito de
sodio y de calcio
Compuestos
yodados
Alcoholes (etanol,
isoproponol)
Metales: Metales:
mercuriales, plata, mercuriales
cobre
Aldehidos: Aldehidos:
taurolidina, formaldehido y
noxitiolina grutaraldehido
Ácido bórico
Oxidantes: peróxido Oxidantes: ozono, Ácidos orgánicos
de hidrogeno peróxido de débiles: ácido
hidrogeno, ácido acético, ácido cítrico
peracético
Tensioactivos Compuestos
anionicos anfóteros
II.8.2.1. NIVELES DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Como ya se mencionó en el Capítulo I , la desinfección es un proceso que

reduce el nivel de microorganismos contaminantes y la materia orgánica, pero
65
no elimina todos los microorganismos presentes. Spaulding destacó la

importancia de la desinfección y propuso tres niveles o grados de
desinfección10. Estos niveles propuestos (alto, intermedio y bajo) se basan en el
hecho de que los microorganismos pueden clasificarse en grupos de acuerdo a
su resistencia intrínseca a los desinfectantes químicos. Estos grupos se pueden
observar en orden decreciente de resistencia en la figura I I .14
Figura II. 14. agentes causales de enfermedades infecciosas en orden decreciente de

resistencia a los desinfectantes
La desinfección de alto nivel destr uye las formas bacterianas

vegetativas, los hongos, las micobacterias y los virus, sobreviviendo algunas
endosporas bacterianas. Esta menor actividad esporicida es el aspecto que
diferencia a la desinfección de alto nivel de la esterilización química. Algunos
desinfectantes de alto nivel pueden destruir un elevado número de esporas
bacterianas a elevadas concentraciones y un tiempo de exposición prolongado,
convirtiéndose así en esterilizantes químicos. Varios productos biocidas se han
66
clasificado en esta categoría, entre ellos se incluyen: el glutaraldehído alcalino al

2% y y varias presentaciones de ácido peracético
Los desinfectantes de nivel inter m edio provocan la destrucción de

las formas bacterianas vegetativas, los virus lipídicos y los hongos, pero pueden
sobrevivir los virus no lipídicos y las micobacterias, así como las esporas
bacterianas. Ejemplos de desinfectantes de nivel intermedio son los alcoholes
(70-90%), los compuestos clorados y los fenólicos en distintas formulaciones y
concentraciones.
La desinfección de bajo nivel elimina las formas bacterianas

vegetativas y los virus lipídicos, pero no eliminan, en tiempos prácticos de uso,
todas las formas fúngicas, las micobacterias, los virus no lipídicos y las esporas
bacterianas. Un ejemplo de desinfectante de bajo nivel lo constituyen los
derivados de amonio cuaternario (QACs).
II.8.3. MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS BIOCIDAS:
La actividad de un agente antimicrobiano (biocida) frente a una bacteria

depende primeramente de su capacidad para atravesar la pared bacteriana, paso
necesario para acceder a su punto de acción “target”. Dicha capacidad está en
relación con su naturaleza fisicoquímica y con la estructura de la barrera que ha
de franquear. El enfoque clásico para dilucidar el mecanismo de acción de los
biocidas reside en establecer una correlación entre los efectos bacteriostáticos o
bactericidas y aquellos que producen cambios fisiológicos o bioquímicos.
La comprensión del mecanismo (s) de acción de un biocida se ha

convertido en un problema de interés actual, debido a la aparición de bacterias
resistentes a estos y a las pruebas emergentes de que la resistencia a los
antibióticos en bacterias podría estar vinculada con la resistencia a estos agentes
desinfectantes.
La eficacia antimicrobiana de las formulaciones biocidas utilizadas para

una amplia gama de aplicaciones (hogar, sanidad e industria) ha sido bien
documentada por Hugo y Russell (1999). Sin embargo, los mecanismos de
acción de los biocidas sólo se han estudiado hace relativamente poco tiempo y la
67
cantidad de información disponible es limitada, aunque creciente. El

entendimiento de los mecanismos de acción de los biocidas, junto con los
factores que influyen en su actividad, se ha convertido en una cuestión clave
para un mejor uso de las formulaciones y el control de la aparición de
microorganismos resistentes a estos.
El mecanismo general (s) de la acción de un biocida puede ser definido de

acuerdo con la estructura bacteriana contra la cual ejerce su actividad principal.
Por lo tanto, tres niveles de interacción, ya han sido mencionados a lo largo de
este capítulo, pero es importante recordarlo: (i) la interacción con los
componentes celulares exteriores (superficie de la célula); (ii) interacción con la
membrana citoplasmática y (iii) la interacción con componentes
citoplasmáticos. Sin embargo, es posible que un biocida actúe en uno o en los
tres niveles de interacción con las células bacterianas para producir su actividad
antimicrobiana.
El daño puede manifestarse de la siguiente manera:
 Disrupción de la fuerza protónica (fuerza protón-motriz)

transmembrana, que conduce a la fosforilación oxidativa y al transporte activo.
 I nhibición de la respiración y de las reacciones catabólicas y

anabólicas.
 Disrupción de la replicación.
 Perdida de la integridad de la membrana, resultado en la ruptura

de constituyentes esenciales extracelulares como pentosas, ácidos nucleicos y
proteínas.
 Lisis.
 Coagulación del material extracelular.
Estas lesiones, que se pueden producir en paralelo, representan el daño

que va desde efectos bacteriostáticos aumentando hasta bactericidas. Los daños
progresivos que comienzan con una lesión, si son mantenidos por suficiente
68
tiempo, o si la concentración aplicada es suficientemente alta, el daño puede

culminar en la muerte de la célula bacteriana.
La acción de los biocidas es distinta según el tipo de microorganismo,

debido a sus distintas características, tanto en composición química como en
estructura, fisiología, replicación y metabolismo. Típicamente, los biocidas
actúan sobre múltiples puntos o dianas; al afectar a diversos componentes es
muy difícil distinguir entre los efectos primarios y secundarios que provocan y
que contribuyen a la muerte o destrucción de los microorganismos.
M uchos productos biocidas interaccionan con la superficie celular y una

vez en el interior del microorganismo pueden dañar uno o más componentes
celulares. Por ejemplo, la clorhexidina y los QACs actúan sobre la membrana
citoplasmática de los cocos gram-positivos, bacterias gram-negativas y
levaduras. Los fenoles ejercen su acción sobre la membrana de las bacterias
vegetativas y de los hongos, pero también coagulan los componentes
citoplasmáticos. Otras dianas intracelulares de los biocidas son las proteínas y
los ácidos nucleicos. El glutaraldehído y el formaldehído actúan sobre las
proteínas, el DNA y el RNA bacteriano.
En la tabla I I .7 se detalla el mecanismo de acción de los agentes biocidas

utilizados en los ensayos experimentales de este trabajo de investigación:
69
Tabla II.7. Mecanismos de Acción de la Solución comercial de Acido Peracético.
MECANISMO DE INTERACCIÓN BIOCIDA TARGET TÍPICO REFERENCIA
Reacción química: oxidación con PAA Enzimas y proteínas con Denyer

radicales libres grupos tiol (SH) (1998)
HP
Interacción física: Ácidos Membrana. Hugo 1999

penetraciòn/partición en la orgánicos
Gradiente de pH
bicapa fosfolipidica débiles: AA
transmembrana
Disipaciòn de la fuerza proton- Ácidos Membrana externa Freese et al

motriz, desacoplamiento de la orgánicos (1973)
oxidación fosforilativa débiles: AA
Sheu et al.
1975)
Inhibición del transporte activo Acidos Membrana externa Freese et al

orgánicos (1973)
débiles: AA
Sheu et al.
1975)
Aumento de la permeabilidad de Ácidos Membrana citoplasmática Maillard

la membrana Orgánicos 2202
PAA y AA
Inhibición de las enzimas PAA Citoplasma Hugo 1992

citoplasmáticas
HP
Interacción con biomoléculas PAA Citoplasma Hugo 1992

funcionales (ADN-ARN)
HP
Actividad autocida inducida Hp Célula bacteriana Maillard

2002
PAA
II.8.4. MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIANA
La resistencia que ejercen las bacterias a los antibióticos, antisépticos y

desinfectantes es un problema de salud pública, que se creía superado.
La resistencia bacteriana a los biocidas fue descrita en las décadas de

1950 y 1960 y ha ido en aumento. Ciertos biocidas como alcoholes,
70
formaldehídos, biguanidas, yodoforos, aldehídos y agentes catiónicos como los

compuestos de amonio cuaternario, la clorhexidina y el triclosán se han
comprometido como posibles causantes de la selección y persistencia de cepas
bacterianas con bajo nivel de resistencia a los antibióticos (Cabrera et,al, 2007).
En la actualidad se ha obtenido un avance considerable en la

comprensión de la respuesta de las bacterias a los bactericidas. La resistencia
puede ser una propiedad natural de un organismo (intrínseca) o conseguida por
mutación o adquisición de plásmidos (autorreplicación, ADN
extracromosómico) o transposones (cromosomal o integrado en plásmidos,
cassettes de ADN transmisibles). Los genes de resistencia naturales en
plásmidos, se originan como mutaciones puntuales en los genes blanco (sitios
de inserción de los genes de resistencia) de bacterias susceptibles y también de
genes que les proveen protección contra otras bacterias.
La resistencia intrínseca se ha demostrado para bacterias Gram

negativas, esporas bacterianas, micobacterias y bajo ciertas condiciones en
especies del género Staphylococcus. (Cabrera et,al, 2007).
Las bacterias Gram negativas por lo general son más resistentes a los
antisépticos y desinfectantes que las Gram positivas. La membrana externa de
las bacterias Gram negativas actúa como una barrera que limita la entrada de
varios tipos de agentes antibacterianos sin relación química. Las moléculas
hidrofílicas de bajo peso molecular pasan fácilmente a través de las porinas, en
cambio las moléculas hidrofóbicas se difunden a través de la bicapa de la
membrana. Además de las vías antes descritas se ha propuesto una tercera vía
para agentes catiónicos como los Compuestos de amonio cuaternario,
biguanidas y diamidinas, los cuales dañan la membrana y facilitan su
autocaptación. Un ejemplo claro de resistencia mediada por la membrana
externa es el de P. aer uginosa que presenta diferencias en la composición del
lipopolisacárido (LPS) y el contenido de cationes como el magnesio, que
produce enlaces estables entre moléculas de LPS y como complemento a este
mecanismo, esta bacteria presenta porinas pequeñas que impiden el paso por
difusión de ciertas sustancias. Algunas cepas que son muy resistentes a
71
clorhexidina, CAC, EDTA y diamidinas se han aislado de muestras clínicas. La

presencia de un LPS menos ácido en la membrana externa puede ser un factor
que contribuye a la resistencia intrínseca. (Cabrera et,al, 2007).
La presencia de lípidos en la membrana externa de los bacilos Gram

negativos se relaciona con el hecho de que estas bacterias son mucho más
resistentes que los Gram positivos a los agentes antibacterianos, incluyendo los
desinfectantes. En los estafilococos, por ejemplo, los lípidos están presentes en
pequeñas cantidades; si se incrementa (por ejemplo haciéndoles crecer en
presencia de glicerol), los microorganismos se vuelven más resistentes a ciertos
fenoles y penicilinas. En las micobacterias, el contenido en lípidos se asocia con
su gran resistencia a los desinfectantes. Se han llevado a cabo estudios con
mutantes rugosos, defectivos en la región interna del núcleo, que resulta
sensibles a una amplia variedad de desinfectantes y detergentes, relacionándose
lo uno con lo otro. Se ha visto también, que la reorganización de los fosfolípidos
de la membrana externa puede permitir la penetración de moléculas
hidrofóbicas por disolución y difusión en los lípidos. (Camargo, Torres, 2003).
La superficie de los Gram negativos lisos es hidrofílica; en el caso de los

mutantes rugosos, sin embargo, tienden a ser mucho más hidrofóbica En las
cepas salvajes, las moléculas del LPS intactos se oponen al acceso rápido de los
biocidas hidrofóbicos o de los antibióticos, al interior de la célula probablemente
mediante un sistema de blindaje protector conferido por los fosfolípidos, mucho
de los cuales no están presentes en la estructura de la membrana clásica. En el
caso de los bactericidas cationicos, como es el caso de las biguanidas y los
derivados de amonio cuaternario, ambos interactúan con fosfolípidos y LPS,
produciendo daño en la membrana celular. (Camargo Torres, 2003).
72
ACRÓNIMOS CAPITULO II
AA Ácido Acético
APA Ácido Peracético
HP Peróxido de Hidrógeno
I I nactivación
K Constante cinética
LPS Lipopolisacáridos
N M icroorganismos (concentración)
NAM n-acetilmuránico
NAM n-acetilmurámico
QAC Derivados de amonios cuaternarios
R Remoción
UFC Unidades formadoras de Colonias
Sufijos
0 Correspondiente a la condición inicial
73
CAPÍTULO III
MODELADO DE PROCESOS
DE DESINFECCIÓN
CAPÍTULO III. MODELADO DE PROCESOS DE DESINFECCIÓN
CAPITULO III. MODELADO DE PROCESOS DE

DESINFECCIÓN.
III.1. REACTORES Y REACCIONES FOTOQUÍMICAS
III.1.1. REACCIONES FOTOQUÍMICAS
Una reacción fotoquímica es un proceso iniciado por la absorción de una

determinada energía radiante por una molécula. Gracias a la absorción de
radiación la molécula excitada puede transformarse en uno o más pasos en un
producto o puede convertirse en un intermediario altamente reactivo que puede
participar en reacciones subsiguientes de naturaleza térmica como sucede, por
ejemplo, en las reacciones en cadena. El primer grupo de reacciones se llama
reacciones moleculares y el segundo, reacciones de radicales libres. A veces, la
absorción de radiación puede ocurrir en una molécula particular pero los
cambios definitivos (en ambos tipos de mecanismos moleculares o de radicales
libres) suceden en otras, como es el caso de las reacciones fotosensibilizadas y
fotocatalíticas (Cassano et al.,1995).
A pesar de las ventajas mencionadas, las reacciones fotoquímicas no son

ampliamente usadas en la práctica industrial. De hecho, se han adoptado
cuando:
(i) ningún proceso alternativo térmico o catalítico está disponible;

(ii) el proceso fotoquímico a escala industrial puede desarrollarse
únicamente con unas pocas dificultades
(iii) la escala de fabricación es pequeña y muy frecuentemente,
dedicada a los productos de alto valor agregado, reduciendo
mucho las dificultades de procesamiento y minimizando los
efectos de los costos de equipamiento y de operación.
En el pasado, una de las razones usadas para explicar esta situación era la
carencia de: (i) el modelo conveniente del reactor y los procedimientos de
74
diseño y (ii) suficiente información cuantitativa con respecto a los parámetros

físicos y químicos pertinentes. Según Cassano et al. (1997) hay otras razones
para el uso limitado de fotoprocesos en operaciones de gran escala. Entre ellos
podemos contar: (i) limitaciones de tamaño, (ii) dificultades de construcción,
(iii) dificultades en el mantenimiento y operación de lámparas, (iv) depósitos en
la pared del reactor que afectan la entrada de radiación al reactor y (v)
existencia frecuente de inhibidores de reacción. La mayoría de estas dificultades
se asocian con la existencia de partes de vidrio o cuarzo en el equipo requerido.
Estos factores han mitigado contra el camino de la fotoquímica. Sin embargo, la
carencia de métodos de diseño no es más una razón (por lo menos para sistemas
homogéneos) como ha sido indicado por Cassano y Alfano (1991).
III.2. DISEÑO DE REACTORES FOTOQUÍMICOS
La comprensión de los procesos que ocurren en un reactor químico de

cualquier escala impone la necesidad de utilizar conocimientos de distintas
disciplinas. En el análisis del proceso a partir de su etapa inicial, la emisión de
energía radiante en forma de fotones por parte de una fuente (la lámpara o el
sol, cuando se utiliza un reactor irradiado) hasta una final en la cual una
molécula de un dado contaminante deviene en una especie inocua para éste, o
se inactiva un microorganismos se aplican conceptos vinculados a la física del
estado sólido, la fisicoquímica, la electroquímica, los fenómenos de transporte
(Cassano et al., 1997),
Puede ser conveniente revisar cual es el significado del diseño de un

fotorreactor; se considera que el diseño de un reactor es un procedimiento
completo definido de la manera siguiente (Cassano et al., 2001; Cassano et al.,
1995):
75
Dada algunas especificaciones de producción tales como las

concentraciones de entrada y salida (o inicial y final) y las especificaciones sobre
la selectividad (si es aplicable), el diseño del reactor resultante debe proveer:
 Los requerimientos para las materias primas.
 Las condiciones de operación (sistemas simples o multifase), tipo de

operación hidrodinámica (flujo continuo, batch, semibatch, etc.) y
reciclos (si es aplicable).
 La/ s temperatura/ s y presión/ es del/ os reactor/ es, la carga de

catalizador (si es aplicable).
 Los requerimientos para evitar inhibiciones y explosiones.
 El número de reactores y la geometría del reactor (forma y dimensiones).

La velocidad de circulación en el reactor o el tiempo de reacción.
 Los requerimientos de mezclado (si son aplicables).
 La calefacción y/ o requerimientos de enfriamiento.
 Los materiales de construcción de reactor.
 El control del reactor, rutinas de mantenimiento y requerimientos de

seguridad.
 Cuando se tratan con reacciones fotoquímicas, el diseño también incluye:
 Las especificaciones de la fuente de radiación (lámpara/ s), es decir la

potencia de salida, su distribución espectral, sus formas y dimensiones,
los requerimientos de operación y de mantenimiento.
76
 El arreglo geométrico de las fuentes de radiación con respecto al espacio

de reacción.
 El sistema de entrada de radiación al reactor (la manera, materiales de

construcción y procedimientos de limpieza).
 Las características de los reflector/ es si es aplicable (cantidad, arreglo,

forma y dimensiones).
Tanto el tamaño de la lámpara como algunas de las especificaciones

asociadas al reactor no pueden cambiarse en forma continua, el diseño siempre
implica un procedimiento iterativo. Luego se verán peculiaridades de los
reactores fotoquímicos originadas por el acoplamiento de los parámetros
característicos del transporte de radiación, cantidad de movimiento, energía y
materia, hacen estas iteraciones siempre necesarias.
Uno de los métodos más poderosos para diseñar un fotorreactor a escala

comercial es el uso de un modelo matemático riguroso sustentado por
experimentos de laboratorio analizados apropiadamente llevados a cabo en
reactores pequeños.
Las etapas del modelado de un reactor pueden presentarse siguiendo una

secuencia lógica típica de los reactores químicos, pero describiendo ciertas
características intrínsecas que hacen necesario utilizar herramientas diferentes
de las que se emplean en el tratamiento de las reacciones puramente térmicas.
Se deberá formular:
a) Un balance de cantidad de movimiento (campo de distribución de

velocidades);
b) Un balance de energía térmica (campo de distribución de temperaturas);
c) Un balance de materias para cada especie - reactivas, intermediarias y
productos- (campo de distribución de concentraciones).
77
d) Los dos últimos balances van a exigir por una parte expresiones de
velocidades de reacción que participan en ellos como términos "fuente" o
"sumidero" (dependiendo si se trata de productos o de reactivos) y por
otra los valores de ciertos parámetros que caracterizan
fisicoquímicamente al sistema reaccionante (coeficiente de difusión o de
transferencia de materia, densidad, conductividad térmica, viscosidad,
etc.).
e) Es indispensable, para los fotorreactores, fotorreactores catalíticos,

cuantificar la velocidad volumétrica local de absorción de fotones
(LVRPA). El cálculo de los valores de la LVRPA requiere de dos tareas
extras:
f) Formulación y resolución del balance de fotones a partir de la ecuación

de transferencia radiativa (RTE)
g) Caracterización óptica del medio mediante los parámetros inherentes, a

saber: coeficientes de absorción y de “scattering”, función de fase, etc.
Es importante remarcar que, excepto en condiciones muy especiales,

siempre existe una acentuada no uniformidad en la distribución espacial de la
LVRPA dentro del reactor (y por ende de las velocidades de reacción), que es de
carácter irreducible (a diferencia, por ejemplo, de la temperatura o las
concentraciones). Esta característica, sumada a lo descrito en (d) y (e), le da a
los requerimientos del diseño de fotorreactores sus características "especiales",
no consideradas cuando se analiza un reactor químico convencional (térmico o
catalítico).
III.2.1. BALANCES DE MATERIA
III.2.1.1. LA ECUACIÓN GENERAL DE CONSERVACIÓN DE MATERIA
La ecuación general de conservación de materia en sistemas de varios

componentes, ha sido cuidadosamente derivada en textos de grado de ingeniería
química
78
∂c ( x,t ) (III.1)
+ ∇N i ( x,t ) = R Hom,i ( x,t )
 ∂t  
  
todos los flujos reacción química
velocidad de de materia homogénea del compomente i
acumulación
La ecuación (I I I .1), válida para una partícula material ubicada en un

punto del espacio de reacción, indica que la velocidad de cambio de la
concentración con el tiempo (también denominada velocidad de acumulación),
sólo se puede modificar por flujos de materia de entrada y salida de dicho
espacio, y/ o por reacción química. La ecuación diferencial es válida en una
única fase; por lo tanto sólo reacciones homogéneas pueden ser descritas por
ella.
III.2.1.2. REACCIONES HETEROGÉNEAS
El caso más simple de analizar para una reacción heterogénea es el de un

sistema que se encuentra perfectamente mezclado y en él tiene lugar en estado
estacionario una reacción catalizada por un sólido. Los componentes a
reaccionar están habitualmente en la fase fluida (sea líquida o gaseosa). El
sistema reactivo fluido puede estar en contacto con paredes impermeables
sólidas, tales como las representadas por las paredes del reactor; otras paredes
pueden ser aberturas de entrada y salida y hay otras que son permeables porque
al menos parte de la materia que es transportada hacia ellas desaparece (para
transformarse en un producto). Ellas constituyen las superficies catalíticas. Es
decir los flujos de materia que llegan a las superficies impermeables no
producen cambios de composición (tan sólo se anulan), mientras que la materia
que llega a superficies catalíticas es alterada en su composición por la reacción
química. El proceso de interés ocurre en la interfaz fluido-sólido. Si la reacción
heterogénea es modelable incluyendo las etapas de adsorción y desorción, y
teniendo en cuenta la correcta estequiometria del proceso, necesariamente la
diferencia de los flujos de materia hacia y desde la pared catalítica es igual a la
velocidad de la reacción química heterogénea. Si n es la normal a la superficie
79
sólida dirigida hacia fuera de ella, y teniendo en cuenta los signos de cada flujo,
se cumple la ecuación (I I I .2):
En → N i (x)×n(x)= − R Het,i (Csup

i ,C j ....T,pH,ect) = − R Het,i (x)
sup
(III.2)
x  
sobre la superficieflujo de materia relacion en la superficie
del componente i del componente i
III.2.2. CAMPO DE RADIACIÓN
Cuando se expresa la velocidad de una reacción fotoquímica es necesario

hacer la distinción entre las etapas oscuras y las activadas por radiación
(iluminadas). Para el tratamiento de las reacciones oscuras se usa la misma
metodología empleada en los reactores convencionales; el principal obstáculo
aparece cuando se evalúa la velocidad de la etapa de iniciación. La existencia de
este paso muy particular constituye la diferencia cinética principal (y la más
importante) entre las reacciones térmicas (o catalíticas) y las activadas por
radiación.
La velocidad de la etapa de activación por radiación es proporcional a la

energía útil absorbida mediante una propiedad que se ha definido como la
Velocidad Local Volumétrica de Absorción de Fotones ó “Local Volumetrical
Rate of Photon Absorption” (I razoqui et al. 1973). La L.V.R.P.A, ( eλa ), representa
la cantidad de fotones (en unidades de energía para un intervalo determinado
de longitudes de onda) que se absorbe por unidad de volumen de reacción y
unidad de tiempo.
La L.V.R.P.A depende del campo de radiación (la distribución de fotones)

existente en el espacio de reacción; vemos entonces que necesitamos conocer el
campo de radiación dentro del fotorreactor. Esta distribución de la energía
radiante no es uniforme en el espacio debido a varias razones; entre ellas, la
atenuación producida por la absorción de especies que está siempre presente.
80
Otros factores importantes a tener en cuenta, son las propiedades físicas y las
características geométricas del sistema lámpara-reactor. Por lo tanto, la
reacción de iniciación será espacialmente dependiente, aún en el caso de
ausencia de gradientes de concentración. Esta carencia de homogeneidad en el
campo de radiación es intrínsecamente irreductible en reactores fotoquímicos
en la práctica.
La evaluación de la L.V.R.P.A. se lleva a cabo resolviendo primero la

ecuación general de transporte de radiación que requiere de las ecuaciones
constitutivas apropiadas para la absorción, emisión y el scattering. El balance
resultante de radiación se aplica entonces al espacio de reacción donde hay
absorción únicamente (en medios homogéneos) o hay absorción y scattering (en
medios heterogéneos), y a la lámpara donde la emisión es el fenómeno
predominante. Combinando ambos resultados uno puede obtener, de una
manera directa, el valor puntual (local) de la velocidad de absorción de
radiación.
III.2.3. DEFINICIÓN DE LA INTENSIDAD DE RADIACIÓN
M acroscópicamente, la radiación puede considerarse como fotones que se

propagan en forma de rayos, caracterizados sólo por su energía y su dirección.
La propiedad fundamental asociada a la energía es la I ntensidad Específica
Espectral, definida por la ecuación (I I I .3), como la energía del haz de radiación
por unidad de tiempo, por unidad de ángulo sólido de la dirección de
propagación, por unidad de área de superficie proyectada según dicha dirección
y por unidad de intervalo de longitudes de onda. En fotoquímica es conveniente
expresar I λ en einstein por metro cuadrado, por estereoradián, por segundo y
por unidad de intervalo de longitud de onda. El valor de la intensidad es
proporcional al número (o densidad) de fotones que se propagan en la dirección
Ω, con una energía igual a hν.
81
 ∂Eλ  (III.3)
I λ ( x , Ω, t ) lim
∂A , ∂Ω , ∂x → 0 ∂A cos θ∂t ∂λ 

 
Para definir I λ podemos considerar una superficie de tamaño diferencial

(dA), que puede ser caracterizada por su posición (x) respecto a un sistema fijo
de coordenadas y su orientación en el espacio, mediante su vector unitario
normal (n), como se muestra en la Figura I I I .1. Desde esta superficie
supongamos que se emite un haz de radiación con dirección ; esta dirección de
propagación genera un diferencial de ángulo sólido dΩ. La dirección de
propagación y la orientación de la superficie, forman un ángulo que puede ser
evaluado por el producto escalar Ω.n = cos θ. M ediante este ángulo podemos
determinar el área proyectada según la dirección de propagación dA’ = dA cos θ.
Entonces, si dEλ es la energía emitida en el rango entre λ y λ+ dλ, podemos
definir la I ntensidad Específica Espectral I λ mediante la ecuación (I I I .3)
En el caso más general, dentro de un reactor fotoquímico la radiación

puede llegar a un volumen reaccionante elemental (punto material) desde todas
las direcciones en el espacio. La integración de la I ntensidad Específica
Espectral en todas las direcciones posibles que vienen desde el espacio esférico
entero de irradiación, define una propiedad fotoquímica llamada Radiación
I ncidente Espectral, ecuación (I I I .4)
Gλ ( x ) = ∫ I λ ( x , )d Ω Ω (III.4)
Ω
En algunos casos, tanto I λ como Gλ pueden ser también función del

tiempo.
82
Figura III. 1 Definición de la Intensidad de Radiación (Adaptada de Cassano et al., 1995)
III.2.4. DEFINICIÓN DE LA VELOCIDAD DE ABSORCIÓN DE
ENERGÍA
Dentro de un reactor fotoquímico la radiación puede llegar a un punto, en

el caso más general, desde todas las direcciones en el espacio. Para que una
reacción fotoquímica ocurra, esta radiación debe ser absorbida por un volumen
reaccionante elemental (punto material). De esta manera los rayos de radiación
provenientes de todas las direcciones deben cruzar un elemento de superficie
que limita tal elemento de volumen. La integración de la I ntensidad Específica
Espectral en todas las direcciones posibles que vienen desde el espacio esférico
entero de irradiación, define una propiedad fotoquímica llamada Radiación
I ncidente Espectr al, como fue desarrollada en la ecuación I I I .4
Se debe notar que en algunos casos, tanto la intensidad como la radiación

incidente pueden ser también función del tiempo. Al igual que en el caso de Gλ,
83
muchas de las propiedades del campo de radiación, surgen de la integración de

esta propiedad fundamental Iλ.
En la Ec. (I I I . 4) se ha realizado una integración para todas las

direcciones posibles Ω dentro del espacio esférico total. Para un sistema en
coordenadas esféricas localizado en el punto de incidencia (el volumen
elemental de reacción) la radiación incidente total es:
ϕ
(III. 5)
θ2
Gλ = ∫
θ
∫ϕ 2
I λ senθ dϕ dθ
1 1
[ θ 1 , θ 2 ] y [ φ1 , φ 2 ] son los límites de integración que define el espacio desde

el cual la radiación arriba al punto de incidencia. Si la radiación arriba desde
todo el espacio 4 π entonces dichos límites se extienden para θ de 0 a π y para
φ de 0 a 2 π .
Debe considerarse que, con la excepción de un haz paralelo y colimado

(donde un sistema de coordenadas cartesianas es suficiente), la energía radiante
que emerge de una fuente (o que alcanza un punto de incidencia) siempre se
propaga en forma esférica. De esta manera, un sistema de coordenadas esféricas
es el sistema natural de representación para la propagación de la radiación.
Para la radiación policromática, debe realizarse una integración sobre el

rango de longitudes de onda de interés (considerando las regiones de λ en que
se solapan la emisión de la lámpara, la transmisión de la pared del reactor y el
coeficiente de absorción de las especies que absorben radiación):
λ2 θ2 ϕ2 (III. 6)
G=∫ ∫θ1 ∫ϕ1 I λ senθ dϕ dθ d λ
λ1
A partir de la definición de la radiación incidente se puede definir la

energía absorbida, en un volumen elemental, de acuerdo a:
84
eλa ( x ) = κ λ ( x ) Gλ ( x ) (III. 7)
eλa es la Velocidad Volumétr ica Local de Absor ción de Fotones

(L.V.R.P.A), muy a menudo inapropiadamente llamada "I ntensidad Absorbida".
Sus unidades son Einstein por metro cúbico y por segundo, muy diferente de las
que corresponden a una I ntensidad; κ λ es el coeficiente volumétrico espectral
de absorción, que guarda algún tipo de relación funcional con la concentración
de las especies absorbentes .
Para radiación policromática:
λ2 (III. 8)
e a = ∫ κ λ Gλ d λ
λ1
(III. 9)
∫λ1 ∫θ1 ∫ϕ1 κ λ
λ θ ϕ
I λ senθ d ϕ dθ d λ
2 2 2
ea =
De esta forma, para evaluar la LVRPA debemos conocer la I ntensidad

Específica Espectral en cada punto dentro del reactor. Su valor puede obtenerse
de la ecuación de transporte de fotones.
III.2.4.1. LA ECUACIÓN GENERAL DE TRANSPORTE DE FOTONES
La forma general de la ecuación de conservación de fotones, a partir de la

intensidad de radiación caracterizada por su longitud de onda y una dirección
de propagación Ω , es (Cassano et al., 1995):
1 ∂ I λ ,Ω ( x )
.
+∇ (I λ ,Ω ( x ) Ω ) = − Wλabs
,Ω ( x ) − Wλout
, Ω ( x ) + Wλ , Ω ( x )
-s em
+ Wλin,Ω- s ( x )
c 
 ∂t   Variación sobre
 
Pérdida por

  
Pérdida por

Ganancia por

Ganancia por
Transiente la dirección Ω absorción del medio " Out - scattering" emisión del medio " In - scattering"
(III.10)
85
La primera hipótesis que podemos hacer para simplificar la ecuación es

suponer el campo de radiación en estado estacionario. Esta suposición es válida,
ya que el sistema alcanza el estado estacionario a la velocidad de la luz. Como
paso siguiente, se pueden incorporar las ecuaciones constitutivas apropiadas
para modelar cada fenómeno. De esta manera un rayo a lo largo de su
trayectoria pierde energía debido a la absorción, que se modela con el
coeficiente de absorción volumétrico κλ que caracteriza a las especies
absorbentes y representa la fracción de la radiación incidente que es absorbida
por la materia por unidad de longitud a lo largo de la ruta del haz de luz. Esta
ecuación constitutiva, cuando se inserta en la ecuación de transporte de fotones
para un medio puramente absorbente, da origen a lo que generalmente se
conoce como “Ley de Bouguer-Lambert” para la absorción de radiación en
medios homogéneos. También se pierde energía debido al “out-scattering”
(pérdida de energía por “scattering”), que se modela mediante el coeficiente
volumétrico de “scattering” σλ. El scattering de salida es un proceso mediante el
cual la radiación transportada en un dado ángulo sólido dΩ alrededor de la
dirección Ω , es desviada por el medio fuera de tal dirección o trayectoria y
dispersada en todas direcciones en el espacio.
La ganancia de energía del haz se debe a la emisión interna y al “in-

scattering”. La posibilidad de que exista emisión radiativa varía
apreciablemente entre un proceso y otro. La mayoría de los materiales producen
una emisión espontánea que depende de su temperatura, siendo significativo a
altas temperaturas (un cuerpo radiante, una llama, etc.). En otros casos los
cuerpos pueden emitir radiación mediante la excitación producida por campos
externos (por ejemplo: un arco de luz producido por una descarga eléctrica
entre dos electrodos, la fluorescencia generada por un campo de radiación, etc.).
El “in-scattering” puede definirse como la contribución de energía

producida por otros rayos distintos de aquel en que se efectúa el análisis; es
decir, parte de la energía dispersada en otros puntos como consecuencia del
86
“out-scattering”, es redistribuida e incorporada a la dirección Ω . Esta

“redistribución” de radiación se puede modelar con la función de fase para
“scattering” p(Ω’→Ω), suponiendo “scattering” elástico (redistribución, sin
cambio de longitud de onda). La función de fase p informa cuales, de todas las
direcciones posibles Ω ’, se incorporan a la dirección del balance Ω .
La expresión para el balance de radiación monocromática, teniendo en

cuenta estas consideraciones es:
dI λ , Ω ( x)
+ κ λ ( x) I λ ,Ω ( x) + σ λ ( x) I λ ,Ω ( x) =
 ds 
      
Pérdida por Pérdida por
Variación sobre absorción " Out - Scattering "
la dirección Ω
σ λ ( x)
p ( Ω ' Ω ) I λ , Ω ( x ') d Ω '
4π ∫ Ω '= 4π 
je +
λ '
Ganancia  
por emisión Ganancia por
" In - scattering "
(III.11)
En el caso de un sistema homogéneo tanto el término de “in scattering”

como el de “Out scattering” pueden despreciarse. Además, si la reacción se lleva
a cabo a temperatura ambiente la emisión también se considera despreciable.
La distribución de la radiación se obtiene resolviendo la ecuación de

transferencia radiativa en un sistema homogéneo con todas las consideraciones
realizadas. En este trabajo en particular, las especies absorbentes varían su
concentración a través del tiempo, por lo tanto es necesaria una dependencia
con esta variable:
dI λ,Ω ( s,t ) (III.12)

+κ λ ( s,t ) I λ,Ω ( s,t ) =0
ds
Con una condición de contorno en el punto de entrada al reactor (s = sR)

dada por:
87
I λ , Ω ( sR , t ) = I λ0, Ω (t ) (III. 13)
La representación paramétrica de la trayectoria del rayo está dada por la

variable s. La ecuación (I I I . 12) es válida para luz monocromática y una
dirección simple Ω . La solución de esta ecuación diferencial provee el campo de
intensidades de radiación.
III.2.4.2. LA CONDICIÓN DE CONTORNO
En las condiciones planteadas, y a efectos de resolver el balance de

radiación, se debe conocer la condición de contorno. Para ello, se pueden
emplear distintos procedimientos.
Existen dos tipos de modelos rigurosos, que permiten el cálculo de la

condiciones de contorno del espacio de reacción, estos son:
M odel o de Em i si ón : son los que modelan la emisión de la fuente,

considerando sus características geométricas y ópticas. H asta el presente, en las
aplicaciones ingenieriles de fotorreactores, las lámparas tubulares han sido
usadas casi exclusivamente. Pueden modelarse dos tipos principales de
lámparas: de emisión superficial y de emisión volumétrica.
Las lámparas de emisión superficial poseen un tubo de vidrio con un

material fluorescente que recubre la pared interna del mismo. La radiación UV
emitida por el mercurio contenido en el tubo es absorbida por el material
fluorescente depositado sobre la superficie, el cual a su vez emite un espectro
continuo de radiación UV y/ o visible, dependiendo de la composición del
material empleado. Entre estas lámparas se encuentran las lámparas actínicas,
de luz negra y las fluorescentes en general. Si el medio existente entre la
lámpara y la pared del reactor es diactínico (la intensidad no cambia con la
trayectoria) a partir de la definición de intensidad específica espectral se obtiene
la ecuación (I I I . 14) en función de la potencia de salida de la lámpara Ps ,λ a una
88
longitud de onda λ (fotones por segundo), rL es el radio de la lámpara, LL es la
longitud útil de la lámpara, y ΥR ,λ es un coeficiente de transmisión de la pared
del reactor (Cassano et al., 1995).
Pλ (III.14)
I λ0 (θ , ϕ ) = R ,λ Υ
2π rL LL
2
Las lámparas de emisión volumétrica, en cambio, producen un espectro

discontinuo o de líneas, generado por la emisión del mercurio gaseoso
contenido en el tubo. En este caso, la emisión es producida por todo el volumen
de la lámpara. Estas lámparas pueden ser de alta, media o baja presión de
mercurio (por ejemplo, germicidas). También en este caso se considera que el
medio existente entre la lámpara y la pared del reactor es diactínico. Además, se
puede aplicar la RTE a todo el volumen de la lámpara, donde existe solamente el
e
fenómeno de emisión representado por el coeficiente de emisión de radiación j λ
Siguiendo el procedimiento presentado por Cassano et al. (1995), se obtiene la
ecuación (I I I . 15).
Pλ (III. 15)
I λ0 (θ , ϕ ) = ∆ ρ S ( x, θ , ϕ )Υ R ,λ
4π rL LL
2 2
La función ∆ρ (x,θ,φ) puede obtenerse como la intersección de la ecuación

de un cilindro en el espacio (la lámpara) con la ecuación de una recta en
coordenadas esféricas (el rayo). Resolviendo la ecuación cuadrática resultante y
reemplazando en la ecuación (I I I . 15), se llega a la ecuación (I I I . 16).
Pλ (rL2 - r 2 sen 2ϕ )1/ 2 (III. 16)

I λ0 (θ , ϕ ) = Υ R ,λ
4π 2 rL2 LL sen θ
89
Donde Ps ,λ es la potencia de salida de la lámpara a una longitud de onda
λ , R L es el radio de la lámpara, LL es la longitud útil de la lámpara, y ΥR ,λ es un

coeficiente de transmisión la pared del reactor.
M odel o de I n ci den ci a : Son los que suponen una dada distribución

de la energía radiante a la entrada del reactor, independizándose de la emisión
de la fuente de radiación. Para determinar experimentalmente la radiación
incidente dentro de un fotorreactor, pueden utilizarse dos tipos de métodos:
i. Físicos: Se basan en la utilización de un instrumento de medición

altamente sensitivo a la radiación, el cual debe ser calibrado con una
fuente cuya potencia de salida y distribución espectral sean
rigurosamente conocidas.
ii. Químicos: mediante el seguimiento de una reacción química

producida por la absorción de energía radiante, cuyas características
cinéticas y propiedades ópticas son perfectamente conocidas, además
de existir una expresión matemática simple que vincule la velocidad
de reacción y la velocidad de absorción de energía radiante.
Entre los métodos físicos de medición uno de los más comúnmente

empleados es el sistema compuesto por radiómetro y un sensor de radiación.
Este dispositivo puede utilizarse para medidas absolutas o relativas del campo
radiante en cualquier zona del espectro dentro del rango visible-ultravioleta. La
principal desventaja es que estos equipos deben ser adecuadamente calibrados
(se deben utilizar fuentes estándar de radiación).
Los métodos químicos brindan resultados confiables y reproducibles

cuando se trata de evaluar la radiación incidente o la velocidad volumétrica de
absorción de fotones dentro de un fotorreactor cualquiera sea su geometría y
tamaño. Esto significa que cuando un actinómetro es apropiadamente usado se
lleva a cabo una especie de “titulación de la luz” en el interior del recipiente de
reacción. El análisis de los resultados experimentales de la reacción del
90
actinómetro mediante un adecuado modelo permite la obtención del valor de la

radiación incidente en la pared.
III.2.4.3. EXPRESIÓN DE LA L.V.R.P.A UTILIZANDO UN MODELO DE

EMISIÓN
Para ambos modelos de lámparas mencionados en el punto anterior, es

necesario conocer los límites de integración de las coordenadas angulares (θ, φ),
correspondientes al ángulo sólido que forma la fuente de radiación con un
punto de incidencia I n dentro del reactor. La figura I I I . 2 muestra la emisión a lo
largo de la dirección θ, φ producido por un elemento de volumen pequeño de la
lámpara que llega al reactor a s = s R . Teniendo en cuenta la figura I I I . 2, la

ecuación I I I . 11 puede ser integrada a lo largo de la dirección de propagación
dada (definida por las coordenadas θ y φ ) a partir de s = s R (a un punto
arbitrario de la radiación a la entrada del reactor) en un punto de incidencia I n

dentro del reactor, como se expresó en la ecuación I I I . 14 donde
I λ0 (θ, φ, t ) = I λ (s R , Ω, t ) es la condición límite para I λ al punto de entrada y para
una dirección arbitraria Ω .
El paso siguiente es integrar todas las posibles direcciones de irradiación

a partir del volumen de la lámpara de emisión para el punto I n .De acuerdo a
I razoqui et al. (1973), el valor de la radiación incidente (Gλ ) en un punto x

dentro del reactor se obtiene integrando el ángulo sólido de incidencia
(dΩ ) = senθ dθ dφ .
91
Figura III.2. Modelo de emisión para una lámpara tubular a lo largo de la dirección (θ,φ) en
un punto In (reactor anular).[Adaptada de Labas et. al, 2008]
En resumen, integrando la ecuación (I I I . 12) con la condición de

contorno (I I I . 13) encontramos la I ntensidad Específica monocromática.
Sustituyendo en la ecuación (I I I . 6) obtenemos la Radiación I ncidente
monocromática. Cuando el resultado se pone en la ecuación (I I I . 7) se obtiene la
ecuación siguiente para la L.V.R.P.A.:

 s = sI ( x,θ , ϕ ) 
κ λ ( x, t ) ∫ ϕ κλ ( s , t )
ϕ2 θ2
a
λ ( x, t ) = λ ,Ω ( t ) exp -∫ s = sR ( x,θ , ϕ )
0
e
1
dϕ ∫θ
1
dθ senθ × I ds 

(III. 17)
En la integral doble, θ considera el largo de la lámpara y φ el diámetro

de la lámpara. Los límites de la integración, que resultan de simples relaciones
92
trigonométricas, están dados por las ecuaciones (I I I . 18-20) (I razoqui et al.,

1973):
 1 (III. 18)
 r cosφ-
θ1 (φ)=tan -1 
( rL2 -r2sen 2 φ ) 2 

 (L L -z) 
 
(III. 19)
(L
 r cosφ- r 2-r 2sen 2φ
) 
1
2
-1  
θ 2 (φ)=tan  
-z
 
 (r 2 -r 2 ) 1 2  (III. 20)
-φ1 =φ2 =cos  -1 L 
 r 
 
III.2.5. MODELADO CINÉTICO EN REACTORES
Un modelo cinético que represente en forma matemática la velocidad de

reacción de un proceso químico o fotoquímico es un requisito indispensable
para diseñar un reactor/ fotorreactor. Es común encontrar en la literatura
expresiones de tipo global que, más allá de su utilidad fenomenológica, no son
fácilmente extrapolables a cualquier otro tipo de reactor (geometría, tamaño,
fuente, etc.) para llevar a cabo el diseño o cambio de escala (Brandi, 2002). Por
esta razón la expresión debe tener desagregadas las dependencias con todas las
variables representativas del proceso (concentraciones, pH, etc.) y del
dispositivo (geometría, lámpara, reflector, etc.), estas últimas expresadas a
través de la adecuada valoración de la LVRPA (fotorreacción). Concretamente,
se busca una expresión con validez puntual e independiente del recinto de
reacción (cinética intrínseca).
93
III.3. MODELOS CINETICOS DE DESINFECCIÓN
Un modelo cinético de desinfección, en esta tesis, desinfección de aguas,

es una idealización simplificada de un proceso complejo en que participan
diferentes fenómenos químicos, biológicos e hidráulicos. Con él se consigue
obtener una expresión matemática que facilita el diseño adecuado de un sistema
de desinfección.
III.3.1. MODELO DE CHICK
El primer planteo de una cinética de desinfección fue enunciado por

Chick (1908), que reconoció cierta similaridad entre la inactivación microbiana
por desinfectantes químicos y las reacciones químicas (Hass, 1999). Un punto
de vista global de los principios de modelado cinético de desinfección ha sido
presentado por Gyuren y Finch (1998). La desinfección es análoga a una
reacción química bimolecular cuyos reactantes son el microorganismo y el
desinfectante, y se puede caracterizar por una ley de velocidad de reacciones
químicas.
R= -kN (III. 21)
Donde:
R= velocidad de inactivación (organismos inactivados / volumen-tiempo)
N= es la concentración de organismos viables a un tiempo t
k= pseudo-constante de velocidad de reacción (depende de la

concentración del desinfectante, del desinfectante, tipo de microorganismo y
sistema a tratar).
En sistemas batch, esto resulta en una caída exponencial de la

concentración de microorganismos ya que la velocidad de inactivación es igual a
94
dN/ dt, asumiendo que k es realmente constante (es decir, la concentración de

desinfectante y demás variables se mantienen constantes).
La ley de Chick expresa la velocidad de inactivación de microorganismos

mediante una expresión correspondiente a una reacción química de primer
orden:
 N  (III.22)
ln   = -kt
 N0 
Donde:
N= concentración de organismos viables a un tiempo t
N o= concentración de organismos a tiempo 0
k= constante de velocidad de inactivación característica del tipo de

desinfectante, microorganismo y aspectos de calidad del agua del sistema.
t= tiempo
La expresión anterior es válida bajo las siguientes condiciones

(Daniel,2001):
• Población homogénea de microorganismos (cultivo puro)
• Reactores de flujo pistón o sistemas «batch» de mezcla completa
• Distribución homogénea de desinfectante
• Concentración de desinfectante constante a lo largo del tiempo
La constante k es válida para una determinada concentración de

desinfectante
95
III.3.2. MODELO DE CHICK-WATSON
Watson (1908), propuso la ecuación (I I I .24) para relacionar la constante

de inactivación (k) con la concentración del desinfectante (C):
(III.23)
k=k ′C n
donde n es el término del coeficiente de dilución y k´ es independiente de

la concentración de desinfectante, y teniendo en cuenta la ecuación (I I I .22),
también es independiente de la concentración de microorganismos.
A partir de la ley de Chick-Watson, cuando C, n y k´ son constantes, la ley

precedente puede ser integrada de manera que, en un sistema batch totalmente
mezclado se obtenga:
 N  (III.24)
 = -k ′tC t
n
ln 
 N0 
Cuando la composición del desinfectante cambia con el tiempo, o cuando

se usa un sistema con configuración distinta al batch, se deben utilizar leyes de
velocidad apropiadas, que caracterizan la transformación del desinfectante
(Haas y Karra, 1994) junto con los balances de materia para obtener la relación
entre la inactivación, la concentración y el tiempo.
A pesar de que la teoría de Chick-Watson es ampliamente utilizada su

validez es limitada para algunas operaciones prácticas de desinfección. La
inactivación de microorganismos en experimentos batch, aun cuando la
concentración de desinfectante es constante, no siempre sigue un modelo de
decaimiento exponencial como el predicho por la ecuación I V.24. Estas
desviaciones a la ye de Chick-Watson dependen del tipo de microorganismo,
tipo de desinfectante y otras condiciones de operación (M ontgomey, 1985).
96
Existen varios modelos de desinfección que tratan de interpretar estas

“desviaciones”. La presencia de hombros o del lag inicial en las curvas de
inactivación se ven frecuentemente en organismos que forman agrupamientos o
“clumps”. Esto quiere decir que no se inactiva una célula bacteriana sino una
unidad formadora de colonia.
Además, curvas de inactivación con “hombros”, pueden ser explicadas

por un modelo disfuncional (Hass, 1999) por un modelo M ultitarget (Severín,
1982) o por un modelo de eventos en serie (Severín et al., 1984).
También pueden observarse curvas de inactivación con “colas” o con

velocidad de desinfección decreciente con el tiempo. Hay varias teorías también
para explicar este fenómeno. Existe una hipótesis que explica este
comportamiento por un concepto mecanístico (Certf, 1977). En este caso se
encontraron cuatro mecanismos particulares para interpretar esta velocidad
decreciente:
• Transformación a una forma resistente durante la inactivación
• Existencia de variantes genéticas de sensibilidad diferente
• Protección de una subpoblación o variaciones en la dosis recibida

de desinfectante
• Agrupamiento de una subpoblación
III.3.3. MODELO DE WICKRAMANAYAKE Y SPROUL
Wickramanyake y Sproul (1988) desarrollaron una formulación empírica

para definir la cinética de inactivación de microorganismos utilizando el modelo
de Chick – Watson, cuya ecuación puede ser escrita de la siguiente manera:
{
N 0 si t  t 0
(III.25)
Log = -k ′(t-t 0) ) si t ≥ t 0
N0
97
Donde k 0 es la tasa de inactivación y t 0 el tiempo lag. El modelo

desarrollado por Wickramanayake y Sproul (1988) está basado en datos
experimentales obtenidos durante la inactivación de quistes de protozoarios con
ozono.
En algunos casos, la velocidad de inactivación permanece constante desde

el inicio de la reacción pero esta disminuye cuando la concentración de
microorganismos es baja, lo que da lugar a una grafica con cola. En estos casos
se puede aplicar una modificación del modelo Chick-Watson cuya ecuación es la
siguiente:
N (III.26)
Log =k1 [1-exp(-k 2 t ]
N0
Este modelo puede reproducir la existencia de un “hombro” al inicio de la

reacción, así como una “cola” al final. Sin embargo, no puede reproducir la
existencia simultánea de ambas regiones.
III.3.4. MODELO DE GARD
En la literatura médica, la importancia de la velocidad de inactivación

decreciente fue reconocida por Gard (1958). En su investigación de la cinética
de inactivación química de un virus, Gard presentó pruebas sobre la velocidad
de inactivación afirmando que no era de primer orden y que decrecía con el
tiempo. Gard propuso la siguiente ecuación para expresar la velocidad de
decrecimiento en un reactor batch.
dN kN (III.27)
- =
dt 1+a(Ct)
O en la forma integrada
98
N (III.28)
= [1+a(Ct) ] a
-k
N0
Donde
N= concentración de organismos viables a tiempo t
C= concentración del desinfectante, constante en el tiempo
k= constante de velocidad de primer orden de inactivación
a= coeficiente de velocidad
III.3.5. MODELO DE COLLINS Y SELLECK
Collins y Selleck (1972) observaron que los datos de desinfección

frecuentemente producen un lag inicial como también una velocidad de
inactivación decreciente como se observa en la figura I V.3 . Si se grafica el
logaritmo de los sobrevivientes versus el tiempo, como se hace en muchas
gráficas de desinfección, se obtiene la forma mostrada en la figura I V.3(a).
Después del lag inicial, se observa que parte de la curva de inactivación tiene
una velocidad de inactivación decreciente con el tiempo. El propósito del
modelo es graficar los sobrevivientes (N/ No) versus el producto de la
concentración y tiempo (Ct) y no versus el tiempo solo (White, 1999). La
ecuación de velocidad para el modelo de Collin-Selleck es la siguiente:
dN (III.29)
=-kN
dt
Donde:
99
k=0 para Ct  τ (III.30)

k=k ' para Ct  τ
k'
k= para Ct  τ
b(Ct)
En este caso, τ es un producto de la concentración y el tiempo (Ct), que

debe ser excedida antes de que se inicie la inactivación. Es semejante a un
umbral, es decir, que no existe inactivación hasta que el tiempo (t) excede un
tiempo lag mínimo (t’).
Después de la integración y aplicación de las condiciones límite, la

expresión de la velocidad se vuelve:
N
=1 para Ct  τ (III.31)
N0
-n
N  Ct 
=  para Ct  τ (III.32)
N0  τ 
III.3.6. MODELO DE HOM
También Hom (1972) desarrollo una formulación cinética flexible y

empírica para la velocidad de inactivación basada en la modificación del
modelo de Chick-Watson (Pretorios P.C y Pretorius W.A, 1999).
N (III.33)
ln =-kC n t m
N0
Siendo m una constante empírica y n el coeficiente de dilución.
100
La ecuación (I I I .33) puede ser modificada para una concentración

constante de desinfectante k´ =kCm .
N (III.34)
ln =-k´ t m
N0
En un estudio posterior, Hass et al (1999), continuaron modificando el

modelo de Hom. En este nuevo modelo se tiene en cuenta en el cálculo, un
decaimiento del desinfectante residual. En la ecuación (I I I .35) C0 es la
concentración inicial de desinfectante y k* es la velocidad de decaimiento
residual de primer orden.
 N  m
m
  nk * t  
m
(III.35)
n
ln =-
   k(C 0 ) 1-exp - 
 N0   nk    m 
III.3.7. MODIFICACIÓN AL MODELO DE HOM (CHO ET AL., 2003)
En un estudio posterior, Cho et al. (2003) propusieron una modificación

del modelo de Hom original que puede simplificarse en la siguiente ecuación
cuando la concentración de desinfectante permanece constante:
N ( III.36)
=-k1 [1-exp(-k 2 t) ] 3
k
Log
N0
Estos tres parámetros del modelo (k 1, k 2 y k 3) hacen posible el ajuste de

los datos de desinfección con curvas que presentan tres regiones diferentes
correspondientes a un “hombro” inicial, una zona de desinfección lineal y una
“cola” final.
101
III.3.8. MODELO DE MAJUNAR
M ajunar et al. (1973) desarrollaron un modelo cinético basado en la

inactivación de poliovirus por ozonización en un reactor batch mezcla perfecta
(Rios, 2003). La expresión planteada fue la siguiente:
dN (III.37)
=KN x C n
dt
Donde x es una constante empirica del modelo. El análisis de los datos

experimentales indicó que la tasa de inactivación (N/ N0) puede ser
correlacionada con el tiempo de contacto y la concentración de desinfectante
utilizando la siguiente ecuación:
 N 
b (III.38)
Ct=a  
 N0 
Donde a y b son constantes dentro de un rango de condiciones

experimentales.
Además de estos modelos empíricos muy conocidos y estudiados, en los

últimos años, se ha propuesto el uso de nuevos modelos matemáticos que
permitan describir curvas de inactivación no lineales. Así, modelos previamente
usados para describir las curvas de crecimiento bacteriano han sido aplicados al
estudio de la desinfección. Por ejemplo, la ecuación de Gompertz, ampliamente
usada para modelar curvas de crecimiento sigmoideas asimétricas, fue probada
con éxito en la inactivación térmica de bacterias (Linton et al., 1995). La
ecuación logística, también fue empleada para describir la inactivación de
Lister ia monocytogenes (Cole et al., 1993). Finch et al. (1988) utilizaron el
modelo de dosis repuesta para evaluar la cinética de inactivación de E. coli con
ozono. Estos modelos muestran en general una bondad de ajuste satisfactoria,
pero carecen de solidez y se adaptan a situaciones particulares. Por otra parte,
los parámetros de estas ecuaciones pueden ser difíciles de calcular, y por lo
general se dificulta la interpretación física o biológica de los parámetros.
102
N (III.39)
Log =a+bC+Ct
N0
Siendo C y t variables independientes y a,b y c parámetros del modelo.
Las constantes y los coeficientes de todos los modelos de decaimiento son

obtenidos por regresión a partir de resultados experimentales, obtenidos en
laboratorio, en condiciones controladas y conocidas, como temperatura, pH,
alcalinidad, color, turbiedad, y para un determinado tipo de microorganismos
(Daniel, 2001).
III.3.9. MODELOS CINÉTICOS PROPUESTOS POR BLAIN SEVERIN
Existen varias teorías que intentan modelar la cinética de la desinfección,

aunque, debe considerarse que la mayoría se determinaron realizando los
estudios con desinfectantes químicos y por lo tanto no son directamente
aplicables al UV.
En este punto se centrará la atención en los análisis de Blain Severin

(1982) propuso tres modelos cinéticos, siendo el más importante el modelo de
Eventos en Serie, considerado como el más apto para representar la
desinfección con UV.
Este modelo en particular es tomado como base por Labas (2004) para
proponer un modelo modificado para el trabajo desarrollado en su tesis
doctoral.
En esta tesis se obtuvieron resultados experimentales de desinfección con

UV sola similares a los encontrados por Labas (2004), por lo tanto, se adoptó el
modelo de eventos en serie modificado para representar estos resultados. Este
modelo completo será presentado en el Capitulo V.
103
III.3.9.1. CINÉTICA DE SEGUNDO ORDEN DE MEZCLADO
La observación fundamental que conduce al desarrollo de la cinética de

segundo orden es que en estudios de inactivación en sistemas batch, una dosis
constante de luz UV ( µw s / cm 2), por ejemplo, un producto constante del flujo
de radiación ( µw / cm 2) y tiempo (s), da un nivel constante de inactivación para
un dado cultivo de organismos (el autor llama erróneamente I ntensidad local al
flujo de radiación, ver punto). Esto parece ser una observación universal
excepto cuando se utilizan dosis muy bajas de UV y cuando la velocidad a la cual
ciertos organismos reparan daños producidos por UV es del mismo orden de
magnitud que la velocidad a la cual se produce el daño con UV (H arms, 1980).
Con la excepción de este caso especial, la observación mencionada es una buena
indicación que la velocidad de inactivación es de primer orden con respecto al
flujo de radiación para la mayoría de los casos. En la cinética de segundo orden
de mezclado, la velocidad de inactivación es también de primer orden con
respecto a la densidad de organismos sobrevivientes. Cuando se quiere
representar en gráficas semilogarítmicas la fracción de sobrevivientes versus
exposición UV, las curvas de inactivación en sistemas batch son lineales. Este
tipo de comportamiento es generalmente verdad para virus con ácidos nucleicos
de cadenas simples (Harms, 1980). Organismos más complejos muestran,
usualmente, una resistencia inicial al UV.
De acuerdo a lo expuesto, para el modelo de segundo orden de mezclado,

la velocidad de inactivación de organismos, RN (números de organismos/ cm 3 s),
se representa por:
R N =kq w (III.40)
donde k (cm 2/ w.s) es la constante de velocidad, qw (w/ cm 2) es el flujo de

radiación UV y N (número de organismos/ cm 3) es la densidad local de
organismos sobrevivientes. Cabe aclarar que el símbolo k es también usada en
cinéticas M ulti-Target y en cinéticas de Eventos en Serie como la constante
104
cinética. Aunque en varios casos k tiene las mismas unidades, el valor y la

interpretación de k no son intercambiables entre los tres modelos.
Para reactores batch con distribuciones espaciales de flujos de radiación

cuasi-uniforme, se asume que qw y N son uniformes. El balance de materia de
organismos sobrevivientes es el siguiente:
dN (III.41)
=-k q w N
dt
donde t es el tiempo de exposición (s). Para las condiciones de contorno N

= N 0 cuando t = 0 y N = N a t = t, la integración da lo siguiente:
N (III.42)
=e -k q w t
N0
donde N es la densidad de organismos sobrevivientes (número de

organismos/ cm 3) y N 0 es la densidad de organismos inicial (número de
organismos/ cm 3).
III.3.9.2. CINÉTICA MULTI-TARGET
El modelo M ulti-target se ha utilizado para describir la resistencia inicial

de los microorganismos a la inactivación UV. Este modelo se desarrolló para
otros tipos de radiación además de la radiación UV y observaciones actuales
sobre los mecanismos de inactivación UV no sostienen el uso de este modelo.
Sin embargo, es utilizado para describir resultados de este tipo de inactivación
(Smith y Hanawalt, 1969; Harms, 1980) debido a la aceptabilidad de su lógica,
su simplicidad matemática y su capacidad para ajustar datos de reactores tipo
batch. Aunque, la cinética M ulti-target se extendió para incluir el caso de la
inactivación en reactores de flujo continuo completamente mezclados.
105
En el desarrollo de este modelo, se asume que una partícula contiene un

número finito, n c, de tar gets o blancos críticos discretos, cada uno de los cuales
debe ser previamente atacados para lograr la inactivación total de una
“partícula”. Una partícula puede representar un organismo con n c tar gets
críticos o un grupo de organismos que posee un total de n c tar gets.
El modelo no puede distinguir entre un grupo de organismos con un

blanco cada uno o un organismo individual con muchos tar gets. En su
aplicación, por lo tanto, toda discusión está dada en términos de un organismo
con muchos tar gets y que el término “organismo” y “partícula” se utilizan de
modo intercambiable. Se asume también que la probabilidad de lograr un golpe
sobre una partícula decrece a medida que avanza la reacción, por ejemplo ya
que disminuye el número de tar gets a ser atacados cuando avanza la reacción la
probabilidad de lograr el próximo golpe, es menor.
III.4. MODELO PSEUDO HETEROGENEO DE DESINFECCIÓN. FLORES

et. al, 2012
III.4.1. INTRODUCCIÓN AL MODELO
Como iniciación al trabajo de investigación y parte del entrenamiento se

estudia un proceso de desinfección pseudo heterogéneo utilizando peróxido de
hidrógeno como desinfectante (este trabajo completo se encuentra en Apéndice
V. Publicaciones) Se realiza la interpretación química del posible mecanismo de
daño celular. La hipótesis planteada es la existencia, en la célula bacteriana, de
sitios factibles (targets), de ser atacados por los ataque de los radicales OH •. De
acuerdo con la literatura consultada, (M c Donnell y Russell, 1999, M aillar,
2002; Dalymple, 2010) en el caso de las bacterias hay tres sitios característicos,
que podrían ser los objetivos del ataque del OH˙: (1) La capa de peptidoglicano,
(2) la capa de lipopolisacáridos (que se encuentra sólo en las bacterias Gram-
negativas) y (3) la bicapa fosfolipídica presentes. En este estudio se trabaja con
E. coli, una bacteria Gram negativa, por lo tanto, los “target” están definidos.
106
Los agentes químicos reactivos como el peróxido de hidrógeno (como los

compuestos halogenados en general) pueden mostrar cierta especificidad de
ataque a los grupos tiol membrana y los ribosomas de la membrana celular
(como ya se mencionó en el Capítulo I I )), pero, con frecuencia, los radicales
hidroxilo tienen reactividad suficiente para interactuar con diferentes
componentes celulares “encapsulando” así el daño primario directo.
Una vez que se produce el ataque a la membrana, las especies reactivas de

oxígeno, EROs) o ROS (por sus siglas en inglés: reactive oxygen species) pueden
actuar en sitios intracelulares vulnerables, tales como proteínas, enzimas,
coenzimas y ácidos nucleicos. El sistema enzimático les permite a las bacterias,
en ciertos casos, reconstituirse (sobre todo cuando el proceso de desinfección
utilizado es la radiación UV), por consiguiente, si la ruptura de la pared celular
no es suficiente, este efecto del peróxido de hidrógeno sobre los componentes
intracelulares podría explicar por qué la desinfección oxidativa es siempre un
proceso irreversible.
Una de las preguntas para desarrollar el modelo fue: cómo se establecen

los mecanismos más plausibles para la producción de ROS? Y como producen
estas especies oxidantes el posterior daño sobre los componentes de la célula?
Una explicación podría observarse en las posibles reacciones químicas que
pueden conducir a esta serie de eventos oxidativos.
La mayoría de estas reacciones han sido objeto de considerables análisis y

estudios, pero al mismo tiempo, también se reconoce que constituyen una
secuencia compleja de una “red de reacciones” de interconexión antes de llegar
a lo que podríamos llamar una especie de "productos finales". Esta
denominación química se aplica a la oxidación completa de todos los
componentes de la bacteria. La segunda parte de la pregunta se podría poner de
esta manera: ¿Es necesario incluir todos estos pasos en el modelo para
representar adecuadamente la operación de desinfección que conduce a la
muerte de la célula? es decir, en qué medida todos ellos compiten con las
bacterias de las especies ROS?
107
En vista de estas dificultades, y la búsqueda de alguna forma de plausible,

y al mismo tiempo simplificada para la representación, conceptualmente sin
distorsiones de todos estos procesos, se podría tratar de adoptar un modelo que
biológico, sin la asignación de una composición detallada de cada una de las
familias representativas de los componentes de la célula. Una vez que este
modelo se realice matemáticamente, será necesario, para averiguar el conjunto
mínimo de parámetros cinéticos que se requieren para representarlo, dentro de
un error aceptable, postular la serie o los eventos en serie-paralelo que
conducen a la muerte bacteriana.
La disrupción de la membrana, la posterior lisis de los componentes de

las bacterias y la oxidación del lisado resultante, se puede modelar como una
secuencia de eventos en serie, seguidos de una secuencia de eventos en paralelo,
en el que el nivel de daño aumentará hasta que la bacteria no sólo muere, o se ve
gravemente afectada en sus funciones vitales, sino también, dado el tiempo
suficiente, los componentes químicos de la célula se oxidan totalmente.
La forma de ruta de la modelo cinético incluye: Bacteria activa (BAC),

Bacteria injuriada (dañada) (BI N ) y la mortalidad de la población bacteriana
(BDE) de las bacterias (“ DE” por el término Death en inglés), así como varios
productos químicos adicionales de la lisis con la denominación genérica de
LYP1, LYP2 ...., Lypn .
III.4.2. MODELADO DE LA REACCIÓN PERÓXIDO-MEMBRANA

CELULAR
En el modelado de la cinética de las reacciones de desinfección con

peróxido de hidrógeno una de las principales dificultades se presenta al
momento de incluir la participación del Fe2+ o Fe3+ en el mecanismo para
producir los radicales hidroxilos (Sies, 1991; Kehrer, 2000), es decir, las
reacciones H aber Weis, fenton o fenton-like. La razón principal de esta
108
dificultad es que no se conocen con precisión las concentraciones de los iones

férrico y ferroso. Una posibilidad para hacer frente a este problema es asumir
que la reacción está mediada por el hierro o efectivamente el par de iones, que
son a concentraciones constantes y que este proceso puede ser incluido como
parte de un paso hipotético de la cinética propuesta. La respectiva constante
específica de esta etapa representa una parte de un mecanismo, muy simple
para generar los radicales hidroxilos. Así, para una determinada familia de
bacterias esta sustitución tomará una pseudo constante cinética que permite el
desarrollo de la propuesta.
Iniciación
k1 • (III.43)
H 2 O 2 
3+ 3+ − → OH − + OH
Fe or Fe + O2 promotion
Se debe notar que cuando la reacción se escribe como anteriormente, sin

incluir específicamente el Fe3+ , k 1 no se conoce.
Propagación
• •
(III.44)
H 2 O 2 + OH  → HO 2 + H 2 O
2 k
H 2 O 2 + HO 2 
k3 •
→ OH +H 2 O + O 2
•
(III.45)
Terminación
•
(III.46)
2OH 
k4
→ H 2O2
2HO 2 
•
k5
→ H 2O2 + O2 (III.47)
• • (III.48)
OH + HO 2 
k6
→ H 2O + O2
109
El proceso que termina con la ruptura de membrana bacteriana se puede

tratar recurriendo a una interpretación pseudohomogénea de la intrincada red
de reacciones superficiales que conduce a la ruptura de la envoltura protectora
en las bacterias. Vamos a representar una especi e hi pot ét i ca de l os
component es de l a par ed cel ul ar como HSCW(BAC) (HSCW por sus siglas en
inglés: hypothetical species of cell wall) para las bacterias activas cuya
concentración se puede expresar en unidades de mol cm -2 y que reacciona con el
radical OH •. Esta composición es la misma para cada bacteria de una
determinada familia de bacterias. Entonces:
HSCW + OH • 
k7
→ HSCW
*
(III.49)
BAC BIN
En este punto, es posible pensar en SSA(BAC) como el ár ea su per f i ci al

especí f i ca por u n i dad de vol u m en de u n a cél u l a (en unidades de
cm 2 cm -3), como el volumen de una célula por CFU (en unidades de cm 3 de CFU -
1) y [ BAC] como a t oda l a con cen t r aci ón i n st an t án ea de l as
bact er i as act i vas (en unidades de CFU cm -3). Representando V(BAC) a la
con cen t r aci ón de l as esp eci es h i pot ét i cas por u n i dad de
vol u m en del f l u i do, pudiéndose calcularse a partir de la concentración
superficial de esta especie mencionado como:
 HSCW 
 BAC 
× SSA B × VB × [
BAC ] ( t )
 
  AC
 AC
Superficial concentration of Superficial area per unit volume of Instantaneous concentration of

of hypotetical species volume of bacterium one CFU active bateria per unit volume
of one bacterium

Instantaneous representation of the total
volumetric concentration of hypotetical species of the active bacteria
(III.50)
Teniendo en cuenta los valores promedios para una familia de bacterias

específica HS(BAC), los valores SSA(BAc) y V(BAC) pueden considerarse constantes
110
 HSCW  × SSA × V = constant (III.51)

 BAC  BAC BAC
k7 = k*7 × HSCW  ×SSA B ×V B (III.52)

   BAC  AC AC
Pseudo homogeneous Superficial
volumetric kinetic constant kinetic constant
Sin embargo, es muy poco probable que un solo radical hidroxilo,

produzca un daño grave a la pared celular. Se desconoce también el número de
moles de OH • necesarios para golpear a la bacteria, y considerar que la bacteria
se ha lesionado, y el número de bacterias que forman la CFU. Siempre es posible
concebir un rendimiento de oxidación como la relación de las unidades
formadoras de colonias (CFU) lesionadas con respecto a los radicales hidroxilos
gastados para producir este evento.
k7 Injured CFU CFU cm 3

k 7# = ; Y7 =  [ =] ; k 7# [ = ]
Y7 OH spent in this event mol CFU s
(III.53)
Con el fin de tener la correcta aplicación de este rendimiento, así como

conseguir la homogeneidad de la unidad que debe tener en cuenta que:
R 7,BAC = − k 7 [ BAC ]  OH 
•
  (III.54)
R 7,OH = − k 7# [ BAC ]  OH 
•
(III.55)
 
Con este enfoque de reacción biológica pseudo homogénea, el paso 7

puede ser finalmente expresada como:
BAC + OH 
k7
→ BIN
•
(III.56)
111
De manera similar, el mismo procedimiento se puede aplicar a las

bacterias dañadas en la reacción con los radicales de acuerdo con la siguiente
ecuación:
k8 = k*8 × HSCW  ×SSA B ×V B (III.57)

 BIN  IN IN
k8 Dead CFU CFU cm 3

k 8# = ; Y8 =  [ =] ; k 8# [ = ]
(III.58)
R 8,BIN = − k 8 [ BIN ]  OH 
•
(III.59)
 
R 8,OH = − k 8# [ BIN ]  OH 
•
(III.60)
 
BIN + OH 
k8 •
→ BDE (III.61)
Este paso (I I I .61) lleva a la ruptura de la pared celular y a la posterior

muerte de la bacteria.
III.4.3. LISIS DE LAS BACTERIAS MUERTAS
La muerte de la bacteria implica que la pared celular se ha roto

permitiendo el acceso del oxidante hacia los componentes intracelulares,
produciendo así el lisado:
BDE + OH • 
k9
→ LYSATE (III.62)
Donde:
112
k9 = k*9 × HSCW  ×SSA B ×V B (III.63)

   BDE  DE DE
k9 Lysed CFU CFU cm 3 (III.64)

k 9# = ; Y9 =  [ =] ; k 9# [ = ]
R 9,BLY = − k 9 [ BDE ]  OH 
•
(III.65)
 
R 9,OH = − k 9# [ BDE ]  OH 
•
(III.66)
 
Una vez que la morfología anatómica de la célula ha sido alterada por el

lisado, los radicales OH • pueden interactuar con los componentes celulares
internos en reacciones típicamente homogéneas. Desde el punto de vista
químico, la actividad de los radicales puede ser interpretada en términos de
varias reacciones en serie y paralelo con un número indefinido de componentes
hipotéticos de la lisis resultante.
En el modelo estos componentes de la lisis están representados por LYp,1;

LYP,2…LYp,..n y corresponden a los grupos importantes de compuestos que,
después de las oxidaciones ulteriores conducen a los productos finales del
proceso de desinfección.
k k k
LYP,1 + OH • 
10,1
→ LYP,1,1 + OH  
11,1
→ ⋅⋅⋅⋅⋅ LYP,1,n −1 + OH  
n ,1
→ E P,1,n
k k k
LYP,2 + OH • 
10, 2
→ LYP,2,1 + OH  
11,2
→ ⋅⋅⋅⋅⋅ LYP,2,n −1 + OH  
n ,2
→ E P,2,n
⋅
⋅
⋅
k k k
LYP,n-1 + OH • 
10, n-1
→ LYP,n −1,1 + OH  
11, n −1
→ ⋅⋅⋅⋅⋅ LYP,n −1,n −1 + OH  
n −1, n
→ E P,n −1,n
k k k
LYP,n + OH • 
10, n
→ LYP,n ,1 + OH  
11, n
→ ⋅⋅⋅⋅⋅ LYP,n,n −1 + OH  
n ,1, n
→ E P,n,n
113
III.4.4. REPRESENTACIÓN MATEMÁTICA DEL MODELO
Los parámetros operacionales del proceso pueden obtenerse a partir de la

solución de un modelo cinético, derivado de la secuencia propuesta de los
procesos que conducen a la destrucción de las células. El cálculo de las
velocidades de reacción para cada etapa se lleva a cabo en todas las posiciones
del reactor. Sin embargo hay que señalar que para un reactor bien mezclado en
la ausencia de efectos externos (por ejemplo, irradiación o mejoras ultrasónicas)
las composiciones son uniformes y corresponden a los valores locales. La
cinética de la reacción se formula en términos de la ley de acción de masas para
todas las etapas propuestas para generar la destrucción bacteriana por el
peróxido de hidrógeno. Podemos asumir que:
(i) El sistema es isotérmico con composiciones perfectamente

mezcladas.
(ii) La aproximación de micro estado estacionario es válida.
(iii) El primer conjunto de oxidación de los productos de lisado es

suficiente para representar el proceso de desinfección.
Si nuestra tercera hipótesis es válida, teniendo en cuenta sólo la primer

reacción de oxidación de los subproductos de lisado, debería ser suficiente para
representar la reacción de desinfección, incluso si no llega a la oxidación total de
los componentes químicos de la célula.
En el esquema de reacción podemos derivar las siguientes expresiones:
2
R OH• = k1 [ H 2 O 2 ] - k 2 [ H 2 O 2 ] OH  + k 3 [ H 2 O 2 ]  HO 2  - k 4 OH  -
• • •
     
k 6 OH   HO 2  - k 7# [ BAC ]  OH  - k 8# [ BIN ]  OH  - k 9# [ BDE ]  OH  -
• • • • •
        
n
∑k  LYP,i   OH 
•
i=1
10,i  
(III.68)
114
2
= k 2 [ H 2O 2 ] OH  - k 3 [ H 2O 2 ]  HO 2  - k 5  HO 2  - k 6 OH   HO 2 
• • • • •
R •
HO2         
(III.69)
La velocidad de reacción para las bacterias activas y las injuriadas puede

representarse a través de las ecuaciones (I I I .70) y (I I I .71):
R BAC = - k 7 [ BAC ]  OH 
•
(III.70)
 
R BIN = k 7 [ BAC ]  OH  - k 8 [ BIN ]  OH 

• •
(III.71)
   
La concentración de los radicales OH puede calcularse a partir de la

ecuación (I I I .43)
2
0 ≅ k1 [ H 2 O 2 ] - k 2 [ H 2 O 2 ]  OH  + k 3 [ H 2 O 2 ]  HO 2  - k 4 OH  - k 6 OH   HO 2 
• • • • •
        
n
-k 7# [ BAC ]  OH  -k 8# [ BIN ]  OH  -k 9# [ BDE ]  OH  -∑ k10,i  LYP,i   OH 
• • • •
      i=1  
(III.72)
Sobre la base de evidencias confirmadas, se supone que las velocidades de

terminación de los pasos (I I I .46) y (I I I .48) son despreciables en comparación
con el paso (I I I .47), que es el paso de terminación predominante, mientras que
el paso (I I I .44) es la etapa de propagación predominante, por tal motivo, la
concentración de los radicales hidroxilos puede expresarse:
k1 [ H 2 O 2 ]
OH  =
•
  n
k 2 [ H 2 O 2 ] +k 7# [ BAC ] +k 8# [ BIN ] +k 9# [ BDE ] +∑ k10,i  LYP,i 
i=1
(III.73)
n
El valor de ∑k
i=1
10,i  LYP,i  puede considerarse como proporcional a la
concentración de bacterias muertas. Esta simplificación es posible porque
115
involucra el mismo nivel de arbitrariedad que todos los términos incluidos

dentro de la sumatoria.
k1 [ H 2O2 ] (III.74)
OH  =
•
  k [ H O ] + k [ B ] + k # [ B ] + ( k # + α k )[ B ]
#
2 2 2 7 AC 8 IN 9 10 DE
Remplazando la ecuación (I I I .74) en la expresión de la velocidad de

reacción para las bacterias activas obtenemos
k1k7 [ BAC ] [ H 2O2 ] (III.75)

RBAC = -
k2 [ H 2O2 ] + k7# [ BAC ] + k8# [ BIN ] + ( k9# + α k10 ) [ BDE ]
Reordenando, la expresión final de la velocidad de desaparición de las

bacterias activas es:
γ A [ BAC ][ H 2O2 ] (III.76)

RBAC = -
[ H 2O2 ] + γ 0 [ BAC ] + γ 1 [ BIN ] + γ 2 [ BDE ]
Donde:
 k1k7  ;
γA =  γ0 =
k7# ;
γ1 =
k8# ; k9# + α k10 ( )
 k2  k2 k2 γ 2 = k 2
Reemplazando la ecuación (I I I .74) en la expresión de la velocidad de

reacción para bacterias injuriadas se obtiene:
k1 [ H 2O2 ] ( k7 [ BAC ] - k8 [ BIN ]) (III.77)

RBIN =
k2 [ H 2O2 ] + k7# [ BAC ] + k8# [ BIN ] + ( k9# + α k10 ) [ BDE ]
La expresión final para la desaparición de bacterias injuriadas es:
R BIN =
[ BAC ][ H 2O 2 ] γ A - [ BIN ][ H 2O 2 ] γ IN (III.78)
[ H 2O 2 ] + γ 0 [ BAC ] + γ1 [ BIN ] + γ 2 [ BDE ]
116
Donde:
k k 
γ IN =  1 8 
 k2 
III.4.5. DISCUSIÓN Y RESULTADOS
Los experimentos se llevaron a cabo en un reactor continuo isotérmico,

bien mezclado. A continuación, el análisis se realiza con un balance de masas
muy simple:
d[ j ] (III.79)
Rj = j BAC , BIN , =BDE , LYPi
dt
 [ BAC ] = [ BAC ]0 for BAC

t=0 
 [ j ] = 0 for j BIN , BDE=, LYPi
Los resultados de la simulación para j = BAC + BI N (bacterias

supervivientes) se compararon con los datos obtenidos a partir del cultivo de
células de la toma de muestras, empleando un programa informático de
optimización multiparamétrica no lineal con el fin de obtener los valores de las
constantes de γ k cinética para k = A, B, 0, 1 y 2.
Los valores de los parámetros cinéticos son:
γA = (2.7 ± 0.1) × 10-3 cm3 mol-1 s-1
γIN = (9.6 ± 3.1) × 10-3 cm3 mol-1 s-1
γ0 = (1.5 ± 0.2) × 10-10 mol CFU-1
γ1 = (4.9 ± 2.2) × 10-8 mol CFU-1
γ2 = (1.7 ± 0.2) × 10-8 mol CFU-1
Con estos parámetros el acuerdo con los datos experimentales se muestra

en la Figura (I I I . 3). El modelo se ajusta razonablemente bien a todos los datos
117
experimentales para toda la gama de concentraciones de peróxido de hidrógeno

exploradas.
Sin embargo, se puede ver que el valor de γ0 es más bien pequeño, por tal
motivo es posible reducir los parámetros del modelo cuando se supone que:
γ 0 [ BAC ] << [ H 2O 2 ] + γ1 [ BIN ] + γ 2 [ BDE ]
Re-escribiendo de las ecuaciones de velocidad obtenidas anteriormente,

la expresión final para las bacterias activas y heridas:
γ A [ BAC ][ H 2O2 ] (III.80)

RBAC = -
[ H 2O2 ] + γ 1 [ BIN ] + γ 2 [ BDE ]
γ A [ BAC ][ H 2 O 2 ] - γ IN [ BIN ][ H 2 O 2 ] (III.81)

R BIN =
[ H 2O 2 ] + γ1 [ BIN ] + γ 2 [ BDE ]
118
Figura III. 3. Resultados de la simulación con el modelo de cinco parámetros (líneas

continuas) comparados con los datos experimentales. La trama presenta a los valores de células
cultivables.
Usando esta suposición se obtiene un nuevo conjunto de cuatro

constantes cinéticas:
γA = (2.7 ± 0.0) × 10-3 s-1cm3 mol-1 s-1
γIN = (10.0 ± 2.8) × 10-3 s-1 cm3 mol-1 s-1
γ1 = (5.3 ± 2.0) × 10-8 mol CFU-1
γ2 = (1.7 ± 0.1) × 10-8 mol CFU-1
119
Figura III.4. Resultados de la simulación con el modelo de cuatro parámetros (líneas

continuas) en comparación con los datos experimentales. La trama presenta a los valores de las
células cultivables.
Se puede observar que el modelo de cuatro parámetros también hace un

buen arreglo con los datos experimentales. En este proceso existe una
competición por los radicales entre dos grupos: (1) las bacterias muertas y los
compuestos resultantes de la formación lisada y (2) las bacterias activas y las
injuriadas. La cuestión importante es saber en qué medida las reacciones
subsecuentes luego de que las bacterias mueren, afectan a la tasa de
desinfección. Estas reacciones corresponden a las constantes cinéticas y k 9 αk 10 .
Ambos se agrupan en γ2. La importancia de este conflicto puede ser visto por lo
γ2 = 0 (ya sea porque k 9 = 0 o αk 10 = 0 o ambos son cero). Los resultados se
muestran en la Figura (I I I .5)
120
Figura III.5. Resultados suponiendo que se omitió la etapa del lisado. Para CAc +CIN en función
del tiempo. Las líneas continuas representan el modelo completo, las líneas quebradas:γ2 = 0.
Se hace evidente que con este supuesto, el modelo predice una

degradación mucho más rápida de las bacterias. La implicación es que la
competición existente por los radicales OH • debería haber sido erróneamente
destacada si γ0 se hacía igual a cero, lo que permite llegar a la conclusión de que
al menos la etapa correspondiente a la formación del lisado no puede ser
ignorada. El aislamiento del efecto correspondiente a cualquiera de k 9 o αk 10 no
se puede obtener a partir de este modelo, pero sin duda αk 10 no puede ser
diferente de cero si k 9 era igual a cero antes.
El modelo también proporciona una buena información sobre la forma en

que el producen las reacciones de inactivación. Con los parámetros obtenidos es
posible seguir los cambios en la concentración de las bacterias activas,
lesionadas y muertas. Ellos se muestran en las Figuras I I I .6 y I I I .7 para dos
diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno.
121
Se hace evidente que la vida de las bacterias lesionadas es muy corta y su

concentración no alcanza valores altos. Este efecto se puede inferir observando
los valores de los parámetros obtenidos. Claramente, k 8 es casi cinco veces
mayor que la k 7.
Figura III.6. Descripción gráfica de la evolución del proceso, de acuerdo al modelo. ●: Datos
experimentales; línea continua: bacterias cultivables (BAC + BIN) línea discontinua: bacterias activas,
rota y la línea de puntos: bacterias lesionadas; la línea de puntos: bacterias muertas.
122
Figura III.7. Descripción gráfica de la evolución del proceso, de acuerdo al modelo.●: Datos
experimentales; línea continua: bacterias cultivables (BAC + BIN); línea discontinua: bacterias
activas, rota y la línea de puntos: bacterias lesionadas; la línea de puntos: bacterias muertas
A partir de estas dos figuras se puede observar también un

comportamiento coherente. Cuando se utilizan concentraciones más bajas de
peróxido de hidrógeno (45 ppm) se observa la supervivencia de un número
importante de bacterias activas y heridas, lo que indica que la oxidación no es
suficientemente intensa como para superar la resistencia de la pared celular.
Por el contrario, a concentraciones más altas (185 ppm) el número de la
superviventes y las bacterias no dañadas disminuye gradualmente y se produce
una ruptura de la pared celular de las bacterias en un tiempo más corto.
Entonces, muy rápidamente, se cambia desde el estado de bacterias lesionadas a
uno de irreversiblemente muertas. Por esa razón, la concentración de bacterias
dañadas es siempre baja. Esto es, al mismo tiempo, una confirmación de que la
concentración de oxidante es el factor más importante para afectar a los sitios
targets de las bacterias.
123
III.4.6. CONCLUSIONES DEL MODELO
Un nuevo modelo cinético para la desinfección química con peróxido de

hidrógeno ha sido desarrollado. Los resultados de la simulación con los
parámetros proporcionan una muy buena concordancia con los datos
experimentales para un amplio intervalo de concentraciones de peróxido de
hidrógeno.
El mecanismo propuesto implica una serie de tres pasos heterogéneos

(analizados como reacciones Pseudo-homogéneas) seguido de un grupo de
reacciones de oxidación de reacciones en serie- paralelo en la fase homogénea .
El proceso de desinfección se caracteriza por los siguientes pasos: (1) La

producción de los radicales hidroxilo que se supone que es promovida por un
mecanismo Fenton o por reacciones de Haber- Weis - like; (2) Un primer ataque
de los radicales hidroxilos para de dañar la pared celular; (3) un segundo ataque
por el mismo oxidante , que produce la destrucción completa de la envoltura
bacteriana; ( 4 ) la formación de un lisado con todos los componentes de la
célula; ( 5 ) la posterior oxidación de las especies químicas resultantes de la lisis
de la bacteria .
Las reacciones que conducen a la formación del lisado y la posterior

oxidación de los componentes de las células compiten con las bacterias activas y
lesionadas por el radical hidroxilo, un fenómeno que con la ayuda del modelo
claramente se pudo observar.
De acuerdo con el modelo, la acción que conduce a la destrucción

completa de la pared celular de bacteria es más rápida que la que produce el
daño, donde se transforma la bacteria activa en bacteria lesionada.
124
El modelo descrito se basa en una descripción idealizada de la

desinfección química, sin introducir una representación conceptual
distorsionada de los procesos implicados en la muerte bacteria.
Los parámetros cinéticos obtenidos deben ser independientes del tipo y el

tamaño del reactor de laboratorio empleado, siempre y cuando se reproduzcan
las condiciones de funcionamiento reportadas, es decir, el rendimiento
isotérmico , el pH y las concentraciones de oxidantes.
Los resultados de este trabajo fueron publicados en: Chemical Engineer ing
Jour nal 198–199 (2012), bajo el título: Chemical disinfection w ith H 2O2 - The pr oposal
of a r eaction kinetic model (388–396). Autor es: Flores Marina; Brandi Rodolfo;
Cassano Alberto y Labas Marisol (Apéndice 5-Publicaciones).
125
ACRONIMOS CAPITULO III
x Vector posición, m
ea Velocidad volumétrica de absorción de fotones

λ
B Bacteria
C Concentración
Ci Concentración del componente i
E energía radiante, einstein s-1
G radiación incidente, einstein s-1 m -2
h constante de Planck, J s
HS Especies hipotéticas presentes en una célula bacteriana
I intensidad específica de radiación, einstein s-1 m -2 sr -1
K Constante cinética las unidades dependen de la reacción en

estudio y de la etapa de la reacción
L longitud, m
Lpy Productos de la lisis
n Vector unitario normal
N Concentración de microorganismos
R Velocidad de reacción, las unidades dependen de la reacción
r radio
Sg coordenada lineal a lo largo de la dirección Ω , m
126
SSA Area superficial especifica (referida a la bacteria)
t Tiempo(s)
Y Rendimiento de oxidación
LETRAS GRIEGAS
γ Frecuencia, s-1
α absortividad molar neperiana, m 2
mol -1
λ longitud de onda, m
Ϭ coeficiente volumétrico de scattering, m -1
ҡ coeficiente volumétrico de absorción, m -1
φ coordenada esférica, rad
θ coordenada esférica, rad
ρ coordenada esférica, rad
Ω ángulo sólido, sr
Ω vector unitario en la dirección de propagación, adimensional
ϒ Parámetros del modelo
Υ Coeficiente de transmitancia en la pared
127
SUBÍNDICES
AC activa
IN I njuriada, dañda
DE muerta
i Componente i
Het heterogéneo
Hom homogéneo
CW Pared celular (cell wall)
0 Referido a la concentración inicial
128
CAPITULO IV
TÉCNICAS ANALÍTICAS
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
CAPITULO IV TÉCNICAS ANALÍTICAS. PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL
CAPITULO IV: TECNICAS ANALITICAS.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
En este capítulo se presenta todo lo referente a las especificaciones de las

experiencias realizadas.
Se detallan las técnicas analíticas empleadas para la determinación de la

concentración de la solución de trabajo, siembra y recuento de
microorganismos. Se describen las técnicas para los ensayos experimentales
químicos y microbiológicos.
Se estudia también el crecimiento bacteriano mediante la curva de

crecimiento con todas las mediciones necesarias para este fin (concentración de
bacterias, absorbancia, temperatura).
Se realiza la descripción del desarrollo de las corridas experimentales,

indispensables para el estudio de la cinética de inactivación, así como también
ensayos adicionales que completan dicho estudio. Se presentan además,
resultados significativos para el posterior análisis de datos y para el modelado
cinético.
IV.1. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Los ensayos experimentales se realizan en un reactor batch, anular,

mezcla perfecta (Figura I V.1)
El reactor está compuesto por:
 Un tanque reservorio de acrílico de 2000 cm 3 de volumen con

camisa refrigerante.
 Un baño termostático (HAAKE) que mantiene la temperatura del

líquido constante a 20°C.
129
EXPERIMENTAL
Figura IV.1. Dispositivo Experimental
El tanque posee un sistema de agitación orbital mecánico hecho a medida

y fuerte, garantizando un eficiente e inmediato mezclado, las características se
pueden ver resumidas en la Tabla I V. 1. Además cuenta con dos orificios
adicionales por donde se realizan la toma de muestras y la medición de
temperatura. Las conexiones entre los elementos del sistema están hechas con
mangueras de silicona.
En las corridas experimentales, donde se utiliza radiación, el dispositivo

fue irradiado con una lámpara tubular Philips TUV (15 W) que se encontraba en
el espacio anular del reactor, separada del líquido por un tubo concéntrico de
cuarzo (ver Figura I V.1). Esta es una lámpara de baja presión de vapor de
mercurio, conocida como germicida, que produce la mayor parte de su emisión
a 253,7nm. El pasaje de luz pudo controlarse debido a la existencia de un
interruptor de encendido/ apagado.
130
EXPERIMENTAL
Tabla IV.1. Características del Dispositivo Experimental

Parámetro Valor
Volumen Total 2000 ml
Radio Interno 3,7 cm
Radio Externo 7,5 cm
Una corrida experimental típica consta de varias etapas que se describen

a continuación:
1. Acondicionamiento del dispositivo experimental. Lavado y

desinfección-. Para ensayos experimentales con UV se encienden las
lamparas30 minutos antes para lograr la estabilidad del sistema.
2. Preparación del inóculo final.
3. Valoración de la solución comercial de APA 15% (v/ v).
4. Preparación de la solución de trabajo (Agregado del volumen de APA

correspondiente).
5. Toma de M uestra.
6. Siembra de las muestras.
7. I ncubación de las muestras.
8. Determinación de la concentración de APA residual.
9. Recuento de bacterias viables.
Previamente a la corrida experimental se debe contar con:
i. Los medios de cultivos seleccionados para el crecimiento de las UFC.
ii. Los tubos con agua de peptona para las diluciones seriadas.
iii. La bacteria incubada a estufa durante al tiempo y temperatura

requeridos(inoculo final)
131
EXPERIMENTAL
IV.1.1. ACONDICIONAMIENTO DEL DISPOSITIVO

EXPERIMENTAL:
Antes de cada corrida se desinfecta el equipo experimental realizando

lavados exhaustivos del reactor y de las mangueras conectoras. Primero se
realizan dos lavados con hipoclorito de sodio al 1%, luego un lavado con alcohol
70% y por último reiterados lavados con agua destilada estéril (tres lavados
mínimo) para garantizar que sean barridos los restos de contaminantes.
Una vez terminado el lavado, se enciende la lámpara UV durante 30

minutos para estabilizarla (en el caso de corridas con UV) además de inactivar
cualquier agente que pueda causar contaminación de la muestra a estudiar.
IV.1.2. PREPARACIÓN DEL INÓCULO BACTERIANO
La cepa ATCC se encuentra liofilizada por lo tanto, antes de comenzar

con la manipulación de la bacteria para la corrida experimental se debe efectuar
la reactivación de la misma.
El medio de cultivo complejo que se utiliza es el Caldo Nutritivo cuya

composición y especificaciones serán detalladas en el apartado I V.3 de este
capítulo. La cepa a utilizar se encuentra en el inicio de la fase estacionaria.
IV.1.2.1. REACTIVACIÓN DE LA CEPA:
Partiendo del liofilizado se introduce la muestra del hisopo en un tubo de

ensayo con 10 ml de caldo nutritivo estándar (20 g/ l) y se incuba en una estufa
de cultivo (Tecno Dalvo M CI 8) a 37°C durante 24 hs. Luego de este cultivo se
toman 2 cm 3 y se colocan en un tubo con 10 cm 3 de caldo nutritivo; este último
paso se realiza en tres tubos más y se incuban a 28°C durante 18 hs. De esta
manera se tiene la certeza que la cepa esta reactivada.
132
EXPERIMENTAL
Una vez la célula bacteriana es viable, se realizan ensayos para verificar la

pureza de las cepas en estudio.
IV.1.2.2. CONSERVACIÓN DE LA CEPA:
Para conservar la cepa en el laboratorio se procede de la siguiente

manera: cada uno de los tubos obtenidos después de la reactivación se siembra
por triplicado en tubos estrías con caldo nutritivo agarizado para posteriores
repiques. Estos tubos pueden conservarse en la heladera entre 4°C y -6°C sin
que se afecte la viabilidad de la bacteria.
IV.1.2.3. CONSERVACIÓN POR CONGELACIÓN: FUNDAMENTOS.
Para conservar la cepa y evitar mutaciones y contaminación, se recurre a

los métodos de criopreservación, estos pueden ser liofilizado o congelación. Los
tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas
microbianas en los laboratorios de microbiología son: i) que el cultivo a
conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación; ii) que durante el tiempo de conservación sobrevivan
al menos el 70-80% de las células, y por último, iii) que estas células
permanezcan genéticamente estables. En este trabajo experimental se utilizó un
método de conservación a largo plazo. Este método es uno de los más
recomendados para preservar las bacterias: se paraliza el crecimiento de las
células microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la
estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente

crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados
con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua
en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células
así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Los tres factores que
133
EXPERIMENTAL
influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este

método son los siguientes:
1) Edad de las células: En la mayoría de los casos conviene utilizar

células maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento,
pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algún estado
que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar
este estado.
2) Velocidad en la congelación y descongelación: Aunque hay
pr ogr amas de congel aci ón bi en est andar i zados par a det er mi nados casos
o ci r cunst anci as, en gener al es m ej or que l as var i aci ones de l a
t emper at ur a sean r ápi das, t ant o par a l a congel aci ón como par a l a
descongel aci ón, por l o que par a descongel ar convi ene poner l as cél ul as a
37º C.
3) Empleo de agentes crioprotectores: Est as sust anci as pr ot egen
del daño que se pueda pr oduci r en l as cél ul as mi cr obi anas en el moment o
de l a congel aci ón. Exi st en muchos compuest os que se pueden ut i l i zar
como cr i opr ot ect or es, per o el que se ut i l i za con m ás fr ecuenci a es el
gl i cer ol , a una concent r aci ón del 15 al 20 %.
Si la cepa está pura, de la estría que se encuentra a 4°C se saca una

ansada y se la coloca en un tubo con 10 cm 3 de caldo nutritivo, se incuba a 28°C
durante 24 hs. Luego se coloca una ansada en un tubo con 10 cm 3 de caldo
nutritivo y se incuba 24 hs. Se toma este último tubo, se coloca el cultivo en un
erlenmeyer, se completa con caldo nutritivo hasta un volumen de 150 ml y se
incuba 25-30 hs, que como se explicará posteriormente, es el tiempo en que la
bacteria llega a la fase estacionaria de crecimiento. Este cultivo final se utiliza
posteriormente para realizar la corrida experimental, previa dilución con
solución fisiológica. En cada etapa del proceso se debe verificar la pureza del
cultivo mediante una observación microscópica (coloración de Gram) y una
siembra en medio EM B observar las colonias típicas
134
EXPERIMENTAL
IV.1.3. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO

PERACETICO Y PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN LA SOLUCIÓN
COMERCIAL:
Los métodos más ampliamente utilizados para el análisis de las

soluciones que contienen APA y H 2O2 son unos métodos de D'Ans y Frey (1914)
y su modificación por Greenspand y M ckellar (1951), en estas técnicas, se valora
primero el H 2O2 con permanganato de potasio y el APA residual se determina a
continuación mediante la adición de yoduro de potasio a la solución que se
titula con tiosulfato de potasio. La determinación precisa de APA se requiere
para monitorear los niveles de APA presente en la mezcla cuaternaria de
equilibrio.
En la tabla I V.2 se indican los reactivos químicos empleados en este

trabajo, indicando su fórmula química, procedencia, grado de pureza y
utilización en los distintos procesos y métodos analíticos utilizados.
135
EXPERIMENTAL
Tabla IV.2. Reactivos Utilizados durante la titulación de la solución comercial de APA
PRODUCTO FORMULA ORIGEN TIPO UTILIZACION

QUIMICA
Solución comercial CH3CO3H Ciagro Solución a analizar.
de Ácido
Peracético
Ácido Sulfúrico H2SO4 Cicarelli 98% pureza Titulación de la
solución comercial-
acidez
Solución de Cicarelli 1% Indicador
Almidón
Solución de KMnO4 Cicarelli Pro-análisis Titulación de la
permanganato de solución comercial-
potasio (0,1 N) indicador
Solución de Na2S2O3 Cicarelli Pro-análisis Titulación de la
tiosulfato de sodio solución comercial-
(0,1 N) indicador
Ioduro de potasio IK Cicarelli Pro-análisis Titulación de la
solución comercial
IV.1.3.1 DETERMINACIÓN DEL TITULO DE LA SOLUCIÓN DE APA 15%.
En primer lugar se realiza una dilución 1/ 200 de la solución comercial de

APA 15%. Se agregan 5 ml de solución comercial con una volpipeta a un matraz
de 1000 ml y se enraza con agua destilada. Esta es nuestra solución de trabajo.
Titulación de H2O2 con KMnO4 0,1 N.
En solución ácida el peróxido de hidrógeno reduce una solución de

KM nO4 de concentración conocida (SPS), con formación de O2. Cumpliéndose:
meq KM nO4 ≡ meq H 2O2.
136
EXPERIMENTAL
Reacción química:
2(8 H + + 5e- + MnO -4 → Mn 2+ + 4 H 2 0)

5 (H 2 O 2 → 2 O 2 + 2 H + + 2 e- )
2 MnO -4 + 6 H + + 5 H 2 O 2 → Mn 2+ + 8 H 2 0 + 10O 2
Técnica Operatoria:
Se toma una alícuota de la dilución, con una volpipeta de 10 ml, se coloca

en un erlenmeyer, al cual se le añaden: 6 ml de H 2SO4 1:8 (4N) para obtener pH
ácido. Luego se titula con KM nO4 de normalidad conocida, hasta el primer
rosado permanente. Se realizan 2 determinaciones.
Cálculos:
Para calcular la concentración, se tiene en cuenta los volúmenes leídos en

la bureta en cada una de las dos determinaciones.
Vgastado (ml)x N KMnO4 (meq/ml)x Peq H2 O2 (meq/ml) x 1000 (ml/L)

ppm H 2 O 2 =
Vvp (ml)
Titulación de PAA con Na2S2O3 0,1 N.
La concentración de ácido peracético se determina yodométricamente. Se

toma una alícuota de la muestra (en este caso es la alícuota que se tituló con
KmnO4), se le añade KI en exceso en medio ácido, y el I 2 liberado es titulado con
una solución patrón secundario de Na2S2O3. Cumpliéndose: meq S2O3- ≡ meq I 2
≡ meq APA. (Los resultados de las titulaciones se encuentran en el Anexo 2
(Experimental).
137
EXPERIMENTAL
Reacciones químicas:
1. Reacción de Oxidación:
CH 3 COOOH+2e - +2H + → CH 3 COOH+H 2 O

2I- → I 2 +2e-
CH 3 COOOH+2H + +2I - → CH 3 COOH+H 2 O+I 2
2. Reacción en la titulación:
I 2 +2e- → 2I
S2 O3-2 → S4 O -24 +2 e-
2S2 O3-2 +I 2 → S4 O -24 +2I 2
Técnica Operatoria:
Se toma una alícuota de la dilución, con una volpipeta de 10 ml, se coloca

en un erlenmeyer, al cual se le añaden 150 µl de KI (0,4 g/ L).
Luego se titula con Na2S2O3 de normalidad conocida, cuando la solución

pasa de marrón pardo a amarillo tenue, se agregan 2 ml de solución de almidón
1% (indicador) hasta observar un color oscuro, marrón-azulado. Se continúa
titulando lentamente hasta incoloro. Se realizan 2 determinaciones (Figura I V.2
a y I V.2.b).
Cálculos:
Para calcular la concentración, se tiene en cuenta los volúmenes leídos en

la bureta en cada una de las dos determinaciones
Vgastado (ml)x N N2S2 O 3 (meq/ml)x Peq APA (meq/ml) x 1000 (ml/L)

ppm APA=
Vvp (ml)
138
EXPERIMENTAL
Figura IV.2. a) Titulación con Permanganato; IV.2. b) Titulación con Ioduro
IV.1.4 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE TRABAJO
Una vez determinada la concentración de APA y de HP, se procede a

realizar la corrida experimental.
En un matraz de 2000 ml se agrega el volumen correspondiente de APA

1/ 200 y se enraza con solución fisiológica.
Una vez lista la solución se vierte en el reactor, se agita, y luego se

agregan los 2 ml de suspensión de E. coli de 24 hs de incubación.
IV.1.5 TOMA DE MUESTRA.
Las muestras se toman en frascos color caramelo estériles que contienen

200 µl de Tiosulfato de sodio 0,1N y 500 µl de catalasa al 0,01%. Ambas
concentraciones fueron calculadas cuantitativamente para inhibir la acción de
los agentes oxidantes y no dañar la concentración bacteriana. Luego de 10
minutos se procede a sembrar en placas de Eosina Azul de M etileno (EM B, por
sus siglas en inglés) en flujo laminar (Nuare, Un 425-400E)
139
EXPERIMENTAL
La grilla experimental para las corridas de la solución comercial de APA-

UV están detalladas en la tabla I V.3 y las corridas experimentales de la solución
comercial de APA están detalladas en la tabla I V.4
Tabla IV. 3 Diseño Experimental: Solución comercial APA+UV
Número de Tipo de Concentración Concentración Tiempos de toma

corridas lámpara de bacterias de muestra
del agente
(UFC cm-3 (segundos)
oxidante
3 15 W 1 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
3 15 W 2 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
3 15 W 3 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
3 15 W 4 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
3 15 W 5 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
3 15 W 6 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
3 15 W 8 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
3 15 W 10 ppm 105 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
140
EXPERIMENTAL
Tabla IV.4 Diseño Experimental: Solución comercial APA

Número de Concentración Concentración Tiempos de toma de muestra
corridas del agente de bacterias (segundos)
oxidante (UFC cm-3)
3 1 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 1.5 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 2 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 3 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 4 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 5 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 6 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 8 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 10 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
3 15 ppm 105 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180,
210, 240, 270, 300.
IV.1.6 SIEMBRA DE LA MUESTRA:
Una variable muy importante en el estudio cinético de la desinfección es

la concentración de bacterias viables. Esta variable es indispensable para el
análisis del proceso de desinfección y la resolución del modelo, ya que se sigue
la evolución de la concentración del microorganismo para analizar el efecto del
ácido peracético y el UV (o la combinación de ambos).
Para determinar la concentración de bacterias presentes en las muestras

se optó por la técnica de recuento en placa por siembra en superficie. Este
método ofrece la ventaja de cuantificar únicamente los microorganismos viables
presentes en una muestra en términos de unidades formadoras de colonia
(UFC).
Partiendo de la muestra obtenida en el proceso de desinfección se

realizaron diluciones seriadas en tubos estériles con 9,0ml de Agua de Peptona
141
EXPERIMENTAL
(Biokar® ). Utilizando la pipeta de 1,0ml con punta estéril, se transfirió

asépticamente 1,0ml de la muestra de E.coli a un primer tubo con 9,0ml de
Agua de Peptona estéril (dilución 1/ 10). Se retiro la punta de pipeta y se desecho
en un contenedor con Hipoclorito de sodio 1%. Se mezcló la suspensión con un
vortex durante unos segundos. Con una nueva punta de pipeta estéril, se
transfirió 1,0 ml al siguiente tubo de dilución (dilución 10 -2) y se mezcló en
vortex. Se repitió el paso anterior, sucesivamente, hasta obtener la dilución 10 -6.
Una vez obtenidas las diluciones sucesivas de la muestra se procedió a realizar
la siembra en superficie en placas de petri estériles con medio EM B (2 placas
por dilución). Se sembró 0,1ml de cada dilución esparciendo la muestra en todas
las direcciones con una espátula de Drigalsky estéril, en la figura I V. 3 a y b se
puede observar parte del proceso de siembra de la muestra.
Figura IV.3. a) acondicionamiento de la muestra. b) siembra de la muestra.
142
EXPERIMENTAL
IV. 1. 7. INCUBACIÓN DE LAS PLACAS:
Una vez realizada la siembra de todas las muestras, estas se incubaron en

posición invertida a 37°C durante 24 horas en una estufa de cultivo. (Figura
I V.4)
Figura IV.4. a) Medios de Cultivo para siembra; b) Incubación de placas invertidas de Ps

aeruginosa
IV.1.8. RECUENTO DE BACTERIAS:
Tras la incubación, se observaron las colonias bacterianas sobre la

superficie del agar. Se seleccionaron las placas de la dilución que produjo un
número de colonias comprendido entre 30–300 y se contó el número de
colonias presentes. El resultado se expresó como UFC/ ml para lo cual se
multiplico el promedio del número de colonias por la inversa de la dilución final
de la muestra.
IV.1.9. DETERMINACIÓN DEL APA RESIDUAL
La concentración de APA residual se determinó mediante el método del

DPD (N,N – dietil – p – fenilendiamina) para lo cual se utilizó un kit comercial
de determinación de cloro total (Hach #8167)(Howarth et al., 2010). El kit
143
EXPERIMENTAL
consiste en sobres de reactivo en polvo que contienen DPD, ioduro de potasio

(KI ) y buffer para mantener el sistema de reacción a pH 6,2.
En presencia del ión ioduro (I -), una solución tamponada de APA oxida
cuantitativamente el ioduro (I -) a iodo (I 2), este último reacciona con el DPD
formando un compuesto de color purpura cuya intensidad es proporcional a la
concentración de APA presente en la solución.
IV.1.9.1. CURVA DE CALIBRADO:
Para la construcción de la curva de calibrado se partió de una solución de

APA de concentración conocida (se inhibió el peróxido de hidrógeno mediante
el agregado de catalasa bovina 0,1%). Se prepararon diluciones seriadas de la
solución con agua destilada en matraces de 100ml para obtener concentraciones
de 0,05 a 2 mg de APA/ L (Rango del Kit). Se tomaron 10ml de cada dilución a
los cuales se les agregó el contenido de un sobre de reactivo en polvo, se mezcló
durante 30 segundos y se midió la absorbancia a 530nm. (Figura I V.5. a. b y c
figura I V.5 curva de calibrado y consumo de APA durante los ensayos
experimentales)
Figura IV.5 a. Determinación en el espectrofotómetro Boeco S-22.Vis
144
EXPERIMENTAL
Figura IV.5. b. Distintas concentraciones de APA: mayor intensidad=mayor

color
Figura IV.5.c. Consumo de APA durante los ensayos experimentales
145
EXPERIMENTAL
IV.2. TÉCNICAS ANALÍTICAS COMPLEMENTARIAS.
En este inciso se detallaran las técnicas analíticas realizadas

adicionalmente a los ensayos experimentales y que completan el estudio de esta
tesis doctoral.
IV.2.1. MÉTODO DE ADICIÓN DE CATALASA PARA LA

ELIMINACIÓN DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO. FUNDAMENTOS
TEÓRICOS.
El método de adición de Catalasa emplea catalasa de hígado de bovino

(Sigma-Aldrich 2300 unidades/ mg), que es una enzima capaz de neutralizar
formas tóxicas derivadas del oxígeno (como el H 2O2), que se forman en los
ambientes acuosos que contienen oxígeno disuelto, como el citoplasma de las
células. La catalasa (Figura I V.6) convierte el peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno molecular (M arín Galvín, 1999). Una unidad de catalasa descompone
1.0 μmol de peróxido de hidrógeno por minuto a pH 7 y a 25º C
aproximadamente (Figuras I V.7 a y I V.7.b)
IV.2.1. 1. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: ADICIÓN DE CATALASA
En primer lugar se prepara una disolución de catalasa a una

concentración de 0.1 g/ L con agua destilada. La preparación de esta disolución
debe realizarse cada dos días de forma que se mantenga la actividad de la
catalasa. Además, esta enzima se inactiva a pH por encima de 8 y por debajo de
5, con lo que las muestras a las que se pretende añadir catalasa deben de ser
previamente neutralizadas a un pH entre 6 y 7. Normalmente se añade unas
tres veces más catalasa de la necesaria para eliminar el peróxido de hidrógeno
presente en las muestras y garantizar una actividad satisfactoria. Para ello se
establece una adición de 0.5 mL de la disolución de catalasa a unos 25 mL de
muestra y un tiempo de reacción de 10 minutos, para eliminar una
concentración de 20 mM de H 2O2.
146
EXPERIMENTAL
Figura IV.6. Cristales de Catalasa observados en el microscopio Leica DM 500 (10X)
Figura IV.7. a y b) Cristales de catalasa luego de reaccionar con peróxido de hidrógeno.

Microscopio Leica DM 500 (10x)
147
EXPERIMENTAL
IV.2.1.2 EFECTO DEL pH EN LA CATALASA DE Aspergillus niger

UTILIZADA
La catalasa del Asper gillus niger es eficaz bajo un rango muy amplio de
pH y de temperatura, y a concentraciones de peróxido de hidrógeno más altas
que la catalasa obtenida de fuente animal. La Catalasa del Asper gillus niger es
especificado en 1000 Unidades Baker por ml.
La Catalasa del Asper gillus niger tiene su actividad óptima (probado a

25°C, 1.5 % H 2O2) en aproximadamente pH 3 a 9. Arriba de pH 7.0, la actividad
disminuye, pero aún en pH 10, más del 50 % de la actividad permanece. En la
figura I V. 8 se puede observar la actividad de la catalasa a diferentes
concentraciones de pH .
Figura IV.8 Actividad de la catalasa de Aspergillus niger a diferentes valores de

pH.
148
EXPERIMENTAL
IV. 2.2. ANÁLISIS DE ESTABILIDAD DE LA SOLUCIÓN DILUIDA

DE APA.
Se evaluó la estabilidad de una solución diluida de APA (4 ppm) durante

9 días. La elección de la concentración corresponde al rango de concentraciones
de APA utilizadas para desinfectar aguas. Se preparó la solución la solución de
acuerdo a lo señalado en el punto I V.1.4 de este capítulo y se determinó
diariamente su concentración de acuerdo a lo detallado en el punto I V.1.9. Se
mantuvo aislada, en un recipiente color caramelo durante 9 días.
La solución no varió su concentración durante 6 días, permaneciendo

estable, luego se redujo un 40%. El ensayo se realizó por duplicado, en la figura
I V.8 se observan los resultados obtenidos.
Figura IV.9. Análisis de Estabilidad de la Solución diluida en el tiempo
En las reseñas bibliográficas, se postula que la descomposición del APA

se puede realizar por 3 formas diferentes:
1. Por hidrólisis:
CH 3COOOH + H 2 O → CH 3COOH + H 2 O 2 (IV.1)
149
EXPERIMENTAL
2. Descomposición espontánea:
2CH 3COOOH → 2CH 3COOH + O 2 (IV.2)

3. Descomposición catalizada por metales de transición
+
CH 3COOOH 
Mn 
→ CH 3COOH+ O 2 + otros productos (IV.3)
De acuerdo a Koubet (1964) y Yuan (1997 ), la descomposición del APA, a

un pH cercano a la neutralidad puede estar representada por el siguiente
esquema:
Este mecanismos fue propuesto para un rango de pH entre de 5.9 a 10.2.

Se propone que el anión perácido juega un papel como nucléofico y el sitio
electrófilo es el carbono carbonilo.
Otros estudios (Ball et al., 1956; 1967) sobre la descomposición

espontánea de diversos perácidos mostraron que la velocidad de desaparición
del perácido (RCOOH ) era de primer orden con respecto a la concentración
de anión perácido ( ROO-), y la velocidad de descomposición alcanza su máximo
cuando el pH es igual a el pKa del perácido.
Para la solución en estudio, y debido a la concentración de agua presente

en la solución cuaternaria de equilibrio (40-42% de agua), la opción de la
hidrólisis es la que más representa/ se asemeja a las condiciones experimentales,
esta hidrólisis no afecta a los fines prácticos la capacidad desinfectante del APA,
ya que los requisitos de estabilidad para los desinfectantes de agua
convencionales (como el cloro) se determinan a las 10 horas de aplicado el
mismo. Como ha sido probado experimentalmente la solución comercial de APA
se mantiene estable por 6 días.
150
EXPERIMENTAL
IV.3. TECNICAS MICROBIOLOGICAS:
IV.3.1. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS.

FUNDAMENTOS. CARACTERÍSTICAS
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento

y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de
los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los
microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy
grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma
deshidratada por lo que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de
cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y re-disolverla en agua
destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden
al resto de los componentes previamente esterilizados en el autoclave.
Para los microorganismos utilizados en esta tesis doctoral se utilizaron

los medios cultivos recomendados para tal fin, optándose por Agar EM B para
Escher ichia coli y para Agar Cetrimide para Pseudomonas aer uginosa.
IV.3.2. MEDIO DE CULTIVO PARA Escherichia coli
El Levine EM B Agar es un medio adecuado para la búsqueda y

diferenciación de bacilos entéricos, a partir de muestras clínicas, aguas servidas,
y otros materiales.
Es recomendado por la American Public H ealth Association, (APHA)

para el análisis microbiológico de productos lácteos y alimentos, y por la
convención farmacopea de los Estados Unidos (USP) para la realización de los
ensayos de límites microbiológicos.
La fórmula original de este medio de cultivo combina las fórmulas de

Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el
aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram
151
EXPERIMENTAL
negativos, la modificación de Levine fue modificar la sacarosa e incrementar la

concentración de lactosa, lo que permite una mejor diferenciación de E. coli.
Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de

enterobacterias. Es nutritivo por la presencia de peptona que favorece el
desarrollo microbiano. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la
lactosa y/ o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los
indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre
una amplia variedad de bacterias Gram positivas. El agar es el agente
solidificante.
Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de

color azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por
microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras.
Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y

levaduras, pueden crecer, originando colonias incoloras y puntiformes. Este
medio de cultivo, es útil para la orientación y no confirmación de especies
bacterianas (ya que numerosas cepas de Citr obacter spp. producen colonias con
brillo metálico), por lo cual es necesario realizar pruebas bioquímicas, para la
identificación de género y especie.
M uchas cepas de Escher ichia coli y Citr obacter spp. presentan un

característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro
oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son
incoloras. La composición de Agar EM B se observa en la tabla I V. 5
152
EXPERIMENTAL
Tabla IV.5. Formula EMB Agar (Levine) en gramos/litro

Peptona 10.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Fosfato dipotasico 2.0
Eosina 0.4
Azul de metileno 0.065
Agar bacteriologico 15
pH FinAL: 7.2 ± 0.2
Almacenamiento y Conservación del Medio de Cultivo
El medio deshidratado debe conservarse en un rango de temperatura de

10-35 º C en un sitio libre de humedad y a resguardo de las radiaciones. Una vez
preparado, debe conservarse en heladera, en un rango de temperatura de a 2-8
º C.
Instrucciones para la preparación del medio
Se deben suspender 37.5 g del polvo en 1 litro de agua purificada.

Calentar con agitación frecuente y llevar a ebullición hasta su disolución total.
Esterilizar en autoclave 121°C durante 15 minutos distribuir en placas de Petri
estériles.
Siembra e Incubación
El sembrado es directo, estriando la superficie o a partir de un caldo

enriquecido. La incubación es de 18-24 horas a 35-37 º C en condiciones de
aerobiosis.
153
EXPERIMENTAL
Morfología de las Colonias.
Una vez cumplido el tiempo de incubación, se procede al recuento y

observación de las colonias, en la tabla VI .6 se detallan las características de
crecimiento que presentan las bacterias en este medio (ver Figura I V.9)
Tabla IV.6 Morfología de las colonias en EMB agar.
Microorganismos Crecimiento Características de las colonias
Escherichia coli ATCC Bueno a excelente Verdosas con brillo metálico y centro
negro azulado
P. aeruginosa ATCC Bueno a excelente Incoloras
Figura IV.10 Colonias características de E.coli en EMB Agar
IV.3.3. MEDIO DE CULTIVO PARA Pseudomonas aeruginosa.
El Agar Cetrimide es un medio utilizado para el aislamiento selectivo de

Pseudomonas aer uginosa y de otras especies del género. Su fórmula cumple
154
EXPERIMENTAL
con los requerimientos de las Farmacopeas Europea, Japonesa y de los Estados

Unidos de Norteamericana (EP, JP y USP respectivamente).
Su formulación permite el crecimiento selectivo de Pseudomonas

aer uginosa y estimula la formación de pigmentos. A este medio debe
agregársele glicerina, para cumplir con el aporte de los nutrientes para el
desarrollo microbiano, el cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven
la formación de pio-cianina, pioverdina, piomelanina y fluoresceína de P.
aer uginosa. La cetrimida es un detergente catiónico que actúa como agente
inhibidor, libera el nitrógeno y el fósforo de las células de casi toda la flora
acompañante, aunque inhibe también algunas especies de Pseudomonas. El
agar es el agente solidificante.
La fórmula del Agar Cetrimide se detalla en la tabla I V.7
Tabla VI.7. Formula del Agar Cetrimide en gramos /Litro

Digestiòn de gelatina pancreatica 20.0
Cetrimide 0.3
Cloruro de Magnesio 1.4
Sulfato de Potasio 10.0
Agar bacteriologico 15
pH FINAL: 7.2 ± 0.2
Almacenamiento y conservación
EL medio deshidratado debe conservarse en un rango de temperatura de

10-35 º C en un sitio libre de humedad y a resguardo de las radiaciones. Una vez
preparado, debe conservarse en heladera, en un rango de temperatura de a 2-8
º C.
155
EXPERIMENTAL
Instrucciones para la preparación
Se deben suspender 46,7 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Agregar

10 ml de glicerina. Dejar reposar 5 minutos. Calentar agitando frecuentemente y
hervir durante 1 minuto para disolución total. Distribuir en tubos u otros
recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121 º C durante 15 minutos.
Siembra e Incubación.
El sembrado es directo, estriando la superficie o a partir de un caldo

enriquecido. La incubación es de 18-24 horas a 35-37 °C, en condiciones de
aerobiosis.
Morfología de las colonias
Las colonias de Pseudomonas en Agar cetrimite presentan un color verde

brillante (ver figura I V.10). Una vez cumplido el tiempo de incubación, se
procede al recuento y observación de las colonias, en la tabla VI .8 se detallan las
características de crecimiento que presentan las bacterias en este medio.
Tabla IV.8. Morfología de las Colonias en Agar Cetrimide

Microorganismos Crecimiento Características de las
colonias
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bueno - excelente Verde fluor
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Inhibido
Figura IV.11. Colonias de Pseudomonas aeruginosa en Agar cetrimide
156
EXPERIMENTAL
VI.3.4. MEDIO DE CULTIVO PARA REACTIVACIÓN Y

CONSERVACIÓN: CALDO NUTRITIVO
El caldo nutritivo es un medio de cultivo utilizado para propósitos

generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos
nutricionales. Está descripto en muchos procedimientos para el análisis de
alimentos, aguas y otros.
M edio no selectivo, contiene triptona y extracto de carne que constituyen

la fuente de carbono y nitrógeno necesarias para el adecuado desarrollo
bacteriano.
Puede ser utilizado además, como pre-enriquecimiento en la búsqueda de

Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar células
dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias. La composición del
caldo nutritivo se describe en la tabla I V.9
Tabla IV.9 Formula en gramos /litro del Agar Nutritivo

Triptona 10
Extracto de carne 5
Cloruro de Sodio 5
pH FINAL: 7.2 ± 0.2
Instrucciones para la preparación
Suspender 20 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos

y calentar con agitación frecuente, llevando a ebullición para disolución total.
Distribuir en tubos u otros recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 minutos.
157
EXPERIMENTAL
Siembra e Incubación
La siembra es directa a partir de la muestra en estudio. Si se trabaja con

hisopo, descargar el contenido del mismo en este medio de cultivo. En
aerobiosis, a 35-37 º C durante 18 a 24 horas.
Crecimiento de las colonias
El crecimiento de las colonias se detalla en la tabla I V.10
Tabla IV.10 Morfología de colonias en caldo nutritivo

Microorganismos Crecimiento
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 satisfactorio
Escherichia coli ATCC 25922 satisfactorio
Staphylococcus aureus ATCC 25923 satisfactorio
IV.3.5 MEDIO LÍQUIDO PARA DILUCIONES: AGUA DE PEPTONA.
El agua de peptona es usada como diluyente y para enriquecimiento

bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interés sanitario.
M edio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en

lugar de solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas
por procesos fisicoquímicos. La concentración del agua de peptona, en
gramos/ litros es peptona de carne 10 gramos/ litro, cloruro de sodio 5
gramos/ litro.
Preparación:
Suspender 15 g de polvo en 1 litro de agua destilada. M ezclar bien y

distribuir. Esterilizar en autoclave a 121 º C durante 15 minutos.
158
EXPERIMENTAL
Siembra:
Por inoculación directa del material en estudio. Como diluyente: realizar las
diluciones 1:10 y 1:100, dependiendo del uso que se le quiera dar.
Incubación:
Aeróbica, a 35-37 º C durante 18-24 horas.
Almacenamiento:
M edio deshidratado: a 10-35 º C. M edio preparado: a 2-8 º C.
VI.4. TRATAMIENTO DE LAS CEPAS EN ESTUDIO.
Como ya se detalló, ambas cepas ATCC se adquirieron liofilizadas por lo

tanto, antes de comenzar con la manipulación de la bacteria para los ensayos
experimentales, como E.coli fue el principal microorganismos estudiado, para
verificar su pureza se realizaron pruebas de coloración y pruebas bioquímicas
específicas.
VI.4.1. TÉCNICAS DE TINCIÓN GRAM
El procedimiento para la tinción de Gram distingue 2 grupos de células.

Las que retienen el colorante primario son llamadas “Gram positivo” y las que
pierden el color primario y toman otro colorante de contraste, llamadas “Gram
negativas”. El mecanismo se basa en las características fisicoquímicas de las
estructuras de la pared celular de los microorganismos (desarrollado en el
Capítulo I I ).
El procedimiento para la tinción se detalla a continuación:
1. Preparar y fijar un frotis de la muestras por analizar pasándola

suavemente en la flama del mechero.
2. Cubrir con colorante de violeta de genciana. Esperar 1 minuto.
159
EXPERIMENTAL
3. Escurrir el colorante de violeta de genciana sin enjuagar y cubrir con

solución Gram yodo. Esperar 1 minuto.
4. Lavar con solución de alcohol acetona hasta decoloración.
5. Cubrir el frotis con colorante de safranina. Esperar 1 minuto.
6. Lavar repetidas veces con agua corriente hasta que no haya restos del
colorante.
7. Secar al aire y observar al microscopio de luz.
8. Preparación de un frotis
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de

una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los
microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil
obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al
vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que
permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea
arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace
que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos
posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que
pudiera haber.
Realización del frotis
Se coloca una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos

limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa
de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una
mínima gota de agua, que resulta suficiente.
Se flamea el ansa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una

pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota
de agua. Remover la mezcla con el ansa de siembra hasta formar una
suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
160
EXPERIMENTAL
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario

realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de
la suspensión bacteriana, que se toma con el ansa de siembra, directamente
sobre el portaobjetos.
Se debe esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación

acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha
precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden
deformarse o romperse.
Fijación de las bacterias al portaobjetos
La fijación se realizó por dos técnicas diferentes:
Por calor (cuando se tomó muestras bacterianas de medio sólido): Se hizo

pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos.
Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido): Se añadieron

unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Para esta técnica
se debe golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de
trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol
se evapore completamente.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones

pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal
es continuar con el proceso de tinción en la figura I V. 12. se observan los pasos
detallados.
161
EXPERIMENTAL
Figura IV.12 a) preparación de porta objetos con agua, b) toma de muestra para la tinción;
c) fijación a la llama
Examen microscópico de la tinción
Se realiza luego el examen microscópico de células vivas y de frotis teñido

por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo
en estudio. También es importante determinar la agrupación y otras
características morfológicas de interés.
En la figura I V.13 a y b se observan las colonias típicas de E.coli y P.

aer uginosa luego de la tinción Gram.
IV.13 a). E. coli (Gram -) IV.13.b) Ps aeruginosa (Gram -)
162
EXPERIMENTAL
IV.4.2. PRUEBAS BIOQUIMICAS
Se realizan pruebas secundarias y terciarias para determinar las especies.
IV.4.2.1. PRUEBAS IMVIC PARA Escherichia coli
Son cuatro pruebas que se utilizan para distinguir bacterias coliformes

entre sí. Las pruebas son: I ndol, Rojo de M etilo, Voges Proskauer y Citrato.
1) I nvestiga ción de la pr oducción de I ndol.
Con esta prueba bioquímica se mide la capacidad del microorganismo de

producir indol a partir de la molécula de triptofano. Sirve para diferenciar
Escher ichia coli y distintas especies del género Edw ar siella (+) de especies de
los géneros Salmonella, Klebsiella y Enter obacter (-).
Materiales:
 cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.
 tubos con caldo triptona.
 ansa.
 reactivo de Kovacs: alcohol amílico + paradimetilbenzal-dehído en

medio ácido.
Procedimiento:
i. I nocular tubos conteniendo caldo triptona. Dejar un tubo sin inocular

como control.
ii. I ncubar a 37 ° C durante 48 horas.
iii. Determinar la presencia de indol utilizando el reactivo de Kovacs.

Para ello, colocar en un tubo de ensayo 1 ml de medio, agregar 0,1 ml
de reactivo y dejar reposar hasta la formación de un anillo.
iv. Observar coloración. I nterpretación de los resultados
163
EXPERIMENTAL
Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa

alcohólica (corresponde a la formación de un compuesto quinónico coloreado
derivado del indol).
Prueba negativa: anillo amarillo en la superficie del medio en la capa

alcohólica (ausencia de indol en medio de cultivo).
2) Investigación de la producción de acetil metil carbinol (Voges

Proskahuer) y ácidos (rojo de metilo).
Con estas dos pruebas se estudia qué tipo de fermentación

(butilenglicólica o ácido mixta) realiza el microorganismo en estudio.
La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de

algunos organismos de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol
(acetoína) a partir de la fermentación (butilenglicólica) de la glucosa. Esta
prueba permite diferenciar Klebsiella pneumoniae y Enter obacter (+) de
Escher ichia coli y otras especies de Klebsiella (-).
La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un

organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de
la fermentación (ácido mixta) de la glucosa. Esta prueba permite diferenciar
Escher ichia coli (+) de distintas especies pertenecientes a los géneros
Enter obacter y Klebsiella (-).
Materiales:
 tubos con caldo glucosa fosfato.
 ansa.
 reactivos para la determinación de acetil-metil-carbinol (solución

alcohólica de naftol al 5% y
 KOH al 40%
 reactivos para la determinación de ácido (solución de rojo de

metilo 0,1%).
164
EXPERIMENTAL
Procedimiento:
i. I nocular tubos conteniendo caldo glucosa fosfato. Dejar un tubo sin

inocular como control.
ii. I ncubar a 37oC durante 48 horas.
iii. Dividir el contenido de cada uno de los tubos en dos partes iguales. En
una mitad, investigar la presencia de acetil-metil-carbinol y en la otra
la presencia de ácidos.
Para determinar acetil-metil-Carbinol:
i. Agregar 0.6 ml de solución alcohólica de naftol al 5%.
ii. Agregar 0,2 ml de solución de KOH al 40%.
iii. Agitar y dejar en reposo 5-10 minutos.
iv. Observar la coloración resultado.
Para determinar ácidos:
i. Agregar al cultivo 10 gotas de solución de rojo de metilo 0,1%.
ii. Observar la coloración.
Interpretación de resultados:
Voges-Proskauer
Prueba positiva: color rojo rosado en la superficie del medio (presencia

de acetoína).
Prueba negativa: sin cambio de color (color amarillo) en la superficie del

medio.
165
EXPERIMENTAL
Rojo de Metilo:
Prueba positiva: el cultivo es lo suficientemente ácido como para

permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un color rojo definido (pH=
4,4) en la superficie del medio.
Prueba negativa: color amarillo (pH= 6) en la superficie del medio.
3) Investigación del aprovechamiento de citrato
Se usa para determinar la capacidad del microorganismo para utilizar

citrato como única fuente de carbono.
Permite diferenciar especies de Salmonella, Klebsiella y Enter obacter

(+) de Escher ichia coli y especies de Edw ar siella, Yer sinia, Actinobacillus (-).
M ateriales:
 tubos con caldo citrato de Koser.
 ansa.
Procedimiento:
i. I nocular tubos conteniendo caldo citrato de Koser. Dejar un tubo sin

inocular como control.
ii. I ncubar a 37oC durante 48 horas.
iii. Observar la presencia o ausencia de crecimiento.
Interpretación del resultado:
Prueba positiva: hay crecimiento (turbidez).
Los resultados para Escher ichia coli puede observarse en la figura I V.14
166
EXPERIMENTAL
Figura IV.14. Pruebas bioquímicas para identificación de E.coli
IV.5. MEDIDA DE ABSORBANCIA DEL MEDIO DE CULTIVO
Es importante conocer a que longitud de onda absorben los medios de

cultivo con los que se prepara el inóculo bacteriano utilizado en las corridas
experimentales, especialmente cual es la absorbancia que tienen a la longitud de
onda utilizada en corridas experimentales con radiación UV germicida (253.7
nm). Para confirmar esa variable a cada uno de los medios de cultivo estériles se
lo sometió a un barrido espectral en el espectrofotómetro UV/ Vis (PERKI N-
ELM ER) Lambda 40.
El caldo nutritivo fue diluido 1/ 20 con solución fisiológica y el valor de

absorbancia a 253.7 nm es de 0.60 con una celda de 1 cm de paso óptico, es
decir un valor de 12 cuando el medio no está diluido (Figura I V. 15).
167
EXPERIMENTAL
4.0
3.6
3.2
208.71
2.8
2.4
Absorbancia
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4 250.3 270.11
0.0
190 200 220 240 260 280 300 320
Longitud de onda [nm]
Figura IV.15. Barrido espectral del medio: caldo nutritivo
Se podría concluir que a 253.7 nm la absorbancia es poca y esto no

interferiría entonces con la acción del UV sobre las bacterias, ya que no hay
competencia con el medio. Además el medio esta diluido, eso disminuye aun
más la absorbancia
IV.5.1 ESTABILIDAD ÓPTICA DEL MEDIO DE CULTIVO
Al ser el medio de cultivo una de las especies absorbentes, la variación de

su coeficiente de absorción durante una corrida experimental significaría un
inconveniente que se deberá tener en cuenta. Entonces es necesario verificar la
168
EXPERIMENTAL
estabilidad óptica del coeficiente de absorción del medio de cultivo cuando se lo

irradia con radiación ultravioleta.
Para ello, se trabaja con los dos medios de cultivos a utilizar en este caso.
El caldo nutritivo es diluido 1/ 20 con solución fisiológica (Roux-Ocefa), se lo
coloca en el dispositivo experimental, se lo hace circular y se encienden las
lámparas, irradiando de esta manera al cultivo. Se toman muestras a intervalos
regulares se las coloca en frascos color caramelo y se mide de cada una la
absorbancia a 253.7 nm.
En esta parte del trabajo se comprobó que los valores de las absorbancias
medidas se mantienen relativamente constantes durante un tiempo prolongado
(Figura I V.16)
Figura IV.16. Absorbancia del caldo de cultivo irradiado con UV.
169
EXPERIMENTAL
IV.6. ESTUDIO DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
IV.6.1. DEFINICIÓN DE CRECIMIENTO
En cualquier sistema biológico, el crecimiento puede ser definido como el

aumento ordenado de todos los componentes químicos. El aumento de masa,
por sí sólo, podría no indicar un crecimiento real, ya que las células pueden
estar incrementando únicamente su contenido de productos de reserva, tales
como el glucógeno o el polihidroxibutirato. En un medio adecuado, y al cual se
han adaptado perfectamente, las bacterias se encuentran en un estado de
crecimiento equilibrado. Durante un período de crecimiento equilibrado, una
duplicación de la biomasa va acompañada de una duplicación de todas las
demás propiedades medibles de la población, por ejemplo, proteínas, ARN,
ADN y agua intracelular. En otras palabras, los cultivos en crecimiento
equilibrado mantienen una composición química constante. La existencia del
crecimiento equilibrado simplifica la tarea de medir la velocidad de crecimiento
de un cultivo bacteriano; como la velocidad de crecimiento de todos los
componentes de la población es la misma, la medida de cualquier componente
basta para determinar la velocidad de crecimiento (Stanier et al., 1985).
IV.6.2. CURVA DE CRECIMIENTO
Cuando se trabaja con una bacteria en particular, en este caso la E. coli,

es fundamental la realización de una curva de crecimiento en un sistema
cerrado representando así lo que ocurre en la naturaleza.
Esta curva tiene un importante significado por dos razones; una es

conocer el tiempo de generación de la bacteria para así conocer su velocidad de
crecimiento (o viceversa) y otra es conocer el tiempo en que llega a la fase
estacionaria, que como se ha mencionado, el inicio de esta etapa es el elegido
para realizar las corridas experimentales.
170
EXPERIMENTAL
Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento

exponencial a altas velocidades durante largo tiempo. La razón es obvia, si se
consideran las consecuencias del crecimiento exponencial. Al cabo de 48 horas
de crecimiento exponencial, una sola bacteria con un tiempo de duplicación de
20 minutos podría originar una descendencia con un peso total de 2.2 x 10 31
gramos (el peso de una célula bacteriana de tamaño medio es de 10-12 gramos),
es decir, unas 4000 veces el peso de la Tierra (Stanier et al., 1985). El
crecimiento de las poblaciones bacterianas está limitado normalmente o bien
por el agotamiento de los nutrientes disponibles o bien por la acumulación de
productos tóxicos del metabolismo. Como consecuencia, la velocidad de
crecimiento disminuye y el crecimiento llega a detenerse. En este punto se dice
que el cultivo está en fase estacionaria (Figura I V.17). La transición entre la fase
exponencial y la estacionaria implica un período de crecimiento desequilibrado,
durante el cual los diversos componentes celulares son sintetizados a diferentes
velocidades.
En las experiencias de laboratorio se realizan cultivos en sistema

cerrados, como realmente ocurre en la naturaleza, donde no existe aporte
continuo de nutrientes, como tampoco extracción de células ni sustancias de
desecho.
171
EXPERIMENTAL
Figura IV.17. Fases de crecimiento bacteriano.
IV.6.3. ETAPA EXPERIMENTAL
Para realizar una curva de crecimiento se parte de un cultivo de la

bacteria elegida a la cual se le quiere estudiar su comportamiento. Dependiendo
de la fase en que se encuentra el microorganismo la fase de latencia será
diferente. (Labas et. al, 2004).
En este trabajo se realizan curvas de crecimiento con cultivos de bacterias

reactivadas en medio complejo (caldo nutritivo). Para comenzar se toma un
tubo de este cultivo, se realiza un repique a un tubo que contiene 10 ml de de
caldo nutritivo y se incuba a 28°C durante 18 horas para asegurar que la
bacteria se encuentra en una etapa activa de desarrollo (fase exponencial) como
luego se comprueba en la curva de crecimiento. Este tiempo se elige para que la
fase de latencia sea lo más corta posible comenzando así más rápidamente la
etapa de crecimiento exponencial.
Luego de las 18 hs se realiza una dilución (1/ 2000) del cultivo activo en
nuevamente en caldo nutritivo. La dilución se realiza en dos pasos; primero se
172
EXPERIMENTAL
toma 1 ml del cultivo y se enrasa con medio de cultivo estéril un matraz de 10 ml

(dilución 1/ 10) y luego se toman 0.5 ml de esta dilución y se enrasa con medio
de cultivo estéril un matraz de 1000 ml (dilución 0.5/ 1000).
Se toma una muestra de 1 ml de esta dilución y se siembra por duplicado

en placas de Petri que contienen EM B agar tomándose como tiempo cero (0) y
el recuento resultante de esta siembra es la concentración de E. coli a tiempo
0
cero (0) ( C Ec ). Las placas sembradas se incuban 24 hs en una estufa de cultivo
a 37 °C y la dilución se incuba en una estufa a 37 º C.
Posteriormente se toman muestras cada dos (2) horas aproximadamente

hasta las 32 hs, luego se toman cada 3 o más horas hasta evidenciar la fase de
muerte. Cada una de estas muestras se siembra en las placas de EM B y se
incuban 24 hs a 37°C. Esta experiencia se llevó a cabo durante 115 horas y fue
replicada en dos experiencias de las mismas características. Así mismo, cuando
se realizaron cada una de las preparaciones del inóculo de ensayo para las
corridas experimentales con irradiación se tomaron muestras esporádicas para
reafirmar la curva.
El recuento de las placas se realiza en varias etapas, precisamente cada

24 horas, que es el tiempo en que la E. coli logra las características típicas para
un mejor recuento.
La curva obtenida cumple con todas las etapas esperadas como se ve en la

figura I V.18 y tabla I V.11.
Debido a que se estudió la “inactivación” es importante destacar que en

todos los estudios relacionado con las bacterias realizados en esta tesis lo que se
mide son bacterias “viables”, es decir, aquellos microorganismos con capacidad
de replicarse.
173
EXPERIMENTAL
h
Log. conc. UFC cm 3
c
tiempo (horas)
Figura IV.18. Curva de crecimiento experimental
174
EXPERIMENTAL
Tabla IV. 11 Tabla de valores de crecimiento de E.coli
175
EXPERIMENTAL
VI.6.3.1. MEDICIÓN DE LA ABSORBANCIA
A cada una de las muestras obtenidas en los tiempos respectivos de la

curva de crecimiento se le midió la absorbancia en un espectrofotómetro UV/ Vis
(PERKI N-ELM ER) Lambda 40 a 253.7 nm, observándose algo muy particular.
Hasta las primeras 12 hs de la experiencia, el valor de la absorbancia es cercano
a la del medio de cultivo solo manteniéndose relativamente constante. A las 16
horas aproximadamente este valor se incrementa hasta llegar a un valor de
absorbancia mucho mayor que el inicial aproximadamente a las 18 hs,
permaneciendo, otra vez, en valores similares (Figura I V.19)
Figura IV.19. Curva de Absorbancia según el crecimiento
176
EXPERIMENTAL
Tabla IV.12. Datos experimentales de las absorbancias medidas en la curva de crecimiento
Tiem po ( hor as) Absor bancia
0 0.2649
2 0.2599
4 0.2516
6 0.2659
8 0.2657
10 0.2767
12 0.2767
16.5 0.7614
18.5 1.2839
20.5 1.3044
22.5 1.3341
24 1.3149
27 1.3176
29.5 1.3258
32 1.2726
39 1.2771
41 1.3141
43.5 1.3027
46 1.2206
48.5 1.2676
51 1.2763
53 1.2501
68 1.2622
76 1.2535
89 1.3823
115 1.2662
177
EXPERIMENTAL
Estos altos valores de absorbancias son posiblemente productos de la

fermentación de la glucosa (piruvato que se convierte en ácido láctico, acético y
fórmico) pero no presentan inconvenientes en las corridas experimentales ya
que la dilución del inóculo final es elevada evitando así probables efectos de
“protección” o crecimiento de la bacteria
El propósito de este capítulo fue describir en detalle cada uno de los

procedimientos y técnicas de laboratorio utilizadas en esta tesis para evaluar la
eficiencia del APA y su combinación con UV como desinfectantes del agua. H an
sido descriptos los materiales y métodos para la ejecución de los experimentos y
los procedimientos de cultivo, siembra y recuento microbiano, además de los
ensayos para verificar la pureza de la cepa.
178
CAPÍTULO V
DESINFECCIÓN.
ÁCIDO PERACÉTICO COMERCIAL
UV
CAPITULO V DESINFECCIÓN APA COMERCIAL -UV
CAPÍTULO V. DESINFECCIÓN APA COMERCIAL-UV
V.1. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
Para estudiar la desinfección de aguas con radiación UV y su combinación

con un agente oxidante se realizaron ensayos experimentales en un fotorreactor,
utilizando APA comercial combinado con UV.
Las corridas experimentales se realizaron de acuerdo a lo descripto en el

Capítulo I V. Desar r ollo Exper imental. Técnicas Analíticas. Una corrida
experimental típica para la desinfección de agua utilizando radicación UV y
UV+APA comercial consta de varias etapas que se mencionan a continuación:
1. Acondicionamiento del dispositivo experimental.

2. Preparación del inóculo.
3. Encendido de la lámpara 30 minutos antes de los ensayos.
4. Lavado del dispositivo experimental.
5. Valoración de la solución comercial de APA 15% (v/ v).
6. Preparación de la muestra (Agregado del volumen de APA
correspondiente).
8. Siembra
9. Recuento
En estos ensayos se trabaja con un medio complejo (Caldo nutritivo), la

dilución del inóculo final fue de 1/ 1000 para lograr que la solución que se
introdujo en el dispositivo se asemeje a “aguas claras”, previo a un proceso de
desinfección y para evitar inconvenientes, como reproducción bacteriana. El
detalle a destacar en estos experimentos es la limpieza y el encendido de la
lámpara UV, Philip TUB de 15 W30 minutos antes de los ensayos, para lograr la
estabilidad (Figura V.1 Esquema del dispositivo experimental).
Los tiempos de toma de muestra y las condiciones experimentales son

detallados extensamente en el Capítulo I V. La toma de muestra se realiza cada 1
179
segundo, con un dispositivo desarrollado para tal fin. Los frascos colectores
poseen tiosulfato de sodio y catalasa para inhibir la acción del APA y del HP
respectivamente e impedir así, que sigan ejerciendo su poder oxidante antes del
sembrado.
Figura V.1. Esquema del Reactor experimental.
Luego del recuento en placas de Petri se grafica la concentración

bacteriana (log C/ C0 ) de E. coli versus tiempo(s). En las figuras V. 2 a V. 11 a
manera de ejemplo, se muestran los resultados obtenidos en una corrida
utilizando lámparas germicidas UVC (Philips) de 15 W. Como se notará el
último recuento válido es a los 7 segundos, en tiempos posteriores los valores no
cumplían las reglas de recuento en placa o no se obtenía desarrollo de bacterias.
Los ensayos experimentales se realizaron por triplicado y la siembra por
duplicado.
Se presentan las figuras correspondientes a los ensayos experimentales

con UV y UV+APA comercial.
180
Figura V.2. Corrida Experimental. Inactivación de E. coli con radiación UV C
Figura V.3. Corrida Experimental. Inactivación de E. coli con radiación UV y

1ppm de APA comercial
181

2ppm de APA comercial
Figura V.5. Corrida Experimental. Inactivación de E.coli con radiación UV y 3

ppm de APA comercial
182
Figura V.6. Corrida Experimental. Inactivación de E. coli con radiación UV y 4

Figura V.7. Corrida Experimental. Inactivación de E.coli con radiación UV y 5

183


184

10 ppm de APA comercial
Figura V. 11. Corridas Experimentales. Inactivación de E. coli con radiación

UV y diferentes concentraciones de APA comercial.
185
V.1.1. ANÁLISIS DE LAS CURVAS DE INACTIVACIÓN
Como se observa en las figuras (V.2-V.11) el empleo de luz ultravioleta

(UV-C) para la desinfección de aguas claras es sumamente efectivo,
obteniéndose un porcentaje de inactivación del 99,99% en tan solo 6 segundos.
Cuando se utilizó luz UV en presencia de diferentes concentraciones de APA, se
esperaba la existencia de un efecto sinérgico entre ambos desinfectantes, sin
embargo los resultados obtenidos demuestran el agregado de APA a la solución
no conduce a un aumento de la efectividad del proceso. Esto puede deberse a
que la luz UV-C tiene un efecto casi inmediato sobre E. coli.
Se puede sugerir que la rápida inactivación bacteriana y la pérdida de la

capacidad de fotorrepararse es debido a las especies activas generadas por la
presencia de la irradiación UV, (los radicales pueden ser producidos
fotoquímicamente por la escisión del enlace O-O del APA) cuyas formulas son
presentadas a continuación:
+hν
CH3CO3 H  → CH 3CO2 + OH  (V.1)
Donde el radical CH 3CO2• disminuye rápidamente formando CH 3• y CO2•

permitiendo a la molécula de ácido peracético posteriormente puede reaccionar
con los radicales producidos, de acuerdo con las siguientes reacciones de
adición y sustracción de hidrógeno lábil:
CH3CO3 H + OH  → CH3CO 4 H 2 +  OOH + CH 3CO 2 H (V.2)
CH 3CO3H + OH • → CH 3CO.• + O 2 +H 2O (V.3)
La presencia de peróxido de hidrógeno, presente en la mezcla comercial,

no sólo contribuye a la formación de una nueva molécula de acido peracético tan
186
pronto como se consume, sino también favorece a la formación de nuevos

radicales hidroxilo (Caretti and Lubello, 2003).
Es importante también la acción del peróxido presente en la mezcla

comercial, ya que un mecanismo de inactivación puede ser atribuible a las
reacciones foto-fenton, lo que podría contribuir a la aceleración de la
inactivación bacteriana, ya que una vez perforada la membrana, los iones
ferrosos y férricos, presentes intracelularmente, son liberados al medio,
catalizando la formación de radicales OH •.
Sin embargo, el principal beneficio de esta combinación es el aporte del

APA residual, previniendo el recrecimiento bacteriano, tornando la condición
celular de dañada a daño irreversible/ muerte. En la tabla V.1 puede observarse
que la ausencia de recrecimiento luego de 24, 48 y 72 horas de la corrida
experimental. La inactivación celular causada por el APA, hace perder a la célula
su capacidad de reproducirse, evitando el recrecimiento por foto reactivación.
Tabla V.1. Recrecimiento Bacteriano

Concentración Combinación Recrecimiento Recrecimiento Recrecimiento
bacteriana APA+UV
inicial 24 horas 48 horas 72 horas
105 UFC cm-3 15 W - 1 ppm S/R S/R S/R
105 UFC cm-3 15 W-2 ppm S/R S/R S/R
10 5 UFC cm-3 15 W-10 ppm S/R S/R S/R
Nota: S/R: sin recrecimiento
187
La morfología de las colonias sometidas a la acción de ambos agentes, al

ser comparadas con el cultivo original (que no fue sometido a la acción
desinfectante), presentó diferencias de tamaño y perdida de coloración:
pudiéndose observar macroscópicamente colonias más pequeñas y
microscópicamente formas bacilares disminuidas (Figura V.12 a y b), también
otros autores han comprobado la disminución del tamaño celular al ser
expuesto a una situación de estrés con radiación UV (Li et al, 1997). Las
sinergias logradas en los tratamientos de APA / UV pueden deberse a la
interacción entre el APA y los rayos UV que generan la producción de radicales
reactivos y microbicidas (OH •) debido a la fotolisis del APA (Caretti y Lubello ,
2003; Lubello et al., 2002 ).
Figura V. 12 a) E.coli previo tratamiento UV
188
Figura V.12 b). E coli post tratamiento UV
Se puede observar en la figura V.11 una separación de las curvas de

inactivación correspondientes a las concentraciones de 6, 8 y 10 ppm de APA,
una tabla comparativa, para los 4 segundos del ensayo experimental (franja de
mayor separación), puede ser confeccionada para analizar los resultados (Tabla
V.2).
189
Tabla V. 2 Logaritmo de inactivación de E. coli a los 4 s del ensayo experimental.
Concentración de APA /UV Log de inactivación a los 4

segundos de ensayos
UV
experimentales
UV (sin APA) 0.99
1 ppm APA (+ UV) 1,03
2 ppm APA (+ UV) 1,1
3 ppm APA (+ UV) 1,2
4 ppm APA (+ UV) 1.2
5 ppm APA (+ UV) 1.25
6 ppm APA (+ UV) 1.7
8 ppm APA (+ UV) 1.89
10 ppm APA (+ UV) 1.99
En síntesis, un análisis a las curvas de inactivación permite observar que

la combinación de la radiación UV / APA logra altos niveles de inactivación a
tiempos de contacto muy bajos, el proceso de inactivación utilizando radiación
UV solamente posee una alta eficiencia, dada por la intensidad de la
iluminación y la alta sección eficaz de absorción del H 2O a las longitudes de
onda usadas, donde se logra el 99.99% de inactivación a los 6 segundos,
resultando un método de desinfección competitivo y simple, sin embargo, la
utilización de APA comercial garantiza que no habrá recrecimiento porque han
sido inhibidos los mecanismos de reparación y defensa bacterianos.
190
V.2. MODELO CINÉTICO PROPUESTO. DESINFECCIÓN CON

RADIACIÓN UV SIN EL AGREGADO DE AGENTES OXIDANTES.
La cinética de la inactivación de microorganismos utilizando radiación

UV (sin agregado de agentes químicos desinfectantes) puede representarse con
una modificación del modelo de Eventos en Serie desarrollado por Severin
(1982).
En el Capítulo I I I . Modelado de la Desinfección se enumeraron varios

modelos cinéticos hasta ahora conocidos, entre los que se desarrolló el modelo
cinético de Eventos en Serie. En este modelo, la bacteria, al ser expuesta a la
radiación UV va sufriendo daños a través de pasos consecutivos que se
acumulan hasta que alcanzan un umbral donde se produce la muerte del
microorganismo (cada uno de estos “daños” produce una alteración parcial en
la estructura de los diferentes bloques químicos que constituyen la secuencia del
ADN y ARN bacteriano). Todas las bacterias que no alcanzan ese nivel umbral
de daño, son sobrevivientes. De esta manera el umbral determina un número
mínimo de eventos (n) necesarios para la inactivación irreversible de un
microorganismo.
La cinética de Eventos en Serie puede representarse como n reacciones

en serie: Después de un evento perjudicial, se considera que se forma una nueva
especie, por tal motivo, el proceso puede ser presentado como una serie de n
reacción según
k
1 C
k
2→C
k
i+1→ C kn (V.4)
C →    → CEc,n
Ec,0 Ec,1 Ec,i Ec,n-1
Con i = 0, 1, 2, ....i...., n y k1 = k2 = kn = k
Las ecuaciones del modelo planteadas son generales, sin embargo para
simplificar la expresión se puede suponer que la constante cinética para cada
etapa es la misma ( k 1 = k 2=……= k n = k), obteniendo así una única constante
llamada constante de inactivación.
191
0
Debe tenerse en cuenta que la concentración inicial de bacterias es C Ec
mientras que es la concentración de aquellos que no han recibido ningún daño
es C Ec,0 .Sólo en t = O C0Ec = C Ec,0 , en cualquier otro momento C Ec,i < C0Ec
C Ec,i es la concentración de un determinado estado de daño (estado i ) en el

microorganismo que se ha alcanzado el nivel de daño "i " y "n"es el límite del
umbral, este “n” es igual al número de eventos necesarios para llegar a la
inactivación por lo tanto n representa a las especies inactivadas, que han sufrido
un daño por lo general casi irreversible. El número total de especies existentes
es n +1 con el fin de dar cuenta de las especies que aún no han recibido ningún
daño.
Todas las bacterias, ya sea las que no han sufrido ningún daño, como las
que sí, pero no han alcanzado el umbral límite "n", son las sobrevivientes CEc .
Debido a que el número de bacterias inactivadas o muertas (dead, por el
término en inglés), puede obtenerse a partir de la diferencia entre la
0
concentración inicial de bacterias, C Ec y la concentración de las sobrevivientes
CEc, se presenta la siguiente ecuación:
n-1 (V.5)
C Ec,dead = C0Ec - C Ec = C0Ec - ∑ C Ec,i
i=0
Es posible escribir el equivalente a un balance de masas para cada

especie:
Para i=0
dC Ec,i (V.6)
(α E )
γ
δ
= - k i +1 (C Ec,i ) λ λ ,0
dt
Para i= 1,2,3….(n-1)
dC Ec,i (V.7)
= k i ( C Ec,i −1 ) ( ,o ) k i +1 −( C Ec,i ) ( ,o )
δ γ δ γ
λ E λα λ E λα
dt
Para i=n
192
dC Ec,i
= k i ( C Ec,i-1 ) (α E )
δ γ
λ λ ,o
dt
(V.8)
Las ecuaciones (6) a (8) necesitan el valor de la tasa de flujo en función

de la posición y tiempo.
E λ,o ( x,t ) = ∫ΩL λ, Ω ( x, t ) d (V.9)

Ω
La ecuación (V.9) se puede obtener si se conoce el valor de la intensidad

de radiación:
dL λ,Ω (s,t) (V.10)

+ α λ (s,t) L λ,Ω (s,t) = 0
ds
(para una longitud de onda λ en la dirección de propagación de radiación

dada por Ω en el tiempo t)
Con las siguientes condiciones de borde:
(V.11)
L λ , Ω (s R , t) = L0λ , Ω (t)
La ecuación (V.10) puede ser integrada y sustituida en la ecuación (V.9).

Por conveniencia, el ángulo sólido puede ser escrito en términos de un sistema
de coordenadas esféricas, lo que resulta:
(V.12)
∫θ1 φd sinθ ( Lθλ ( , , θt ) )φexp  ∫sR − ( s,αt ) ds 
φ2 θ2 sL
E λ ,o (s, t) = ∫ d 0
φ1
Para calcular el campo de radiación dentro del reactor, se necesita un

modelo de emisión de la lámpara. Con este fin, la fuente tres dimensiones con el
modelo de emisión volumétrica propuesto por Cassano et al. (1995) se aplica:
0.5 (V.13)
 2  r (cos φ − 1) + rL 
2 2 2
 Pλ,L
L (θ, φ) = ϒ w  2 2
0

 4π rL L L  sinθ
193
ϒw es un valor promedio de la transmitancia pared del reactor. (Debe

notarse λ es un subíndice porque este trabajo se lleva a cabo con radiación
monocromática).
Para los ángulos limitantes son:
 r cosφ −  r 2 (cos 2 φ − 1) + r 2  1 2  (V.14)

  L 
θ1 (φ) = tan -1  
 (L L − z) 
 
 1  (V.15)
 r cosφ −  r 2 (cos2φ−1) + rL2  2

θ2 (φ) = tan -1  
−z
 

 
 
 (r 2 − r 2 ) 12  (V.16)
−φ1 = φ2 = cos  L -1 
 r 
 
La ecuación final puede ser resuelta con la ayuda de integraciones

numéricas
(ϒ Pλ ,L ) ( 4π2 rL2 L L )  φ2 θ2
E o ( r, z, t ) = ∫ ( dφ ) ∫ dθ 2
w
 ×
2  r 2 ( cos 2 φ -1) + rL2 
0.5
 φ1 θ1
 sL  
 r ( cos φ − 1) + r 
0.5

2 2

2
L exp  − ∫ α ( s, t ) ds  
 sR  
(V.17)
Sin embargo, el valor de Pλ,L no es siempre conocido (es un valor

proporcionado por el fabricante de la lámpara) y cambia invariablemente a lo
largo del tiempo de la vida útil de la fuente de radiación. Es posible medir
utilizando métodos actinómetro (Murov et al, 1993; Zalazar et al, 2005), es
conveniente utilizar una forma alternativa de la ecuación (V. 17). (Esto es
particularmente siempre es posible en el trabajo de investigación de
laboratorio).
194
 lamp reactor characteristics  (V.18)

E0W =f  
System geometry 
Con la ayuda elaborados artificios algebraicos es posible transformar la

ecuación 17 en la siguiente expresión:
Eo φ2 θ2
 sL

∫ d 2 φr ( cosθ 1)
0.5
E o ( r, z, t ) = W
∫d
2 2
r φ −exp+
2
L ∫ ( s, t ) ds−  α
ψ φ1 θ1  sR 
(V.19)
Por último, ya que para un reactor de área de sección transversal

constante, la media de volumen se reduce a una integral sobre la longitud del
reactor, el promedio de volumen se debe calcular de acuerdo con:
1 LR (V.20)
E o ( r, z, t ) = ∫ E o ( r, z, t ) dz
LR 0
La ecuación final, para ser utilizada en las ecuaciones (V.6) a (V.8) es.
γ LR ro
 φ2 θ2
2  Eo W 
∫ dz ∫ rdr  ∫ dφ ∫ dθ
γ
E = 2 2   2×
o
( ro − ri ) LR  ψ  0 ri  φ1 θ1
γ
 sL 
 r ( cos φ − 1) + rL  exp  − ∫ α ( s, t ) ds  
0.5
2 2 2
 
 sR  
(V.21)
El coeficiente neperiano de absorción del sistema, α, está definido por la

ecuación (V.22). M uchas especies contribuyen a este coeficiente, como el caso
de las bacterias y del medio de cultivo (c).
(V.22)
α = αEc + αc with αEc = ∑ κEc,i C Ec,i
195
1 λ max (V.23)
αc =
Pc ∫
λ min λ Pλ d α λ
∧
Donde: κ [ = ] cm ( CFU ) and CEc,i [ =] CFU cm -3.
2 -1
V.3. SOLUCIÓN NUMÉRICA
El objetivo de esta parte del trabajo es la obtención de los parámetros

cinéticos derivados de las ecuaciones del modelo que mejor se ajusten a los
resultados experimentales. Para la estimación de estos parámetros cinéticos se
realizó un programa en M atlab. El núcleo del programa básicamente es un
estimador de parámetros que utiliza una rutina de optimización paramétrica no
lineal por cuadrados mínimos. Para obtener los parámetros cinéticos
correspondientes al modelo, descritos por las ecuaciones (6), (7) y (8), los datos
experimentales se comparan con los valores obtenidos en las simulaciones del
modelo, empleando un estimador multiparamétrico no-lineal (rutina de
Gauss-Newton) junto con un programa de optimización (algoritmo Lebenberg-
M arquart) para la convergencia global. El método también proporciona los
valores residuales de la matriz jacobiana para calcular los resultados dentro de
un 95% intervalo de confianza. La ecuación (6), (7) y (8) se resuelve con el
método Runge-Kutta.
V.4 ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS Y RESULTADOS

DEL MODELO
Los valores de los parámetros obtenidos son:
γ=0.5
N=4
K=(1.310.18) x 18 8 s-1 (cm 3s einsteins -1) γ(CFUcm- 3) 1-γ
δ= (0,70,02)
196
En la figura V.13 se observa la evolución en función del tiempo de las

concentraciones de E. coli experimentales de Labas (2004) y Flores (esta tesis)
con el ajuste del modelo propuesto por Labas et al (2009).
Figura V.13 Evolución de las concentraciones experimentales, - o-(Labas), -•-

(Flores) y la simulación del modelo (línea solida) para la desinfección con UV.
El buen ajuste de los resultados experimentales (Labas, 2004; Flores,

este trabajo) con el modelo propuesto (Labas et al, 2009) puede ser observado
en la figura V.13.
En esta gráfica puede notarse además que la inactivación tiene un tiempo

de inducción. El hombro inicial típico que corresponde al valor de n = 4 no se
puede notar claramente en el plot de los resultados experimentales debido a las
dificultades en la toma de muestras para t=0 y t=1 segundos.
197
V.5 CONCLUSIONES DEL CAPITULO
Se realizaron experiencias en un fotorreactor de desinfección con

radiación UV y la combinación de UV con el agregado de distintas
concentraciones de una mezcla comercial de ácido peracético (APA). Se observó
que con el agregado del APA, la velocidad de inactivación presentó un leve
aumento con respecto a las corridas con radiación UV solamente.
Este comportamiento fue explicado teniendo en cuenta que, por un lado,

la mezcla del APA absorbe radiación UV, por lo tanto consume una parte de
fotones que podrían ser utilizados para inactivar al microorganismo (efecto de
competencia) y por otro lado la fotodegradación del APA facilita la producción
de especies oxidantes que atacan al microorganismo. Estos dos efectos son
antagónicos y el resultado final es un efecto sinérgico. El mecanismo de la
sinergia también podría explicarse por un mecanismo de daño múltiple de dos
métodos de desinfección diferentes, que causan diferentes tipos de lesiones en
los microorganismos, y estos daños, acumulativos, pueden acoplarse. Los
principales objetivos de la radiación UV son los ácidos nucleicos, mientras que
los desinfectantes químicos , tales como el APA y de H 2O2 , son las paredes
celulares microbianas, las membranas y los sistemas enzimáticos o de
transporte. Como resultado de ello, los mecanismos de reparación microbianos,
necesarios para reparar daños menores, pueden sobrecargarse, lo que lleva a su
incapacidad para reparar las lesiones y posteriormente se produce la muerte
celular . En el caso del único desinfectante, el daño es menor y susceptible de
reparación.
La combinación del UV con el uso de la mezcla comercial del APA

muestra una leve mejora en la eficiencia del proceso de desinfección, pero a los
fines de aplicación práctica, el agregado del agente desinfectante, podría
encarecer el proceso sin aumentar significativamente el porcentaje de
inactivación. Sin embargo existe la ventaja adicional: que el agregado del
desinfectante químico tiene un efecto residual, que no posee la aplicación de
radiación UV.
198
Se aplicó el modelo de Eventos en Serie modificado (Labas, 2004; 2007) a

los datos experimentales utilizando solamente radiación UV, la bondad del
ajuste entre las predicciones del modelo y los datos experimentales obtenidos de
la inactivación de E. coli utilizando la solución comercial de APA a diferentes
concentraciones + UV ha sido obtenida.
Para un estudio completo del sinergismo UV-APA es necesario estudiar

previamente el comportamiento cinético del desinfectante comercial, este
estudio será realizado en el Capítulo VI .
199
ACRONIMOS CAPITULO IV
ea Velocidad volumétrica de absorción de fotones

λ
C Concentración
CEc Concentración de los microorganismos
Ci Concentración del componente i
E energía radiante, einstein s-1
G radiación incidente, einstein s-1 m -2
h constante de Planck, J s
I intensidad específica de radiación, einstein s-1 m -2 sr -1
K Constante cinética las unidades dependen de la reacción en

estudio y de la etapa de la reacción
L longitud, m
t Tiempo(s)
V Volumen
LETRAS GRIEGAS
γ Frecuencia, s-1
α absortividad molar neperiana, m 2
mol -1
λ longitud de onda, m
Ϭ coeficiente volumétrico de scattering, m -1
200
ҡ coeficiente volumétrico de absorción, m -1
φ coordenada esférica, rad
θ coordenada esférica, rad
ρ coordenada esférica, rad
Ω ángulo sólido, sr
ϒ Parámetros del modelo
201
CAPÍTULO VI
PROCESOS DE DESINFECCIÓN.
UTILIZANDO
ÁCIDO PERACÉTICO COMERCIAL
CAPITULO VI PROCESOS DE DESINFECCIÓN USANDO ÁCIDO
PERACÉTICO
CAPÍTULO VI. PROCESOS DE DESINFECCIÓN

USANDO ÁCIDO PERACÉTICO.
VI.1. METODO EXPERIMENTAL
Con el objetivo de estudiar la desinfección de aguas con ácido peracético

comercial, se han llevado a cabo diferentes ensayos experimentales. El esquema
de las condiciones en las cuales se desarrolló cada ensayo, la toma de muestras,
así como el detalle de cada etapa del proceso, han sido presentados en el
Capítulo I V.
Cada ensayo experimental de ácido peracético (APA) consta los siguientes

pasos:
1. Acondicionamiento del dispositivo experimental.
2. Preparación del inóculo.
3. Lavado del dispositivo experimental.
4. Valoración de la solución comercial de APA 15% (v/ v). Selección
de la concentración a trabajar.
5. Preparación de la muestra (Agregado del volumen de APA
correspondiente).
6. Desinfección bacteriana en el Reactor.
8. Siembra.
9. Recuento.
En cada ensayo experimental, se trabajó con un medio complejo (caldo

nutritivo), la dilución del inóculo final fue de 1/ 1000 para lograr que la solución
a introducir en el reactor sea semejante a “aguas claras”. Este paso se hace
202
PERACÉTICO
previo al proceso de desinfección, propiamente dicho, para evitar tales

inconvenientes, como la reproducción bacteriana. La temperatura de trabajo es
de 20 º C y el pH es de 6, manteniéndose constantes durante los ensayos
experimentales.
La concentración de APA comercial cuyo poder de inactivación se quiere

evaluar es seleccionada. En el caso de las corridas experimentales donde se
inhibe el peróxido de hidrógeno presente en la solución comercial, (HP), debe
inactivarse el mismo con catalasa y volver a realizar la titulación hasta que el
viraje del indicador sea inmediato, indicando la ausencia del HP.
Durante cada ensayo experimental se estudia además,

independientemente al poder de inactivación, la variación en la concentración
de los agentes desinfectantes, a lo largo de las experiencias.
Las corridas experimentales se realizan por triplicado y las siembras en

placa se realizan por duplicado, estas se describen en el Capítulo I V.
VI.2. RESULTADOS EXPERIMENTALES
VI.2.1. RESULTADOS EXPERIMENTALES CON APA COMERCIAL.

bacteriana de E. coli (log (C/ C0 )) versus el tiempo (s). En las figuras (VI .1) a (VI .
9) se muestran los resultados obtenidos utilizando la mezcla comercial de APA a
diferentes concentraciones. Se contabilizó el último recuento válido, de acuerdo
a las reglas de recuento en placa descriptas en el Capítulo I V.
203
PERACÉTICO
Figura VI.1. Inactivación de E. coli con solución comercial de APA (1 ppm). Las
barras de error están contenidas dentro del símbolo.
Figura VI.2. Inactivación de E. coli con solución comercial de APA (1.5 ppm). Las
barras de error están contenidas dentro del símbolo.
204
PERACÉTICO
Figura VI.3. Inactivación de E. coli con solución comercial de APA (2 ppm)
Figura VI.4. Inactivación de E. coli con solución comercial de APA (3 ppm).
205
PERACÉTICO
206
PERACÉTICO
207
PERACÉTICO
Tipo II
Tipo III
Tipo I
Figura VI.9. Inactivación de E. coli con diferentes concentraciones de solución

comercial de APA
El proceso de inactivación bacteriana incluye una gran variedad de

reacciones de distinta naturaleza y fenómenos de transferencia de materia. Los
mecanismos de inactivación no han sido completamente dilucidados, y
generalmente, los ataques de los agentes desinfectantes, que no presentan sitios
específicos tan puntuales como los antibióticos, pueden interaccionar con la
célula bacteriana de diferentes maneras: difusión transmembrana, oxidación
radicalaria, cambio de potencial, etc. (Russell 2003; Denyer y M aillard, 2002;
Denyer ,1995). Las moléculas del desinfectante una vez que interaccionan con el
microorganismo tienen como objetivo interrumpir alguna función vital de
importancia celular, que luego de algunas o varias etapas, de acuerdo a la
208
PERACÉTICO
concentración, al microorganismo y a cuestiones ambientales, se alcanza la lisis

celular (Chapman, 2003; Denyer y Stewart, 1998).
Una de las explicaciones más razonables que se encuentran en la

literatura química para explicar la rápida velocidad de desinfección del APA se
puede encontrar en la reacción de ruptura homolítica del ácido peracético
propuesta por Bach et al., (1996) y estudiada en detalle por Rokhina et al.,
(2010). La propuesta de un posible mecanismo de interacción entre las especies
químicas y microbianas es importante con el fin de optimizar la acción del
biocida. (Flores et al., 2013)
Existen registros bibliográficos donde se menciona la acción del ácido

peracético como agente oxidante, según Baldry (1983) el APA disrumpe los
enlaces –SH y -SS de enzimas y paredes celulares (Kitis, 2004), además causa
dislocación las funciones quimiosmóticas del transporte de membrana y
desnaturalización de proteínas (Liberti, 1999). El APA intracelular puede oxidar
las enzimas esenciales impidiendo los procesos bioquímicos, alternando los
niveles de solutos (M alchesky, 1992). El mecanismo de acción es desnaturalizar
las proteínas y enzimas y así incrementar la permeabilidad celular (Small,
2007).
Las reacciones de oxidación química en cadena se describen en las

ecuaciones (VI .1.) a (VI .7.). Estas reacciones fueron propuestas por Rokhina
(2010) en la oxidación de componentes orgánicos con APA.
CH 3C( = O)OOH→ CH 3C(= O)O• + HO• (VI.1)
CH 3C( = O)OOH + HO• → CH 3C(= O)• + O2 + H 2O (VI.2)
CH 3C( = O)OOH + HO• O)OO•

→ CH 3C( = +
H 2O (VI.3)
CH 3C(= O)O• H 3C• → CO 2 + (VI.4)
2 CH 3C( = O)O•  2 H 3C• + 2 CO + O 2 (VI.5)
H 3C• + O2 → OOCH 3• (VI.6)
209
PERACÉTICO
CH 3C( = O)O• + HO• → CH 3C(= O)OOH (VI.7)
La reacción de la ecuación (VI .1), que representa la etapa de iniciación, es

muy importante debido a que forma el radical OH  y además es la etapa
controlante de la velocidad de reacción. La ecuación (VI .6) sólo es importante
en ambientes saturados de oxígeno.
Si bien todas las especies radicalarias generadas en estas reacciones

(VI .1-VI .7) son contribuyentes activas a cualquier mecanismo de oxidación, son
los radicales OH  y CH 3 los más significativos. Según Block (2001), en el
apartado de “compuestos peroxigenados” del libro Esterilización desinfección y
 
antisepsia, los radicales orgánicos CH 3 (C=O)O y CH 3 (C=O) le confieren al
APA su amplio poder esporicida, ya que estos radicales poseen una vida media
ampliamente superior al radical OH  .
Debe ser tenido en cuenta, además el sinergismo de la mezcla comercial

ácido peracético-peróxido de hidrógeno, Alarsi et al. (1992) estudiaron la
inactivación de E. coli con peróxido de hidrógeno, y cuando este oxidante se usó
en combinación con el APA el efecto fue notablemente mayor, indicando así un
sinergismo entre ambos agentes oxidantes. Según Liberti (1999), el poder
biocida de la mezcla es mucho más fuerte que la del APA o del peróxido solo,
indicando su sinergismo.
La Figura VI .9 muestra los resultados obtenidos durante la serie de

ensayos de inactivación bacteriana, donde las concentraciones empleadas varían
de 1 a 15 ppm de solución comercial. Está bien documentado que las curvas de
inactivación, donde se grafica el logaritmo de la concentración de las bacterias
sobrevivientes versus el tiempo de los ensayos experimentales, pueden
aproximarse a una línea recta (tipo I ); curvas con diferentes hombros (tipo I I ) o
curvas con hombros y colas (tipo I I I ). Por lo tanto, cuando se cambia la
concentración del desinfectante, cada familia de curvas representa más
notablemente el fenómeno, que prevalece en las diferentes circunstancias del
proceso. Generalmente las curvas de inactivación del logaritmo de las
sobrevivientes versus el tiempo, se alejan de la línea recta, es por lo tanto,
210
PERACÉTICO
factible pensar que la fase “lag” que se observa en estas curvas no-lineales
representa la serie de etapas y condiciones que conllevan a la muerte celular,
siendo una de las condiciones más importantes la concentración del
desinfectante.
En esta figura, las curvas señaladas como “tipo I ” muestran claramente

una rápida inactivación, con un pequeño hombro y con una parte importante de
su trayectoria que presenta las características de una línea recta.
Las figuras representadas por las curvas de "tipo I I " no permiten

diferenciar con precisión si son el resultado de una inactivación muy lenta o un
hombro que se extiende por un tiempo muy largo. A bajas concentraciones de
desinfectante, la inactivación es muy lenta, podría considerarse como un
periodo de inducción, donde el desinfectante ataca la membrana, pero este
ataque no es suficiente para causar un daño severo en la estructura celular.
Las curvas de inactivación que corresponden al “tipo I I I ”, muestran un

hombro y una cola muy marcados, y por lo tanto este tipo de curva no puede ser
representada, en ningún tramo por una línea recta, en este tipo de curvas, puede
pensarse que la acción de los agentes oxidantes ataca a la membrana
conduciendo lentamente a la pérdida de su permeabilidad, es decir que la
membrana se oxida gradualmente y el microorganismos se resiste a este ataque
desplegando sus mecanismos de defensa propios como son la actividad
enzimática (catalasa); la bomba de protones, etc., hasta que una vez agotados
estos mecanismos se consigue el daño irreversible o la muerte.
Debe notarse, que para las concentraciones superiores a los 5 mg L -1, las
gráficas son líneas rectas y se obtiene el 99,99 % de inactivación en menos de 2,1
minutos. Es interesante destacar que aproximadamente 6 mg L -1 es la
concentración usualmente aplicada en la desinfección de aguas cuando se utiliza
APA como agente desinfectante (Colgan y Gehr, 2001, Lefevre et al. 1992). Al
trabajar con estas concentraciones, es acertado pensar que los agentes oxidantes
atacan las moléculas más externas de la membrana, generando un subsecuente
rompimiento de enlaces alcanzando rápidamente la lisis celular. De esta
211
PERACÉTICO
manera, el nivel de daño crítico se alcanza a medida que se llega a la

descomposición lipídica. Por lo tanto, podemos afirmar que la velocidad y
tiempo requerido para llegar al umbral límite de daño crítico también depende
de la velocidad en que se lleve a cabo la descomposición de la membrana.
Además esta velocidad obedece a la concentración del desinfectante, a las
condiciones ambientales de trabajo (pH, temperatura) y a las propiedades del
agua analizada.
En la figura VI .9, se pueden observar dos tipos de comportamientos

característicos: los hombros y las colas marcados para las curvas Tipo I I I . Hay
varias razones para explicar el hombro: si se inactiva un clump de
microorganismos que existe en suspensión, todas las células presentes en el
grupo deben ser inactivadas antes de que la capacidad de formación de colonias
de la agrupación esté totalmente inactivada. Otra posible explicación es que las
poblaciones de bacterias expuestas a bajas concentraciones de desinfectante
requieren una acumulación sucesiva de lesiones para llegar a su límite de
umbral. Generalmente, cuando se trabaja con concentraciones bajas de
desinfectantes, los mecanismos de protección de las bacterias son capaces de
contrarrestar el daño celular causado por las especies oxidantes. Una vez pasado
el limite umbral la resistencia disminuye notablemente, desapareciendo el
hombro, y mostrando así que los mecanismos de reparación bacteriana no han
sido capaces de evitar el efecto del desinfectante. No obstante, la velocidad y
tiempo requerido para llegar al umbral límite también dependerá, como se
mencionó anteriormente, de la velocidad en que se lleve a cabo la
descomposición de la membrana.
La presencia de colas en una curva de inactivación puede tener una

interpretación plausible distinta: si algunos de los actuales microorganismos
son intrínsecamente más resistentes que otros, pueden sobrevivir en las
condiciones estudiadas y mostrar una reducción en la tasa de inactivación y, en
consecuencia, la desaparición de las colonias será sensiblemente más lenta.
Además, la competencia por los productos de la oxidación subsiguiente del
lisado (productos resultantes de las bacterias muertas) con las bacterias activas,
212
PERACÉTICO
pueden contribuir también a la aparición de colas. Algunos autores (Benabbou

et al., 2007; Coleman et al., 2005) sugieren que este comportamiento se debe al
aumento de compuestos producidos por la lisis bacteriana, que causan
protección a las bacterias no lastimadas, de modo que no son atacadas
efectivamente.
Es importante destacar que por los resultados obtenidos, si se busca las

concentraciones más efectivas que hacen al proceso más eficiente, se debería
optar por las que generan curvas del tipo I . Es decir en aplicaciones prácticas se
debería trabajar con concentraciones por arriba de las 5ppm de solución
comercial de APA.
VI.2.2. RESULTADOS EXPERIMENTALES INHIBIENDO EL

PERÓXIDO.
Para evaluar la participación del peróxido de hidrógeno (HP) como

desinfectante en la mezcla comercial, se procedió a su inhibición con catalasa
bovina al 0,1% (Sigma Aldrich), continuando luego con el procedimiento de una
corrida experimental típica (Técnicas Analíticas. Pr ocedimiento Exper imental,
capítulo I V). Las corridas experimentales seleccionadas a modo de ejemplo son
3, de diferentes concentraciones de APA: de 4, 5, 6 ppm de ácido peracético, en
solución con el HP inhibido. Estas concentraciones no fueron seleccionadas al
azar, sino que se pretende estudiar concentraciones efectivas, con una alta tasa
de inactivación y una baja concentración de desinfectante.

bacteriana de E. coli versus tiempo, en las figuras VI . 10. a VI . 12. se muestran
los resultados obtenidos en una corrida experimental inhibiendo el peróxido de
hidrógeno de la solución comercial, en las figuras VI .13 a VI . 15 se compararon
los resultados de la inhibición del peróxido versus los resultados obtenidos en
las corridas experimentales de la solución comercial de APA. Las condiciones
ambientales de los ensayos fueron las mismas, pH, temperatura constante, y
mezcla perfecta. Se contabilizó el último recuento válido, de acuerdo a la técnica
de recuento en placa referenciada en el Capítulo I V.
213
PERACÉTICO
Figura VI. 10 Inactivación de E. coli con 4ppm de APA inhibiendo peróxido de

hidrógeno.
Figura VI.11. Inactivación de E. coli con 5ppm de APA inhibiendo peróxido de

hidrógeno.
214
PERACÉTICO
Figura VI.12. Inactivación de E. coli con 6ppm de APA inhibiendo peróxido de

hidrógeno.
Para visualizar el efecto del aporte desinfectante del HP a la solución

comercial APA, se cotejaron los valores obtenidos en la bibliografía (Labas et al.
2006; 2009) con los resultados obtenidos durante nuestros experimentos. En
las figuras VI .13. a VI .15. se muestran corridas experimentales (de la misma
concentración) donde se exhibe el poder desinfectante del APA solo (cuando el
HP es inhibido) versus el poder desinfectante de la solución comercial.
Para la misma concentración de APA (4, 5 y 6 mg L- 1) se grafica la

concentración de E. coli versus tiempo.
215
PERACÉTICO
Figura VI. 13. Comparación de la velocidad de inactivación de E. coli con 4 ppm

de solución APA comercial vs 4ppm APA inhibiendo peróxido.
Figura VI.14. Comparación de la velocidad de inactivación de E. coli con 5 ppm

APA solución comercial vs 5 ppm APA inhibiendo peróxido.
216
PERACÉTICO
Figura VI.15. Comparación de la velocidad de inactivación de E. coli con 6 ppm

APA solución comercial vs 6 ppm APA inhibiendo peróxido.
Del análisis de las figuras VI .13. a VI .15. se puede observar que para obtener
el mismo nivel de desinfección (99,9%) logrado por la mezcla comercial de APA
es necesario duplicar el tiempo de contacto cuando se utiliza APA solo. Esto
puedo ser visualizado claramente en la tabla VI .1.
Tabla VI.1. Tiempo necesario para lograr el mismo nivel de inactivación: solución
comercial de APA versus APA inhibiendo peróxido.
APA solución comercial APA inhibiendo HP
Concentración Tiempo de Concentración Tiempo de

Inactivación Inactivación
(mg L-1) (mg L-1)
(s) (s)
4 180 4 300
5 120 5 290
6 90 6 150
217
PERACÉTICO
Este resultado muestra claramente un mayor incremento en la tasa de

desinfección cuando se trabaja con la mezcla comercial. Este fenómeno se
explica por el efecto sinérgico generado por la presencia de HP en la mezcla.
Puede considerarse que el sinergismo se ve beneficiado, en parte, por el

aporte de los radicales OH • por parte del peróxido. La generación de radicales
fuertemente oxidantes formados a partir del HP es el resultado de un/ os
mecanismo/ s bien conocido/ s.
El HP no es por sí mismo un radical, pero se convierte por medio de

reacciones Fenton o H aber-Weis en el radical OH • en presencia de los iones Fe2+
o Cu+ prevalecientes en las células (Deblin et al., 1981), las reacciones pueden
visualizadas en las ecuaciones (VI . 8) y (VI .9)
(VI.8)
Reacción Fenton: Fe 2+ +H 2 O 2 → Fe3+ +OH  +OH -
(VI.9)
Reacción Haber-Weis:O -2 +H 2 O 2 
H
→ O 2 +H 2 O+OH 
Los radicales formados afectan a la célula en diferentes niveles (cambio

de permeabilidad, alternación de las funciones vitales), siendo el radical OH •
uno de los agentes que produce mayor daño celular.
Es importante destacar, el rol activo que juega la enzima catalasa ante la

presencia del peróxido de hidrógeno, como ya se mencionó en el Capítulo I I , el
peróxido puede formar especies reactivas de oxígeno, donde el radical hidroxilo
es el oxidante más activo. Estas especies reactivas de oxigeno dañan las
proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos en las bacterias, necesitándose
sistemas antioxidantes eficientes para contrarrestar este daño, entre los que
incluyen las enzimas. Hay varias enzimas capaces de degradar el peróxido de
hidrógeno: las catalasas, las peroxidasas y las peroxirredoxinas; mientras que
las peroxidasas eliminan el HP usándolo para oxidar a otros sustratos y a
diferencia de otras enzimas que requieren sustratos reducidos, las catalasas
218
PERACÉTICO
(presente en E .coli) dismutan el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno

(Diaz, 2002).
Este mecanismo protector que exhiben las bacterias aerobias, se ve

inhibido ante la presencia del APA, cuyo poder oxidante es tan fuerte que oxida
los enlaces terminales de los aminoácidos presentes en esta enzima,
impidiéndole desarrollar su mecanismo protector. La acción de la HP se basa
principalmente en la oxidación causada por los radicales hidroxilos en forma
casi exclusiva. Hay abundante bibliografía donde se menciona la acción del
ácido peracético como agente oxidante, desnaturalizado de proteínas,
produciendo cambios de potencial en las membranas celulares y generando
radicales OH •, esta bibliografía ha sido presentada a lo lardo de este capítulo y
de capítulos anteriores (Capitulo I , Capitulo I I ).Es interesante la comparación
de los resultados obtenidos con ensayos experimentales donde se utiliza
solamente HP como agente inactivante.
La tabla VI 2 muestra la comparación de los resultados obtenidos con los

ensayos experimentales donde se utiliza solamente HP como agente inactivante.
En esta tabla los valores de la izquierda fueron extraídos de los resultados
publicados por Labas et al. (2008, 2009) para un tiempo de reacción total de
9000 s, empleando el mismo procedimiento experimental, también fueron
publicados y analizados por Flores et al., 2014. De los resultados obtenidos con
APA comercial se puede observar que a bajas concentraciones (2 mg L -1) se
obtuvo una inactivación alta (99,9%) en sólo 300 s. Para alcanzar el mismo nivel
de inactivación, en corridas experimentales que duraron 2,5 h, utilizando HP se
requiere una concentración de 160 mg L- 1.
219
PERACÉTICO
Tabla VI.2. Resultados de inactivación empleando peróxido de hidrógeno y APA

comercial.
HP solo(*) APA solución comercial
(t = 9000 s) (t = 300 s)
H2O2 Inactivación APA Inactivación
(mg L-1) (%) (mg L-1) (%)
15 80 1 28.4
45 92 2 99.9
160 99.9 5 >99.99
185 99.99 15 >99.99
(*) Labas, 2009
La mezcla comercial presenta un resultado único, que permite inferir en la

existencia de diferentes mecanismos de acción de los desinfectantes
desarrollándose en serie y en paralelo. Los hidroperóxidos orgánicos como el
APA contienen grupos peróxidos que son una fuente indiscutible de alto
potencial de oxidación, esto hace que la mezcla comercial sea altamente efectiva.
Los daños a la membrana celular, por diversos mecanismos como procesos
oxidativos, cambio de potencial, penetración transmembrana, etc., hacen que se
pierda el transporte activo celular, provocan la disipación de la bomba de
protones dejando debilitada a la bacteria, mientras que el APA inhibe los
procesos catabólicos y anabólicos en el citoplasma, es probable que el HP
produzca una oxidación radicalaria.
Si bien la naturaleza de las interacciones no ha sido completamente

dilucidadas, existen referencias al respecto de la combinación de agentes
biocidas que poseen mecanismos bioquímicos o fisicoquímicos
complementarios que pueden conducir a una actividad sinérgica (Denyer y
M aillard, 2002).
220
PERACÉTICO
VI.3. MODELO CINETICO
Con los resultados de corridas peróxido hidrógeno extraídos de un

trabajo previo, las corridas con ácido peracético inhibiendo peróxido de
hidrógeno y las corridas experimentales con la solución comercial de APA, se
desarrolló un esquema cinético del proceso de inactivación de E. coli.
En la Tabla VI .3. se muestra el esquema de reacción del proceso de

inactivación, mientras que el aporte de los agentes desinfectantes en forma
individual y la reacción global de ambos desinfectantes se analizarán por
separado. En principio, es posible modelar cada etapa del ataque con una
expresión cinética de primer orden con respecto a la concentración del
microorganismo y de primer orden respecto a la concentración del agente
atacante.
TABLA VI.3 Etapas de reacción propuestas
APA+BACT → BSEN
APA+BSEN 
vía catalasa
→ BCIN
APA+BCIN → BID
HP+BACT → BSEN
HP+BSEN 
ataque de la catalasa
→ BDAN
HP+BDAN → BID
APA + BSEN → BDAM
APA+BDAN → BID
HP + BCIN → BID
BID → Lisis
221
PERACÉTICO
VI.3.1. MODELO CINÉTICO DE LA DESINFECCIÓN DE AGUA CON

APA (PERÓXIDO DE HIDRÓGENO INHIBIDO).
Para modelar la cinética de la desinfección del agua con APA habiéndose

inhibido el peróxido de hidrógeno, se seleccionaron los ensayos experimentales
de tres concentraciones diferentes de APA donde se inhibe el peróxido de
hidrógeno de la mezcla comercial; estas concentraciones corresponden a: 4, 5, 6
ppm, la selección de estas concentraciones responde al rango de
concentraciones que pueden ser usadas en aplicaciones prácticas (alta velocidad
de inactivación a bajos tiempo de contacto). Es decir, se tomaron las curvas de
inactivación más efectivas, aquellas que no presentaron hombro y cola
marcados al momento de graficar los resultados, correspondientes al Tipo I de
curvas de desinfección.
El esquema cinético se basa en proponer un ataque donde intervienen

distintas etapas en serie.
k C k C k C
BACT 
APA,1 APA
→ BSEN 
APA,2 APA
→ BCIN 
APA,3 APA
→ BID → ... → Lisis (VI.10)
En cada una de estas etapas, la especie bacteriana cambia de estado y la

magnitud del daño para producir estos cambios de estado difiere de una etapa a
otra.
El primer contacto del APA, representado por la ecuación (VI .11), con la
célula bacteriana es con la membrana externa, esta constituye una verdadera
red de peptidoglicano y lipopolisacáridos, que le proveen integridad estructural
y la aíslan del medio circundante. Esta estructura es el “target” principal de los
biocidas fuertemente oxidantes. (Los componentes estructurales de la
membrana que son atacados por el ácido peracético, son los grupos tiol,
presente en las proteínas y enzimas transmembrana). También es posible prever
que esta alteración al normal funcionamiento celular, produzca la fosforilación
222
PERACÉTICO
oxidativa y a la alteración del transporte activo (Rusell, 2003, M aillard, 2002;

Denyer y M aillard, 2002)
APA+BACT → BSEN (VI.11)
Donde BACT es la bacteria activa, viable con la pared celular intacta y BSEN
es la bacteria que ha sufrido una alternación en los sitios target de la membrana,
cambiando su permeabilidad, el gradiente de pH, dejándola sensibilizada para
un posterior ataque.
En una segunda etapa, una vez alterada la permeabilidad de la

membrana, el ácido peracético tiene un rápido y fácil acceso a los mecanismos
de defensa que exhibe la bacteria, como la enzima catalasa. El estado celular
ahora es una bacteria sensibilizada, cuyas funciones metabólicas han sido
alteradas (presenta inhibida la actividad de la enzima catalasa).
APA+BSEN 
vía catalasa
→ BCIN (VI.12a)
donde BCI N es la bacteria (sensibilizada) catalasa inhibida.
Una propuesta plausible para la acción del APA con la catalasa es que
produce una oxidación en los enlaces de los residuos de las proteínas,
cambiando el estado de oxidación e impidiendo que esta cumpla su función
como antioxidante. Es posible pensar en la siguiente etapa de reacción para la
inhibición del poder antioxidante de la enzima.
 aaFe ( III ) Por   → aa *RM ( FeIV=O ) Por •+ 

APA (VI12b)
Donde aa son los aminoácidos que constituyen la enzima y aaRM son los
aminoácidos cuyos residuos han sido modificados (subíndice RM ).
Fe(I I I ) y (Fe I V=O) representan diferentes estados de oxidación del

hierro presente en el grupo hemo y Por simboliza a la porfirina . En la Figura
VI .16 se puede observar el grupo hemo, este está formado un anillo orgánico
complejo, la porfirina, a la que se une un átomo de hierro en estado ferroso, este
átomo de hierro tiene seis enlaces de coordinación, cuatro en el plano de la
molécula plana de pofirina y unidos a ella, dos perpendiculares.
223
PERACÉTICO
Figura VI.16. El grupo hemo (adaptada de Lehninger, 2005)
Una vez ocurrida la reacción enzimática, la bacteria, con el mecanismo de

defensa inhibido y con la pérdida de la integridad de la membrana celular, (lo
que permite el pasaje del agente oxidante al interior del citoplasma), queda
irreversiblemente dañada. El ataque del agente oxidante a la bacteria con la
catalasa inhibida resulta en la ruptura de sus constituyentes esenciales como
pentosas, nucleótidos y proteínas. Es importante recordar que la bacteria está
en contacto permanente con el APA debido a la característica de mezcla perfecta
del espacio de reacción.
APA+BCIN → BID (VI.13)
Esto se representa en la reacción (VI .13) donde BI D es bacteria irreversiblemente

dañada
Una vez producido el daño irreversible, la subsiguiente interacción

produce la lisis celular, donde el agente oxidante sigue reaccionando luego con
los componentes celulares.
BID → Lisis (VI.14)

El daño irreversible se representa en la ecuación (VI . 14).
224
PERACÉTICO
El esquema de las etapas de reacción puede ser representado por la figura

VI .17.
Figura VI.17. Esquema de reacción APA inhibiendo HP
VI.3.1.1. BALANCE DE MATERIA EN EL REACTOR
Para hallar las expresiones que permiten obtener los parámetros del
modelo, es necesario plantear el balance de materia correspondiente. Dado que
el reactor es un tanque de 2 litros de capacidad, que se encuentra perfectamente
mezclado, la concentración de APA se considera uniforme en todo el volumen
del reactor. Además el reactor opera en forma isotérmica, ya que la temperatura
permanece constante a 20º C mediante el uso de una camisa refrigerante.
La concentración del agente desinfectante (APA inhibiendo peróxido)

puede suponerse siempre en exceso frente a la concentración de
microorganismos. Esto implica que prácticamente la concentración del agente
desinfectante se conserva constante a lo largo de toda la reacción. Este
comportamiento fue verificado experimentalmente, comprobando que no se
225
PERACÉTICO
producen variaciones en la concentración durante los ensayos experimentales

(Capítulo I V).
Bajo las suposiciones mencionadas, se plantea el balance de materia en el

reactor batch para cada una de las especies involucradas (como se trabaja con
un sistema totalmente mezclado, la concentración de bacterias es uniforme en
todo el volumen del reactor). Así podemos escribir:
dC BACT
= −( k APA,1C APA ) C BACT
dt (VI.15)
dC BSEN
= − ( k APA,2 C APA ) C BSEN + ( k APA,1C APA ) C BACT (VI.16)
dt
dC BCIN
= − ( k APA,3C APA ) C BCIN + ( k APA,2 C APA ) C BSEN (VI.17)
dt
dC BID
= +( k APA,3C APA ) C BCIN (V.18)
dt
Con sus correspondientes condiciones iniciales, a tiempo igual a cero:
C BACT = C0BACT ; C BSEN = C BCIN C BID= 0 = (VI.19)
Es importante destacar la siguiente relación donde:
C BVIA = C BACT + C BSEN + C BCIN = C0BACT −C BID (VI.20)
La concentración de las bacterias viables (CBVI A) es la diferencia existente

entre las bacterias activas (concentración inicial experimental) y las bacterias
irreversiblemente dañadas, siendo estas concentraciones las que se puede
determinar experimentalmente.
226
PERACÉTICO
VI.3.1.2. ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS Y RESULTADOS

DEL MODELO
Un paso determinante en el modelado y simulación de las etapas de

desinfección, lo constituye la estimación de parámetros, dado que los resultados
obtenidos dependen en gran medida del rigor con que se haga esta estimación.
Los parámetros cinéticos del modelo fueron estimados siguiendo el

esquema de trabajo que se muestra en la figura VI .18. El objetivo de esta parte
del trabajo es la obtención de los parámetros cinéticos derivados de las
ecuaciones del modelo que mejor se ajusten a los resultados experimentales.
Para la estimación de estos parámetros cinéticos se realizó un programa en
M ATLAB.
Los correspondientes balances de materia, se resolvieron numéricamente

utilizando un M étodo de Runge-Kutta de cuarto orden. Los parámetros
cinéticos del modelo son obtenidos mediante un procedimiento de regresión de
mínimos cuadrados no lineal (NLLS) basado en el algoritmo de optimización de
Levenberg-M arquardt. Este procedimiento encuentra aquellos valores de los
parámetros que minimizan la suma de cuadrados de las diferencias entre los
logaritmos de las concentraciones predichas por el modelo y de las
concentraciones obtenidas a partir de los datos experimentales. Como resultado
de la simulación numérica, se obtuvieron valores de concentración de las cuatro
especies BACT, BSEN , BCI N , BI D para diferentes tiempos de reacción.
Siguiendo el esquema de trabajo, la raíz del error cuadrático medio

(RM SE, por sus siglas en inglés) se calculó en base del logaritmo de las
concentraciones utilizadas en la estimación de parámetros y las concentraciones
experimentales, este RM SE que se define entonces como:
2
1 N  ln(C BVIA ,i ) − ln(C BVIA ,i ) 
EXP MOD
RMSE = ∑
N i  ln(C EXP


(VI.21)
BVIA ,i ) 
227
PERACÉTICO
Figura VI. 18. Esquema para la obtención de parámetros cinéticos
En las figuras VI . 19. a VI . 21. se observa la historia temporal de la

concentración de E. coli experimental para diferentes valores de APA
conjuntamente con el ajuste del modelo propuesto.
228
PERACÉTICO
Figura VI.19. Evolución de las concentraciones experimentales (•) y del modelo

(línea sólida) para una concentración de APA inhibiendo peróxido de 4 ppm.
Figura VI.20. Evolución de las concentraciones experimentales (•) y del modelo

(línea sólida) para una concentración de APA inhibiendo peróxido de 5 ppm.
229
PERACÉTICO
Figura VI. 21 Evolución de las concentraciones experimentales (•) y del modelo

(línea sólida) para una concentración de APA de 6 ppm inhibiendo HP.
Figura VI. 22. Comparación de las concentraciones de E. coli del modelo

propuesto versus concentración E. coli experimental.
230
PERACÉTICO
Aplicando regresión lineal simple se obtiene el coeficiente de correlación

(R2) de 0,9767, lo que indica que el modelo representa adecuadamente lo
obtenido experimentalmente.
Las figuras VI . 19. a VI . 22. muestran el buen ajuste entre las predicciones
del modelo y los datos experimentales obtenidos de la inactivación de E. coli
utilizando APA como único agente oxidante.
Los valores de los parámetros cinéticos, que representan los ensayos

experimentales y la raíz del error cuadrático medio son:
KAPA,1=(4.8629 ± 0.2553)×10-1 mM-1 s-1
KAPA,2=(1.2480 ± 0.1857) mM-1 s-1
KAPA,3=(8.3489 ± 2.0282)×102 mM-1 s-1
RM SE= 8,6%
Del análisis de los parámetros obtenidos en este proceso surgen

diferentes observaciones: la constante KAPA, 1, etapa controlante, coincide con
los postulados teóricos, donde se presenta como la etapa más lenta de la
inactivación bacteriana a la primer interacción biocida-bacteria. En la literatura,
se muestra a la membrana externa celular como la primera barrera a franquear
por el agente desinfectante (Ortega M orente et al., 2013; Block, 1991). La
bacteria exhibe, en este paso sus primeros mecanismos de defensa, como
cambios en la permeabilidad celular, y reducción de actividades metabólicas.
Los mecanismos de reacción bacteria-APA, una vez realizado el primer contacto,
no están completamente dilucidados, pero se ha comprobado, para los
compuestos peroxigenados reacciones radicalarias con los grupos tiol y de
oxidación-reducción con los metales de transición presentes en la superficie
celular (Block, 2001; M arquis et al., 1995). Ninguna de estas reacciones son
instantáneas y dependen de varios factores como son: la concentración celular,
la concentración del biocida, el biocida en sí, el pH y la temperatura (Denyer,
1995). Una vez alterada la homeostasis celular, se produce la penetración al
interior de la célula (Russell, 2003).
231
PERACÉTICO
El parámetro KAPA,2 representa una reacción de sensibilización más una

reacción de inhibición enzimática no competitiva, donde la estructura proteica
que determina la actividad enzimática de la catalasa es perturbada (oxidada por
el APA). Esto afecta a la tasa de la reacción catalizada por la enzima ya que la
presencia del inhibidor produce un cambio en su estructura y su forma. Este
cambio en la forma implica que la catalasa deja de ser capaz de unirse
correctamente al sustrato (peróxido de hidrógeno). Esto reduce la concentración
de enzima "activa" resultando en una disminución de la velocidad máxima
enzimática (Vmax).
El último parámetro obtenido, KAPA,3, constituye la etapa más veloz del

mecanismo propuesto para APA, esto es coincidente con los resultados
esperados y los resultados propuestos por la literatura: el APA ya ha alterado la
membrana celular e inhibido los mecanismos principales de defensa, como la
actividad de la catalasa, y la fuerza protón motriz (PM F, proton motive force,
por sus siglas en inglés), esta última ha sido documentada como uno de los
targets del ácido orgánico (Ortega M orente el al., 2013; Hugo, 1978). Una vez
penetrado el citoplasma, el APA interacciona velozmente con los constituyentes
vitales de la célula causando un daño irreversible, siendo destacable la reacción
con los nucleótidos de purina y los ácidos nucleídos por su interacción con los
grupos aminos y sulfidrilos (Adams et al., 1981; Vosberg and Hoffman, 1971)

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
Se seleccionaron ensayos experimentales con tres concentraciones

diferentes de peróxido de hidrógeno (15, 25, 33 ppm) utilizando E. coli como
microorganismo modelo. La selección de estos valores, responde a que a
concentraciones menores, la tasa de inactivación del HP es sumamente baja y
los tiempos experimentales son prolongados (superiores a las 3 horas). La
realización del esquema cinético con estas concentraciones permite lograr una
mayor eficiencia en el cálculo del poder desinfectante, esto es un aspecto muy
232
PERACÉTICO
importante, ya que la velocidad de reacción se ve afectada considerablemente

por la concentración.
El esquema cinético se basa en proponer un ataque donde intervienen

distintas etapas en serie.
k C k C k C
BACT 
HP ,1 HP
→ BSEN 
HP ,2 HP
→ BDAM 
HP ,3 HP
→ BID → ... → Lisis (VI.22)
La bacteria activa (BACT) sufre una sensibilización por parte del ataque del
peróxido quedando sensibilizada para un posterior embate del desinfectante
HP+BACT → BSEN (VI.23)
La bacteria sensibilizada (BSEN ) continua reaccionando con la molécula

de peróxido de hidrógeno hasta producirse un daño considerable (BDAN ) que, si
bien altera las funciones celulares, no produce la muerte de la misma, ni altera
su viabilidad y cultivabilidad. Debe destacarse que en esta etapa la bacteria
posee enzimas específicas que le permiten defenderse del ataque del peróxido,
como la enzima catalasa.
HP+BSEN 
ataque de la catalasa
→ BDAN (VI.24.a)
Se propone el siguiente esquema de reacción para representar la

interacción peróxido de hidrógeno-enzima catalasa. Este esquema fue
realizando de acuerdo a los expuesto en diferentes bibliografías (Battistuzzi et
al, 2010; Galvan et al., 2010; Ghiladi et al., 2005, ) sobre las reacciones de las
hemo enzimas.
 aa Fe ( III ) Por  +H 2 O 2 → aa Fe ( IV=O ) Por •+  +H 2 O (VI.24.b)
 aaFe ( IV=O ) Por •+  + H 2 O 2 → aa Fe ( III ) Por  +H 2 O + O 2 (VI.24.c)
donde aa: son los aminoácidos que rodean al grupo hemo. El hierro se
encuentra en estado de oxidación 3+ (Fe 3+ ) y es el elemento principal del grupo.
Además, se puede observar una reacción redox, donde las especies oxidantes
son reducidas luego a su estado original.
233
PERACÉTICO
La reacción general puede resumirse de la siguiente forma:
2H 2 O 2 
enzima catalasa
→ 2H 2 O + O 2 (VI.25)
Si bien se ensayó experimentalmente el poder inactivante de la catalasa

sobre el peróxido, se estudió también la reacción enzimática mediante un
programa de visualización molecular, VM D (VM D es un programa de
visualización y análisis estructural de proteínas de dominio público). Se obtuvo
del Protein Data Bank (PDB) una enzima catalasa cristalizada mediante la
técnica de Rayos X (doi.10.1038) y se visualizaron los sitios de interés para la
reacción, destacándose las interacciones de la molécula de peróxido con el
grupo hemo (Fe (I I I )) de la enzima. Las imágenes VI .23 y VI . 24 son el resultado
de esta etapa (Apéndice I I I . VM D).
Figura VI.23. Estructura en forma de cinta de la enzima catalasa (en el extremo

inferior derecho se observa la molécula de peróxido de hidrógeno).
234
PERACÉTICO
Figura VI.24. Imagen de la molécula de peróxido sobre el grupo hemo presente

en la enzima. Representación de los residuos de aminoácidos.
La bacteria dañada, pierde su viabilidad luego de que sus constituyentes

vitales dentro de la célula sufren un daño irreversible (BI D). La disrupción de la
membrana citoplasmática a menudo es ejemplificada por la fuga de los
componentes intracelulares, como el potasio (K+ ) seguido de fosfatos
inorgánicos, el pool de aminoácidos y los materiales de absorción en 260nm:
ácidos nucleicos y proteínas (Lambert y Hammond 1973).
HP+BDAN → BID (VI.26)
Una vez causado el daño irreversible, un subsiguiente ataque del agente

oxidante causa el lisado celular, expresándose finalmente como:
BID → Lisis (VI.27)
235
PERACÉTICO
VI.3.2.1. BALANCE DE MATERIA EN EL REACTOR.
Las suposiciones del modelo son las mismas desarrolladas en el inciso

VI .3.1.1 El balance de materia para cada especie es el siguiente:
dC BACT
= −( k HP,1C HP ) C BACT (VI.28)
dt
dC BSEN
= − ( k HP,2 C HP ) C BSEN + ( k HP,1C HP ) C BACT
dt (VI.29)
dC BDAM
= − ( k HP,3C HP ) C BDAM + ( k HP,2 C HP ) C BSEN
dt (VI.30)
dC BID
= +( k HP,3C HP ) C BDAM (VI.31)
dt
La concentración de bacterias viables puede ser obtenida mediante la
relación:
C BVIA = C BACT + C BSEN + C BDAM = C0BACT −C BID (VI.32)
El esquema del ataque en serie propuesto es representado en la Figura

VI . 25
236
PERACÉTICO
Figura VI.25 Esquema de Ataque: Peróxido de Hidrógeno

DEL MODELO:
Para la estimación de los parámetros cinéticos del modelo se repite la

metodología de trabajo propuesta en el inciso VI .3.1.2 representada en el
esquema VI .18.
En las figuras VI . 26. a VI . 29. se observa la evolución en función del

tiempo de las concentraciones de E. coli experimentales con el ajuste del modelo
propuesto.
237
PERACÉTICO
Figura VI.26. Evolución de las concentraciones experimentales (•) y la

simulación del modelo (línea solida) para una concentración de 15 ppm de HP

238
PERACÉTICO

Figura VI.29. Concentración de E. coli del modelo versus concentración de E.coli

experimental
239
PERACÉTICO
El coeficiente de correlación tiene un valor de 0,969 lo que indica que el

modelo predice adecuadamente lo que ocurre en las experiencias.
Las figuras VI . 26. a VI . 29. muestran la bondad del ajuste entre las
predicciones del modelo y los datos experimentales obtenidos de la inactivación
de E. coli utilizando HP como único agente oxidante, a diferentes
concentraciones.
Los valores de los parámetros cinéticos y la raíz del error cuadrático

medio son:
kHP,1=(4.9327 ± 0.6072)×10-1 mM-1 s-1
kHP,2=(3.9437 ± 0.1999)×10-4 mM-1 s-1
kHP,3=(8.0495 ± 3.6625)×10-2 mM-1 s-1
RSM : 1,6%
El primer parámetro cinético obtenido en esta etapa kHP,1= (4.9327 ±

0.6072)×10-1 mM-1 s-1 se encuentra en el mismo orden que el parámetro
KAPA,1=(4.8629 ± 0.2553)×10-1 mM-1 s-1, (cuando se utiliza APA como único
agente oxidante), en un análisis a primera vista se podría pensar que esta
constante no era la esperada, ya que, siendo el APA un oxidante más potente
que el peróxido de hidrógeno, se esperaría obtener una diferencia en el orden de
magnitud de las constantes. No obstante, haciendo un análisis más profundo, se
encuentran varias explicaciones para ocurra este fenómeno:
i) ambos son compuestos peroxigenados y actúan en forma similar

en el primer contacto con la membrana celular. El mecanismo
de acción ante las células bacterianas se basa principalmente en
el oxigeno activo y la capacidad de formar especies radicalarias
(Ortega M orente et al., 2013; Russell, 2003, Denyer, 1995).
ii) el peróxido de hidrógeno reacciona con los metales
biodisponibles en la membrana celular, catalizando estos su
velocidad de reacción;
iii) la célula bacteriana exhibe los mismos mecanismos de defensa
ante todos los biocidas. La membrana de las bacterias Gram-
240
PERACÉTICO
negativas actúa como una barrera semipermeable y es la

responsable de de la resistencia intrínseca de estos
microorganismos ante diferentes compuestos antimicrobianos.
La membrana externa de la familia de bacterias
Enter obacter iaceae actúa como una barrera limitando o
previniendo el ingreso de una gran diversidad de compuestos
químicos, sin importar su composición (Gilbert et al., 1990;
Nikaido y Vaara, 1985).
El parámetro kHP,2=(3.9437 ± 0.1999)×10-4 mM-1 s-1 es la etapa

controlante de este mecanismo. Se caracteriza por una reacción de
sensibilización en la bacteria y una reacción catalizada por enzimas. El
mecanismo ya ha sido desarrollado en el ítem VI .3.2.1 de este capítulo. El
peróxido se consume en parte, liberando agua y oxigeno, al reaccionar con la
catalasa pierde gran parte de su efectividad. Como la concentración de
desinfectante está en exceso, el HP, reacciona con la bacteria sensibilizada,
alterando sus funciones vitales y dejándola dañada.
El parámetro kHP,3=(8.0495 ± 3.6625)×10-2 mM-1 s-1 representa el

cambio de estado de bacteria dañada a bacteria irreversiblemente dañada. Al
comparar este parámetro con el obtenido al utilizar APA como agente
desinfectante, (ambos actuando sobre una bacteria injuriada), el valor del
parámetro KAPA,3=(8.3489 ± 2.0282)×102 mM-1 s-1, muestra que, una vez
vencida la primer resistencia ambos desinfectantes actúan a diferentes
velocidades, siendo el APA un agente oxidante más fuerte que el HP en estas
condiciones de trabajo.

APA COMERCIAL
Se seleccionaron corridas experimentales con tres concentraciones

diferentes de APA comercial: 5, 6, 8 ppm. Estas concentraciones corresponden a
241
PERACÉTICO
las más efectivas y aplicables en la práctica ya que se logran altas tasas de

inactivación (99.99%) en cortos periodos de tiempo.
El esquema cinético propuesto para la solución comercial de APA se

representa mediante etapas en serie, donde se considera la acción del ácido
peracético y del peróxido de hidrógeno en conjunto. Así se puede escribir el
siguiente sistema:
k C k C k C
BACT 
HP ,1 HP
→ BSEN 
HP ,2 HP
→ BDAM 
HP ,3 HP
→ BID (VI.33)
k C k C k C
BACT 
APA ,1 APA
→ BSEN 
APA ,2 APA
→ BCIN 
APA ,3 APA
→ BID (VI.34)
k C k C
BSEN 
APA ,5 APA
→ BDAM 
APA ,4 APA
→ BID (VI.35)
k C
BCIN 
HP ,4 HP
→ BID (VI.36)
BID → ... → Lisis (VI.37)
El esquema cinético propuesto es representado en la figura VI .30.
242
PERACÉTICO
Figura VI.30. Esquema cinético: ataque de APA comercial
VI.3.3.1. BALANCE DE MATERIA EN EL REACTOR.
Los presupuestos del modelo son los mismos que se desarrollaron en el

inciso VI .3.1.1 El balance de materia para cada especie es el siguiente:
dC BACT
= − ( k APA,1C APA ) + ( k HP,1C HP )  C BACT VI.38)
dt
dC BSEN
= ( k APA,1C APA ) ( k+
HP,1C HP )  C BACT (−k APA,2 C APA )
 ( k+
HP,2 C HP ) ( k+
APA,5 C APA )  C BSEN
dt
(VI.39)
243
PERACÉTICO
dC BCIN
= ( k APA,2 C APA ) C BSEN ( k−APA,3C APA )
 (k +HP,4 C HP )  C BCIN
dt
((VI.40)
dC BDAM
= ( k APA,5C APA ) + ( k HP,2 C HP )  C BSEN − ( k APA,4 C APA ) + ( k HP,3C HP )  C BDAM
dt
(VI.41)
La concentración de bacterias viables puede ser obtenida mediante la

relación:
C BVIA = C BACT + C BSEN + C BDAM = C0BACT −C BID (VI.42)

DEL MODELO.
Para la estimación de los parámetros cinéticos del modelo se repite la

metodología de trabajo propuesta en el inciso VI .3.1.2 representada en el
esquema VI .18.
En las figuras VI . 31. a VI . 34. se observa la evolución en función del

tiempo de las concentraciones de E. coli experimentales con el ajuste del modelo
propuesto.
244
PERACÉTICO

simulación del modelo (línea solida) para una concentración de APA comercial
de 5 ppm

de 6 ppm
245
PERACÉTICO

de 8 ppm
Figura VI.34.Concentración de E.coli del modelo versus concentración de E.coli

experimental
246
PERACÉTICO
El coeficiente de correlación R2= 0,991 indica que el modelo representa

adecuadamente lo obtenido experimentalmente.
Las figuras VI . 31. a VI . 34. muestran la bondad del ajuste entre las
predicciones del modelo y los datos experimentales obtenidos de la inactivación
de E. coli utilizando la solución comercial de APA a diferentes concentraciones.
Los valores de los parámetros cinéticos son los siguientes:
KAPA,4=(1.0035 ± 0.0747) mM-1 s-1
KHP,4=(5.1731 ± 2.3537) ×103 mM-1 s-1
KAPA,5=(2.4664 ± 0.5124) mM-1 s-1
RM SE: 7.1%
Se hace notar que los parámetros aquí estudiados corresponden a las

reacciones de interacción entre el ácido peracético y el peróxido de hidrógeno,
donde se pone de manifiesto el sinergismo de la mezcla comercial.
Sin duda, el resultado más destacable del estudio del sinergismo, es el

valor KHP,4=(5.1731 ± 2.3537) ×103 mM-1 s-1, donde el peróxido de hidrógeno,
una vez que el APA inhibió la catalasa, exhibe una alta velocidad e reacción,
oxidando los múltiples targets celulares, incluyendo la peroxidación y la
disrupción de la bacteria, oxidación por los capturadores de oxígeno (oxígenos
“scavengers”), los grupos tiol, alteración en los procesos energéticos, alteración
de la síntesis de proteínas, culminado con la muerte celular.
Los parámetros KAPA,5 y KHP,2 representan el cambio del estado celular de

bacteria sensibilizada a bacteria dañada, BSEM →BDAM, cuando se utiliza la mezcla
comercial y cuando solo se utiliza el peróxido de hidrógeno respectivamente.
Del análisis de estos parámetros, se puede observar que con HP solo, la etapa
BSEM →BDAM es la más lenta de todo el proceso de desinfección, sin embargo en
presencial de APA esta etapa es muy rápida, la velocidad de ataque del APA en
esta etapa es 6175 veces más rápida que con HP solo. En esta comparación de
parámetros es considerable el sinergismo de la solución comercial (KAPA,5 )
247
PERACÉTICO
donde es claramente visible el efecto supra aditivo de la acción bactericida de

ambos desinfectantes.
Los parámetros KHP,4 y K APA,3 corresponden al estado celular BCI N →BI D,

donde la bacteria, con el mecanismo de defensa inhibido pasa a un estado de
daño irreversible. De la comparación de los valores: KHP,4=(5.1731 ± 2.3537)
×103 mM-1 s-1 y KAPA,3=(8.3489 ± 2.0282)×102 mM-1 s-1 se observa que si bien la
etapa con APA solo es muy rápida, una vez que el APA ha inhibido la catalasa, la
interacción bacteria-peróxido que culmina en un daño bacteriano letal es aún
más veloz (6.2 veces). Similares situaciones han sido reportadas para el
peróxido de hidrógeno (Block 2001), donde la actividad bactericida ha sido
mejorada mediante la combinación de catalizadores que aceleran la formación
de las especies reactivas de oxigeno, mejorando la performance del peróxido
como oxidante. La acción conjunta del APA-HP solo ha sido estudiada
cualitativamente en la bibliografía existente. El sinergismo APA-HP puede
explicarse como un mecanismo de daño múltiple, donde los agentes biocidas
generan diferentes tipos de lesiones a los microorganismos, y el perjuicio
causado se ve incrementado por la participación de ambos.
VI.4. CONCLUSIONES
Se ha propuesto un modelo cinético químico para representar la

inactivación bacteriana de un indicador de contaminación biológica en aguas. Se
obtuvieron los parámetros necesarios para completar el modelo, donde el
esquema cinético propuesto ajusta apropiadamente con los resultados
experimentales previamente obtenidos.
En este parte del trabajo se ha estudiado la acción en conjunto y por

separado de dos agentes desinfectantes tales como el peróxido de hidrógeno y el
ácido peracético, a fin de evaluar el efecto sinérgico. Solo hay precedentes de un
estudio de sinergismo de la mezcla comercial (Alasri et al., 1992) donde
solamente se realiza una evaluación experimental, la literatura sobre acción en
248
PERACÉTICO
conjunta del APA y el HP es escasa y no se encontraron registros de un modelo

cinético que considere el sinergismo de la mezcla.
De acuerdo a los ensayos experimentales realizados, y a los resultados

presentados en la Tabla VI . 2, se puede concluir claramente que la eficiencia del
HP es mucho menor que la APA por sí solo. No obstante, el aporte del HP es de
suma importancia cuando forma parte de la mezcla comercial. Se debe señalar
que esta “mejora” ocurre sólo después de la APA ha iniciado el ataque contra la
célula, lo que indica que los sistemas de protección que existían antes (catalasa)
han sido inhibidos o eliminados y sólo entonces, el HP puede participar
activamente en la reacción de inactivación rápida.
Cuando se utiliza solamente el HP la tasa de inactivación es lenta, siendo

la interacción peróxido-catalasa, la etapa de controlante de la reacción. Para el
caso de la inactivación con APA inhibiendo peróxido, la etapa más veloz es la
etapa de inactivación bacteriana, donde la membrana ha sido penetrada y
oxidados los mecanismos de defensa. Cuando se trabaja con la mezcla comercial
de APA, la contribución de HP para el proceso se vuelve importante, pero
solamente después de que ha ocurrido un ataque rápido del APA, produciendo
daños en los targets vitales del metabolismo de la célula, y en particular
oxidando los aminoácidos presentes en la catalasa, impidiendo de esta forma,
que el microorganismo puede defenderse. Por lo tanto, el APA ataca a las
bacterias en la primera etapa, facilitando el subsiguiente ataque a las bacterias
dañadas por HP. En una segunda etapa, tanto el APA y el HP, actuando en
conjunto, producen rápidamente el daño irreversible en la bacteria, con un
notable incremento en la tasa de inactivación en comparación a la observada
cuando el APA actúa solo (sinergismo potenciador).
En resumen, se llevó a cabo un extenso estudio teórico - experimental

utilizando la mezcla comercial de ácido peracético (APA) como agente
desinfectante. En base a los estudios experimentales, se postuló un mecanismo
de desinfección, nunca antes propuesto, considerando el poder oxidante de cada
uno de los agentes de la mezcla por separado y el efecto sinérgico de estos. El
mecanismo de este modelo comprende a través de ecuaciones matemáticas
249
PERACÉTICO
simples, los procesos fisicoquímicos y enzimáticos involucrados en la

inactivación bacteriana, como oxidación de enlaces proteicos, inhibición de
mecanismos de defensa bacterianos y alteración en las funciones metabólicas
vitales en los microorganismos. Se obtuvieron las concentraciones de
desinfectantes ideales y las condiciones de trabajo óptimas para lograr altas
tasas de inactivación (99.99%) en cortos períodos de tiempo.
250
PERACÉTICO
ACRONIMOS CAPITULO VI
aa Aminoácidos
APA Ácido Peracético
B Bacteria
HP Peróxido de Hidrógeno
K Constante cinética
Por Porfirina
V velocidad
SUFIJOS
ACT Activa
CI N Catalasa inhibida
DAM Dañada
ID I rreversiblemente Dañada
RM Residuos de aminoácidos
SEN Sensibilizada
251
CAPÍTULO VII
CONCLUSIONES
Y
PERSPECTIVAS FUTURAS
CAPITULO VII CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS
VII. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS
VII.1 CONCLUSIONES
En este trabajo de Tesis Doctoral en Tecnología Química se procura ofrecer una

tecnología alternativa al problema que genera la utilización de cloro y sus derivados en
la desinfección de aguas debido a la formación de los subproductos de desinfección
(DBP´ s). Para ello, se estudian los aspectos relevantes de procesos alternativos de
desinfección, como agentes oxidantes amigables con el ambiente, como es el ácido
peracético, y su combinación con radiación UV, utilizando procesos avanzados de
oxidación.
La combinación de un adecuado diseño de las experiencias, un modelado de la

cinética de desinfección y el análisis de los resultados permitieron obtener las siguientes
conclusiones:
Se realizaron experiencias en un fotorreactor de desinfección con radiación UV y

la combinación de UV con el agregado de distintas concentraciones de una mezcla
comercial de ácido peracético (APA). Se observó que con el agregado del APA, la
velocidad de inactivación presentó un muy leve aumento con respecto a las corridas con
UV sola.
Este comportamiento fue explicado teniendo en cuenta que por un lado, la mezcla
del APA absorbe radiación UV, por lo tanto consume una parte de fotones que podrían
ser utilizados para inactivar al microorganismo (efecto de competencia) y por otro lado
la fotodegradación del APA facilita la producción de especies oxidantes que atacan al
microorganismo. Estos dos efectos son antagónicos y el resultado final es un efecto
sinérgico leve.
En resumen, la combinación del UV con el uso de la mezcla comercial del APA

muestra una leve mayor eficiencia, sin embargo a los fines de aplicación práctica, el
agregado del agente desinfectante, hace más complejo al proceso de desinfección.
Puede, por otro lado, existir la ventaja adicional que el agregado del desinfectante tiene
un efecto residual, que no posee la aplicación de radiación UV.
252
Se realizaron experiencias de inactivación con una mezcla comercial de APA y se

realizaron corridas inhibiendo la acción del peróxido de hidrógeno (HP) presente en la
mezcla. La velocidad de inactivación con la mezcla comercial es muy rápida con respecto
a la obtenida con el HP inhibido. Lo cual demuestra que el H P desempeña un rol
importante en el proceso de inactivación.
El uso de la solución comercial de APA garantiza que no haya recrecimiento

bacteriano, luego de 24, 48 y 72 horas de realizadas las pruebas de desinfección, esto es
atribuible a que el agente químico oxidante, inhibe las funciones enzimáticas de defensa
que poseen las bacterias y oxida las proteínas esenciales, necesarias para realizar las
funciones metabólicas.
Comparando con resultados obtenidos previamente utilizando Peróxido de

hidrógeno solo como agente desinfectante, puede concluirse que la velocidad de
inactivación con HP es mucho más lenta que usando la mezcla comercial de APA y que
la velocidad de inactivación utilizando la mezcla comercial de APA es mucho mayor que
la suma de las velocidades de inactivación con APA solo (inhibiendo el HP) y el HP solo,
mostrando un notable efecto sinérgico de potenciación.
Este sinergismo de potenciación puede explicarse a partir del distinto

comportamiento del APA y del HP. Se ha postulado un ataque rápido por parte del APA
en una primera etapa, lo que facilita el subsiguiente ataque a las bacterias dañadas por
HP. Entonces la contribución de HP para el proceso se vuelve importante, pero
solamente después de que ha ocurrido el mencionado ataque rápido del APA,
produciendo daños en los targets vitales del metabolismo de la célula, y en particular
oxidando los aminoácidos presentes en la catalasa, impidiendo de esta forma, que el
microorganismo puede defenderse. En una segunda etapa, tanto APA y HP, actuando en
conjunto, producen rápidamente el daño irreversible en la bacteria, con un notable
incremento en la tasa de inactivación en comparación a la observada cuando el APA
actúa solo (sinergismo potenciador).
Se propuso un esquema cinético y se realizó el modelado cinético completo. Este

modelo comprende a través de ecuaciones matemáticas simples, los procesos
fisicoquímicos y enzimáticos involucrados en la inactivación bacteriana.
253
El modelo descrito se basa en una descripción idealizada de la desinfección

química. Por consiguiente, los parámetros cinéticos obtenidos son independientes del
tipo y el tamaño del reactor de laboratorio empleado, siempre y cuando se reproduzcan
las condiciones de funcionamiento reportados; es decir, las concentraciones del
oxidante, pH y condiciones isotérmicas.
El modelo se ajusta adecuadamente a lo observado experimentalmente,

permitiendo describir y explicar mecanisticamente lo que sucede durante el proceso de
inactivación.
El modelo cinético propuesto será de suma utilidad para el diseño de nuevos

reactores y su aplicación en cambios de escala del proceso.
VII.2 PERSPECTIVAS FUTURAS
A partir de los estudios realizados y de las conclusiones obtenidas, surgen nuevas

líneas a seguir en estudios futuros en la desinfección de aguas.
1.- Una de ellas es ampliar el estudio de procesos de desinfección de aguas para la

eliminación de microorganismos patógenos utilizando diferentes agentes oxidantes,
catalizadores y sus combinaciones, con y sin radiación UV, poniendo énfasis en la
descripción mecanística de los procesos de transporte y de reacción que gobiernan la
acción de los agentes utilizados, la comparación de la eficiencia de los desinfectantes
más utilizados, el conocimiento de la forma en que se produce la alteración de la
composición biológica que conduce a estos resultados y finalmente verificar la huella
ecológica de los desinfectantes sobre el ambiente, realizando estudios comparativos
entre los distintos procesos, lo que requiere la búsqueda de las condiciones operativas
óptimas para brindar la mayor eficiencia desinfectante del o los agentes utilizados.
2.-Cuantificar la forma y el grado en que se produce el daño sobre los

microorganismos durante proceso de desactivación y/ o muerte a través de técnicas de
PCR-electroforesis y microscopía de epifluorescencia.
254
3.- Realizar ensayos de toxicidad de los distintos desinfectantes con

microcrustáceos u otros indicadores de toxicidad característicos de la región litoral
argentina.
255
APENDICE I
APENDICE I. ENSAYOS EXPERIMENTALES CON E. coli
APENDICE I. ENSAYOS EXPERIMENTALES Escherichia coli
AI.1 GRILLAS EXPERIMENTALES APA COMERCIAL
Corrida N° 1 – 1 ppm Solución de APA.

Concentración de APA (1/200): 703,93 ppm APA – 1105 ppm H2O2 Dosis: 1 ppm APA
Volumen de APA (1/200) agregado: 2,84 ml Concentración de E. coli: 2,75E+05 UFC/cm3
Tiempo de Concentración de E. coli (UFC/cm3)
Retención Corrida N° 1 Corrida N° 2 Media [C] C/C0 Log [C/C0]
Hidráulico (s)
0 2,75E+05 2,75E+05 2,75E+05 1,00E+00 0,00E+00
10 2,64E+05 2,70E+05 2,67E+05 9,71E-01 -1,28E-02
20 2,63E+05 2,70E+05 2,66E+05 9,67E-01 -1,45E-02
30 2,59E+05 2,67E+05 2,63E+05 9,56E-01 -1,94E-02
60 2,51E+05 2,67E+05 2,59E+05 9,42E-01 -2,60E-02
90 2,38E+05 2,40E+05 2,39E+05 8,69E-01 -6,09E-02
120 2,29E+05 2,20E+05 2,25E+05 8,18E-01 -8,72E-02
150 2,29E+05 2,15E+05 2,22E+05 8,07E-01 -9,30E-02
180 2,36E+05 2,00E+05 2,18E+05 7,93E-01 -1,01E-01
210 2,18E+05 2,10E+05 2,14E+05 7,78E-01 -1,09E-01
240 2,20E+05 1,98E+05 2,09E+05 7,60E-01 -1,19E-01
270 2,04E+05 1,95E+05 2,00E+05 7,27E-01 -1,38E-01
300 2,00E+05 1,93E+05 1,97E+05 7,16E-01 -1,45E-01
600 6,54E+03 6,46E+03 6,50E+03 2,36E-02 -1,63E+00
Remoción/Inactivación(300 seg)=28,36% - Remoción/Inactivación(600 seg)=97,64%
Corrida N° 2 – 1,5 ppm Solución de APA.
Concentración de APA (1/200): 684,9 ppm APA – 1130,5 ppm H2O2 Dosis: 1,5 ppm APA
Hidráulico (s)
0 2,80E+05 2,80E+05 2,80E+05 1,00E+0 0,00E+00
10 2,60E+05 2,51E+05 2,56E+05 9,14E-01 -3,89E-02
20 2,51E+05 2,50E+05 2,51E+05 8,96E-01 -4,75E-02
30 2,50E+05 2,48E+05 2,49E+05 8,89E-01 -5,10E-02
60 2,45E+05 2,33E+05 2,39E+05 8,54E-01 -6,88E-02
90 2,20E+05 2,04E+05 2,12E+05 7,57E-01 -1,21E-01
120 1,94E+05 1,80E+05 1,87E+05 6,43E-05 -1,75E-01
150 1,49E+05 1,27E+05 1,38E+05 4,93E-01 -3,07E-01
180 1,08E+05 9,08E+04 9,94E+04 3,55E-01 -4,50E-01
210 7,16E+04 6,96E+04 7,06E+04 2,52E-01 -5,98E-01
240 5,29E+04 4,99E+04 5,14E+04 1,84E-01 -7,36E-01
270 3,92E+04 3,60E+04 3,76E+04 1,34E-01 -8,72E-01
256
300 2,71E+04 2,29E+04 2,50E+04 8,93E-02 -1,05E+00

Remoción/Inactivación(300 seg)= 91,07%
Hidráulico (s)
0 2,86E+05 2,86E+05 2,86E+05 1,00E+00 0,00E+00
10 2,40E+05 2,52E+05 2,46E+05 8,60E-01 -6,54E-02
20 2,31E+05 2,42E+05 2,37E+05 8,29E-01 -8,16E-02
30 2,32E+05 2,40E+05 2,36E+05 8,25E-01 -8,35E-02
60 2,19E+05 2,24E+05 2,22E+05 7,76E-01 -1,10E-01
90 1,80E+05 1,63E+05 1,72E+05 6,01E-01 -2,21E-01
120 1,42E+05 1,42E+05 1,42E+05 4,97E-01 -3,04E-01
150 2,89E+04 2,90E+04 2,90E+04 1,01E-01 -9,94E-01
180 2,98E+03 3,00E+03 2,99E+03 1,05E-02 -1,98E+00
210 2,35E+03 2,26E+03 2,31E+03 8,08E-03 -2,09E+00
240 1,02E+03 9,50E+02 9,85E+02 3,44E-03 -2,46E+00
270 6,10E+02 7,50E+02 6,80E+02 2,38E-03 -2,62E+00
300 3,00E+02 3,00E+02 3,00E+02 1,05E-03 -2,98E+00
Hidráulico (s)
0 2,80E+05 2,80E+05 2,80E+05 1,00E+00 0,00E+00
10 2,41E+05 2,10E+05 2,26E+05 8,07E-01 -9,30E-02
20 2,11E+05 1,93E+05 2,02E+05 7,21E-01 -1,42E-01
30 1,97E+05 1,89E+05 1,93E+05 6,89E-01 -1,62E-01
60 1,90E+05 1,71E+05 1,81E+05 6,46E-01 -1,89E-01
90 1,02E+05 8,00E+04 9,10E+04 3,25E-01 -4,88E-01
120 5,10E+03 1,95E+04 1,23E+04 4,39E-02 -1,36E+00
150 3,55E+03 3,55E+03 3,55E+03 1,27E-02 -1,90E+00
180 1,19E+03 1,08E+03 1,14E+03 4,07E-03 -2,39E+00
210 7,22E+02 7,16E+02 7,19E+02 2,57E-03 -2,59E+00
240 3,80E+02 3,30E+02 3,55E+02 1,27E-03 -2,90E+00
270 3,70E+02 2,00E+02 1,95E+02 6,96E-04 -3,16E+00
300 7,00E+01 1,08E+02 8,90E+01 3,18E-04 -3,50E+00
257

Hidráulico (s)
0 2,45E+05 2,45E+05 2,45E+05 1,00E+00 0,00E+00
10 1,98E+05 1,91E+05 1,95E+05 7,96E-01 -9,91E-02
20 1,70E+05 1,68E+05 1,69E+05 6,90E-01 -1,16E-01
30 1,60E+05 1,57E+05 1,59E+05 6,49E-01 -1,88E-01
60 3,17E+04 2,85E+04 3,01E+04 1,23E-01 -9,11E-01
90 9,80E+03 7,30E+03 8,55E+03 3,49E-02 -1,46E+00
120 1,38E+03 1,20E+03 1,29E+03 5,27E-03 -2,28E+00
150 4,30E+02 5,30E+02 4,80E+02 1,96E-03 -2,71E+00
180 3,00E+01 3,00E+01 3,00E+01 1,22E-04 -3,91E+00
210 x x x x X
240 x x x x X
270 x x x x X
300 x x x x X
Hidráulico (s)
0 2,70E+05 2,70E+05 2,70E+05 1,00E+00 0,00E+00
10 1,70E+05 1,59E+05 1,65E+05 6,11E-01 -2,14E-01
20 1,35E+05 1,21E+05 1,28E+05 4,74E-01 -3,24E-01
30 8,00E+04 7,30E+04 7,65E+04 2,83E-01 -5,41E-01
60 7,90E+03 7,30E+03 7,60E+03 2,81E-02 -1,55E+00
90 6,10E+02 6,00E+02 6,05E+02 2,24E-03 -2,65E+00
120 5,00E+01 5,00E+01 5,00E+01 1,85E-04 -3,73E+00
150 x x x x X
180 x x x x X
210 x x x x X
240 x x x x X
270 x x x x X
300 x x x x X
258

Hidráulico (s)
0 2,09E+05 2,09E+05 2,09E+05 1,00E+00 0,00E+00
10 9,60E+04 9,90E+04 9,75E+04 4,67E-01 -3,31E-01
20 6,20E+04 7,40E+04 6,80E+04 3,25E-01 -4,88E-01
30 2,20E+04 3,00E+04 2,60E+04 1,24E-01 -9,05E-01
60 7,00E+02 2,00E+03 1,35E+03 6,46E-03 -2,19E+00
90 3,00E+01 3,00E+01 3,00E+01 1,44E-04 -3,84E+00
120 x x x x X
150 x x x x X
180 x x x x X
210 x x x x X
240 x x x x X
270 x x x x X
300 x x x x X
Hidráulico (s)
0 2,98E+05 2,98E+05 2,98E+05 1,00E+00 0,00E+00
10 1,26E+05 1,50E+05 1,38E+05 4,63E-01 -3,34E-01
20 5,50E+04 5,60E+04 5,55E+04 1,86E-01 -7,30E-01
30 1,30E+03 2,00E+03 1,65E+03 5,54E-03 -2,26E+00
60 1,00E+02 1,30E+02 1,15E+02 3,86E-04 -3,41E+00
90 x x x x X
120 x x x x X
150 x x x x X
180 x x x x x
210 x x x x x
240 x x x x x
270 x x x x x
300 x x x x x
259
Tabla 9. Fracción de Remoción/Inactivación

Tiempo C/C0
(s) 1 ppm 1,5 ppm 2 ppm 3ppm 4 ppm 5 ppm 6ppm 8 ppm
0 1,00E+0 1,00E+0 1,00E+0 1,00E+0 1,00E+0 1,00E+0 1,00E+0 1,00E+0
10 9,71E-1 9,14E-1 8,60E-1 8,07E-1 7,96E-1 6,11E-1 4,67E-1 4,63E-1
20 9,67E-1 8,96E-1 8,29E-1 7,21E-1 6,90E-1 4,74E-1 3,25E-1 1,86E-1
30 9,56E-1 8,89E-1 8,25E-1 6,89E-1 6,49E-1 2,83E-1 1,24E-1 5,54E-3
60 9,42E-1 8,54E-1 7,76E-1 6,46E-1 1,23E-1 2,81E-2 6,46E-3 3,86E-4
90 8,69E-1 7,21E-1 6,01E-1 3,25E-1 3,49E-2 2,24E-3 1,44E-4 x
120 8,18E-1 6,36E-1 4,97E-1 4,39E-2 5,27E-3 x x x
150 8,07E-1 2,86E-1 1,01E-1 1,27E-2 1,96E-3 x x x
180 7,93E-1 9,11E-2 1,05E-2 4,07E-3 1,22E-4 x x x
210 7,78E-1 7,93E-2 8,08E-3 2,57E-3 x x x x
240 7,60E-1 5,11E-2 3,44E-3 1,27E-3 x x x x
270 7,27E-1 4,14E-2 2,38E-3 6,96E-4 x x x x
300 7,16E-1 2,75E-2 1,05E-3 3,18E-4 x x x x
AI. 2GRILLA EXPERIMENTAL UV Y UV/APA
Corrida N° 1 – UV-C.
Concentración de E. coli: 2,91E+05 UFC/cm3
Hidráulico (s)
0 2,91E+05 2,91E+05 2,91E+05 1,00E+00 0,00E+00
1 2,47E+05 2,53E+05 2,50E+05 8,59E-01 -6,59E-02
2 2,26E+05 2,36E+05 2,31E+05 7,95E-01 -9,98E-02
3 1,21E+05 1,31E+05 1,26E+05 4,32E-01 -3,65E-01
4 2,68E+04 2,76E+04 2,72E+04 9,33E-02 -1,03E+00
5 4,20E+03 4,40E+03 4,30E+03 1,48E-02 -1,83E+00
6 1,75E+03 1,83E+03 1,79E+03 6,17E-03 -2,21E+00
7 8,60E+02 9,00E+02 8,80E+02 3,02E-03 -2,52E+00
8 x x x x x
260
Corrida N° 2 – UV-C / 1 ppm APA.

Concentración de APA (1/200): 637,34 ppm APA – 1028,5 ppm H2O2 Dosis: 1 ppm APA
Hidráulico (s)
0 2,90E+05 2,90E+05 2,90E+05 1,00E+0 0,00E+00
1 2,66E+05 2,31E+05 2,49E+05 8,57E-01 -6,71E-02
2 2,46E+05 2,12E+05 2,29E+05 7,90E-01 -1,03E-01
3 1,25E+05 1,19E+05 1,22E+05 4,21E-01 -3,76E-01
4 2,26E+04 2,18E+04 2,22E+04 7,66E-02 -1,12E+00
5 3,00E+03 2,96E+03 2,98E+03 1,03E-02 -1,99E+00
6 1,26E+03 1,14E+03 1,20E+03 4,14E-03 -2,38E+00
7 7,50E+02 6,10E+02 6,80E+02 2,34E-03 -2,63E+00
8 x x x
Hidráulico (s)
0 2,96E+05 2,96E+05 2,96E+05 1,00E+00 0,00E+00
1 2,89E+05 2,73E+05 2,81E+05 9,49E-01 -2,26E-02
2 2,79E+05 2,72E+05 2,76E+05 9,32E-01 -3,12E-02
3 1,18E+05 1,08E+05 1,13E+05 3,82E-01 -4,20E-01
4 1,82E+04 1,66E+04 1,74E+04 5,88E-02 -1,23E+00
5 2,10E+03 2,00E+03 2,05E+03 6,93E-03 -2,16E+00
6 1,10E+03 9,00E+02 1,00E+03 3,38E-03 -2,47E+00
7 7,00E+02 6,60E+02 6,80E+02 2,30E-03 -2,64E+00
8 x x x x x
261

Hidráulico (s)
0 2,90E+05 2,90E+05 2,90E+05 1,00E+00 0,00E+00
1 2,84E+05 2,74E+05 2,80E+05 9,67E-01 -1,45E-02
2 2,67E+05 2,57E+05 2,62E+05 9,03E-01 -4,42E-02
3 1,54E+05 1,48E+05 1,51E+05 5,22E-01 -2,83E-01
4 2,36E+04 2,26E+04 2,31E+04 7,96E-02 -1,10E+00
5 2,97E+03 2,95E+03 2,96E+03 1,02E-02 -1,99E+00
6 9,60E+02 7,60E+02 8,60E+02 2,97E-03 -2,53E+00
7 3,10E+02 3,00E+02 3,05E+02 1,05E-03 -2,98E+00
8 x x x x x
Hidráulico (s)
0 3,16E+05 3,16E+05 3,16E+05 1,00E+00 0,00E+00
1 2,80E+05 2,74E+05 2,77E+05 8,75E-01 -5,80E-02
2 2,40E+05 2,35E+05 2,38E+05 7,52E-01 -1,24E-01
3 1,15E+05 1,07E+05 1,11E+05 3,52E-01 -4,54E-01
4 3,04E+04 3,00E+04 3,02E+04 9,55E-02 -1,02E+00
5 5,70E+03 4,30E+03 5,00E+03 1,58E-02 -1,80E+00
6 1,41E+03 1,10E+03 1,26E+03 3,97E-03 -2,40E+00
7 8,00E+02 7,30E+02 7,65E+02 2,42E-03 -2,61E+00
8 x x x x x
262

Hidráulico (s)
0 3,42E+05 3,42E+05 3,42E+05 0,00E+00 0,00E+00
1 3,18E+05 3,00E+05 3,09E+05 9,04E-01 -4,41E-02
2 2,89E+05 2,89E+05 2,89E+05 8,45E-01 -7,31E-02
3 1,68E+05 1,58E+05 1,63E+05 4,77E-01 -3,22E-01
4 3,10E+04 2,90E+04 3,00E+04 8,77E-02 -1,06E+00
5 2,50E+03 2,00E+03 2,25E+03 6,58E-03 -2,18E+00
6 8,50E+02 7,60E+02 8,05E+02 2,35E-03 -2,63E+00
7 5,10E+02 5,00E+02 5,05E+02 1,48E-03 -2,83E+00
8 x x x x x
Corrida N° 7 – UV-C / 6 ppm.
Hidráulico (s)
0 2,98E+05 2,98E+05 2,98E+05 1,00E+00 0,00E+00
1 2,94E+05 2,90E+05 2,92E+05 9,80E-01 -8,83E-03
2 2,42E+05 2,16E+05 2,29E+05 7,67E-01 -1,15E-01
3 6,70E+04 6,30E+04 6,50E+04 2,18E-01 -6,61E-01
4 6,16E+03 6,00E+03 6,08E+03 2,04E-02 -1,69E+00
5 1,22E+03 1,00E+03 1,11E+03 3,72E-03 -2,43E+00
6 6,00E+02 5,60E+02 5,80E+02 1,95E-03 -2,71E+00
7 4,40E+02 3,40E+02 3,90E+02 1,31E-03 -2,88E+00
8 x x x x x
263

Hidráulico (s)
0 2,05E+05 2,05E+05 2,05E+05 1,00E+00 0,00E+00

1 2,00E+05 1,89E+05 1,95E+05 9,51E-01 -2,18E-02
2 1,67E+05 1,44E+05 1,56E+05 7,60E-01 -1,19E-01
3 3,50E+04 3,20E+04 3,35E+04 1,63E-01 -7,87E-01
4 3,40E+03 3,10E+03 3,25E+03 1,58E-02 -1,80E+00
5 6,50E+02 6,20E+02 6,35E+02 3,09E-03 -2,51E+00
6 3,40E+02 3,00E+02 3,20E+02 1,56E-03 -2,81E+00
7 2,10E+02 2,00E+02 2,20E+02 1,07E-03 -2,97E+00
8 x x x x x
Corrida N° 9 – UV-C / 10 ppm.
Hidráulico (s)
0 1,63E+05 1,63E+05 1,63E+05 1,00E+00 0,00E+00
1 1,49E+05 1,31E+05 1,40E+05 8,62E-01 -6,47E-02
2 1,40E+05 1,00E+05 1,20E+05 7,38E-01 -1,32E-01
3 2,30E+04 2,22E+04 2,26E+04 1,39E-01 -8,57E-01
4 2,10E+03 2,00E+03 2,05E+03 1,26E-02 -1,90E+00
5 4,40E+02 3,60E+02 4,00E+02 2,45E-03 -2,61E+00
6 2,20E+02 1,90E+02 2,05E+02 1,26E-03 -2,90E+00
7 x x x x x
8 x x x x x
Remoción/Inactivación(7 seg)= 99,99% - Remoción/Inactivación(7 seg)= 99,87%
264
AI. 3 DATOS EXPERIMENTALES UTILIZADOS EN EL MODELO CINETICO
AI.3.1 ACIDO PERACÉTICO INHIBIENDO PERÓXIDO
C APA Tiempo CEc

(ppm) (s) (UFC/ml)
4 0 2.88E+05 2.88E+05
1.00E+01 2.82E+05 2.70E+05
2.00E+01 2.63E+05 2.34E+05
3.00E+01 2.57E+05 1.94E+05
6.00E+01 1.84E+05 9.82E+04
9.00E+01 1.06E+05 4.67E+04
1.20E+02 2.99E+04 2.18E+04
1.50E+02 1.38E+04 1.01E+04
1.80E+02 2.10E+03 4.70E+03
2.10E+02 1.56E+03 2.18E+03
2.40E+02 7.95E+02 1.01E+03
2.70E+02 4.00E+02 4.68E+02
3.00E+02 2.10E+02 2.17E+02
5 0 2.66E+05 2.66E+05
1.00E+01 2.39E+05 2.42E+05
2.00E+01 2.06E+05 1.97E+05
3.00E+01 2.01E+05 1.53E+05
6.00E+01 1.15E+05 6.28E+04
9.00E+01 7.85E+04 2.44E+04
1.20E+02 1.72E+04 9.35E+03
1.50E+02 2.93E+03 3.58E+03
1.80E+02 1.90E+03 1.37E+03
2.10E+02 8.30E+02 5.24E+02
2.40E+02 5.65E+02 2.00E+02
2.70E+02 2.55E+02 7.67E+01
3.00E+02 8.00E+01 2.93E+01
6 0 2.92E+05 2.92E+05
1.00E+01 2.48E+05 2.57E+05
2.00E+01 1.89E+05 1.96E+05
3.00E+01 1.55E+05 1.42E+05
6.00E+01 2.42E+04 4.73E+04
9.00E+01 1.22E+04 1.51E+04
9.10E+01 1.22E+04 1.45E+04
1.20E+02 2.88E+03 4.76E+03
1.21E+02 2.88E+03 4.58E+03
265
1.50E+02 5.70E+02 1.50E+03

1.51E+02 5.70E+02 1.45E+03
1.80E+02 2.00E+02 4.75E+02
1.81E+02 2.00E+02 4.57E+02
AI. 3.2 PEROXIDO DE HIDROGENO
CHP Tiempo CEC

ppm (s) (UFC/ml)
15 0 2.80E+05 2.80E+05
3.00E+02 2.60E+05 2.67E+05
6.00E+02 2.54E+05 2.54E+05
1.20E+03 1.98E+05 2.29E+05
1.80E+03 1.78E+05 2.06E+05
3.60E+03 1.50E+05 1.50E+05
5.40E+03 1.19E+05 1.10E+05
7.20E+03 6.56E+04 8.04E+04
9.00E+03 4.63E+04 5.87E+04
25 0 2.80E+05 2.80E+05
3.00E+02 2.45E+05 2.58E+05
6.00E+02 2.19E+05 2.37E+05
1.20E+03 1.73E+05 1.99E+05
1.80E+03 1.42E+05 1.67E+05
3.60E+03 7.52E+04 9.89E+04
5.40E+03 4.22E+04 5.86E+04
7.20E+03 2.86E+04 3.47E+04
9.00E+03 2.11E+04 2.06E+04
33 0 2.80E+05 2.80E+05
3.00E+02 2.40E+05 2.51E+05
6.00E+02 1.92E+05 2.24E+05
1.20E+03 1.25E+05 1.78E+05
1.80E+03 1.02E+05 1.41E+05
3.60E+03 5.35E+04 7.08E+04
5.40E+03 3.76E+04 3.55E+04
7.20E+03 2.42E+04 1.78E+04
9.00E+03 9.10E+03 8.91E+03
266
AI.3.3 SOLUCION COMERCIAL DE APA
C APA Tiempo CEc

(ppm) (s) (UFC/ml)
5 0 2.70E+05 2.70E+05
1.00E+01 1.65E+05 1.90E+05
2.00E+01 1.28E+05 9.93E+04
3.00E+01 7.65E+04 4.67E+04
6.00E+01 7.60E+03 4.02E+03
9.00E+01 6.05E+02 3.22E+02
1.20E+02 5.00E+01 2.55E+01
6 0 2.09E+05 2.09E+05
1.00E+01 9.75E+04 1.28E+05
2.00E+01 6.80E+04 5.46E+04
3.00E+01 2.60E+04 2.09E+04
6.00E+01 8.32E+02 9.91E+02
6.10E+01 8.32E+02 8.94E+02
9.00E+01 3.00E+01 4.51E+01
8 0 2.98E+05 2.98E+05
1.00E+01 1.38E+05 1.40E+05
2.00E+01 5.55E+04 4.11E+04
3.00E+01 9.42E+03 1.09E+04
3.10E+01 9.42E+03 9.50E+03
5.90E+01 1.00E+02 2.06E+02
6.00E+01 1.00E+02 1.79E+02
267
APÉNDICE II
APENDICE II CATÁLOGO LAMPARA PHILIPS TUV 15
TUV T8
TUV 15W SLV
Lámparas de descarga de vapor de mercurio a baja presión con una

ampolla tubular de cristal
Datos del producto
• Características Generales
Descripción del - • Características de Dimensiónes
Sistema
Longitud Casquillo- 437.4 (max) mm
Base/Casquillo G13
-Casquillo A
Forma de la lámpara T26
Longitud B de Inser- 442.1 (min), 444.5 (max) mm
Aplicación Principal Desinfección
ción
Vida útil 9000 hr
Longitud Total C 451.6 (max) mm
Diámetro D 28 (max) mm
• Característcas de la Fuente de Luz
Designación de - • Datos Producto
Color
Código de pedido 726179 40
Código de producto 871150072617940
• Características Eléctricas Nombre de Producto TUV 15W SLV
Nombre de pedido TUV 15W SLV/25
Pot. de la Lámpara 15 W
del producto
Estimada
Piezas por caja 1
Potencia Técnica de 15.9 W
Configuración de 25
la Lámpara
embalaje
Voltaje de la Lámpara 54 V
Cajas por caja exte- 25
Corriente de la 0.34 A
rior
Lámpara
Código de barras del 8711500726179
producto
• Características Medioambientales Código de barras de 8711500638618
la caja exterior
Contenido de 2.0 mg
Código logístico - 928039004005
mercurio (Hg)
12NC
Peso neto por pieza 81.600 gr
• Características relativas a UV
Radiación UVC 4.9 W
268
APENDICE II CATÁLOGO LAMPARA PHILIPS TUV 15
TUV T8
Plano de dimensiones
TUV 15W SLV

Product A (Max) B (Min) B (Max) C (Max) D (Max)
TUV TL-D 15W 437.4 442.1 444.5 451.6 28
D
A
B
C
13
TL-D Coloured Casquillo
Datos fotométricos
%
100
% 100
80
80
60
60
40
40
20 20
200 300 400 500 600 700 l nm 200 300 400 500 600 700 λ [nm]
TUV T8 TUV T8
© 2013 Koninklijke Philips Electronics N.V.

Todos los derechos reservados.
Las especificaciones están sujetas a cambios sin previo aviso. Las marcas registradas son propiedad
de Koninklijke Philips Electronics N.V. o de sus respectivos propietarios.
www.philips.com/lighting 2013, Mayo 9

Datos sujetos a cambios
269
APÉNDICE III
APENDICE III MODELADO MOLECULAR CON VMD
APENDICE III. MODELADO MOLECULAR CON VMD

AIII.1 LECTURA DEL PROGRAMA
Info) VMD for WIN32, version 1.9.1 (February 1, 2012)
Info) http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/
Info) Email questions and bug reports to [email protected]
Info) Please include this reference in published work using VMD:
Info) Humphrey, W., Dalke, A. and Schulten, K., `VMD - Visual
Info) Molecular Dynamics', J. Molec. Graphics 1996, 14.1, 33-38.
Info) -------------------------------------------------------------
Info) Multithreading available, 4 CPUs detected.
Info) Free system memory: 418MB (21%)
Info) OpenGL renderer: Intel(R) HD Graphics
Info) Features: STENCIL MDE CVA MTX NPOT PP PS GLSL(OVF)
Info) Full GLSL rendering mode is available.
Info) Textures: 2-D (8192x8192), 3-D (256x256x256), Multitexture (8)
Info) Spaceball driver not installed. Spaceball interface disabled.
Info) No joysticks found. Joystick interface disabled.
Info) Dynamically loaded 69 plugins in directory:
Info) C:/Program Files (x86)/University of Illinois/VMD/plugins/WIN32/molfile
Info) File loading in progress, please wait.
Info) Using plugin pdb for structure file C:\Users\marina\Downloads\1DNP.pdb
Info) Using plugin pdb for coordinates from file C:\Users\marina\Downloads\1DNP.
pdb
Info) Determining bond structure from distance search ...
270
APENDICE III MODELADO MOLECULAR CON VMD
Info) Eliminating bonds duplicated from existing structure...
Info) Finished with coordinate file C:\Users\marina\Downloads\1DNP.pdb.
Info) Analyzing structure ...
Info) Atoms: 8081
Info) Bonds: 7930
Info) Angles: 0 Dihedrals: 0 Impropers: 0 Cross-terms: 0
Info) Bondtypes: 0 Angletypes: 0 Dihedraltypes: 0 Impropertypes: 0
Info) Residues: 1315
Info) Waters: 373
Info) Segments: 1
Info) Fragments: 379 Protein: 4 Nucleic: 0
vmd >
271
APÉNDICE IV
APENDICE IV
CARACTERÍSTICAS DEL MICROORGANISMO MODELO ESTUDIADO (2):

Pseudomonas aeruginosa. DATOS GENERALES. DESARROLLO
EXPERIMENTAL
Pseudomonas aer uginosa pertenece a la familia Pseudomonadaceae y es un

bacilo Gram negativo aerobio estricto con único flagelo polar. No muestra
metabolismo fermentativo ni forman esporas. Tiene requerimientos nutritivos muy
sencillos pues no presenta exigencias nutricionales, crece quimiorganotróficamente a
pH neutro y temperaturas en la zona de la mesofilia. Por lo general lo hace muy bien a
las 24 horas. En medios como el agar M üeller-H inton o tripticasa de soja exhiben un
pigmento color verde característico. Algunas cepas, en particular las aisladas de
pacientes con enfermedades respiratorias, son extremadamente mucosas. El
polimorfismo cultural (colonias de diferentes tamaños) es relativamente común.
La mayoría de las cepas son fácilmente reconocidas por la producción de un

pigmento verde, que es el resultado de la mezcla de dos pigmentos hidrosolubles: la
piocianina (azul) y la pioverdina (amarillo fluorescente). El primero es exclusivo de esta
especie, por lo que su presencia basta para la identificación de la misma. La pioverdina,
en cambio, es un pigmento común de las especies de Pseudomonas del grupo
fluorescente (P. putida y P. fluor escens, además de P. aer uginosa)
Pseudomonas aer uginosa produce catalasa y oxidasa, así como amoníaco a

partir de arginina, y puede utilizar citrato como única fuente de carbono. Las colonias
presentan un olor dulzón (frutal) característico debido a la producción del compuesto 2
-aminocetofenona.
AIV. 1 HABITAD
Pseudomonas aer uginosa se encuentra ampliamente distribuida en la

naturaleza. Se puede aislar de muestras de suelo, aguas puras y contaminadas, así como
de plantas y animales (Hardalo y Edberg, 1997). Puede proliferar en ambientes
272
acuáticos, así como en superficies de materias orgánicas propicias en contacto con el

agua. Generalmente se encuentra en aguas superficiales luego de tormentas y lluvias, lo
cual sugiere que el suelo y la vegetación son importantes reservorios del agente
(Geldreich, 1999).
Esta bacteria es capaz de utilizar una enorme variedad de compuestos orgánicos

como sustrato para crecer, capacidad que le permite colonizar nichos en los que los
nutrientes son escasos.
Esta habilidad para adaptarse y crecer en cualquier hábitat explica su constante

presencia en el medio ambiente (M enna y Gerba, 2009).
El hallazgo de P. aer uginosa en balones de agua destilada de hospitales y su

presencia en reservorios de agua potable (tanques domiciliarios, tanques cisterna,
depósitos de medios de transporte) con mayor frecuencia y en concentraciones elevadas,
ha sido atribuido a la posible multiplicación y mayor supervivencia de la misma en
relación con las demás bacterias comúnmente aisladas del agua (Calderón, 1976). Bajas
concentraciones en agua embotellada pueden subsistir por meses dado que esta bacteria
tiene la capacidad de enlentecer su metabolismo para perdurar con trazas de carbono y
nitrógeno como nutrientes (Geldreich, 1999).
La epidemiología de esta especie refleja una predilección por ambientes húmedos,

su identificación y colonización está en función de la humedad. En la comunidad se las
puede hallar en piletas de natación, hidromasajes, floreros, soluciones de limpieza,
desinfectantes, etc. La colonización en humanos también depende de la humedad,
encontrándose en perineo, axilas y oídos.
Contrariamente a lo que parece todos nosotros estamos en contacto diariamente

con P. aer uginosa. Se ha detectado como parte de la flora normal corporal
obteniéndose aislamientos de esta bacteria a partir de entre el 2 y el 8% de heces de
personas sanas (H ardalo y Edberg, 1997) lo que nos muestra que nuestro contacto con la
misma es cotidiano y representa una amenaza para la salud en condiciones especiales.
273
AIV.1.1.PATOGENIA Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Pseudomonas aer uginosa es un patógeno oportunista que si bien no está

catalogado como agente patógeno en sentido propio, puede causar enfermedades a las
personas cuyos mecanismos de defensa locales o generales son deficientes. Es decir
ancianos, lactantes, quienes han sufrido quemaduras o heridas extensas, enfermos
sometidos a un tratamiento inmunosupresor o que padecen el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SI DA), patologías que cursan con deterioro del sistema
inmunológico como cáncer, desnutrición y diabetes . Una vez que se produce la
infección, este microorganismo genera una serie de compuestos tóxicos que no solo
causan daño tisular extenso (Britigan et al., 1992) sino adicionalmente interfieren con el
funcionamiento del sistema inmune (Döring et al., 1987).
Existe un grupo poblacional, formado por los enfermos de fibrosis quística,

especialmente vulnerable a las infecciones con P. aer uginosa (Pier GB., 1985). La
misma infecta el tracto respiratorio de 60-87% de los pacientes fibroquísticos
convirtiéndose en el microorganismo de infección predominante (Fick, 1992). En este
caso los factores de adherencia bacteriana juegan un papel significativo en la
patogénesis de la infección respiratoria y están involucrados en la invasión pulmonar de
los pacientes.
Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales agentes de infecciones

oportunistas en pacientes hospitalizados. Es responsable de alrededor del 20% de las
infecciones nosocomiales. Se halla entre los primeros agentes más frecuentes de
bacteriemia por gram negativos y se la asocia con una alta tasa de mortalidad
(Basualdo, 2006). Ha sido reportada como causante del 11% de infecciones urinarias,
8% de infecciones en el sitio quirúrgico, 16% de neumonías y 3-4% de septicemias
nosocomiales (Dembry et al., 1998; Trautmann et al., 2005). Esta situación se ve
agravada por la dificultad para tratar las infecciones por P. aer uginosa, ya que esta
bacteria presenta una muy alta resistencia natural a distintos antibióticos y a
desinfectantes (Hardalo y Edberg, 1997). Se ha sobrevivir y multiplicarse en aguas
tratadas debido a la densa capa polisacárida que establece una barrera física como
274
química capaz de proteger a la bacteria de las moléculas e iones de cloro libre residual
(Reilly, 2000).
La mayoría de las infecciones causadas por P. aer uginosa adquiridas en el

entorno hospitalario resultan del contacto o del uso de fluidos contaminados co mo
agua, desinfectantes, soluciones de limpieza, etc. (M ena y Gerba, 2009). El agua de
canilla es fuente importante de infección nosocomial tanto por contacto directo del
paciente como cuando se utiliza para preparación de soluciones o lavado de material y
equipamiento médico (Bert et al., 1998, Vanholder et al.,1990). La bacteria se adhiere
a la superficie de los instrumentos produciendo una especie de agregado llamado
biofilm (Costerton et al., 1994) que contamina por ejemplo catéteres, válvulas
cardíacas, sondas urinarias o tubos endotraqueales. M ás del 80% de las bacteriemias
nosocomiales resultan de la contaminación de catéteres intravasculares (Archibald y
Gaynes, 1997). Definitivamente, la estancia hospitalaria prolongada, especialmente en
unidades de cuidado intensivo y la presión de selección de los antibióticos son los
factores que favorecen la aparición de cepas multirresistentes. Este hecho, convierte a la
infección por P. aer uginosa en un verdadero problema de salud pública que afecta no
solo el curso de la evolución del paciente sino que aumenta la estancia hospitalaria, el
uso de antibióticos y los costos de los servicios de salud.
En el caso de huéspedes no comprometidos, P. aer uginosa es responsable de

infecciones en ojo, oído y piel a partir de agua contaminada. La incidencia de
colonización por la bacteria en personas sanas es relativamente baja en comparación a
las hospitalizadas, siendo del 0 -2% en piel, 0-3,3% en mucosa nasal y 0-6,6% en
garganta (Pollack 1995).
275
AIV. 2 EXPERIMENTAL Pseudomonas aeruginosa
A4.2.1 ACTIVACIÓN DE LA CEPA ATCC 15442 Pseudomonas aeruginosa
• Día 1:
Acondicionamiento del material de trabajo y preparación de los medios de cultivo

necesarios (Ver tabla resumen al final del documento).
A última hora de la tarde, inoculación del medio complejo con la cepa ATCC
liofilizada.
Procedimiento:
 I nocular con las células liofilizadas un erlenmeyer con 150 ml de caldo

nutritivo.
 Llevar a estufa a 37°C por 24 horas
• Día 2:
A última hora de la tarde, primeros repiques en erlenmeyer y tubos de ensayo.
Procedimiento:
 Tomar 1ml del caldo nutritivo incubado y descargar en un nuevo

erlenmeyer con 150 ml de caldo nutritivo.
 Tomar otro ml del caldo nutritivo incubado y descargar en un tubo de

ensayo con 9 ml de caldo nutritivo.
 Repetir el paso anterior en 2 nuevos tubos de ensayos con 9 ml de caldo

nutritivo.
NOTA: un tubo de ensayo será utilizado al día siguiente para realizar las
observaciones microscópicas; otro para realizar estrías en agar cetrimide, y el último
para plaqueos en agar cetrimide a partir de diluciones seriadas.
276
 Llevar el erlenmeyer y los tubos a estufa por 24 horas a 37°C.
• Día 3:
Primeras horas de la tarde: observaciones microscópicas y pruebas bioquímicas.
Realización de estrías.
Realización de plaqueos
Últimas horas de la tarde: segundos repiques.
Procedimiento:
 De un tubo de ensayo incubado:
 Realizar 10 estrías en agar cetrimide, entre mecheros.
De otro tubo de ensayo incubado:
 Tomar 1 ml y llevar a 9 ml de agua de peptona. Homogeneizar en vortex.
 Tomar 1 ml del tubo con agua de peptona inoculado y llevar a un nuevo

tubo con 9 ml de agua de peptona. Homogeneizar en vortex.
 Repetir el procedimiento hasta obtener 9 tubos con agua de peptona

inoculados, respetando la secuencia de las diluciones seriadas.
 Tomar 0,1ml de las diluciones seriadas y descargar el contenido en las

placas de petri con agar cetrimide, comenzando desde el tubo más
diluido al más concentrado.
 Tomar 0,1 ml del tubo inoculado y descargar en otra placa de petri con
agar cetrimide.
 Distribuir uniformemente el liquido descargado sobre las placas de petri

inoculadas con ansa de vidrio.
277
 Dejar secar y llevar luego a estufa a 37°C por 24 horas para incubación
(en forma invertida).
 Llevar a estufa el tubo de ensayo con el inoculo inicial por 24 horas más
a 37°C.
De otro tubo de ensayo incubado:
 Observaciones microscópicas.
Del erlenmeyer incubado:
 Tomar 1 ml y llevar a 9 ml de caldo nutritivo en tubos de fondo cónico

para centrífuga (de 15ml con tapa a rosca).
 Repetir el procedimiento hasta alcanzar un total de 15 tubos inoculados.
 Llevar a estufa a 37°C por 12-18 horas.
• Día 4:
Primeras horas de la mañana: preparado de los tubos inoculados para su

mantención en freezer.
Por la tarde: observación de las placas de petri. Recuentos. Plaqueo a partir de

diluciones seriadas del cultivo en tubo de ensayo con 48 horas de incubación.
Procedimiento:
Para cada uno de los tubos de centrifuga incubados:
 Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos.
 Descargar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de solución salina.

Centrifugar en iguales condiciones (1er lavado).
 Repetir el paso anterior (2do lavado).
 Descargar el sobrenadante y resuspender en 5 ml de caldo nutritivo con

278
glicerol al 15%.
 Llevar al freezer.
Para el tubo con 48 hs de incubación:
 Realizar el plaqueo en placas de petri con agar cetrimide, de igual

manera a como fuera realizado el día anterior. Llevar a estufa a 37°C por
24 horas.
• Día 5:
Recuento de las placas.
Tabla AIV. 1 Material necesario Activación P. aeruginosa
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5
Caldo Nutritivo en Erlenmeyer 150 150

ml ml
Caldo Nutritivo en Tubos 27 ml 135 ml 162 ml
Agar cetrimide para estrías 90 ml
Agar cetrimide en placas 250 ml 250 ml 500 ml
Agua de peptona para dilución 81 ml 81 ml 162 ml

seriada
Solución fisiológica 300 ml
Caldo Nutritivo + glicerol 75 ml
279
Figura AIV. 1 Estria P. aeruginosa
Figura AIV.2 Comparación de placas de P aeruginosa: dilución (izquierda), sin diluir (derecha)
280
Figura AIV. 3 P. aeruginosa bajo luz UV
Figura AIV.4 Confección de la curva de calibrado
281
AIV.3 ENSAYOS EXPERIMENTALES CON Pseudomonas aeruginosa

Volumen de APA (1/200) agregado: 2,84 ml Concentración de Ps: 2,77E+05 UFC/cm3
Tiempo Corrida1: Conc. Ps

0 2,77E+05
10 2,60E+05
20 2,59E+05
30 2,57E+05
60 2,50E+05
90 2,29E+05
120 2,27E+05
150 2,27E+05
180 2,24E+05
210 2,15E+05
240 2,15E+05
270 2,04E+05
300 2,00E+05
600 6,10E+03
282
Corrida N° 2 – 1,5 ppm Solución de APA.

Concentración de APA (1/200): 684,9 ppm APA – 1130,5 ppm H2O2 Dosis: 1,5 ppm APA
Volumen de APA (1/200) agregado: 4,38 ml Concentración de Ps. 2,80E+05 UFC/cm3
Tiempo Corrida 1: Conc. Ps

0 2,80E+05
10 2,62E+05
20 2,50E+05
30 2,48E+05
60 2,45E+05
90 2,18E+05
120 1,90E+05
150 1,30E+05
180 7,28E+04
210 7,16E+04
240 5,00E+04
270 3,70E+04
300 1,00E+04


0 2,79E+05
10 2,35E+05
20 2,21E+05
30 2,22E+05
60 2,19E+05
90 1,70E+05
120 1,30E+05
150 2,79E+04
180 2,80E+03
210 2,22E+03
240 1,00E+03
270 4,10E+02
300 3,00E+02
283


0 2,80E+05
10 2,20E+05
20 1,99E+05
30 1,97E+04
60 5,10E+03
90 3,55E+03
120 7,22E+02
150 3,80E+02
180 1,19E+03
210 7,00E+01
240 5,00 E +01
270 X
300 X


0 2,60E+05
10 1,70E+05
20 3,10E+04
30 3,17E+04
60 1,38E+03
90 9,80E+03
120 3,30E+02
150 2,00E+01
180 x
210 x
240 x
270 x
300 x
284


0 2,70E+05
10 8,70E+04
20 8,00E+04
30 7,90E+03
60 5,00E+01
90 x
120 x
150 x
180 x
210 x
240 x
270 x
300 x
285
APÉNDICE V
Chemical Engineering Journal 198–199 (2012) 388–396
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Chemical Engineering Journal

journal homepage: www.elsevier.com/locate/cej
Chemical disinfection with H2O2 ? The proposal of a reaction kinetic model

Marina J. Flores a, Rodolfo J. Brandi a,b, Alberto E. Cassano a,b, Marisol D. Labas a,b,⇑
a
INTEC, Universidad Nacional del Litoral and CONICET, 3000 Santa Fe, Argentina
b
Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas. Universidad Nacional del Litoral, 3000 Santa Fe, Argentina
h i g h l i g h t s
" Escherichia coli inactivation using H2O2 is modeled as a chemical-like kinetics.

?
" Bacteria death is assumed to be the result of cellular wall break down by OH attack.
" The first three steps are modeled as pseudo-homogeneous superficial reactions.
" The next steps are homogeneous oxidations of the lysate chemical components.
" Simulations using an intrinsic kinetic model are fully validated with experiments.
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: The inactivation (death) of Escherichia coli bacteria in water employing hydrogen peroxide has been stud-
Received 8 February 2012 ied and a five log decrease in CFU cm?3 was achieved. The reaction kinetics was modeled as a series of
Received in revised form 29 April 2012 biochemical steps represented by pseudo-homogeneous reactions between hydroxyl radicals and the
Accepted 30 May 2012
components of the cellular walls. Afterwards, the lysate was supposed to undergo a group of parallel
Available online 9 June 2012
reactions leading to the oxidation of the chemical components of the cell. It was assumed that the initi-
ation step of hydrogen peroxide dissociation is promoted by the presence of iron or iron-superoxide com-
Keywords:
pounds. In addition the model takes into account that the reaction forming the lysate as well as the ones
Disinfection
Hydrogen peroxide
that follow the destruction of the bacterium wall, compete for the available oxidizing radicals with the
Kinetic model steps that involve the attack on active and injured bacteria. A four parameter representation shows good
Escherichia coli agreement for the whole range of employed hydrogen peroxide concentrations. The results are valid for
any form and size of the employed reactor as long as the described operating conditions (pH and concen-
trations) are maintained. This development constitutes a very general model that is capable to describe
inactivation processes whose graphical representation also shows the presence of shoulders at the begin-
ning and tailings in the end of the operation.
? 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction toxic effect exerted by hydrogen peroxide on microorganisms de-

pends on the cell characteristics, its physiological state, extension
The antimicrobial and/or antiseptic properties of hydrogen per- of time of exposure, environmental conditions and employed
oxide have been known for many years due to its efficacy and rea- H2O2 concentration [9,10].
sonable manipulation safety [1,2]. This compound is effective The chemical mechanism that promotes the hydrogen peroxide
against a wide spectrum of bacteria, yeasts, molds, viruses and decomposition to produce the highly oxidative OH? and O?? 2 radicals
spore forming organism [1,3]. is well known. However, its effect on different microorganism has
Disinfectant agents affect the microorganisḿs viability and sur- been usually inferred but not firmly established.
vival by attacking their different structures. Depending on the dis- The damaging strokes to the bacteria cellular components have
infectant agent capacity to break through the cell wall, the been attributed to a particular phenomenon called oxidative stress
disinfectant can cause sequential damage in the different organ- resulting from the action of those reactive oxygen species known
elles of the cell, DNA molecules, etc. [4]. The toxic effects of H2O2 as ROS [1,11]. Sies [12] defined the oxidative stress, as a disruption
on Escherichia coli have been extensively studied [5–8]. The cyto- of the prooxidant–antioxidant balance in favor of the former, lead-
ing to potential injury. Hydroxyl radicals may impact on different
components of the cell producing the above mentioned oxidative
⇑ Corresponding author at: INTEC, Universidad Nacional del Litoral and CONICET,
3000 Santa Fe, Argentina.
stress; i.e., ROS can affect the cell in different levels and there is
E-mail address: [email protected] (M.D. Labas). no doubt that, particularly the OH? radical, can produce a severe
1385-8947/$ - see front matter ? 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.cej.2012.05.107
286
M.J. Flores et al. / Chemical Engineering Journal 198–199 (2012) 388–396 389
Nomenclature
B bacteria c0 kinetic parameter (mol CFU?1)

k kinetic constant, units depend on the specific reaction c1 kinetic parameter (mol CFU?1)
step of the model c2 kinetic parameter (mol CFU?1)
CFU colony forming units a constant related to dead and lysed bacteria
E generic representation of all the elements that consti-
tute the mathematical representation of the process Subscripts
I generic representation of all the Ac + In elements that AC relative to active bacteria
constitute the mathematical representation of the pro- IN relative to injured bacteria
cess DE relative to death bacteria
R volumetric reaction rate (CFU cm?3 s?1) CW relative to cell wall
t time (s) PN relative products of bacteria lysis
HS hypothetical species of the components of the cell wall
SSA specific superficial area per unit mass of the cell Superscripts
(cm2 cm?3) 0 indicate initial condition
LY products of bacteria lysis
Y oxidation yield of reactions involving OH? radicals Special symbols
(CFU mol?1) () concentration of chemical of species (mol cm?3), or con-
centration of colonial forming units in the bulk
Greek letters (CFU cm?3)
cA kinetic parameter (cm3 mol?1 s?1)
cIN kinetic parameter (cm3 mol?1 s?1)
cellular damage that leads to an irremediable outcome; i.e., its components, hindering the possibility of bacteria recovery or
death. resuscitation.
Moreover, the extreme reactivity of these radicals provides Several kinetic models to represent the disinfection process
them the means to become major participants in the toxic pro- have been published. Some of them are empirical equations such
cesses mediated by free radicals [13], a conclusion that has been as for example those proposed Chick [34], Watson [35], Hom
demonstrated by numerous studies [14–19]. In the spontaneous [36], Cerft [37], Buchnann et al. [38], Membre et al. [39] while oth-
mutagenesis and oxidative damage to DNA in Salmonella typhimu- ers, very well represented by the work of Severin et al. [40] with
rium, Storz et al. [20] found that OH? can produce a break in the their series and multi target events have a more mechanistic ap-
double chain and/or some chemical modifications in the nitrogen proach. Just recently a much direct interpretation of the involved
bases. In a study of the membrane system, Anzai et al. [21] found oxidation process has been published by Marugan et al. [41].
that hydroxyl radicals increased lipid peroxidation. The toxicity In this work we have made an attempt to develop a general
of OH? radicals generated in vivo has also been well documented model to describe the chemical disinfection reaction based on a
by Nunoshiba et al. [11]. Rincon et al. [22] studied the photocata- simplified generic interpretation of a very difficult and intricate
lytic process with TiO2 for disinfection of drinking water and pos- mechanism. Thus, the membrane disruption, the subsequent lysis
tulated that the interaction of hydroxyl radicals with bacteria led of the components of the bacteria and the oxidation of the result-
to its inactivation. ing lysate, were modeled as series of episodes followed by a se-
One of the most logical hypotheses is to consider that a quence of parallel events, in which the level of damage will
Fenton-like or Haber-Weis-like reactions [11,13,23,24] at low iron increase until the bacteria not only dies or is severely affected in
concentrations [25,26] could be the main cause of formation of the its vital functions but also, given enough time, the chemical com-
hydroxyl radical, and that this radical will be the most important ponents of the cell will be fully oxidized. Hence, this model should
product of these reactions. Even if Fenton and Fenton-like reactions be useful to characterize quite accurately simple as well as com-
are usually conducted at acidic pH, it has been shown that they can plex survival curves of inactivation. In fact, in the present context
also be effective working at circumneutral pHs [27–31]. Moreover, it appears capable of accommodating initial resistances or retards,
problems usually encountered en large scale applications will as manifested by the shoulder which appears in many survival
never be an important issue in biological systems. However, with curves as well as the observed tailings at the end of other methods.
respect to the participation of type of reactions, their inclusion This detailed description of the possible pathway through different
does not mean that one will ignore that microorganisms have steps, enhances a virtual visualization of the full process and sim-
defensive systems to inhibit the destruction of its internal oxida- plifies further actions concerning reactor design, scale-up or opti-
tion–reduction balancing [32] and some competition will always mization procedures.
be present. These considerations are one of the principal grounds
for the model presented in this report.
For disinfection purposes, the non-persistent characteristic of 2. Experimental
hydrogen peroxide becomes a disadvantage to maintain the water
quality in the distribution system. However, its use is widely 2.1. The reacting system
spread because it is relatively inexpensive, easily removed when
desired and unlikely to be hazardous to health if used properly In all experimental runs we employed a well-stirred, cylindrical
[33]. In addition, it does not give rise to disinfection byproducts, batch reactor, having a total reaction volume of 2000 cm3. Stirring
as it is the case of other strong oxidants. But even more impor- was achieved with an external orbital shaking device. A cooling
tantly, the consequence of the hydrogen peroxide action leads to jacket connected to a thermostatic bath (Haake) surrounds the
a complete and irreversible destruction of the bacteria reactor to keep the reacting system at a constant temperature of
287
390 M.J. Flores et al. / Chemical Engineering Journal 198–199 (2012) 388–396
20 ?C. The top of the reactor has provisions for sampling, pH and hydrogen peroxide to make sure that the starting solution was free
temperature measurements (see Fig. 1). from other inactivating agents.
Each sample was examined with the following measurements:
absorbance at 350 nm (spectrophotometric analysis) for hydrogen
2.2. Chemicals peroxide and CFU counting using specific Petrifilm™ plates (3 M
Microbiology Products) for E. coli and coliform bacteria. This meth-
The following chemical were used: hydrogen peroxide (Merck, od has been recognized by the American Public Health Association
pro-analysis 30%), Catalase (from Aspergillus niger, Biochemika), in Standard Methods for the examination of Dairy Products [43]
Ammonium molybdate (Cicarelli, pro-analysis), Potassium iodide and the Association of Official Analytical Chemists International
(Cicarelli, pro-analysis), Potassium acid phthalate (Cicarelli, 95% in Official Methods of Analysis (AOAC) [47] as equivalent to the
pro-analysis), Physiological saline solution (Roux-Ocefa), Nutrient conventional plate method for this type of microorganism. Dilu-
broth (Biokar Diagnostics), Sodium hydroxide (Cicarelli, pro-analy- tions of the samples to obtain the optimum concentrations for
sis) and Peptone water (Biokar Diagnostic). the CFU counting method were made with a sterile peptone water
solution. To quench the hydrogen peroxide action during the time
interval between sampling and spread plating, a known fraction of
2.3. Experimental procedure the sample was mixed with the required amount of catalase solu-
tion. Control experiments were conducted to ensure that the em-
Throughout this work E. coli strain ATCC 8739 was used. The ployed concentrations of catalase solutions did not affect bacteria
purity of the strain was verified by conventional methods concentrations. After spreading the plates with the appropriate
[42,43]. The culture was grown in a complex medium (Nutrient volume of sample they were incubated for 24 h at 37 ?C.
broth) that had beef extract as the main component. Therefore,
the broth composition was: tryptone: 10 g L?1, beef extract
5 g L?1 and NaCl: 5 g L?1. 3. Kinetic model proposal
The working solution was prepared from a culture that had
reached the stationary phase of growing and, afterwards, was The key point is to search for one acceptable assumption con-
brought to a 1/1000 dilution with physiological saline. This cerning the possible place where the action of ROS can take place.
dilution helped to ensure that there was no bacteria growth during According to Dalrymple et al. [2] in the case of bacteria there are
the disinfection run due to the fact that the growing culture three sites of the cell that could be the targets for ROS invasion:
concentration was sufficiently diluted [44,45]. An atomic spectros- (1) The peptidoglycan layer, (2) the lipopolysaccharide layer
copy analysis (Perkin-Elmer-5000 AAnalyst) detected traces of iron (found only in Gram-negative bacteria) and (3) the phospholipid
and copper ions in the growing culture (Cu = 7.7 lg g?1 and bilayer. In this study E. coli was the chosen bacteria to work with
Fe = 43 lg g?1). and consequently the three layers will be present. Chemical-reac-
The prepared culture was mixed with the desired amount of tive agents like hydrogen peroxide may display some target spec-
hydrogen peroxide and distilled water. The hydrogen peroxide ificity like membrane thiol groups and ribosomes but, frequently,
concentrations varied between 15 and 300 ppm. They were mea- hydroxyl radicals have sufficient reactivity to interact with differ-
sured with colorimetric techniques at 350 nm, according to Allen ent cellular components obscuring the direct primary damage. It
et al. [46] with a Perkin-Elmer-330 spectrophotometer. All initial is very likely that, this could be the way to break down the cell
concentrations (at t = 0) were in the order of 105 CFU cm?3 and membrane. Once this action occurs, ROS could still act on intracel-
afterwards, samples were withdrawn at different time intervals lular vulnerable sites such as enzymes, coenzymes and nucleic
for several determinations. The exact value of the bacteria’s initial acids. The enzymatic system appears to be one of the most impor-
concentration was measured for each experiment. Runs were tant and irreplaceable reconstructive agent for bacteria reactiva-
duplicated and samples subjected to triplicate determinations. tion in UVC disinfection. Consequently, if the disruption of the
The initial pH was 7 and remained practically constant during all cellular wall is not enough, this effect of hydrogen peroxide on
the runs. In addition, experiments were carried out without intracellular components could explain why oxidative disinfection
is always an irreversible process.
With regard to the most plausible mechanisms for producing
damage on components of the cell several detailed studies have
been reported, many of them still under discussion. Nevertheless,
it is recognized that the process constitute a large sequence of a
complex network of interconnected steps before reaching what
might be called the ‘‘final product’’ (inactivation). The fundamental
question is to know if only one simple reaction path is sufficient or
if it is necessary to resort to more than one to complete the pur-
sued objective and, in this case, whether or not it is indispensable
to model all the steps involved in the oxidation of the lysis prod-
ucts to adequately represent the disinfection operation leading to
cell death.
In view of these difficulties, and searching for some form of
plausible, simplified and at the same time, conceptually undis-
torted representation of all these processes, one could try to adopt
a model that takes into account the previously mentioned actions
on the biological metabolism, without assigning a detailed compo-
sition to each of the representative family of cell components. Once
this model is mathematically stated, it will be necessary to find out
the minimum set of kinetic parameters that are required to depict,
Fig. 1. Schematic representation of the experimental reactor setup. within an acceptable error, the series or series–parallel events that
288
lead to the dead of the bacteria. In this sense, the membrane dis- an initiation step promoted by iron (III) or iron (III)-superoxide to
ruption, the subsequent lysis of the components of the bacteria split the hydrogen peroxide, the following sequence can be
and the oxidation of the resulting lysate, can be modeled as series proposed:
of episodes followed by a sequence of parallel events, in which the
level of damage will increase until the bacteria is severely affected 3.1.1. Initiation
in its vital functions [1,41,48] without pursuing further oxidation
reactions if they are not necessary. k1
? ?
The kinetic model put forward here for E. coli disinfection is a H2 O2 ??????????????????
?! OH þ OH ð1Þ
Fe2þ þH2 O2 or Fe3þ þO??
2 promotion
conceptual modification of the one described by Marugan et al.
[41] where a reaction pathway is proposed for the undamaged, Note that, when the reaction is written as above, without
damaged and inactivated populations of bacteria and particularly, including specifically the Fe3+ or the Fe3þ þ O??
2 promotion, k1 is
for the structural mechanism of the bacteria decease. Instead of not known.
considering the attachment of titanium dioxide particles on the
bacterium wall that afterwards is followed by the classical oxida- 3.1.2. Propagation
tive mechanism of the photocatalytic system, in this work we be-
gin by considering the full sequence of hydroxyl radicals
formation and then, explicitly takes into account that there is k2
H2 O2 þ OH? ?! HO?2 þ H2 O ð2Þ
one attack on the cell membrane components according to Dal-
rymple et al. [2] that could involve one or more steps until the cell k3
anatomy is disrupted causing the bacteria’s death; i.e. it is neither H2 O2 þ HO?2 ?! OH? þ H2 O þ O2 ð3Þ
active, nor culturable [49]. At this point a lysate is achieved. After-
wards, the most important families of cells components are in- 3.1.3. Termination
volved in a net of parallel-series oxidative reactions that can
compete with the active and injured cells for the hydroxyl radicals
k4
and thus affecting the disinfection rate. 2OH? ?! H2 O2 ð4Þ
In modeling the intrinsic reaction kinetics of disinfection with
hydrogen peroxide one of the major difficulties is to include the k5
2HO?2 ?! H2 O2 þ O2 ð5Þ
iron or iron-superoxide participation in the mechanism to produc-
ing hydroxyl radicals [11,13]; i.e. the Fenton-like or Haber-Weis- k6
like reactions: OH? þ HO?2 ?! H2 O þ O2 ð6Þ
Fe2þ þ H2 O2 ! Fe3þ þ ? OH þ OH? All these steps have been studied in details for several years
3þ 2þ now and are fully accepted in the scientific literature Buxton
Fe þ H2 O2 ! Fe þ ? O2 H þ H þ
et al. [50], Laat and Gallard [51], Zalazar et al. [52] just to mention
or a few examples.
Fe3þ þ O??
2 ! Fe
2þ
þ O2 3.1.4. Membrane disruption
Fe2þ þ H2 O2 ! Fe3þ þ OH? þ OH? The process that ends up with the membrane breakdown may
be treated by resorting to a pseudo-homogeneous interpretation
There are two reasons for this complication: (1) The real mech- of the intricate network of superficial reactions that leads to the
anistic interaction of iron compounds inside the cell to explain the rupture of the protective envelope. Let HSCW jBAC represent a hypo-
effects produced by the oxidative radicals is not fully understood thetical species of the components of the cell wall of the active bac-
yet and (2) the concentrations of the ferric and the superoxide ions teria whose concentration can be expressed in units of mol cm?2
are not precisely known. and that reacts with the OH? radical. This composition is the same
One artificial way to deal with this problem is to assume that for every bacterium of a given family of bacteria. Then,
the reaction is effectively mediated by iron or the couple ferric-
superoxide ions, that they are at constant concentrations and that k?7
HSCW jBAC þ OH? ?! HSCW jBIN
this process can be included as part of a hypothetical kinetic step.
The respective pseudo specific constant of this stage represents the At this point, it is possible to think of SSAjBAC as the specific
mechanism to generate the hydroxyl radicals. superficial area per unit volume of one cell (in units of cm2 cm?3),
VjBAC as the volume of one cell per CFU (in units of cm3 CFU?1) and
3.1. A proposal of a tentative reaction representation of the bacteria [BAC] as the whole instantaneous concentration of the active bacte-
death ria (in units of CFU cm?3 of reacting medium). The concentration of
hypothetical species per unit volume of the fluid may be calculated
The reactions that lead the hydroxyl radical generation are from the above mentioned superficial concentration of this species
known to the point that, if desired, all the values of the specific ki- as:
netic constants of each step have been well established. Assuming
½HSCW jBAC ? ? SSAjB ? VjBAC ? ½BAC ?ðtÞ

|fflfflfflfflfflfflffl{zfflfflfflfflfflfflffl} |fflfflfflffl{zfflfflfflAC
ffl} |ffl{zffl} |fflfflfflffl{zfflfflfflffl}
Superficial concentration of of hypotetical species of one bacterium Superficial area per unit volume of bacterium volume of one CFU Instantaneous concentration of active bateria per unit volume
|fflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflffl{zfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflfflffl}
Instantaneous representation of the total volumetric concentration of hypotetical species of the active bacteria
289
Taking into account averaging values for specific family of bac- of view the activity of the OH? radicals can be interpreted in terms
h i
teria, HSCW jBAC in the cell wall, SSAjBAC and VjBAC may be assumed of several parallel-series reactions with an undefined number of
hypothetical components of the resulting lysis. In the model they
almost constant. Then,
are represented by LYP;1 ; LYP;2 ; . . . LYP;n?1 ; LYP;n , that correspond to
½HSCW jBAC ? ? SSAjBAC ? VjBAC important groups of compounds which, after ulterior oxidations
will produce the end products of the disinfection process:
¼ constant k7
|{z}
Pseudo-homogeneous volumetric kinetic constant
þOH? þOH? þOH?
¼
?
k7 ?½HSCW jBAC ? ? SSAjBAC ? VjBAC LYP;1 ! LYP;1;1 ! ? ? ? LYP;1;n?1 ! EP;1;n
|{z}
þOH? þOH? þOH?
Superficial kinetic constant LYP;2 ! LYP;2;1 ! ? ? ? LYP;2;n?1 ! EP;2;n
However, it is very unlikely that just one hydroxyl radical will ..
. ð10Þ
produce a serious damage to the cell wall. Neither the number of
moles of OH? which are necessary to consider that the bacterium þOH? þOH? þOH?
LYP;n?1 ! LYP;n?1;1 ! ? ? ? LYP;n?1;n?1 ! EP;n?1;n
has been injured, nor the number of bacterium that form a CFU
are known. It is always possible to conceive an oxidation yield as þOH? þOH? þOH?
LYP;n ! LYP;n;1 ! ? ? ? LYP;n;n?1 ! EP;n;n
the ratio of injured CFU with respect to the spent hydroxyl radicals
to produce this event:
# k7 Injured CFU CFU # cm3 3.2. Mathematical representation of the model

k7 ¼ ; Y7 ¼ ? ½¼? ; k7 ½¼?
Y7 OH spent this event mol CFUs
Operational parameters of the process might be obtained from
In order to have the proper application of this yield as well as
the solution of a kinetic model, derived from the proposed se-
achieving unit’s homogeneity it must be considered that:
quence of processes that leads to the cell destruction. The calcula-
R7;BAC ¼ ?k7 ½BAC ?½OH? ? tion of the reaction rates for each step is carried out in every
position of the reactor. However one should note that for a well
R7;OH ¼ ?k7 ½BAC ?½OH? ?
#
mixed reactor in the absence of external effects (for example, irra-
With this pseudo homogeneous, biological reaction approach, diation or ultrasonic enhancements) compositions are uniform and
step 7 can be finally expressed as: correspond to the local values. The reaction’s kinetics was formu-
lated in terms of the mass action law for all the proposed steps
k7
BAC þ OH? ! BIN ð7Þ to generate bacterial destruction by hydrogen peroxide. We can as-
sume that:
In a similar way, the same procedure can be applied to the in-
jured bacteria in the reaction with the OH? radicals according to:
(i). The system is isothermal with perfectly mixed compositions.
?
k8
|{z}
¼ k8 ?½HSCW jBIN ? ? SSAjBIN ? VjBIN (ii). The micro steady state approximation is valid.
|{z}
Pseudo-homogeneous volumetric kinetic constant Superficial kinetic constant (iii). The first set of lysate products oxidation is enough to repre-
k8 ¼ Yk88 ; Y 8 ¼ OH? spentin
# Dead CFU
this event
½¼? CFU
mol
# cm
; k8 ½¼? CFUs
3
sent the disinfection process (to be confirmed with the
R8;BIN ¼ ?k8 ½BIN ?½OH ? ? results).
R8;OH ¼ ?k8 ½BIN ?½OH? ?
#
If our third assumption is valid, considering only the first oxida-

tion reaction of lysate byproducts should be sufficient to represent
k8
BIN þ OH? ! BDE ð8Þ the disinfection reaction even if it does not reach the total oxida-
tion of the cell’s chemical components.
This step leads to the rupture of the cellular wall and the death From the reaction scheme we can derive the following
of the bacterium. expressions:
3.1.5. Lysis of dead bacteria

The death of the bacterium implies that the cellular wall has
ROH? ¼ k1 ½H2 O2 ? ? k2 ½H2 O2 ?½OH? ? þ k3 ½H2 O2 ?½HO?2 ? ? k4 ½OH? ?2
? k6 ½OH? ?½HO?2 ? ? k7 ½BAC ?½OH? ? ? k8 ½BIN ?½OH? ?
# #
been broken permitting the access of the oxidant to the intracellu-
lar components, rendering the lysate: n
X
? k9 ½BDE ?½OH? ? ? k10;i ½LYP;i ?½OH? ?
#
ð11Þ
? k9
BDE þ OH ! LYSATE ð9Þ i¼1
where:
?
k9 ¼ k9 ?½HSCW jBDE ? ? SSAjBDE ? VjBDE
|{z} |{z}
Pseudo-homogeneous volumetric kinetic constant Superficial kinetic constant
# k9 Lysed CFU CFU # cm3

k9 ¼ ; Y9 ¼ ½¼? ; k9 ½¼?
Y9 OH? spentin this event mol CFUs
R9;BLY ¼ ?k9 ½BDE ?½OH? ?
R9;OH ¼ ?k9 ½BDE ?½OH? ?
#
Once the anatomic morphology of the cell has been altered pro- RHO?2 ¼ k2 ½H2 O2 ?½OH? ? ? k3 ½H2 O2 ?½HO?2 ? ? k5 ½HO?2 ?2 ? k6 ½OH? ?
ducing the lysate, the OH? can interact with its internal compo-
? ½HO?2 ? ð12Þ
nents in typical homogeneous reactions. From the chemical point
290
The reaction rate expression for the Active and Injured bacteria ½BAC ?½H2 O2 ?cA ? ½BIN ?½H2 O2 ?cIN
RBIN ¼ ð19Þ
are: ½H2 O2 ? þ c0 ½BAC ? þ c1 ½BIN ? þ c2 ½BDE ?
? ?
k1 k8
RBAC ¼ ?k7 ½BAC ?½OH? ? ð13Þ where cIN ¼ k2
RBIN ¼ k7 ½BAC ?½OH? ? ? k8 ½BIN ?½OH? ? ð14Þ 4. Results and discussion
Applying the Micro Steady State Assumption (MSSA), from steps Fig. 2 displays all the experimental data obtained in this work.
(1) to (6) the hydroxyl radical concentration (OH?) can be readily Two direct conclusions can be extracted from these results. The
calculated. first is that concentrations of hydrogen peroxide below approxi-
Additionally, on the basis of previous confirmed evidences it is mately 300 ppm are impractical regardless the disinfection time.
assumed that the rates of termination steps (4) and (6) are negligi- The second is that in all cases, the required processing extent does
ble as compared with (5) that is the predominant chain termina- not appear to offer an attractive prospect for large-scale
tion step and that stage (2) is the predominant propagation step applications.
[53–55]; then the hydroxyl radical concentration is: Moreover, from these results, it was not considered necessary a
further increase in the concentration of hydrogen peroxide be-
k1 ½H2 O2 ? cause, having reached five orders of magnitude in the change of
½OH? ? ¼ n
ð15Þ
# # #
X the CFU population, the evolution of the figure suggests that a
k2 ½H2 O2 ? þ k7 ½BAC ? þ k8 ½BIN ? þ k9 ½BDE ? þ k10;i ½LYP;i ?
i¼1
small reduction in the processing time would not have introduced
P a major improvement in the above mentioned disadvantageous
The value of ni¼1 k10;i ½LYP;i ? may be considered proportional to circumstance.
the concentration of dead bacteria. This simplification is possible A significant portion of the curves exhibits a linear behavior.
because it involves the same level of arbitrariness that all the terms However, simple first-order kinetics, as one knows, cannot repre-
included in the summation symbol. sent the shoulder that is shown at the beginning of all experiments.
n
X Later we will see another advantage that has this model showing
k10;i ½LYP;i ? ¼ ak10 ½BDE ? ð16Þ some aspects of the process that the first-order approximation
i¼1 would not be able to unveil.
Experiments were carried out in an isothermal, well mixed,
k1 ½H2 O2 ? batch reactor. Then the analysis was made with a very simple mass
½OH? ? ¼ # # #
ð17Þ
k2 ½H2 O2 ? þ k7 ½BAC ? þ k8 ½BIN ? þ ðk9 þ ak10 Þ½BDE ? balance:
Replacing Eq. (17) in into Eq. (13) and rearranging the result the d½E?
final expression for the disappearance rate of Active bacteria is: Rj ¼ E ¼ BAC ; BIN ; BDE ; LYPi ð20Þ
dt
cA ½BAC ?½H2 O2 ? (
RBAC ¼ ? ð18Þ
½H2 O2 ? þ c0 ½BAC ? þ c1 ½BIN ? þ c2 ½BDE ? ½BAC ? ¼ ½BAC ?0 for BAC
t¼0
½E? ¼ 0 for E ¼ BIN ; BDE ; LYPi
where
? ? # # # The simulation results for I = BAC + BIN (surviving bacteria) were
k1 k 7 k7 k8 ðk9 þ ak10 Þ
cA ¼ ; c0 ¼ ; c1 ¼ ; c2 ¼ compared with the data obtained from the cell culture of the sam-
k2 k2 k2 k2
pling employing a non-linear, multiparameter optimization com-
Similarly, replacing Eq. (17) into Eq. (14) and operating on the puter program, in order to obtain the values of the kinetic
result, the final expression for the disappearance rate of injured constants ck for k = A, B, 0, 1 and 2.
bacteria is:
Fig. 2. Simulation results with the five parameters model (solid lines) compared Fig. 3. Simulations results with the four parameters model (solid lines) compared
with experimental data. The plot portrays the values of culturable cells. with experimental data. The plot portrays the values of culturable cells.
291
Fig. 5. A graphical description of the concentration evolution of the principal

species existing in the reacting medium as seen by the model. The plot follows
changes in concentration of the active, injured and dead bacteria at 45 ppm
Fig. 4. Results assuming that the step producing the lysate of the dead bacteria is concentration of H2O2. Experimental data: solid line: culturable bacteria [BAC
omitted. For [BAC+BIN]/[B0] vs. time: solid lines: complete model; broken lines: + BIN]; broken line: active bacteria; broken and dotted line: injured bacteria; dotted
c2 = 0. line: dead bacteria.
The obtained values of the kinetics parameters were c2 = 0 (either because k9 = 0 or ak10 = 0 or both are cero). The re-
sults are shown in Fig. 4.
cA ¼ ð2:7 ? 0:1Þ ? 10?3 cm3 mol?1 s?1 It becomes clear that with this assumption the model predicts a
cIN ¼ ð9:6 ? 3:1Þ ? 10?3 cm3 mol?1 s?1 much faster degradation of the bacteria. The implication is that the
existing competition for the OH? radicals should have been wrongly
c0 ¼ ð1:5 ? 0:2Þ ? 10?10 mol CFU?1 disregarded if c0 is made equal to zero, permitting to conclude that
c1 ¼ ð4:9 ? 2:2Þ ? 10?8 mol CFU?1 at least the step corresponding to the formation of the lysate can-
c2 ¼ ð1:7 ? 0:2Þ ? 10?8 mol CFU?1 not be ignored. The isolation of the effect corresponding to either
k9 or ak10 cannot be obtained from this model, but certainly ak10
With these parameters, the agreement with the experimental cannot be different from zero if k9 is equal to zero before.
data is shown in Fig. 3. The simulation results fit quite well all The model also provides good information about the way in
the experimental data for the whole range of explored hydrogen which the inactivation reaction proceeds. With the obtained
peroxide concentrations. parameters it is possible to follow the changes in concentration
However, it can be seen that the value of c0 is rather small. It is of the active, injured and dead bacteria. They are shown in Figs.
possible to reduce the parameters of the model if we assume that: 5 and 6 for two different concentrations of hydrogen peroxide.
c0 ½BAC ? ? ½H2 O2 ? þ c1 ½BIN ? þ c2 ½BDE ? ð21Þ It becomes clear that the life of the injured bacteria is very short
and its concentration never reaches very high values. This effect
Rearranging the resulting equations, the final expressions for can be seen by looking at the values of the obtained parameters.
Active and Injured bacteria result: From these two figures it can also be observed a consistent
cA ½BAC ?½H2 O2 ? behavior. When lower concentrations of hydrogen peroxide are
RBAC ¼ ? ð22Þ
½H2 O2 ? þ c1 ½BIN ? þ c2 ½BDE ?
cA ½BAC ?½H2 O2 ? ? cIN ½BIN ?½H2 O2 ?

RBIN ¼ ð23Þ
½H2 O2 ? þ c1 ½BIN ? þ c2 ½BDE ?
Using this assumption, a new set of four kinetic constants was
obtained:
cA ¼ ð2:7 ? 0:0Þ ? 10?3 cm3 mol?1 s?1

cIN ¼ ð10:0 ? 2:8Þ ? 10?3 cm3 mol?1 s?1
c1 ¼ ð5:3 ? 2:0Þ ? 10?8 mol CFU?1
c2 ¼ ð1:7 ? 0:1Þ ? 10?8 mol CFU?1
The new plot is shown in Fig. 3.
It can be observed that the four parameters model also renders
a good agreement with the experimental data. In this process ex-
ists a competion for the OH? radicals between two groups: (1)
the dead bacteria and the compounds resulting from the lisate for-
mation and (2) the active and the injured bacteria. The important Fig. 6. A graphical description of the concentration evolution of the principal
question is to know to what extent the subsequent reactions after species existing in the reacting medium as seen by the model. The plot follows
changes in concentration of the active, injured and dead bacteria at 185 ppm
the bacteria’s death affect the desinfection rate. These reactions concentration of H2O2. Experimental data: solid line: culturable bacteria [BAC + BIN];
correspond to the kinetic constants k9 and ak10. Both are grouped broken line: active bacteria; broken and dotted line: injured bacteria; dotted line:
in c2. The importance of this conflict can be seen by making dead bacteria.
292
used (45 ppm) the survival of a major number of active and injured Acknowledgments
bacteria is seen, indicating that the oxidation is not sufficiently in-
tense to overcome the resistance of the cell wall. Conversely, at The authors are grateful to Universidad Nacional del Litoral
higher concentrations, (185 ppm) the number of survival and (UNL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
undamaged bacteria gradually decreases and there is a breaking (CONICET), and Agencia Nacional de Promoción Científica y Técnica
of the bacteria envelope in a shorter time. Then, very rapidly, it (ANPCyT) for its financial support.
changes from the state of injured bacteria to one of irreversible
death. For that reason, the concentration of injured bacteria is al-
ways low. This is, at the same time, a confirmation that oxidant References
concentration is the most important factor to affect bacterial target
[1] M.D. Labas, C.S. Zalazar, R.J. Brandi, A.E. Cassano, Reaction kinetics of
sites [56]. bacteria disinfection employing hydrogen peroxide, Biochem. Eng. J. 38
Both figures show in the curves represented by the solid lines, (2008) 78–87.
[2] O.K. Dalrymple, E. Stefanalos, M.A. Trotz, D.Y. Goswami, A review of the
the small shoulder mentioned in the beginning of this section.
mechanisms and modeling of photocatalytic disinfection, App. Catal. B 98
It is also very interesting to note that taking the ratio between k7 (2010) 27–38.
and k8 (which is equal to 0.28) one gets the relationship between [3] B.R. Cords, S.L. Burnett, J. Hilgren, M. Finley, J. Magnuson, Sanitizers: halogens,
injured bacteria and fully active bacteria. This is shown more clearly surface-active agents, and peroxides, in: P.M. Davidson, J.N. Sofos, A.L. Branen
(Eds.), Antimicrobials in Food, 3rd ed., CRC Press Taylor & Francis Group,
by setting Eq. (14) equal to zero resulting ½BIN ?=½BAC ? ¼ 0:28. This is Florida, 2005.
good evidence that the first stage is slower than the second. But this [4] S. Malato, P. Fernandez-Ibañez, M.I. Maldonado, J. Blanco, W. Gernjak,
relationship is not much less than one to allow grouping both stages Decontamination and disinfection of water by solar photocatalysis: recent
overview and trends, Catal. Today 147 (2009) 1–59.
is a single one. Consideration of the mechanistic series process, al- [5] S. Rafellini, M. Schenk, S. Guerrero, S.M. Alzamora, Kinetics of Escherichia coli
lows unequivocally demonstrating the existence of the initial resis- inactivation employing hydrogen peroxide at varying temperatures, pH and
tance observed in the shoulders of the figures. concentrations, Food Control 22 (2011) 920–932.
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5. Conclusions Escherichia coli killing induced by hydrogen peroxide, Free Radic. Res.
Commun. 6 (1989) 47–55.
[8] J.J. Schurman, Antibacterial Activity of Hydrogen Peroxide Against Escherichia
A new kinetic model for chemical disinfection with hydrogen coli 2001.
peroxide has been developed. It was validated with experiments [9] B.J. Juven, M.D. Pierson, Antibacterial effects of hydrogen peroxide and
methods for it detection and quantization, J. Food Prot. 59 (1996) 1233–1241.
using E. coli as a surrogate bacterium. Simulation results with a four
[10] B. Halliwell, Oxidative stress in cell culture: an under-appreciated problem?,
parameters mathematical description provide very good agree- FEBS Lett 540 (2003) 3–6.
ment with the experimental data for a wide range of hydrogen per- [11] T. Nunoshiba, F. Obata, A.C. Boss, S. Oikawa, T. Mori, S. Kawanishi, K.
oxide concentrations. Yamamoto, Role of iron and superoxide for generation of hydroxyl radical,
oxidative DNA lesions and mutagenesis in Escherichia coli, J. Biol. Chem. 274
The proposed mechanism involves a series of three heteroge- (1999) 34832–34837.
neous steps (analyzed as pseudo-homogeneous reactions) fol- [12] H. Sies, Role of the reactive oxygen species in biological process, Klin.
lowed by a group of parallel-series oxidation reactions in the Wochenschr. 69 (1991) 965–968.
[13] J.P. Kehrer, The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity, Toxicology
homogeneous phase. 149 (2000) 43–50.
The disinfection process is characterized by the following steps: [14] E.B. Freese, J. Gerson, H. Taber, H.J. Rhaese, E. Freese, Inactivating DNA
(1) Production of the hydroxyl radicals which is supposed to be alterations induced by peroxides and peroxide-producing agents, Mutat. Res. 4
(1967) 517–531.
promoted by a Fenton like or Haber-Weis-like reactions; (2) A first [15] S.P. Wolff, A. Garnera, R.T. Dean, Free radicals, lipids and protein degradation,
attack by the hydroxyl radical to damage the cellular wall; (3) A Trends Biochem. Sci. 11 (1986) 27–31.
second attack by the same oxidant, that produces the complete [16] V. Vallyathan, Generation of oxygen radicals by minerals and its correlation to
cytotoxicity, oxygen radicals and lung injury, Environ. Health Perspect. 102
destruction of the bacterium envelope; (4) The formation of a ly-
(1994) 111–115.
sate with all the cell components; (5) Subsequent oxidation of [17] P.J. Barnes, Reactive oxygen species and airway inflammation, Free Radical.
the chemical species resulting from the lysis of the bacterium. Biol. Med. 9 (1990) 235–243.
[18] A.R. Krapp, V.B. Tognetti, N. Carrillon, A. Acevedo, The role of ferredoxin-NADP
The reactions leading to the formation of the lysate and the fur-
super (+) reductase in the concerted cell defense against oxidative damage.
ther oxidation of the cells components compete with the active Studies using Escherichia coli mutants and cloned plant genes, Eur. J. Biochem.
and injured bacteria for the hydroxyl radical, a phenomenon that 249 (1997) 556–563.
with the help of the model can be clearly unveiled. [19] F. Buyuksonmez, T.F. Hess, R.L. Crawford, R.J. Watts, Toxic effects of modified
fenton reaction on Xanthobacter flavus FB 71, Appl. Environ. Microbiol. 64
In accordance with the model, the action that leads to the com- (1998) 3759–3764.
plete destruction of the bacterium cell wall is faster than the one [20] G. Storz, M.F. Christman, H. Sies, B.N. Ames, Spontaneous mutagenesis and
that produces the initial damage that transforms the active bacte- oxidative damage to DNA in Salmonella typhimurium, Proc. Natl. Acad. 84
(1987) 8917–8921.
rium into injured bacterium. [21] K. Anzai, M. Hamasuna, H. Kadono, S. Lee, H. Aoyagi, Y. Kirino, Formation of ion
The reported model is based on an idealized description of the channels in planar lipid bilayer membranes by synthetic basic peptides,
chemical disinfection, but does not introduce a conceptually dis- Biochem. Biophys. Acta 1064 (1991) 256–266.
[22] A.G. Rincón, C. Pulgarin, N. Adler, P. Peringe, Interaction between E. coli
torted representation of the processes involved in the bacterium inactivation and DBP-precursors-dihydroxybenzene isomers – in the
death. Consequently, the obtained kinetic parameters should be photocatalytic process of drinking-water disinfection with TiO2, J.
independent of the type and size of the employed laboratory reac- Photochem. Photobiolog. A: Chem. 139 (2001) 233–241.
[23] B. Halliwell, J.M. Gutteridge, Biologically relevant metal ion-depend hydroxyl
tor, as long as the reported operating conditions are reproduced; radical generation. An update, FEBS 307 (1992) 108–112.
i.e. isothermal performance, pH and oxidant concentrations. Then, [24] R.J. Watts, D. Washington, J. Jowsawkeng, F.L. Loge, A.L. Tell, Comparative
they should be useful for scale-up or reactor design as well as opti- toxicity of hydrogen peroxide, hydroxyl radical, and superoxide anion to
Escherichia coli, Adv. Environ., Res. 7 (2003) 961–968.
mization procedures.
[25] I. Yamazaki, L.H. Piette, EPR spin-trapping study on the oxidizing species
Finally, it should be remarked that this is a very general model formed in the reaction of the ferrous ion with hydrogen peroxide, J. Am. Chem.
that by the simple expedient of adding one set of parallel reactions Soc. 113 (1991) 7588–7593.
(that were not needed in this work) it is possible to represent typ- [26] S. Croft, B.C. Gilbert, J.R. Lindsay Smith, A.C. Whitwood, An E.S.R. investigation
of the reactive intermediate generated in the reaction between Fe(II) and H2O2
ical tailings of disinfection curves very often shown when a differ- in aqueous solution. Direct evidence for the formation of the hydroxyl radical,
ent disinfectant is used. Free Radicals Res. 17 (1992) 21–39.
293
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294
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295
358 © IWA Publishing 2014 Water Science & Technology | 69.2 | 2014
A novel approach to explain the inactivation mechanism

of Escherichia coli employing a commercially available
peracetic acid
Marina J. Flores, Maia R. Lescano, Rodolfo J. Brandi, Alberto E. Cassano
and Marisol D. Labas
ABSTRACT
Marina J. Flores
The chemical inactivation of Escherichia coli employing a commercial mixture of peracetic acid (PAA)
Maia R. Lescano
was studied. For this purpose, experiments were carried out using dilutions of the unmodified Rodolfo J. Brandi
Alberto E. Cassano
mixture, and also the same mixture but altered with hydrogen peroxide (HP) previously inhibited. Marisol D. Labas (corresponding author)
INTEC (Universidad Nacional del Litoral and
Also, these results were compared to those obtained before employing HP alone. It was found that CONICET),
Guemes 3450-CP 3000,
the mixture is much more efficient than HP and PAA acting separately. Furthermore, it was found
Santa Fe,
that PAA without HP is much more efficient than HP alone. A plausible explanation is presented. The Argentina
E-mail: [email protected]
homolysis of PAA would give rise to a chain reaction that generates a significant number of highly
Rodolfo J. Brandi
oxidizing radicals. An attacking scheme to bacteria in two stages is proposed, where the initial step, Alberto E. Cassano
Marisol D. Labas
mainly caused by PAA, is very fast and eliminates some specific components of the bacteria that Facultad de Ingeniería y Ciencias Hídricas (FICH),
Universidad Nacional del Litoral,
would otherwise inhibit the parallel action of HP. Thereafter, the emergence of a potentiating
Ciudad Universitaria,
synergetic action of the second oxidant seems to be immediately unveiled. Ruta Nacional N 168 – Km 472,4,
W
(3000) Santa Fe,

Key words | commercial peracetic acid, Escherichia coli, hydrogen peroxide, synergism, water Argentina
disinfection
INTRODUCTION
Water disinfection is carried out to prevent the spread of of hydroxyl radicals (Caretti et al. ; Caretti & Lubello
human pathogens that may be present in wastewater efflu- ), PAA is a stronger biocide for a wide spectrum of micro-
ents. The efficient inactivation of pathogenic bacteria, organisms (Baldry ; Baldry & French ), while HP
viruses and protozoan parasites from water and wastewaters requires much larger doses for the same level of inactivation
is critical, since sewage discharges may increase the risks of (Wagner et al. ). Some of the desirable attributes of PAA
waterborne infections. Studies have pointed out that are the easiness of treatment implementation, its broad spec-
untreated wastewater is the first contributor of bacteria to trum of activity even in the presence of heterogeneous
the aquatic ecosystem. Chlorine is the most commonly organic matter, and a minor dependence on the pH.
used disinfectant but can also have an important drawback Regarding the specific mechanism of the PAA attack
such as disinfection by-products (Nieuwenhuijsen et al. against microorganisms, one may speculate that PAA func-
). tions in a similar way to other peroxides and oxidizing
Peracetic acid (PAA) is a strong oxidant. Its oxidation agents; thus, possibly PAA disrupts sulfhydryl (–SH) and di-
potential is larger than the one of chlorine or chlorine dioxide sulphide (S–S) bonds in proteins and enzymes, and then
(Kitis ; Rossi et al. ) and it is a much more potent breaks important components in the membranes and
antimicrobial agent than hydrogen peroxide (HP), being inside the cell by oxidative disruption (Malchesky ).
rapidly active at low concentrations. The equilibrium state An important advantage of PAA is that it inactivates cata-
of commercial PAA is a mixture of peracetic and acetic lase, an enzyme that is known to act by inhibiting highly
acid, as well as water and HP. Although HP also contributes oxidant hydroxyl radicals (Block ). Additionally, intra-
to the inactivation power of the mixture and to the formation cellular PAA action may oxidize essential enzymes,
doi: 10.2166/wst.2013.721
296
359 M. J. Flores et al. | Water disinfection using a commercial mixture of peracetic acid Water Science & Technology | 69.2 | 2014
impairing vital biochemical pathways, active transport The bacterial inoculums remained in the stove for 24
across membranes and intracellular solute concentrations hours at a constant temperature of 37 C. The solution
W
(Kitis ). used for the experimental runs was prepared from a culture
Different ways have been proposed to explain the that had reached the beginning of the stationary phase of
chemical inactivation process. It can be thought that the oxi- growth and afterwards was brought to a 1/1000 dilution
dizing action takes place on the cellular wall or that, after with physiological saline. This dilution ensured that there
regular or facilitated diffusion, the oxidant acts on the com- was no bacteria growth during the inactivation run because
ponents of the interior of the bacteria or that in fact it the growing culture concentration was sufficiently diluted.
operates with a combination of both processes. However, The prepared culture was mixed with the desired concen-
for optimization purposes, it is also very relevant to explain tration of PAA in the reactor.
why PAA behaves in a manner so different than the one The initial concentrations of bacteria a t ¼ 0 were always
observed applying other disinfectants, for example, HP. around 105 CFU (colony forming units) mL?1. Afterwards,
Research studies that show the synergistic effect samples were withdrawn at different intervals. To quench
between the PAA and HP are virtually non-existent, with the PAA and HP action during the time interval between
the exception of the work of Alasri et al. (). In this sampling and spread plating, a known volume of the sample
work an experimental study adding different amounts of was mixed with the required amount of sodium thiosulfate
HP to a PAA solution was performed in order to observe (200 μL) and catalase (500 μL) solutions respectively. These
those synergistic effects. experiments were very effective in achieving their goals,
Therefore, for practical purposes, it is important to study which were twofold. Different concentrations of catalase
the inactivation results produced by the mixture and identify and thiosulfate were tested until the obtained combination
the mechanism of the observed oxidation activity. Due to of the concentration of both compounds showed that (i) the
this fact, the use of commercial PAA as an alternative disin- desired inhibition was obtained and (ii) this combination
fectant was studied in this report. Its efficiency was tested did not affect in any way the existing population of bacteria.
employing a microbial indicator of water contamination, The plates were incubated for 24 h at 37 C in an EMB
W
Escherichia coli, commonly used in this process. (Eosin Methylene Blue) plate. Runs were duplicated and
samples were subjected to triplicate determinations.
MATERIALS AND METHODS RESULTS AND DISCUSSION
In all experiments, a well-stirred batch annular reactor PAA inactivation effects

having a total reaction volume of 2 L was employed. Stirring
was achieved with an external orbital shaking device. A Figure 1 shows the average results obtained during a series
cooling jacket connected to a thermostatic bath surrounds of inactivation tests that employed concentrations from 1
the reactor to keep the reacting system at a constant temp- to 15 mg L?1 using the commercial PAA mixture. It is well
erature of 20 C. The top of the reactor has provisions for documented that a plot of log of survivors versus time may
W
sampling, pH and temperature measurements. For the give a straight line (type I), or curves with different shoulders
experimental runs, a PAA commercial mixture (Química (type II), or curves with shoulders and tails (type III). Thus,
Agroindustrial Neo: PAA 15% v/v; HP 20%; acetic acid when the disinfectant concentration is changed, each family
25% and water 40%) was used. It is important to study sep- of curves represents more markedly the phenomenon that
arately the effect of the two oxidizing components of the prevails in the different circumstances of the process.
mixture. Therefore, the reactant was also investigated free Curves named ‘Type I’ show clearly a rapid inactivation,
from HP. Inhibition of HP was achieved using catalase with a small shoulder and an important portion of their tra-
(from Aspergillus niger, Biochemika), allowing in this way jectory having the characteristics of a straight line. Those of
the study of the efficiency of PAA alone. ‘Type II’ do not allow distinguishing with precision if they
Escherichia coli strain ATCC 8739 was used throughout are the result of a very slow inactivation or a shoulder that
this work. The culture was grown in a complex medium: a extends for a very long time. Those of ‘Type III’ show a
nutrient broth. The complete broth composition was: tryp- marked shoulder and tail, and therefore these cannot be rep-
tone: 10 g L?1; beef extract: 5 g L?1; and NaCl: 5 g L?1. resented by a straight line.
297
Table 1 | Inactivation results employing HP and commercial PAA
HP alonea (t ¼ 150 min) Commercial PAA (t ¼ 5 min)
H2O2 (mg L?1) Inactivation (%) PAA (mg L?1) Inactivation (%)
15 80 1 28.4
45 92 2 99.9
160 99.9 5 > 99.99
185 99.99 15 > 99.99
a
From Labas et al. (2009).
150 minutes, employing the same experimental procedure.

From Table 1, in the experiments with the commercial
PAA (2 mg L?1) a much greater inactivation was obtained
Figure 1 | Decrease in CFU as a function of time employing the commercial mixture of
PAA. (Slope and R2 for those plots that show features corresponding to a
(99.9%) in just 5 minutes. To reach the same level of inacti-
straight line in a significant portion of their trajectory.) vation, in runs that lasted 2.5 h, using HP, a concentration of
160 mg L?1 was required.
Notice, however, that for concentrations larger than
5 mg L?1, the plots are straight lines and 99.99% inacti- Synergetic effect of the mixture
vation is obtained in less than 2.1 minutes. It may be
interesting to note that approximately 6 mg L?1 is coinci- The next step is to elucidate if, when employing commercial
dent with the concentration usually applied in water PAA in the absence of HP, the experimental results show
disinfection processes when PAA is employed (Lefevre significant differences. Two sets of experiments were per-
et al. ; Colgan & Gehr ). In the inactivation formed inhibiting HP activity. For PAA concentrations of
curves of Figure 1, two typical deviations from a straight 5 and 8 mg L?1 the results are shown in Figure 2. It can
line can be observed: shoulders and tails. There are several be seen that, to get the same level of inactivation (99.9%)
reasons for the shoulder: if clumps of microorganisms achieved by the mixture of PAA without inhibition of the
exist in the suspension, all cells in the clump needed to be HP, it is necessary to increase the contact time by approxi-
inactivated before the colony-forming ability of the cluster mately three times.
is fully inactivated. Another possible explanation is that This outcome implies a larger increase in the inacti-
the bacteria populations exposed to low concentrations of vation rate operating with the mixture. This is explained
disinfectant required a successive accumulation of injuries by the synergistic effect generated by the presence of HP.
to reach their threshold limit.
The presence of tailing in an inactivation curve may have
a different plausible interpretation: if some of the existing
microorganisms are intrinsically more resistant than others,
they can survive under the studied conditions and display a
reduction in the inactivation rate and, consequently, the dis-
appearance of the CFU will be appreciably slowed down.
Additionally, the competition for the subsequent oxidation
of the lysate (products resulting from the dead bacteria
lysis) with the active bacteria for the existing oxidizing
agents can contribute also to the tailings appearance.
Organic peroxides as PAA contain peroxide groups that
are an indisputable source of high oxidation potential. In
any event, these results should be compared with those
obtained employing HP alone. They are summarized in
Table 1. Values on the left were extracted from results pub- Figure 2 | Decrease in CFU as a function of time employing PAA without the presence of
lished by Labas et al. (, ) for a total reaction time of H2O2 and using the commercial PAA.
298
Interpretation of the obtained results Rokhina et al. (). These authors have shown that a
chain reaction occurs with a pathway described as follows:
The following explanation of the results is based on the
hypothesis that chemical inactivation is just a particular CH3 C( ¼ O)OOH ! CH3 C( ¼ O)O? þ HO? (1)
case of a rather unusual oxidation reaction mechanism.
Table 2 shows an interesting comparison between the inac- CH3 C( ¼ O)OOH þ HO? ! CH3 C( ¼ O)? þ O2 þ H2 O
tivating activity using HP intervening solely, PAA acting
(2)
alone and the commercial mixture of HP and PAA.
From Table 2, it can be seen that to achieve 99.9% inac-
tivation, the dose required is 24,000 and 22.5 mg min L?1 CH3 C( ¼ O)OOH þ HO? ! CH3 C( ¼ O)OO? þ H2 O (3)
for HP and PAA respectively (the HP is 1,067 times
slower than the PAA alone), and the inactivation process CH3 C( ¼ O)O? ! H3 C? þ CO2 (4)
with the mixture requires a dose of 8.16 mg min L?1 and
inactivation is 2.76 times faster than with PAA alone. Fur- 2 CH3 Cð¼ OÞO? → ?
← 2 H3 C þ 2 CO þ O2 (4a)
thermore it can be seen that the effect of the mixture is
greater than the sum of the individual effects of the two iso-
H3 C? þ O2 ! OOCH?3 (5)
lated disinfectants. Clearly there is a potentiating synergistic
effect between HP and PAA.
The commercial mixture shows a unique result, which CH3 C( ¼ O)O? þ HO? ! CH3 C( ¼ O)OOH (6)
raises the thought of the existence of a very distinct mechan-
ism of action. The generation of strong oxidative radicals Reaction (1), which represents the initiation step, is very
from HP results from a well-known mechanism. The important because it forms the radical HO? and it was found
action of the HP is based primarily on the oxidation to be the rate controlling step. The authors claim that all the
caused by hydroxyl radicals almost exclusively. On the generated radical species are active contributors to any oxi-
other hand, one can venture to say that, in the case of the dation mechanism but HO? , and to some extent the
PAA, something substantially different takes place. H3 C? radicals, are the most significant ones. The reaction
requires the presence of an eligible catalyst that should be
PAA oxidation mechanism of the types usually encountered in Fenton or Fenton-like
reactions (Bianchini et al. ). It has been shown that
There may be more than one possible explanation to inter- the existing intra- or extra-cellular Fe2þ is able to produce
pret the results of inactivation of Escherichia coli with the this type of reaction (Imlay & Linn ). It is important
PAA. In this work, a tentative interpretation of the data is to note that only traces of some transition metal compounds
proposed, which advances a new approach to explain are needed to induce the reactions mentioned above (Li
chemical inactivation processes for microorganisms. It is et al. ; Nieto-Juarez et al. ; Jung et al. ).
the result of adapting chemical oxidation reactions pro- Free radicals such as peroxy radicals, the superoxide
duced by the presence of hydroperoxide groups on anion, and the hydroxyl radical are responsible for many
organic substances. of the possible damaging reactions (McDonell & Russell
The explanation proposed for the fast oxidation rate of ; Denyer & Maillard ). The chain reactions rep-
PAA considers the homolytic PAA reaction proposed by resented by Equations (1)–(6) may provide an adequate
Bach et al. () and studied and confirmed in details by explanation for the rapid kinetics of inactivation by PAA.
Table 2 | Comparison of efficiencies of different processes of Escherichia coli inactivation (Temperature: 20 C)

W
Disinfectant Percent inactivation Concentration (mg L?1) Reaction time (min) Dose; D99.9 (mg min L?1) Reference
HP 99.9% 160 150 24.000 Labas et al. ()a

PAA alone 99.9% 5 4.5 22.5 This work
PAA commercial mix 99.9% 5 1.6 8.16 This work
a
From Labas et al. (2009).
299
Potentiated, synergetic effect of HP in the rate of inactivation as compared with the one
observed when PAA acts alone (potentiating synergism).
From the dose results presented in Table 2, it can be con-
cluded that the efficiency of HP is much lower than that
of PAA acting alone. Moreover, a potentiating synergistic CONCLUSIONS
effect when working with the commercial mixture, having
both PAA and HP, can be surely inferred. From the results Water disinfection employing a commercial mixture of PAA
presented in Figure 2, it should be noted that this enhance- was studied. Experiments have demonstrated that there is a
ment happens only after the PAA has initiated the attack much greater inactivation efficiency of PAA (after inhibition
against the cell, indicating that the protecting systems that of HP existing in the mixture) than that of HP alone.
existed before have been removed and only then can HP The inactivation process with the commercial mixture of
participate actively in the rapid inactivation reaction. PAA (5 to 8 mg L?1) is 2.76 times faster than with PAA
Considering the above reasoning, as a first approxi- alone. It can be seen that the effect of the mixture is greater
mation to the inactivation reaction modeling with the PAA than the sum of the individual effects of the two isolated dis-
commercial mixture, the following scheme incorporating infectants. A potentiating synergetic effect of the existing HP
the bacteria attack in two stages can be proposed: in the commercial mixture was found.
A tentative interpretation for the formation of strong oxi-
BAct → BInj → BDe (7) dant species, based on a chain reaction and a scheme of
HP(very slow) HP(very fast)
attack on bacteria in two stages, has been proposed to
explain the observed results.
BAct → BInj → BDe (8)
PAA(very fast) PAA(fast)
Here, BAct represents an active bacteria and BInj and ACKNOWLEDGEMENTS

BDe portrait injured bacteria and dead bacteria respectively.
In this process, injured bacteria have suffered a certain level The authors are grateful to Universidad Nacional del Litoral
of damage, but they are not lysate. So, active bacteria plus (UNL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y
injured bacteria are considered as viable bacteria. Técnicas (CONICET), and Agencia Nacional de Promoción
When HP is used alone (reaction (1)), the inactivation Científica y Técnica (ANPCyT) for their financial support.
rate is slow, since the first stage (from active bacteria to Thanks are also given to Lic. Pablo D. Nieres for his valu-
damaged bacteria) is the controlling step. In the case of able help in some experimental essays.
the mixture of PAA having HP inhibited (reaction (8)),
the reaction is much faster and the controlling step is the
second (from bacteria damaged to dead bacteria). This REFERENCES
can be explained because it is known that some micro-
Alasri, A., Roques, C., Michel, G., Cabassud, C. & Aptel, P. 
organisms may be protected against HP by their catalase Bactericidal properties of peracetic acid and hydrogen
enzymatic activity. This enzyme does not act against peroxide, alone and in combination, and chlorine and
PAA; in fact, this compound can also inactivate or inhibit formaldehyde against bacterial water strains. Canadian
catalase activity (Malchesky ; Wagner et al. ; Journal Microbiology 38 (7), 635–642.
Galvan et al. ). Bach, R. D., Ayala, P. Y. & Schlegel, H. B.  A reassessment
of the bond dissociation energies of peroxides: an ab
When working with the commercial mixture of PAA
initio study. Journal American Chemical Society 118 (50),
(having HP), the contribution of HP to the process becomes 12758–12765.
important, but only after a fast PAA attack has occurred, Baldry, M. G. C.  The bactericidal, fungicidal, and sporicidal
producing damage in vital parts of the cell metabolism, par- properties of hydrogen peroxide and peracetic acid. Journal
ticularly inactivating catalase. Therefore, PAA rapidly of Applied Bacteriology 54 (3), 417–423.
Baldry, M. G. C. & French, M. S.  Disinfection of sewage
attacks the bacteria in the first stage, facilitating the sub-
effluent with peracetic acid. Water Science and Technology
sequent attack of the damaged bacteria by HP. In a 21 (3), 203–206.
second stage, both PAA and HP, acting together, produce Bianchini, L., Carlucci, L., Caretti, C., Lubello, C., Pinzino, C. &
the very fast death of the bacteria, with a notable increase Piscitelli, M.  An EPR study of wastewater disinfection by
300
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First received 30 June 2013; accepted in revised form 15 October 2013. Available online 29 October 2013
301
Litter CH015.tex 21/10/2013 13: 56 Page 253
CHAPTER 15
Water disinfection with UVC and/or chemical inactivation.

Mechanistic differences, implications and consequences
Marina Flores, Rodolfo Brandi, Alberto Cassano & Marisol Labas
15.1 INTRODUCTION
Human society requires water for drinking, sanitation, cleaning, production of food and energy,
and support of commercial and industrial activities.
Water in nature can contain a variety of contaminants such as minerals, salts, heavy metals,
organic compounds, radioactive residues and living materials, for example parasites, fungi, and
bacteria (US EPA, 2003). In rural and urban areas of low-income countries, millions of the most
vulnerable people lack access to improved water, sanitation and hygiene (WASH) services. Unsafe
water from all sources contributes significantly to the global burden of disease, principally through
the waterborne transmission of gastrointestinal infections such as cholera, typhoid, hepatitis, and a
wide range of agents that cause diarrhea and even death. Thus, cheap and effective water treatment
systems that can be used at different scales, from single-point water sources to small-community
water supplies, can make a valuable contribution to reducing the burden of disease by improving
access to safe water (Ahmed et al., 2011).
Microbiological contamination is a widespread problem and water is one of the most important
vehicles for disseminating this type of pollution, contributing to the dispersion of bacteria, yeasts,
fungi, spores, etc. Part of this contamination is the product of an uncontrolled discharge of
biological wastes or the usage of domestic sewage systems without the corresponding treatment.
Typically, these problems are very often solved with chlorine (or its derivatives) disinfec-
tion, an old, low cost water treatment technology that is very efficient and has an extensive use.
Alongside these advantages, it is well-known the existence of an important drawback resulting
from the toxicity of some of the chlorine disinfection by-products (DBPs) produced by the inter-
action of chlorine and chlorine derivatives with organic substances either naturally existing in
water, or resulting from improperly treated industrial or sanitary wastes (McDonnel and Russell,
1999). Some of these DBPs have been already included in the existing lists of substances having
mutagenic or carcinogenic properties.
During the last years, organizations of different origin have insisted in the need for a gradual
substitution of chlorine for water disinfection and requested for more research efforts aimed at
developing efficient alternatives having reasonable costs (Ahmed et al., 2010). Global reduction
of chemical deposition into the environment is necessary.
Addressing these problems calls out for a tremendous amount of research to be conducted to
identify robust new methods of purifying water at lower cost and with less energy, while at the
same time minimizing the use of chemicals and impact on the environment.
In the latest advances in water purification and disinfection, mainly in the oxidation of toxic
organic compounds, persistent and cumulative, are used the new technologies of advanced oxida-
tion processes (AOPs), which are methods that involved chemical or photochemical generation
and use of species transitional powerful as the hydroxyl radical (OH• ).
This work contains a comprehensive, albeit reduced, report on some of the processes in use,
the kinetic modeling that accompany several of them and the theories behind those proposals,
especially when they have been developed by us, in relation to technologies for water disinfection.
253
302
254 M. Flores et al.
Five disinfection methods were compared: (i) UV disinfection, (ii) hydrogen peroxide disin-
fection, (iii) peracetic acid disinfection (iv) peracetic acid + UV disinfection and (v) Hydrogen
peroxide + UV disinfection. The main target of the study was trying to understand and interpret
the differences that exist between the different procedures. In addition, we were searching for
quantitative information in order to get an idea, as approximate as possible, about operating con-
ditions and final results, with the aim of being able to distinguish among them, which might be
the most efficient, economical and environmentally friendly method.
15.2 DISINFECTION
Disinfection is the process used to reduce the number of pathogenic microbes in the water (US
EPA, 2003).
The most common and widespread health risk associated with drinking water is contamination,
either directly or indirectly, by human or animal excreta and the microorganisms contained in
feces. Drinking such contaminated water or using it in food preparation may cause new cases
of infection. Pathogenic (disease-causing) organisms of concern include bacteria, viruses and
protozoa.
The disinfection process has been routinely carried out since the dawn of the 20th century to
eradicate and inactivate the pathogens from water used for drinking purpose. Disinfectants in
addition to removing pathogens from drinking water, serve as oxidants in water treatment. They
are also used for (i) removing taste and color; (ii) oxidizing iron and manganese; (iii) improving
coagulation and filtration efficiency; (iv) preventing algal growth in sedimentation basins and
filters, and (v) preventing biological regrowth in the water distribution system (US EPA, 1989).
Disinfection may be chemical, physical or a combination of both. Many disinfectants are
used alone or in combinations (e.g. hydrogen peroxide and peracetic acid) in the health-care
setting. These include alcohols, chlorine and chlorine compounds, formaldehyde, glutaraldehyde,
ortho-phthalaldehyde, hydrogen peroxide, iodophors, peracetic acid, phenolics, and quaternary
ammonium compounds. A viable alternative could be the use of chemical agents plus UV radiation
to avoid revival of microorganisms. Disinfection kinetic models are the basis for assessing the
disinfection performance and the design of contactor systems (Trussell and Chao, 1977). Over
the years, a number of kinetic models have been proposed for the formulation of disinfection
design criteria.
Model adequacy is dependent upon the robustness of the underlying inactivation rate law. If
the model accounts for the disappearance, the most cited are: Chick (1908); Watson (1909); Gard
(1957); Selleck et al. (1978); Hom (1972), Hass (1999); Severin et al. (1983) among others.
A summary of some water disinfection processes with kinetic modeling and used devices that
have been developed by us (case studies) in Table 15.1.
All these experiments were conducted with pure water. In practical cases, usually the water
will have impurities. Both organic residues as well as inorganic salts affect the efficiency of the
process, either because they consume the oxidizing agent (when applicable) or because according
to their size, they can help bacteria to be concealed behind these substances affecting the capacity
of penetration of radiation when this treatment is applied. In any practical application, these
considerations will have to be born in mind.
15.3 UV DISINFECTION
UV disinfection is using the ultraviolet light with appropriate wavelengths to penetrate the cells of
microorganisms and destroying the molecular structure of DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA
(ribonucleic acid). It results in growing cell death and (or) regenerative cell death. Thereby, the
microorganism cannot reproduce (Smith, 2011). UV disinfection is a physical method. It does not
add any substance to the water, and operates without any side effects. It is better than chlorination
303
Water disinfection with UVC and/or chemical inactivation 255
Table 15.1. Summary of cases in study.
Disinfection Microorganism
process model Reactor Kinetic model/mechanism approach
UVC Escherichia coli Well stirrer batch Modified Severin model (proposed by Labas
ATCC 8739 annular reactor(*) et al., 2009).
Hydrogen Escherichia coli Well stirrer batch Series parallel pseudo-chemical steps (proposed
peroxide ATCC 8739 annular reactor(*) by Flores et al., 2012).
Peracetic acid Escherichia coli Well stirrer batch An extended series parallel pseudo-chemical
ATCC 8739 annular reactor(*) steps (described in this work).
UV/Hydrogen Escherichia coli Well stirrer batch Modified Severin model (proposed by Labas
peroxide ATCC 8739 annular reactor(*) et al., 2009).
UV/Peracetic Escherichia coli Well stirrer batch Mechanistic approach (described in this work).
acid ATCC 8739 annular reactor(*)
(*) In all experiments, a well-stirred batch annular reactor having a total reaction volume of 2000 cm3 was
employed. The internal radius is ri = 3.7 cm and the external one is ro = 7.5 cm. Stirring was achieved
with a custom made, strong, eccentrically operated, orbital shaking device. A cooling jacket connected to
a thermostatic bath (Haake) surrounds the reactor to keep the reacting system at a constant temperature of
20◦ C. See also Figure 15.1.
Figure 15.1. Experimental reactor. The lamp shown in the figure was used only in those experiments that
required UVC radiation.
about in that aspect. It is usually combined with other substances, for example: UV + H2 O2 ,
UV + H2 O2 + O3 , UV + TiO2 , in order to obtain better disinfection results (US EPA, 2006).
Among the advantages of the use of UV disinfection of water can be mentioned:
• No addition of chemicals.
• Neither pH nor temperature-dependent.
• Specific inactivation mechanism.
• Effective against parasites
15.3.1 The principle of UV disinfection

According to Bolton and Cotton (2008), the mechanism of UV disinfection depends on the
absorption of radiation in proteins and nucleic acids (RNA and DNA) of a given microorganism.
304
Figure 15.2. DNA damage UV-induced. (a) thymine-thymine cyclobutane pyrimide dimer and (b) thymine-
cytosine dimer. Where T: thymine and C: cytosine.
The absorption of large UV doses of the proteins present in the cell membranes leads to rupture
of these membranes and, consequently, to cell death. In contrast, absorption of lower UV doses of
the DNA may disrupt the ability of the microorganism to reproduce, preventing ulterior infection
of the medium.
The effective UV wavelength range can be divided into four different bands: UVA (400–
315 nm), UVB (315–280 nm), UVC (280–200 nm) and vacuum ultraviolet light (200–100 nm).
UVB and UVC light are always used for the disinfection of drinking water treatment, since they
have higher germicidal properties (Harm, 1980). However, the lamp market has been moving
slowly toward sources of radiation usually knows as germicidal lamps with preponderant almost
monochromatic radiation in the UVC (λ = 253.7).
Different forms of DNA lesion have been found to result from UVC-induced damage: some
molecules present in the DNA, such as purines and pyrimidines, absorb strong ultraviolet radiation
(maximum at 254 nm) and undergo chemical changes, such as dimers and hydrates. The two
major UV-induced DNA lesions are cyclobutane-pyrimidine dimers, CPDs, (see also Fig. 15.2)
and Dewar valence isomers (Häder and Sinha, 2005). The dimerization has been considered the
main cause of mutagenic effects resulting from UV radiation.
15.3.1.1 Repair mechanisms

Many organisms have developed active and passive preventive measures to minimize or repair
phototoxic DNA damage and can be repaired following UV disinfection by light-dependent (pho-
toreactivation) and light-independent (dark repair) mechanisms found in many organisms, such
as fecal coliforms, which include Escherichia coli. The repair mechanisms are:
Photoreactivation: The photoreactivation process is catalyzed by enzymes known as photolyases,
which directly reverse DNA damage, and consequently recovers microbial viability (Weber,
2005).
Recombination repair: recombination repair fills the daughter strand gap by moving a comple-
mentary strand from homologous region of DNA to the site opposite the damage (Häder and
Sinha, 2005).
305
Excision repair: Dark repair pathway function by replacing the damaged DNA with a new,
undamaged nucleotides based on the information on the complementary DNA strand (Britt,
1996; Hader and Sinha, 2005).
15.3.2 Case study: UV disinfection in clear water conditions

This section work presents a detailed kinetic study of the rate of removal of a model bacteria
(Escherichia coli) employing UV radiation (253.7 nm) in a laboratory reactor where all the sig-
nificant operating variables were carefully measured and controlled. A significant modification
of the Series-Event Model was used to interpret the experimental data. The developed model is
based on a rather complex dependence with respect to the Escherichia coli concentration and to
the radiation that is effectively absorbed by the bacteria which was precisely quantified. The con-
centration evolution was analyzed employing the plate count method with Petrifilm(TM) specific
plates.
15.3.2.1 Experimental procedure

Escherichia coli strain ATCC 8739 was used throughout this work. The purity of the strain was
verified by conventional methods (APHA, 1984; Marshall, 1992).
The culture was grown in a complex medium (Nutrient broth) that had beef extract as the main
component. Therefore, the broth composition was: tryptone: 10 g L−1 , beef extract 5 g L−1 and
NaCl: 5 g L−1 .
The working solution was prepared from a culture that are in the beginning of the stationary
phase and afterwards was brought to a 1/1000 dilution with physiological saline to simulate clear,
transparent waters. The specific absorption coefficients of the two culture media and E. coli
were measured in a UV-Vis Lamda 40 Perkin-Elmer Spectrophotometer at 253.7 nm. An atomic
spectroscopy analysis (Perkin-Elmer-5000 AAnalyst) detected traces of iron and copper ions in
the growing culture (Cu = 7.7 µg g−1 and Fe = 43 µg g−1 ).
Initial E. coli concentrations ranged from 104 to 106 CFU cm−3 (CFU = colony forming unit).
Notice that, in this case, the system was irradiated, in distinct experiments, with two tubular
lamps of different power, placed on the centerline of the annular space and separate from the
polluted water by a concentric quartz tube.
15.3.2.2 Experimental runs

The lamps were turned on, allowing 30 minutes for stabilizing their operation. The sample at t = 0
was taken at the same time that the lamp shutters were taken off. Afterwards, samples were taken
at different time intervals for several measurements.
The exact value of the initial concentration of bacteria was measured for each experiment.
Runs were duplicated and samples subjected to triplicate determinations. The initial pH was 7
and remained practically constant during all the runs. It is necessary to emphasize that none of
these experiments was done in the presence of any oxidizing agent as for example, hydrogen
peroxide, in order to make sure that only the effect of the ultraviolet radiation was observed.
The CFU counting method was made with a sterile peptone water solution. Dilutions of the
samples to obtain the optimum concentration for the CFU counting were used. Each sample
was subjected to the following measurements: absorbance a 253.7 nm and CFU counting using
specific Pretrifilm™ plates (3 M Microbiology Products) for E. coli and coliform bacteria. The
plates were incubated during 24 hours at 37◦ C.
After one experimental run was completed, the UV lamp was turned on for 30 minutes. After-
wards, the reactor was washed with distilled water. This operation was repeated three times. Then
the reactor remained kept with a mixture of distilled water and alcohol until the next experimental
run. Before starting a new experiment, the reactor was washed again twice with distilled water
to remove any residual alcohol. Before beginning with the usual protocol corresponding to the
characteristics of every experiment, the UVC radiation source was turned on again for a period
306
of an hour with the reactor completely empty. This procedure was applied in the four different
cases described in this work.
15.3.2.3 Kinetic model

The developed model is a modification of the Series-Event one originally proposed by Severin
(1982). The model is thought of as a series of consecutive “damaging reactions” each one of them
producing a partial alteration on the structure of the different chemical blocks that construct the
DNA and RNA sequence of the bacteria. However, it exist a threshold limit. Organisms which
have reached an event level greater than the threshold limit are inactivated and those which are
below this level survive. For this reason, part of the information needed for the model is to know
this threshold limit.
The original kinetic model was formulated in terms of mixed second order kinetics with respect
to the local light intensity and the concentration of microorganisms existing in each event level.
However, in the experiments performed in a batch reactor, assumption was made that the light
intensity was uniform and constant and the hypothesis was incorporated in the kinetic model
(uniform intensity).
Experiments were also carried out in a completely mixed, annular, flow-through reactor. This
assumption was fully removed in our work.
After a damaging event, it is considered that a new species is formed. Then, the process can be
presented as a series of n reactions according to (Labas et al., 2009):
k1 k2 ki+1 kn
CEc,0 −−−→ CEc,1 −−−→ CEc,i −−−→ CEc,n−1 −−−→ CEc,n (15.1)
with i = 0, 1, 2, . . ., i, . . ., n and k1 = k2 = kn = k
0
It should be noticed that the initial concentration of bacteria is CEc whereas CEc,0 is the concen-
0
tration of those that have not received any damage. Only at t = 0, CEc = CEc,0 . At any other time
0
CEc,i < CEc . CEc,i is the concentration of a given state of damage (state i) in the microorganism
that has reached the level of injured “i” “and “n” is the threshold limit” equal to the number of
events needed to reach inactivation thus n represents inactivated “species” that have suffered an
usually quasi-irreversible damage an can be counted as dead bacteria. The total number of existing
“species” is n + 1 in order to account for the species that have not yet received any injury.
All bacteria, either the ones that have no damage or the others that have received some level
of damage, but have not reached the threshold limit “n”, are survival bacteria CEc. Because the
number of inactivated or death bacteria can be obtained from the difference between the initial
0
concentration CEc and the concentration of survival bacteria CEc
n−1
?
0 0
CEc,dead = CEc − CEc = CEc − CEc,i (15.2)
i=0
It is possible to write the equivalent to a mass balance (bacteria inventory) for each species:
For i = 0:
dCEc,i
= −ki+1 (CEc,i )δ ?(αλ Eλ,0 )γ ? (15.3)
dt
For i = 1, 2, . . . , n − 1:
dCEc,i ? ?
= ki (CEc,i−1 )δ ?(αλ Eλ,o )γ ? − ki+1 (CEc,i )δ (αλ Eλ,o )γ (15.4)
dt
For i = n:
dCEc,i ? ?
= ki (CEc,i−1 )δ (αλ Eλ,o )γ (15.5)
dt
Equations (15.3) to (15.5) need the value of the fluence rate as a function of position and time.
From the definition of the fluence rate:
?
Eλ,o (x, t) = Lλ,? (x, t) d? (15.6)
?
307
Thus, it can be obtained if the value of the radiance (radiation power) is known. From the
radiative transfer equation for homogeneous media:
dLλ,? (s,t)
+ αλ (s,t)Lλ,? (s,t) = 0 (15.7)
ds
where Lλ,? is the spectral radiance of wavelength λ and direction ?.
With the boundary condition:
Lλ,? (sR ,t) = L0λ,? (t) (15.8)
Equation (15.7) can be formally integrated and substituted into Equation (15.6). For conve-
nience, the solid angle may be written in terms of a spherical coordinate system, resulting in the
following result:
? φ2 ? θ2 ? ? sL ?
0
Eλ,o (s, t) = dφ dθ sin θ(Lλ (θ, φ, t)) exp − α(s, t) ds (15.9)
φ1 θ1 sR
To calculate the radiation field inside the reactor, an emission model for the lamp is needed.
With this purpose, the three dimensional source with volumetric emission model proposed by
Cassano et al. (1995) will be applied. As shown in the Appendix for integrating Equation (15.9)
the following boundary conditions apply:
For the value of: L0 (θ, φ)
? ? 0.5
Pλ,L 2[r 2 (cos2 φ − 1) + rL2 ]
L0 (θ,φ) = ϒw (15.10)
4π 2 rL2 LL sin θ
ϒ w is an average value of the reactor wall transmittance. (Notice that the subscript λ has been
dropped because this work is carried out with monochromatic radiation).
And for the limiting angles are:
? ?
2 2 2 ½
−1 r cos φ − [r (cos φ − 1) + rL ]
θ1 (φ) = tan (15.11)
(LL − z)
? ½
?
r cos φ − [r2 (cos2 φ − 1) + rL2 ]
−1
θ2 (φ) = tan (15.12)
−z
? ?
−1 (r 2 − rL2 )½
−φ1 = φ2 = cos (15.13)
r
The final equation that can be solved with the help of numerical integration is:
⎧φ ⎡ s ⎤⎫
?2 ?θ2 ?L
(ϒw Pλ,L )(4π 2 rL2 LL )sin θ ⎨ 0.5
⎬
Eo (r, z, t) = 0.5
(dφ) dθ 2 [r 2 (cos2 φ − 1) + rL2 ] exp⎣− α(s, t)ds⎦
2[r 2 (cos2 φ − 1) + r 2 ] ⎩
L
⎭
φ1 θ1 sR
(15.14)
However, the value of Pλ,L is not always well known (it is provided by the lamp manufacturer)
and invariably changes along the time of operation of the useful life of the radiation source. When
the fluence rate at the reactor wall can be measured with actinometer methods (Murov et al.,
1993; Zalazar et al., 2005), it is convenient to use an alternative form of Equation (15.14). This
is particularly always possible in laboratory research work.
? ?
lamp reactor characteristics
E?0|W ? = f (15.15)
System geometry
with E?0|W ? being the fluence rate at the reactor wall.
308
Therefore, with the help of the elaborate algebraic artifice it is possible to transform Equation
(15.14) into the following expression:
⎡ ⎤
?φ2 ?θ2 ?sL
? E o |W ? 0.5
Eo (r, z, t) = dφ dθ 2[r 2 (cos2 φ − 1) + rL2 ] exp⎣− α(s,t)ds⎦ (15.16)
ψ
φ1 θ1 sR
where ψ is a geometric factor that always should be computed because LR , rL and ri are known:
?LR φ?2 (ri ) (φ,ri ,z)
θ2 ?
1 0.5
ψ= dz dφ dθ 2[r 2 (cos2 φ − 1) + rL2 ] (15.17)
LR
0 φ1 (ri ) θ1 (φ,ri ,z)
Notice the difference between Equations (15.14) and (15.16); in the second, ri is a constant.
Eo |W /ψ gives the boundary condition just before the absorption process produced by the reacting
medium commences at r = ri . ψ accounts for the geometrical relationship that expresses the
relative location of the lamp (with all its dimensions) and the inner wall of the reactor at r = ri .
It is clear that, with the exception of the wall compound transmission coefficient given by ϒW ,
from the lamp until the point at r = ri , the medium is transparent. Eo |W is the value that can be
obtained with potassium ferrioxalate actinometry (Murov et al., 1993; Zalazar et al., 2005).
Finally, since for a reactor of constant cross sectional area, the volume average is reduced to an
integral over the reactor length, the volume average of Eo (r, z, t) must be calculated according to:
?
1 LR
?Eo (r,z,t)? = Eo (r,z,t) dz (15.18)
LR 0
The final result to be used in Equations (15.3) to (15.5) is:

⎧ ⎡ s ⎤⎫γ
? ?γ ?LR ?ro ⎨?φ2 ?θ2 ?L ⎬
? ? 2 E o |W 0.5
Eo = 2
γ
dz r dr dφ dθ 2 [r 2 (cos2 φ − 1) + rL2 ] exp⎣− α(s, t)ds⎦
(ro − ri2 )LR ψ ⎩ ⎭
0 ri φ1 θ1 sR
(15.19)
The linear napierian radiation absorption coefficient of the system (α) is defined as:
?
α = αEc + αc with αEc = κEc,i CEc,i (15.20)
?
1 λmax
and αc = αλ Pλ dλ (15.21)
Pc λmin
∧
where κ[=]cm2 (CFU)−1 and CEc,i [=]CFU cm−3 .
In order to facilitated the understanding of the development of the limits of integration of
Equation (15.19), in the appendix included at the end of the main text, it has been added a figure
to explain clearly the meaning of all the variables used to obtain Equations (15.10) to (15.13).
15.3.2.4 Experimental results

Disinfection with UV radiation has been effective, achieving high rates of inactivation at short
contact times (Fig. 15.3) employed worldwide for decades. The primary advantage of UV disinfec-
tion is to control microorganisms without chemicals and it has numerous benefits for municipal,
industrial and commercial customers.
309
Figure 15.3. Results employing UVC radiation, with different lamps. Dotted lines and solid lines are results
from the model. (Reproduced from Photochemical & Photobiological Sciences; Reference:
Labas et al., 2009. Reproduced by permission of The Royal Society of Chemistry: www.
res.org/pbs).
15.4 HYDROGEN PEROXIDE
The antimicrobial and/or antiseptic properties of hydrogen peroxide have been known for many
years because of its efficacy and reasonable manipulation safety (Dalrymple et al., 2010; Labas
et al., 2006). It is effective against a wide spectrum of bacteria, yeast, molds, viruses and spore
forming organism (Cords et al., 2005; Labas et al., 2008). The cytotoxic effect exerted by hydrogen
peroxide on microorganisms depends on the cell type used, its physiological state, length of
exposure, environmental condition, H2 O2 concentration used and the cell culture media employed
(Labas et al., 2008; Raffellini et al., 2010). According to its concentration hydrogen peroxide
can act as bacteriostatic or as bactericide. The cytotoxic effects of H2 O2 on Escherichia coli have
been extensively studied (Labas et al., 2005; 2008; Raffellini et al., 2010).
For water disinfection purposes, the non-persistent characteristic of hydrogen peroxide becomes
a disadvantage to maintain the water quality in the distribution system. However, its use is widely
spread because it is relatively inexpensive, is easily removed when desired and is unlikely to be
health hazardous if used properly.
15.4.1 The principle of disinfection using hydrogen peroxide

Hydrogen peroxide is disinfectant with recognized antimicrobial properties that can be used
because is effective and easy to manipulate. In addition, the chemical mechanisms that promote the
hydrogen peroxide decomposition can be inferred but infrequently established with indisputable
certainty. However it is known that is due to its ability to generate strongly oxidant chemical species
like the hydroxyl radical OH• . This radical species reacts with almost all biological molecules.
The attack by the OH• radical, in the presence of oxygen, initiates a complex cascade of oxidative
reactions leading to decomposition of the all the enzymes and organic compounds that result from
the rupture of the cell membrane.
15.4.2 Case study: hydrogen peroxide disinfection in clear water conditions

This section is an attempt to model the disinfection process based on a chemical interpretation
of the possible mechanism of cell damage. The key point is to search for the most accepted
assumptions concerning the possible place where the action of reactive hydroxyl radical can
take place. According to literature, (Dalymple, 2010; Maillar, 2002; Mc Donnell and Russell,
1999) in the case of bacteria three sites of the cell could be the targets for OH• invasion: (i)
310
The peptidoglycan layer, (ii) the lipopolysaccharide layer (found only in Gram-negative bacteria)
and (iii) the phospholipid bilayer. In this study Escherichia coli was the chose bacteria and
consequently the three layers will be present.
After the attack to the membrane, the oxidation of the products resulting from the lysis of the
bacteria, was modeled as a series of chemical events, which leads to its dead or to an irreversible
damage. The pathway of the kinetic model includes: active (BAC ), inactive (BIN ) and death (BDE )
population of bacteria, as well as several additional chemical products of the lysis with the generic
denomination of LYP1 , LYP2 , . . . , LYPn .
The kinetic model developed in this work was successfully validated with experimental data.

The experimental procedure, the culture media preparation and handling and conditioning of the
bacterium has been detailed in 15.3.2.1.
The following chemical were used in this experience: hydrogen peroxide (Merck, pro analysis
30%), Catalase (from Aspergillus niger, Biochemika), Ammonium molybdate (Cicarelli, pro-
analysis), Potassium iodide (Cicarelli, pro-analysis), Potassium acid phthalate (Cicarelli, 95%
pro-analysis), Physiological saline solution (Roux-Ocefa), Nutrient broth (Biokar Diagnostics),
Sodium hydroxide (Cicarelli, pro-analysis) and Peptone water (Biokar Diagnostic).
To quench the hydrogen peroxide action during the time interval between sampling and spread
plating, a known fraction of the sample was mixed with the required amount of catalase solu-
tion. Control experiments were conducted to ensure that the employed concentrations of catalase
solutions did not affect bacterial concentrations. After spreading the plates with the appropriate
volume of sample they were incubated for 24 h at 37◦ C.

This development is an attempt to model the disinfection process based on a chemical
interpretation of the possible mechanism of cell damage.
In modeling the intrinsic reaction kinetics of disinfection with hydrogen peroxide one of the
major difficulties is to include the iron or iron-superoxide participation in the mechanism to
produce hydroxyl radicals (Kehrer, 2000; Sies, 1991); i.e. the Fenton-like or Haber-Weis-like
reaction:
k1
H2 O2 −−−−− −−−−−−−−
2+ 3+
−−−
−
−−−−−−→ OH− + OH• (15.22)
Fe +H2 O2 or Fe +O2 promotion
Note that, when the reaction is written as above, without including specifically the Fe3+ or the
Fe3+ + O•−
2 promotion, k1 is not known.
The formation of hydroxyl radicals is proposed according to the following path:
Propagation:
k2
H2 O2 + OH• −−−→ HO•2 + H2 O (15.23)
k3
H2 O2 + HO•2 −−−→ OH• + H2 O + O2 (15.24)
Termination:
k4
2OH• −−−→ H2 O2 (15.25)
k5
2HO•2 −−−→ H2 O2 + O2 (15.26)
k6
OH• + HO•2 −−−→ H2 O + O2 (15.27)
15.4.2.2.1 Membrane disruption
The process that ends up with the membrane breakdown may be treated by resorting to a pseudo
homogeneous interpretation of the intricate network of superficial reactions that leads to the
rupture of the protective envelope. Let HSCW|B represent a hypothetical species of the components
of the cell wall of the active bacteria whose concentration can be expressed in units of mol cm−2
311
and that reacts with the OH• radical. This composition is, on the average, the same one for every
specific bacterium species. Then,
k7∗
HSCW |BAC + OH• −−−→ HSCW |BIN (15.28)
At this point, it is possible to think of SSA|BAC as the specific superficial area per unit volume of
one cell (in units of cm2 cm−3 ), V|BAC as the volume of one cell per CFU (in units of cm3 CFU−1 )
and [BAC ] as the whole instantaneous concentration of the active bacteria (in units of CFU cm−3
of reacting medium). The concentration of hypothetical species per unit volume of the fluid may
be calculated from the abovementioned superficial concentration of this species as:
[ HSCW |B ] × SSA|B × V |BAC × [B ](t) (15.29)
? ?? AC? ? ?? AC? ? ?? ? ? AC
?? ?
Superficial concentration of Superficial area per unit volume of Instantaneous concentration of
hypotetical species volume of bacterium one CFU active bateria per unit volume
of one bacterium
? ?? ?
Instantaneous representation of the total volumetric
concentration of hypotetical species of the active bacteria
Taking into account averaging values specific bacterium species, [HSCW |BAC ] in the cell wall,
SSA|BAC and V |BAC may be assumed almost constant. Then:
[HSCW |BAC ] × SSA|BAC × V |BAC = constant (15.30)
? ?
k7 = k7∗ × HSCW |BAC × SSA|BAC × V |BAC (15.31)
???? ????
However, it is very unlikely that just one hydroxyl radical will produce a serious damage to
the cell wall. Neither the number of moles of which OH• that are necessary to consider that
the bacterium has been injured, nor the number of bacterium that form a CFU are known. It is
always possible to conceive an oxidation yield as the ratio of injured CFU with respect to the
spent hydroxyl radicals to produce this event:
k7 Injured CFU CFU cm3
k7# = ; Y7 = • [=] ; k7# [=] (15.32)
In order to have the proper application of this yield as well as achieving unit’s homogeneity it
must be considered that:
R7,OH = −k7∗ [BAC ][OH• ] (15.33)
With this pseudo homogeneous, biological reaction approach, step 15.28 can be finally
expressed as:
k7
BAC + OH• −−−→ BIN (15.34)
In a similar way, the same procedure can be applied to the injured bacteria in the reaction with
the OH• radicals according to:
? ?
k8 = k8∗ × HSCW |BIN × SSA|BIN × V |BIN (15.35)
???? ????
k8 Dead CFU CFU cm3

k8# = ; Y8 = [=] ; k8# [=] (15.36)
Y8 OH• spent in this event mol CFU s
R8,OH = −k8# [BIN ][OH• ] (15.37)
k8
BIN + OHg −−−→ BDE (15.38)
This step leads to the rupture of the cellular wall and the death of the bacterium.
312
Lysis of dead bacteria

The death of the bacterium implies that the cellular wall has been broken permitting the access
of the oxidant to the intracellular components, rendering the lysate:
k9
BDE + OH• −−−→ LYSATE (15.39)
Once the anatomic morphology of the cell has been altered producing the lysate, the OH•
can interact with its internal components in typical homogeneous reactions. From the chemical
point of view the activity of the OH• radicals can be interpreted in terms of several parallel-series
reactions with an undefined number of hypothetical components of the resulting lysis. In the
model they are represented by LYP,1 , LYP,2 ,…,LYP,n−1 , LYP,n that correspond to important groups
of compounds which, after ulterior oxidations will produce the end products of the disinfection
process:
+OH• +OH• +OH•
LYP,1 −−−−−−→ LYP,1 −−−−−−→ · · · · · LYP,1,n−1 −−−−−−→ EP1,n (15.40)
• • •
+OH +OH +OH
LYP,n−2 −−−−−−→ LYP,n−2,1 −−−−−−→ · · · · · LYP,n−2,n−1 −−−−−−→ EP,n−2,n (15.41)
LYP,n - 1 −−−−−−→ LYP,n−1,1 −−−−−−→ · · · · · LYP,n−1,n−1 −−−−−−→ EP,n−1,n (15.42)
LYP,n −−−−−−→ LYP,n,1 −−−−−−→ · · · · · LYP,n,n−1 −−−−−−→ EP,n,n (15.43)
15.4.2.3 Mathematical model final equations

The final expression for the disappearance rate of active bacteria is:
γA [BAC ][H2 O2 ]
RBAC = − (15.44)
[H2 O2 ] + γ0 [BAC ] + γ1 [BIN ] + γ2 [BDE ]
where: ? ?
k1 k7 k7# k8# (k9# + αk10 )
γA = ; γ0 = ; γ1 = ; γ2 = (15.45)
k2 k2 k2 k2
The final expression for the disappearance rate of injured bacteria is:
[BAC ][H2 O2 ]γA − [BIN ][H2 O2 ]γIN
RBIN = (15.46)
[H2 O2 ] + γ0 [BAC ] + γ1 [BIN ] + γ2 [BDE ]
where: ? ?
k1 k8
γIN = (15.47)
k2

According to Figure 15.4, it can be noticed that the model reproduces the experimental results.
The model also provides good information about the way in which the inactivation reaction
proceeds. It is possible to follow the changes in concentration of the active, injured and dead
bacteria, it is shown in Figures 15.4a,b for two different concentrations of hydrogen peroxide. In
the present context, it appears capable of accommodating biological recovery, as manifested by
the shoulder which appears in many survival curves.
From these two figures, it can also be observed a consistent behavior. When lower concen-
trations of hydrogen peroxide are used (45 ppm) the survival of a major number of active and
injured bacteria is seen, indicating that the oxidation is not sufficiently intense to overcome the
resistance of the cell wall. Conversely, at higher concentrations, (185 ppm) the number of survival
and undamaged bacteria gradually decreases and there is a breaking of the bacteria envelope in a
shorter time. Then, very rapidly, it changes from the state of injured bacteria to one of irreversible
death.
313
Figure 15.4. Graphical description of the concentration evolution of the principal species existing in the
reacting medium as seen by the model. The plot follows changes in concentration of the
active, injured and dead bacteria at (a) 45 µg/cm3 and (b) 185 µg/cm3 of concentration of
H2 O2 . Experimental data: Solid line: culturable bacteria (BAC + BIN ); broken line: Active
bacteria; broken and dotted line: Injured bacteria; dotted line: Dead bacteria. (Reproduced
from Chemical Engineering Journal, Vol. 198–199/edition N◦ 1, Flores et al.; Pages 388–396;
Reproduced with permission from Elsevier).
15.5 PERACETIC ACID
Peracetic acid (PAA) use increased in the recent years because of its ecologically beneficial
properties (the reaction products are oxygen, water, and acetic acid) and its relative low cost.
However, the most remarkable attributes of PAA are: the broad spectrum of activity even in the
presence of heterogeneous organic matter, the absence of persistent toxic or mutagenic residual
314
byproducts, no quenching requisites, small dependence of pH, short contact time requirements
and effectiveness for primary and secondary effluents. PAA is also characterized by its easy
technical preparation. The equilibrium state of its commercial solution is shown in the following
equation:
H+
−−
CH3 COOOH + H2 O ←−−−−
−−−−
→
−− CH3 COOH + H2 O (15.48)
PAA is a strong oxidant and disinfectant. Its oxidation potential is larger than that of chlorine or
chlorine dioxide. PAA is a more potent antimicrobial agent than hydrogen peroxide, being rapidly
active at low concentrations against a wide spectrum of microorganisms (Baldry, 1983; Baldry and
French, 1989b; Fraser et al., 1984). Its demonstrated effectiveness against V. cholera suggested
it should be a significant element in cholera control efforts. It is know that the PAA disinfection
capabilities are due to its ability to generate strongly oxidant chemical species such as the O− 2
superoxide radical or its conjugated base HO•2 , and the hydroxyl radical OH• . The damaging
effects of the bacteria cellular components seems to be produced by a particular phenomenon
called oxidative stress, resulting from those reactive oxygen species known as ROS (Labas et al.,
2006).
15.5.1 PAA mode of action

It is suggested that PAA disrupts the chemiosmotic function of the lipoprotein cytoplasmic mem-
brane and transport through dislocation or rupture of cell walls (Baldry and Fraser, 1988; Leaper,
1984). Thus, it may be that it is equally effective against outer membrane lipoproteins, facili-
tating its action against Gram negative cells (Leaper, 1984). Its action as a protein denaturant
may help to explain its characteristics as a sporicide and ovicide (Block, 1991). Furthermore,
intracellular PAA may also oxidize essential enzymes; thus, vital biochemical pathways, active
transport across membranes, and intracellular solute levels are impaired (Fraser et al., 1984).
It was demonstrated that PAA acts on the bases of the DNA molecule (Tutumi et al., 1973). An
important advantage of PAA is that it may inactivate catalase, an enzyme known to hinter free
hydroxyl radicals (Block, 1991).
15.5.2 Case study: water disinfection with peracetic acid in clear water conditions
This study was aimed at evaluating the disinfection efficiency of the PAA commercial solution
(15%) with the usual indicator of fecal contamination, Escherichia coli. The disinfection aptitude
of PAA was studied at different concentrations (1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6 mg L−1 ) as well as various
inactivation times. The reacting system used in all experiments was an annular, well-mixed batch
reactor having a total volume of 2000 cm3 . The feasibility of PAA for water efficient water
disinfection has been verified in this work: a 99.99% reduction of E. coli CFU was achieved,
with doses ranging from 1 to 6 mg L−1 and 5 minutes of contact time. A kinetic disinfection
mechanism is proposed to explain the obtained results.

bacterium has been detailed in 15.3.2.1.
The following chemical were used: Peracetic acid (Quimica Agroindustrial Neo: PAA 15%
v/v; H2 O2 20% v/v; acetic acid 25% v/v and water 40% v/v); Catalase (from Aspergillum
niger, Biochemika); Potassium permanganate solution, 0.1 N (Cicarelli, pro-analysis);
Sulfuric acid (Cicarelli, pro-analysis); Sodium thiosulfate (Cicarelli, pro-analysis); Physiological
saline solution (Roux-Ocefa); N,N-diethyl-p-phenylene-diamine (DPD) (Hach), Nutrient broth
(Biokar Diagnostics), Eosine Methylene Blue (EMB) Agar (Biokar Diagnostics) and Peptone
water (Biokar Diagnostic).
To quench the peracetic acid and hydrogen peroxide action during the time interval between
sampling and spread plating, a known fraction of the sample was mixed with the required amount
315
of sodium thiosulfate and catalase solution respectively. Control experiments were conducted
to ensure that the employed concentrations of thiosulfate and catalase solutions did not affect
bacteria concentrations. The plates were incubated, after spreading them with the appropriate
volume of sample, for 24 h at 37◦ C in EMB plate.
15.5.2.2 A proposed kinetics of peracetic acid decomposition

Rokhina et al. (2010) developed a complete chain reaction mechanism that originated several
radical species, which can oxidize different sites (targets) of the bacteria’s cell membrane and its
internal constituents. The reaction was applied to advanced oxidation processes (AOPs), such as
phenol degradation with the assistance of MnO2 , and the cycle was analyzed both theoretically
and experimentally. The proposed scheme also resorted to previous reports that reinforced their
proposal Heywood et al. (1961), El-Agamey et al. (2003), Shi and Li (2007) and Ciotti et al.
(2008). Leaving aside the details that can be found in the original publication, the chain reaction
pathway is described as follows:
CH3 C(=O)OOH → CH3 C(=O)O• + HO• (15.49)

• •
CH3 C(=O)OOH + HO → CH3 C(=O) + O2 + H2 O (15.50)
• •
CH3 C(=O)OOH + HO → CH3 C(=O)OO + H2 O (15.51)
CH3 C(=O)O• → H3 C• + CO2 (15.52a)

• •
2CH3 C(=O)O → 2H3 C + 2CO + O2 (15.52b)
H3 C• + O2 → OOCH3• (15.53)
• •
CH3 C(=O)O + HO → CH3 C(=O)OOH (15.54)
Equation (15.53) is only important in oxygen saturated environments. It was found that Equation
(15.49) is the rate controlling step. The authors claim that all the generated radical species are
active contributors to the degradation mechanism but OH• and to some extent the H3 C radicals,
are the most significant ones. The reaction requires the presence of an eligible catalyst that should
be of the types usually encountered in Fenton or Fenton-like reactions. In our reacting system
employing AAS (Perkin-Elmer-5000 AAnalyst) we always found traces of cooper and iron species.
Thus, this reaction could provide the necessary conditions for a fast attack to different components
of the microbial cellular membrane. Additionally, at pH between 5 and 10 the following reaction
is also possible (Koubet, 1964; Yuan et al., 1997):
CH3 C(=O)OOH + CH3 C(=O)OO− → 2CH3 C(=O)O• + O2 + H+ (15.55)
Equation (15.55) contributes to increase the concentration of oxidative radicals.

In Figure 15.5, it is shown that for concentrations larger than 5 ppm 99.9% disinfection is obtained
in less than 2 minutes. It is interesting to note that just small concentrations of PAA are needed
to produce these results.
However, it must be noted that these results were obtained using clear water and in the absence
of natural organic matter (NOM). PAA has been shown to be a very active oxidant of many
organic compounds and, consequently, the presence of this type of impurities in natural waters
will certainly have a negative influence in the actual inactivation effectiveness. In fact, they will
participate in parallel oxidative pathways competing with the attack produced by the oxidizing
species on active and/or partially injured bacteria. Other adverse effects such as for example, the
occurrence of inorganic salts, will also affect the disinfection mechanism.
316
Figure 15.5. Disinfection results as a function of time. PAA is the parameter.
15.6 PERACETIC ACID + UV LIGHT
In the literature, the principal applications of these processes refer to the oxidation of organic
compounds, dissolved inorganic compounds and other pollutants that are toxic and/or refractory
to biological treatments. Few references were found, however, regarding their use for wastewater
disinfection (Caretti and Lubello, 2003).
Contrary to other advanced oxidation processes (UV/H2 O2 , O3 /H2 O2 , O3 /UV, TiO2 /UV),
numerous bibliographic references for the combined treatment between peracetic acid (PAA)
and UV do not exist (Caretti and Lubello, 2003). PAA based product consist of equilibrium
mixtures of peracetic acid, hydrogen peroxide, acetic acid and water in different proportions
where hydrogen peroxide plays different roles, being implied in the restoration of the equilibrium
between the different species after consumption of PAA but also acting as an oxidizing biocide
itself (Bianchini et al., 2002).
The biocide action of PAA and H2 O2 can be attributed to the production of highly reactive
radicals, above all the hydroxyl radical OH• originated by the cleavage of the peroxidic bond.
In the absence of UV irradiation, Fenton reactions, which are catalyzed by transition metal ions
traces are usually responsible for radical creation. In the presence of UV irradiation, radicals can
be photochemically produced by the cleavage of the O-O bond by UV light (Bianchini et al.,
2002).
15.6.1 Case study: disinfection of water with peracetic acid and its combination with UVC
bacterium has been detailed in Section 15.3.2.1.
Samples were taken every 1 second, with a sampling device especially designed for that purpose.
En all the disinfection experiments the plates were incubated, after spreading them with the
appropriate volume of sample, for 24 h at 37◦ C in EMB plate.
As mentioned in 15.3.2.1, in this case, the system was irradiated, in distinct experiments, with
two tubular lamps of different power, placed on the centerline of the annular space and separate
from the polluted water by a concentric quartz tube. In these cases, the lamps were turned on,
317
allowing 30 minutes for stabilizing their operation. The sample at t = 0 was taken at the same time
that the lamp shutters were taken off. Afterwards, samples were taken at different time intervals
for several measurements.
15.6.1.2 A proposed kinetics of peracetic acid + UV

There are different possible conceptually different explanations to interpret the result of disin-
fection of Escherichia coli with PAA and UV radiation. We will advance some possibilities and
finally propose our tentative explanation of our data.
According to Caretti and Lubello (2003), it is possible to go back to the peroxide acids theory to
show how the action of UV produces a homolytic rupture in the O - O bond of the PAA molecule,
with the subsequent formation of the hydroxyl radical:
+hν
CH3 CO3 H −−−→ CH3 CO•2 + OH• (15.56)
CH3 CO•2 rapidly declines forming CH•3 and CO2 while the molecule of peracetic acid can sub-
sequently react with the OH• radicals produced, according to the following reactions of addition
and subtraction of labile hydrogen:
CH3 CO3 H + OH• → CH3 CO4 H2 + HOO• + CH3 CO2 H (15.57)
CH3 CO3 H + OH• → CH3 CO• + O2 + H2 O (15.58)
The presence of hydrogen peroxide within the commercial product of the PAA contributes not
only to the formation of new PAA as soon as it is consumed, but also to the formation of new
hydroxyl radicals.
According to Keller et al. (2008), the photodissociation of the PAA can follow one or even
more than one of the following three possible reaction pathways:
CH3 CO3 H−→CH3 CO•2 + OH• → CH3 + CO2 + OH• (secondary) (15.59)
The first reaction (15.59) is initiated by a homolytic O-O bond cleavage to generate two
photoproducts.
Equation (15.60) follows a concerted mechanism with simultaneous fission of an O-O bond
and a C-C bond:
CH3 COH → CH3 + CO2 + OH• (15.60)
Equation (15.61) is also stepwise reaction but instead begins with a C-C bond cleavage:
CH3 CO3 H → CH3 + CO3 H → CH3 + CO2 + OH• (secondary) (15.61)

As shown in Figure 15.6, the combination of UV/PAA achieved higher levels of inactivation at
lower contact times.
Results of the microbiological analysis on samples showed that PAA and UV together were
very effective in bacteria removal. It can be assumed, in accordance with previous mechanistic
proposals, that this very high effectiveness was due to the generation of hydroxyl radicals by the
photolysis phenomena, but the obtained inactivation rates were similar to those produced using
UV radiation as a single agent (7–8 seconds). This would indicate that the addition of PAA does
not lead to a significant increase in the effectiveness of the process. Nevertheless, the benefits of
this combination are that peracetic acid would act as a bactericide, preventing bacterial regrowth,
turning the bacteria inactivation an irreversible dead.
318
Figure 15.6. Results employing UVC plus PAA.
15.7 HYDROGEN PEROXIDE + UV
Publications concerning kinetic studies of the combined use of UVC radiation and hydrogen
peroxide are very limited. Sundstrom et al. (1992) proposed two kinetic models: a mixed second
order model and an application of the typical Series-event model. Later Gardner and Sharma
(1992) described the inactivation of spores of B. subtilis in terms of a kinetic expression derived
from the Multi-Target model. Just recently, Alkan et al. (2007) studied inactivation working with
coliform bacteria in superficial waters and interpreted their results calculating the coefficients of
the Chick–Watson model.
However, there is no consensus concerning the most certain mechanism that explains the
action of H2 O2 /UV in disinfection process. Sundstrom et al. (1992) employing bacteria such as
Escherichia coli and Bacillus subtilis found a beneficial effect on the rate because of the addition
of hydrogen peroxide on the other hand, Rajala-Mustonen and Heinomen-Tanski (1995) found
the opposite result.
Rincon and Pulgarin (2004) found a synergistic effect of low wavelength UV radiation and low
concentrations of hydrogen peroxide (less than 10 ppm). Bayliss and Waites (1979) and Standard
et al. (1983) found an acceptable effectiveness of the method to inactivate vegetative cells and
spores employing rather large concentrations of H2 O2 .
15.7.1 Case study: disinfection with hydrogen peroxide and UV light in

clear water conditions
bacterium has been detailed in 15.3.2.1 and 15.3.2.2.
The lamps were turned on, allowing for 30 minutes stabilizing their operation. The working
solution was added to the reactor, immediately after the proper dosage of peracetic acid is added to
the reactor and immediately starts stirring to homogenize the medium. Samples were taken every
1 second, with a sampling device designed for that purpose. En all the disinfection experiments
the plates were incubated, after spreading them with the appropriate volume of sample, for 24 h
at 37◦ C in EMB plate.
319
Table 15.2. Processing time to reach 99.99% reduction

of the CFU concentration.
Process Time/s
UVC (40 W) irradiation 10

UVC (15 W) irradiation 14
This table was adapted and modified from Labas et al.,

2009. Photochem. Photobiol. Sci. rsc.org/pps.
Figure 15.7. Results employing UVC plus hydrogen peroxide. 15 W nominal input power lamp. Dot-
ted lines, dotted and broken lines, broken lines and solid lines are results from the model.
(Reproduced from Photochemical & Photobiological Sciences; Reference: Labas et al., 2009).
Reproduced by permission of The Royal Society of Chemistry: www. res.org/pbs).

The Modified Series-event model was applied once more. The equations for this process are very
similar to those derived for the first case (Section 15.3).
However, Equation (15.16) in Section 15.3 must be significantly modified according to
(Labas et al., 2009):
α = αEc + αc + αp (15.62)
where αp = κp Cp . In these equations, the linear napierian radiation absorption coefficients are
defined for the bacteria, the aqueous solution and hydrogen peroxide respectively, each one of
them derived from the corresponding values of concentrations and κ expressed in terms of cm2
mole−1 or cm2 CFU−1 .

Table 15.2 shows the time required to reach the same level of reduction of the microbiological
contamination for three of the alternatives explored before. It is clear that the effect produced by
hydrogen peroxide alone is negligible compared with the one corresponding to UVC alone.
Then, under these conditions, it is not necessary to consider the existence of two separate
reaction kinetics that compete in parallel.
However, a very significant outcome was observed. The time required to reach 99.99% inacti-
vation increases when H2 O2 is added. The larger the added concentration of hydrogen peroxide,
the longer is the time to reach the desired inactivation results.
One explanation is immediate: hydrogen peroxide acts as an inner filter, absorbing UVC
radiation (at 254 nm, its molar napierian absorption coefficient is not too high but important as
compared with the other components of the reacting medium).
The combination of UVC and hydrogen peroxide, under the explored operating conditions, is
detrimental to the UVC effectiveness performance (Figs. 15.7 and 15.8).
320
Figure 15.8. Results employing UVC plus hydrogen peroxide. 40 W nominal input power lamp. Dot-
ted lines, dotted and broken lines, broken lines and solid lines are results from the model.
(Reproduced from Photochemical & Photobiological Sciences; Reference: Labas et al., 2009.
Reproduced by permission of The Royal Society of Chemistry: www. res.org/pbs).
15.8 CONCLUSIONS
Disinfection by ultra-violet light (UV) is accepted as being the most effective in removing
pathogenic organisms. However, since the process typically consumes a great deal of power it is
both expensive to operate and has a large carbon footprint. Depending on the financial resources
existing, the water distribution rate needed and the quality of the source water the choice of
treatment may vary.
Throughout the industrialized world and advanced developing countries, large efforts are made
investigating alternative disinfection/oxidation practices. This chapter is a brief account of the
possibilities of peracetic acid and hydrogen peroxide as additional optional choices for water
treatment plants.
From this point of view, our preliminary results seem to suggest that peracetic acid may be
considered as a good alternative oxidant for water treatment processes of water, since potentially
produces less unwanted byproducts, becoming an environmentally friendly agent.
A second final consideration indicates that it is important to complete the development of very
rigorous and reliable modeling of all the involved kinetics. This means to carry out work with
waters having more realistic compositions; i.e., considering cases that may contain organic matter
or inorganic salts that could severely affect the process efficiency. This additional information
will facilitate the proposal of reactor design and scaling-up methods that are necessary to help
out with the application of commercial competitive processes.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are grateful to Universidad Nacional del Litoral (UNL), Consejo Nacional de Inves-
tigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), and Agencia Nacional de Promoción Científica
y Técnica (ANPCyT) for its financial support. We also thank the editorials that allowed us the
reproduction of some graph.
Graphics 15.4.1 (a) Reprinted from Chemical Engineering Journal , Vol. 198–199/edition N◦ 1,
Authors: Marina J. Flores, Rodolfo J. Brandi, Alberto E. Cassano, Marisol D. Labas, “Chemical
disinfection with H 2 O2 – The proposal of a reaction kinetic model”, Pages 388–396, Copyright
(2013), with permission from Elsevier.
321
Graphics 15.4.1 (b) Reprinted from Chemical Engineering Journal , Vol. 198–199/edition N◦ 1,
Authors: Marina J. Flores, Rodolfo J. Brandi, Alberto E. Cassano, Marisol D. Labas, “Chemical
disinfection with H 2 O2 – The proposal of a reaction kinetic model”, Pages 388–396, Copyright
(2013), with permission from Elsevier.
Graphic 15.3.2 has been reproduced from Photochemical & Photobiological Sciences; Reference:
Labas et al., 2009, “Water disinfection with UVC radiation and H 2 O2 . A comparative study”.
Reproduced by permission of The Royal Society of Chemistry: www. res.org/pbs.
Graphics 15.7.1 has been reproduced from Photochemical & Photobiological Sciences; Refer-
ence: Labas et al., 2009, “Water disinfection with UVC radiation and H 2 O2 . A comparative study”.
Reproduced by permission of The Royal Society of Chemistry: www. res.org/pbs.
Graphics 15.7.2. has been reproduced from Photochemical & Photobiological Sciences; Ref-
erence: Labas et al., 2009, “Water disinfection with UVC radiation and H 2 O2 . A comparative
study”. Reproduced by permission of The Royal Society of Chemistry: www. res.org/pbs.
APPENDIX
Emission model for tubular germicidal lamps

In the integral of Equation (15.9) (Section 15.3), the region of integration for the fluence rate may
be divided into two parts: (i) the first, corresponding to the solid angle delimited by the lamp
boundaries (?s) that is the solid angle that transports radiative energy coming from the body of
the lamp, and (ii) the solid angle corresponding to the remaining of the surrounding space, then:
⎡ ⎤
? ?
Eλ,0 = ⎣ Lλ,? (x, t)d? + Lλ,? (x, t)d?⎦ (15.A-1)
?s 4π−?s
Obviously, no radiation comes from the space defined by the solid angle 4π − ?s and the only
non-zero integral is the first. The final result can be written in terms of a spherical coordinate
system with origin at the point of incidence I (See Figs. 15.A-1a,b); then:
⎡ ⎤
? φ2 ? θ2 s̄=s(x,θ,ϕ)
?
⎢ ⎥
Eλ,o (x,t) = dφ dθ sin θLλ,? (θ, φ,t) exp⎣− κs (t,s̄)d s̄⎦ (15.A-2)
φ1 θ1
s̄=sR (θ,ϕ)
Two important observations must be made in connection with Equation (15.A-2):

1. After writing the equation in terms of the spherical coordinate system, the solid angle corre-
sponding to the space defined by the lamp boundaries (?s ) originated a first integration in θ(φ)
and a second one in φ. These integrals have limits of integration that are complex functions of
the system geometry. The methodology for obtaining these limits will be illustrated following
an approach proposed by Irazoqui et al. (1973). For the moment we can say (Fig. 15A-1) that
these angles define, in a spherical coordinate system which is the natural system for radiation
propagation, the volume of the lamp that is able to send light to the chosen point inside the
reactor, the point x at s = s.
2. In Equations (15.A-1) and (15.A-2) the boundary condition has taken the form of L0λ (φ,θ,t).
This value must be provided by a lamp emission model. At this point it suffices to say that:
? ?
0 System geometry
Lλ (θ, f , t) = f (15.A-3)
Lamp characteristics
Equation (15.A-2) provides, in mathematical form, all the elements needed to compute the flu-
ence rate in homogeneous media. With an emission model for the lamp and the proper integration
limits for the lamp radiation contributions to an arbitrary point of incidence (In ), it is the possible
322
Figure 15.A1. (a) Limits of integration for the source, (b) The extended, voluminal, isotropic emission
source model (adapted from Cassano et al., 1995).
to calculate the local value of the radiation energy absorbed per unit time and unit reaction volume
at any point of the reactor. For monochromatic radiation, this is the value required to formulate
the kinetics expressed by Equations (15.3) to (15.5).
As indicated before, the modeling of the lamp emission should provide the boundary condition
for the radiative transfer equation inside the reactor. There are lamps that produce an arc that emits
radiation by itself and, consequently, photons come out directly from such an arc. The whole lamp
volume makes emission. For example, this is the case of mercury arc low, medium and high-
pressure tubular lamps. We speak in these cases of “voluminal emission”. Voluminal emission
may be safely modeled as an isotropic emission; in this case the spectral radiance associated with
each bundle of radiation originated in some element of volume of the lamp is independent of
direction, and the associated emitted energy (per unit time and unit area) is also isotropic.
The following assumptions are made (Cassano et al. (1995)):
1. The emitters of the radiation source are uniformly distributed over the region of emission (a
volume).
2. In terms of Specific Intensities each elementary extension of emission has an isotropic emission
but the outgoing radiation energy is also isotropic when the emitting element is a volume.
3. Any emission element of the lamp emits per unit time, and for a given wavelength, an amount
of energy proportional to its extension and independent of its position inside the lamp volume.
4. When emission is voluminal, each of the differential volumes of emission is transparent to the
emission of its surroundings (an approximation which is not important if one works with the
information about the lamp output).
5. The lamp is a perfect cylinder bounded by mathematical surfaces with zero thickness. Hence,
any bundle of radiation coming from inside does not change its intensity or direction when
it crosses this boundary (an approximation which is not important if one works with the
information about the lamp output).
6. The lamp is long enough; consequently, neglecting end effects, the emission produced by the
lamp along its central axis is uniform. This assumption does not impose uniformity on the
323
radiation field generated along the direction of the central axis. All what is said here is that
“end effects” are neglected.
7. Emission from the lamp is at steady state.
8. The lamp has a length LL and a radius rL.
9. A spherical coordinate systems located at each point of radiation reception (In) inside the
reactor can characterize the arriving Specific Intensity (also called radiance). It is necessary
to know the distance from such a point to the centerline of the lamp and two pairs of angular
coordinates [(θ1, θ2), (φ1,φ2)] that define the extension of the useful emitting volume of the
lamp.
Since a volume produces emission, the general radiative transfer equation (Alfano and Cassano,
2009) can be applied inside the lamp. There is no absorption (assumption 4) and no scattering.
The resulting equation is:
dLλ,? (s, t) e
= jλ?, (s, t) (15.A-4)
ds
Here, s is a directional coordinate in a three-dimensional space. From assumptions 2, 3 and 6,
emission is isotropic (independent of direction) and uniform (independent of position). Hence, at
steady state:
Lλ? (0) = 0 (15.A-5)
In the lamp, along the direction ?, at s = 0, there is no entrance of radiation; this situation
provides the required boundary condition for Equation (15.8):
s= 0 Lλ? (0) = 0 (15.A-6)
Integrating from s = 0 to s = ss (see Fig. 15.A-1) and using the following change of coordinates:
ds = −dρ (15.A-7)
where ρ corresponds to the spherical coordinate system defined at point In .

s=0 ρ = ρ2 (15.A-8)
s = ss ρ = ρ1 (15.A-9)
ρ1 and ρ2 are defined in Figure 15.A-1. Then, one gets:
Lλ? (ss ) = jλe [?ρs (x, θ, φ)] (15.A-10)
with:
[?ρs (x, θ, φ)] = ρ2 (x, θ, φ) − ρ1 (x, θ, φ) (15.A-11)
It must be remarked that, as it should have been expected, ?ρs is a function of the position x in
the reactor and the direction of the incoming radiation given by the spherical coordinates (θ, φ).
Once more, from s = ss to s = sR there is no emission, no scattering and no absorption (the
medium has been assumed to be diactinic); from assumption 5 there is no refraction or reflection
at the lamp boundaries, then:
dLλ? (s)
=0 (15.A-12)
ds
Consequently:
L0λ (θ, ϕ) = Lλ? (sR ) = Lλ? (ss )ϒR,λ? (15.A-13)
Finally, the boundary condition is:
L0λ (θ, ϕ) = jλe [?ρs (r, θ, ϕ)]ϒR,λ? (15.A-14)
Reflection and absorption at the reactor wall were accounted for by means of the wall
transmission coefficient ϒR,λ .
324
The value of jλe must be related to the monochromatic lamp output power Pλ,s . By definition,
jλe is the energy emitted per unit volume, unit solid angle of emission and unit time; then:
dPλ,s = jλe dVe d? (15.A-15)
? ?
Pλ,s = jλe dVe d? (15.A-16)
?S VS
Since jλe corresponds to an isotropic and uniform emission:

Pλ,s Pλ,s Pλ,s
jλe = ? ? = = (15.A-17)
VS dVe ?S d? 4π(π rL2 LL ) 4π 2 rL2 LL
From Equations (15.A-11) and (15.A-14) we must know the values of ρ2 (x, θ, φ) and ρ1 (x, θ, φ).
In order to know these values one must obtain explicit expressions for the independent variable
ρ, at the positions indicated by Equations (15.A-7) and (15.A-8). In the case of our reactor they
are seen in Figure 15.A-1. Let us consider a point located in an arbitrary position In , having
coordinates x(r, z, β). Let us look at an arbitrary direction (θ, φ).
Using the nomenclature indicated in Figure 15.A-1, from standard analytic geometry, the
equation of the boundary surface of the radiation source (a cylinder) in spherical coordinates is
written as follows:
ρ2 sin2 θ − 2ρ(sin θ cos φ)r + (r 2 − rL2 ) = 0 (15.A-18)
The two solutions of this quadratic equation are precisely the values of ρ; i.e., they are the
intersections of the ρ coordinate with the front and rear parts of the lamp at any value of θ and φ:
r cos φ ± (r 2 cos2 φ − r 2 + rL2 )½
ρ1,2 = (15.A-19)
sin θ
Finally, the following value for ?ρS is obtained:
½
2[r 2 (cos2 ϕ − 1) + rL2 ]
?ρs = (15.A-20)
sin θ
Equations (15.A-14), (15.A-17) and (15.A-20) provide the boundary condition for the emission
model, i.e.:
½
Pλ,S ϒR,λ? [r 2 (cos2 ϕ − 1) + rL2 ]
L0λ (x, θ, ϕ) = (15.A-21)
2π 2 rL2 LL sin θ
It must be noticed that either in Equation (15.A-21), all the characteristics of the lamp and
the relative position of the reactor with respect to the lamp are included. When this value is
used to calculate the photon absorption rate that is required to formulate the reaction rate inside
the reactor, this information is fully incorporated into the mass balances, i.e., we have the lamp
characteristics and its position inside the reactor incorporated as part of the design methodology.
Limits of integration for the variables θ and φ
The spectral radiance is a function of the directional coordinates. The limits of integration for the
independent variables θ and φ must be obtained.
Limits for the independent variable θ
Limiting rays coming from the lamp and reaching the generic point (r, β, z) inside the reactor
must satisfy two conditions:
(i) if the ray limits the value of θ, its equation (a straight line in space) must have a common
solution with the equation of the circumference that define the opaque zone (or lamp ends) of
the upper and lower parts of the lamp; however, for any plane at constant φ (a plane in r−z)
there are two values of θ that satisfy this condition for both the upper and lower boundaries;
325
(ii) to eliminate this ambiguity a second restriction on θ must be imposed: one must choose the
angle corresponding to the intersection of the ray with that portion of the circumference that,
limited by the two generatrix lines corresponding to the limiting angles of φ, is closer to the
generic point (r, β, z), as indicated in the figure.
From Figure 15.A-1:
(LL − z) = ρ1 cos θ1 (15.A-22)
−z = ρ1 cos θ2 (15.A-23)
and with Equation (15.A-19):
? ½
?
−1 r cos φ − [r 2 (cos2 φ − 1) + rL2 ]
θ1 (φ) = tan (15.A-24)
(LL − z)
? ½
?
−1 r cos φ − [r 2 (cos2 φ − 1) + rL2 ]
θ2 (φ) = tan (15.A-25)
−z
Limits for the independent variable φ
The limiting rays in the φ-direction, for any value of the angle θ, must be tangent to the lamp
boundary at points located on the two generatrix lines of the cylinder (see Fig. 15.A-1). These
values can be obtained by imposing a restriction in the values of ρ1 and ρ2. At the limiting points,
since ?ρ = 0, both intersections of the ρ-coordinate with the lamp boundary must coincide,
i.e., in a projection of the lamp on the x-y plane, the limiting rays are tangent to the directrix
circumference of the lamp. This means that the condition in space is:
ρ1 = ρ 2 (15.A-26)
From Equation (15.A-19) the following equation is obtained:

r 2 cos2 φ = r 2 − rL2 (15.A-27)
and since φ can only take on values in the first and fourth (negative value) quadrants, we have:
? ?
2 2 ½
(r − r )
−φ1 = φ2 = cos−1 L
(15.A-28)
r
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

DOCTOR EN TECNOLOGÍA QUÍMICA

DESINFECCIÓN DE AGUAS, UTILIZANDO UN AGENTE

Directora: Dra. Marisol D. LABAS Co-Director: Dr. Alberto E. CASSANO

Miembros del Jurado

SANTA FE, 2014

A los miembros del Jurado por su interés y participación en la evaluación de la presente

A Agustina Dalla Fontana y Pato Galvez, quienes me ayudaron (y ayudan) con la

Al Departamento de Microbiología de la Facultad de I ngeniería Química, por su buena

A los que empezaron siendo compañeros de doctorado y terminaron siendo mis

Al personal del I nstituto de Desarrollo Tecnológico para la I ndustria Química (I NTEC)

Al Consejo Nacional de I nvestigaciones Científicas y Técnicas (CONI CET), Universidad

Finalmente, quisiera extender mi agradecimiento a todas esas personas, que aún no

potable es primordial para la salud, uno de los derechos humanos básicos y un

componente de las políticas eficaces de protección de la salud. Uno de los principales

problemas de la humanidad en pleno siglo XXI es el acceso al agua potable y a medios

adecuados de saneamiento. Esta problemática influye de manera directa sobre la salud

de una gran parte de la población mundial e indirectamente repercute en el desarrollo

afrontar éste y otros muchos problemas.

El tratamiento de los efluentes y las aguas contaminadas mediante procesos

superficiales, como los ácidos húmicos, dando lugar a numerosos productos de

cuales, de acuerdo a numerosos estudios presentan propiedades mutagénicas,

carcinogénicas y/ o tóxicas. Un sistema de desinfección ideal debería garantizar la

eficiencia máxima para la remoción de microorganismos patógenos sin generar

subproductos tóxicos e indeseables. La solución correcta del problema de la

de Oxidación (PAOs) y como caso particular, de indudable crecimiento en la

investigación de los últimos años, se destaca la aplicación de aquellas que emplean

hidroxilo (OH˙) que reacciona con el contaminante logrando su destrucción.

En esta Tesis de Doctorado en Tecnología Química se aborda uno de los aspectos

vacantes como es la determinación de la cinética de la inactivación para un

contaminante microbiológico modelo (Escher ichia coli) en aguas claras con

desinfectantes alternativos amigables con el ambiente.

Se estudia inicialmente un proceso de desinfección pseudo heterogéneo

utilizando peróxido de hidrogeno como desinfectante. Se realiza la interpretación

química del posible mecanismo de daño celular. La hipótesis planteada es la existencia,

radicales OH˙: la capa de peptidoglicano, la capa de lipopolisacáridos (que se encuentra

sólo en las bacterias Gram-negativas) y la bicapa fosfolipidica. La disrupción de la

membrana, la posterior lisis de los componentes de las bacterias y la oxidación del

secuencia de eventos en paralelo, en el que el nivel de daño aumentará hasta que la

bacteria no sólo muere, o se ve gravemente afectada en sus funciones vitales, sino

también y dado el tiempo suficiente, los componentes químicos de la célula se oxidan

Como una segunda etapa, se lleva a cabo un extenso estudio experimental

utilizando la mezcla comercial de acido peracético (APA) como agente desinfectante. El

peracético, peróxido de hidrógeno, acido acético y agua. En base a los estudios

experimentales, se postula un mecanismo de desinfección, nunca antes propuesto,

el efecto sinérgico de estos. El mecanismo de este modelo comprende a través de

ecuaciones matemáticas simples, los procesos fisicoquímicos y enzimáticos

involucrados en la inactivación bacteriana, como oxidación de enlaces proteicos,

inhibición de mecanismos de defensa bacterianos y alteración en las funciones

metabólicas vitales en los microorganismos. Se obtienen las concentraciones de

inactivación (99.99%) en cortos períodos de tiempo.

Como complemento, se estudia la combinación de la solución comercial de APA

serie, donde, en este modelo, la bacteria, al ser expuesta a la radiación UV va sufriendo

donde se produce la muerte del microorganismo. Se realizan análisis de recrecimiento y

fotoreparación bacterianos para evaluar el potencial uso de la combinación de ambos

acceso al agua microbiológicamente segura. Además, realizará aportes para contribuir

con la solución del problema de tratamiento de aguas, en especial, con la ausencia de

subproductos de desinfección sin involucrar mayores costos adicionales.

I.1 IMPORTANCIA DEL AGUA 1