Guia Laboratorio Inmovilizacion Alfa-Amilasa

DEPARTAMENTO DE
GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O

CIENCIAS DE LA VIDA
CAMPO
CÓDIGO: DCVI-GS-v3-2018-
001
Ciencias de la Vida Y la
DEPARTAMENTO: Agricultura CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
ASIGNATURA: Enzimología PERIODO S-II NOV20 - NIVEL: 6to

LECTIVO:
ABR21
DOCENTE: Dr. Rodrigo Avalos NRC: 5033 PRÁCTICA 3
N°:
TEMA DE LA Evaluación de la actividad enzimática de α-amilasas extraídas del hongo Aspergillus

PRÁCTICA: niger inoculado en residuos agroindustriales de Solanum tuberosum (cáscara de papa).
INTRODUCCIÓN:
La α-amilasa (EC 3.2.1.1) es una enzima que se encuentra en el reino animal, vegetal y microbiano;
como Penicillium commune, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus amyloliquefaciens,
Aspergillus oryzae y Aspergillus niger (de Souza & Oliveira, 2010); tiene como función catalizar la
endohidrólisis de los enlaces glicosídicos α1,4 presentes en almidón, glucógeno, dextrinas y azúcares de
bajo peso molecular; este tipo enzima puede permanecer unidas al sustrato y dirigir múltiples escisiones,
posteriores a la escisión inicial (Akinfemiwa & Muniraj, 2021). Las condiciones óptimas para este tipo de
enzimas son a pH 5 a 7 (Espinel & López, 2009) y temperatura de 35 a 37℃, aunque este rango varia en
dependencia de su origen (Divakaran, Chandran, & Pratap, 2011); como en el caso de la α-amilasa fúngica,
proveniente de Aspergillus niger, posee un pH óptimo de 5 a 6 y un temperatura de 60 ℃ (Navarro, 2019).
Dentro de las α-amilasas, se encuentran las amilasas maltogénicas (EC 3.2.1.133) catalíticamente
versátiles y pueden hidrolizar enlaces α1,4 así como α1,6; poseen 130 residuos adicionales en el extremo
N, ausentes en las α-amilasas típicas, y adicionalmente, pueden hidrolizar la acarbosa, potente inhibidor
de estas enzimas (Mehta & Styanarayana, 2016).
La obtención de enzimas puede ser costosa y de alta complejidad. Un método para evitar pérdidas
innecesarias del material enzimático, pérdida de actividad y lograr brindarle mayor estabilidad; es la
inmovilización enzimática, proceso a través de soportes que permitan su continua reutilización en procesos
industriales; esto se fundamenta en el hecho de que las enzimas son biocatalizadores; mismos que no se
consumen durante la reacción (Castillo, 2005). La inmovilización enzimática permite un uso continuo,
reutilización y control de las concentraciones de las enzimas empleada, además, mejora la estabilidad y
actividad de la enzima en función del pH y la temperatura; especialmente, al ser inmovilizadas quedan
protegidas ante enzimas proteolíticas, aumentando así la eficiencia del sistema (Romero et al. 2014).
OBJETIVOS:
1.1. Objetivo General:
Evaluar la actividad enzimática de α-amilasas extraídas del hongo Aspergillus niger inoculado en
residuos agroindustriales de Solanum tuberosum (cáscara de papa), a partir de extractos
enzimáticos inmovilizados
1.2. Objetivo Específicos:
a. Inmovilizar 𝛼-amilasas extraídas de Aspergillus niger inoculado en desechos agroindustriales de
Solanum tuberosum (cáscara de papa)
b. Evaluar los parámetros cinéticos, actividad específica, tanto de la enzima libre y de la enzima
inmovilizada.
c. Estudiar la importancia de la inmovilización enzimática
MATERIALES:
REACTIVOS: INSUMOS:
• Alginato de sodio • Matraz Erlenmeyer
• Cloruro de calcio 2% • Pipeta Pasteur
• Citrato • Tubos de ensayo
• Agua destilada • Almidón
• Tampón acetato 50 mM • Matraz Erlenmeyer
• DNS
• Yodo
• Ácido clorhídrico
• Hidróxido de potasio
EQUIPOS: Centrifuga, Potenciómetro. Agitador magnético, Espectrofotómetro, incubadora, pHmetro ,

Cronómetro
MUESTRA: Cultivo de Aspergillus niger.
INSTRUCCIONES:
Utilice ropa de protección: vestimenta apropiada, mandil, guantes, gafas de seguridad, cabello recogido.
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:
Atrapamiento en alginato de sodio

Retención física de la enzima en las cavidades interiores de un matriz sólida porosa.
1. Pesar 0.5 g de alginato de sodio y disolver en 25 mL de agua destilada.

2. Mezclar volúmenes iguales (5mL) de solución de enzima y solución de alginato de sodio al 2%,
hasta obtener una concreción de alginato al 4% (p/v).
3. Prepara una solución gelificante de Cloruro de calcio (CaCl2.2H2O) al 2% p/v
4. La mezcla de alginato expulsar gota a gota por medio de una pipeta Pasteur de 1mm de diámetro
a la solución de cloruro de calcio al 2% (p/v).
5. Agitar por dos horas hasta que las perlas alcancen un tamaño de 3 mm de diámetro.
6. Lavar las perlas con agua destilada y recolecta por filtración.
7. Remojar las perlas en una solución de alginato al 0.1 % durante 24 horas y lavar con agua
8. Para almacenar se lo hace en ausencia de luz y a temperatura ambiente.
Ilustración 1"Inmovilización enzimática con alginato"
Ensayo de la actividad enzimática

Cosiste en experimentos hidroliticos variando la concentración inicia de almidón entre 1 y 9.5 g/L a
concentración de enzima, pH y temperatura constante.
1. Preparar 10 mL de disoluciones de almidón de diferentes concentraciones a partir de la disolución
madrea al 0.5 % (5g/L) completando el volumen con buffer acetato 50mM a un de pH 5.6.
2. Agregar a la solución 20uL de enzima inmovilizada al tiempo 0
3. Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados.
4. Tomar muestras de 500 uL en intervalos de tiempo de 10 s y trasferir a un tubo de ensayo que
contenga 1 ml de HCl 0.5 N para frenar la reacción.
5. Luego llevar a agua de ebullición durante 2 minutos y enfriar en baño de hielo.
6. Anadir 3,4 mL de agua destilada y 100 uL de solución de I 3 al 2% para la formación del complejo
coloreado iodo-almidón (complejo no hidrolizado).
7. Trascurrido 10 minutos en el espectrofotómetro medir las absorbancias a una longitud de onda de
530nm.
8. Realizar el mismo procedimiento tanto para la enzima inmovilizada como para la enzima libre.
Curva de calibración para el almidón

1. Formar un complejo almidón- iodo con soluciones de contracciones conocidas de almidón al 0.5%
y añadir 200 uL de iodo
2. Para completar la concentración final completar con buffer acetato hasta un volumen final de 10
mL.
3. Medir las absorbancias de estas soluciones después de 10 min de la edición de iodo.
4. En espectrofotómetro determinar la absorbancia del complejo iodo-almidón mediante un barrido
espectral para determinar el pico de absorbancia.
RESULTADOS OBTENIDOS:
• Perlas inmovilizadas de la enzima alfa amilasa.
• Calcular los parámetros cinéticos de la alfa-amilasa inmovilizada y libre
Parámetro Alfa-amilasa libre Alfa-amilasa inmovilizada
Km
Vmáx
RECOMENDACIONES:
• Para la realización de las perlas de alginato se utiliza una pipeta Pasteur, ya que con esta se
puede obtener perlas del mismo tamaño y mas uniformes, a diferencia de una jeringa que resulta
muy problemática al momento de querer expulsar el alginato de sodio, generándose perlas
ovaladas en vez de circulares y de diferentes tamaños.
• Al realizar la cinética enzimática tomar en cuanta que el Km aumenta al esta la enzima
inmovilizada.
• Toma en cuenta todas las normas del laboratorio y trabajar con sumo cuidado en el mismo
Referencias
Akinfemiwa, O., & Muniraj, T. (2021). Amylase. StatPearls Publishing.

Castillo, F. (2005). Biotecnología Ambiental. Tébar. Obtenido de. Obtenido de 2005:
https://books.google.com.ec/books?id=19ffPAm3E3kC&pg=PA307&dq=inmovilizacion+de+enzimas&hl
=es-419&sa=X&ved=0ahUKEwjV4NTgjIPcAhUFpFkKHUR1CLAQ6AEINjAD#v=onepage&q&f=false
de Souza, P., & Oliveira, P. (2010). Application of microbial a-amylase in industry -A review- . Braz. J. Microbiol,
32-50.
Divakaran, D., Chandran, A., & Pratap, R. (2011). Comparative study on production of a-Amylase from Bacillus
licheniformis strains. Braz J Microbiol, 1397-1404.
Espinel, E., & López, E. (2009). PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE α-AMILASA DE PENICILLIUM
COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE FERMENTACIÓN EN FASE SÓLIDA. UNAL, 36-54.
Mehta, D., & Styanarayana, T. (2016). Bacterial and Archaeal α-Amylases: Diversity and Amelioration of the
Desirable Characteristics for Industrial Applications. Frontiers in Microbiology.
Navarro, G. (2019). Determinación de la cinética enzimática de la obtención de jarabe de glucosa a partir de
papa. Obtenido de Repositorio UNCP:
http://repositorio.uncp.edu.pe/bitstream/handle/UNCP/5294/T%20%20010_45895943_D.pdf?sequence
=1&isAllowed=y
Romero, L., Mejía, C., Sánchez, A., Balagurusamy, N., & Luévanos, M. (2014). Application of Immobilized
Enzymes. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila, 1-9. Obtenido de 1-9

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EQUIPOS: Centrifuga, Potenciómetro. Agitador magnético, Espectrofotómetro, incubadora, pHmetro ,

ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

Atrapamiento en alginato de sodio

1. Pesar 0.5 g de alginato de sodio y disolver en 25 mL de agua destilada.

Ilustración 1"Inmovilización enzimática con alginato"

Ensayo de la actividad enzimática

Curva de calibración para el almidón

Parámetro Alfa-amilasa libre Alfa-amilasa inmovilizada

Akinfemiwa, O., & Muniraj, T. (2021). Amylase. StatPearls Publishing.

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