Obtención de callos del girasol (Helianthus annuus L.

Jacome Garrido Nadin Sabina 1 & Pérez Navarrete Blanca Isabel 2

[email protected] 1 & [email protected] 2
Universidad de las Fuerzas Armadas, Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura,
Cultivo de tejidos vegetales
Entregado el 25 de Noviembre del 2021

Resumen
El girasol (Helianthus annuus L.) es una de las plantas de gran importancia debido a su semilla
oleaginosa, por lo que son codiciadas para su desarrollo in-vitro. Este trabajo se planteó como
objetivo obtener callos in vitro de Helianthus annuus L a partir de semillas., para ello se trabajó
con la variedad Caburé-15 del girasol, se utilizaron como explantes el ápice, secciones de
hipocótilo, epicótilo y hojas de las plántulas y se les agregó reguladores de crecimiento como
BAP, 2,4-D y AIA. Los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de diseño factorial
con el programa INFOSTAT. Dando como resultado el crecimiento de callos con los
reguladores BAP y la ramificación y ápices con el regulador AIA.

Palabras Clave: Helianthus annuus L, in vitro, BAP, 2,4-D y AIA.

Introducción obtención de material vegetal en cualquier

Helianthus Annuus (Girasol), es una planta época del años, procesamiento de mayor
perteneciente a la familia de las asteráceas, número de muestras en menor tiempo y
originaria de América del norte y Europa, menos espacio, propagación de plantas de
es de gran importancia económica al ser la interés o en peligro de extinción, clonación
principal semilla oleaginosa usada en de germoplasma valioso, generación de
Europa (Perror et al, 2019). Tiene gran bancos de germoplasma, producción de
tolerancia al estrés hídrico adaptándose a metabolitos secundarios, mejoramiento
climas húmedos y áridos (Debaeke et al, genético de cultivos, entre otros (Castillo,
2017). Se desarrolla a temperaturas entre 10 2017).
y 30°C, siendo los 25°C su temperatura
óptima de crecimiento (Ecco et al, 2017). Las técnicas biotecnológicas, como el
cultivo de tejidos y los sistemas de
El cultivo de tejidos es una técnica que transferencia de genes están limitadas
consiste en aislar una porción de planta, principalmente por la respuesta del cultivo
conocido como explante, y proporcionar de tejidos (Oziyigit et al., 2007). Diferentes
artificialmente las condiciones físicas y partes de la planta han sido utilizados como
químicas necesarias para que las células se explantes para técnicas de cultivo de
desarrollen en distintos tipos de tejidos tejidos, tales como embriones inmaduros,
(Roca & Mroginski, 2008). maduros, ejes embrionarios, hojas,
meristemos, yemas, brotes hipocótilos,
La importancia del cultivo in vitro viene de pecíolos, raíces y tallos (Inoka &
sus posibles aplicaciones, por ejemplo el Dahanayake, 2015).,
desarrollo de tratamientos contra plagas,
 Estos métodos biotecnológicos permiten Tabla 1: Análisis estadístico de Tukey
acelerar y apoyar el mejoramiento genético Protocolos Supervivencia Eficacia
(%) (%)
convencional en muchos cultivos, sin
PD1 80.00 82.00
embargo, la escasez de recursos genéticos
PD2 91.00 89.10
adecuados en las variedades del girasol, ha PD3 97.00 97.00
frenado la regeneración de plantas PD4 18.50 8.90
completas, puesto que depende de la PD5 100.00 98.70
naturaleza del explante, el contenido PD6 78.00 79.00
hormonal del medio y del genotipo por lo PD7 31.00 21.00
que el desarrollo de dichas características,
ha sido limitado considerablemente (Pola &
100
Santiz, 2019).
80
60
Por esta razón la callogénesis es una fuente
40
de material celular desdiferenciado para su
20
uso en diferentes aplicaciones, desde el
0
mejoramiento genético hasta la producción PD1 PD2 PD3 PD4 PD5 PD6 PD7
de metabolitos secundarios de interés a
Supervivencia % Eficacia %
nivel in vitro (Rodríguez et al, 2014).
Figura 1: Análisis estadístico de Tukey
En el cultivo in vitro de tejidos de girasol
generalmente se usan plántulas y ápices de Tabla 2: Análisis de similitud de Tukey
brotes (Robinson y Everett, 1990). Las Protocolos Promedio de
contaminación
plantas maduras cultivadas en el campo (%)
pueden utilizarse para la propagación de PD5 0.1 a
girasol (Sujatha y Prabakaran, 1997). PD3 1.4 ab
PD2 7.4 b
Materiales y Métodos PD1 8.01 b
Selección de protocolo de desinfección PD4 62.2 c
Se usaron los 7 protocolos establecidos de PD6 20.04 d
la tabla N°4 (anexos), donde se utilizó PD7 48.5 e
como unidad experimental un explante, en
este caso usamos semillas maduras del
Helianthus annuus L (girasol) por frasco Metodología del cultivo in vitro
utilizado. Se realizaron 10 repeticiones por Se usaron semillas maduras de diferentes
tratamiento y se estudio por una prueba de variedades de girasol, estas fueron
Tukey la eficacia y la supervivencia por desinfectadas con alcohol al 70% durante 2
tratamiento realizado como lo podemos ver minutos, después se aplicó bicloruro de
en la tabla N°1. Además, logramos mercurio 0,1% durante 5 minutos. Para la
identificar la similitud de cada tratamiento germinación se usó el medio de cultivo
mediante una prueba de similitud de Tukey, Murashige y Skoog, 1962 (MS) sin
demostrando que los protocolos 5 y 3 son hormonas, el pH de estos se ajustó a 5,7-5,8
los más parecidos en desinfección (Fig. 1). y se añadió 7 g/L de agar. Se esterilizó en
autoclave a una presión de 1,2 atm durante
20 minutos y a 120°C. Los cultivos se S.C G. C.M D.E C.V
sometieron a un fotoperiodo de 14 horas luz L
y una temperatura de 25 ± 2°C. Después
del desarrollo de las plantas, se realizó el Medio 12,66 3 4,22 - -
experimento. *

Explan 3,85 3 1,28 - -

En el experimento se usaron como te *
explantes: el ápice, algunas secciones de
hipocótilo, epicótilo y la hoja del girasol MxE 3,40 9 0,38 - -
Caburé-15, que fueron colocados en cuatro *
medios de cultivo:
Error 11,27 112 0,10 0,32 70,3
● MS +1 mg/L de 6- %
bencilaminopurina (BAP).
● MS +5 mg/L de BAP Nota: Datos ficticios.
● MS +1 mg/L de ácido 2,4 -
diclorofenoxiacético (2,4 -D) De la interacción medio-explante del
● MS +1 mg/L de ácido indol acético primer experimento se observó que a los 30
(AIA). días el mayor crecimiento de los callos se
Para evaluar el crecimiento de los callos se dio en el medió que contenía 5 mg/L de
tomaron 8 réplicas por tratamiento a los 30 BAP para todos los explantes, esto se
días de cultivo, utilizando el peso fresco de detectó visualmente desde los doce días.
los mismos en gramos menos el peso inicial
del explante. También se determinó la
presencia de raíces adventicias, gracias al
porcentaje de explantes.

El experimento se analizó de forma

independiente, mediante un análisis de
varianza para un diseño factorial
empleando el programa estadístico
INFOSTAT. La metodología fue tomada de Fig. 2. Interacción medio-explante en el crecimiento
de los callos de girasol.
Rodríguez et al, 2002.

Resultados

Se encontraron diferencias significativas

entre los medios de cultivo y entre los
explantes, de igual manera en las
interacciones medio-explante de cada
experimento.
Fig. 3. Efecto del AIA en la formación de raíces
adventicias de girasol.

Tabla 3: Análisis de varianza del experimento 1

Al analizar el crecimiento tomando en
cuenta el tipo de explante usado se observó Con respecto al enraizamiento solo se
que el hipocótilo mostró mayor valor sin observaron raíces adventicias que solo
diferencias significativas con el epicótilo contenían el regulador AIA donde a los 12
(Fig. 2). Después de 12 días, en los días estaban formadas. Pola & Santiz
explantes procedentes de hipocótilos y (2019), obtuvieron resultados similares
epicótilos se observaron raíces adventicias donde en los callos se formaron raíces
en el medio que contenía AIA, pero no se primarias y adventicias donde la
evaluó. A los 30 días se encontró raíces concentración de AIA fue de 0.1mg/L con
adventicias en el hipocótilo, epicótilo y 72% de formación mientras que la más baja
hoja (Fig. 3). fue de 52% con concentración de 0.5 mg/L
En los ápices no se desarrollaron callos, (Rodríguez et,. al, 2020).
pero si crecimiento de plántulas donde se
apreció un 75% de enraizamiento (Fig. 3). Conclusiones
● Existió un mayor crecimiento en los
Discusión callos cuyo medio contenía 5 mg/L
En experimentos realizados (Pola & Santiz, de BAP y el explante hipocótilo.
2019) han utilizado reguladores BAP y (2,4 ● Se dió un desarrollo de plántulas a
D) donde reportan la obtención de callos de partir de ápices en medios que
girasol empleando concentraciones de contenían 1 mg/L de AIA.
1.5mg/L de (2,4-D). Según Inoka y ● Se dió un comportamiento
Dahanayake (2015), lograron obtener diferencial entre genotipos en el
callos con 0.1 mg/L de BAP, también con medio constituido por BAP 5 mg/L.
seis concentraciones diferentes de 6- Recomendaciones
bencilaminopurina. Uno de los que menor 1. Verificar que las concentraciones de
incremento se produjo fue Witrzens et al. hormonas añadidas sean adecuadas
(1998) donde el AIA estimuló el para el explante.
crecimiento de los callos, pero no se reflejó 2. Llevar a cabo el protocolo de
en qué medida. Esto demuestra la desinfección antes de la
formación de callos en diferentes introducción del explante.
porcentajes dependiendo de la 3. Tomar nota del desarrollo y
concentración de reguladores establecidos. características del callo a los 12 días
y 30 días.
El mayor crecimiento que se observó de 4. Controlar las condiciones del medio
callos fue al pasar los 30 días, resultados para evitar la necrosis del explante
similares obtuvieron Pola & Santiz (2019), o posible contaminación.
donde los resultados se registraron después
de cuatro semanas. En nuestros resultados Bibliografía
el mejor regulador para la estimulación de ➔ Alexandrino, T. D., da Silva, M. G.,
callos fue el BAP mientras que Pola & Ferrari, R. A., Ruiz, A., Duarte, R.,
Santiz (2019) fue AIA mostrando ser el Simabuco, F. M., Bezerra, R., &
mejor explante con 100% de callogénesis; Pacheco, M. (2021). Evaluation of
en explantes de hipocótilo a 0.5mg/L de some in vitro bioactivities of
AIA no existió la formación de callos.
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hoja en Ugni molinae. Bosque Suhair, Hussein, Alkareem, Abd,
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http://www.scielo.org.mx/scielo.ph
p?pid=S0188- Anexos
62662020000100145&script=sci_a ➔ Tabla 4. Protocolos de desinfección
rttext ➔ Tabla 5. Protocolos repetidos
Tabla 4. Protocolos de desinfección
Título del artículo Autores Protocolo de desinfección Protocolo de introducción

1. Shoot Propagation From Ali yasir Hafed AlIssawi Hameedah Se usó NaOCl2 al 10% por 10 min. y Se disolvió 50 mg de BA en 1 ml de HCl
Three Sunflower Abd Noor Abbood Taghreed Fakhir cloruro mercúrico al 0,01% durante 2 para 50 ml de agua destilada, se
(Helianthus annuus L.) Jaber min. Para el meristemo apical se usó distribuyó en el medio MS
Genotype Callus Induction Wigdan Kamal Noor ; Dalal Abdul NaOCl2 con concentraciones de 1,4 y concentraciones de 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5
8% para 250 ml. Para todas las mg/L en tubos con 30 ml de medio, cada
in Vitro Hussein Kadhim Salwa Hamza
concentraciones se añadió tween-20. Se tubo con cinco plántulas por 6
Hussein sumergieron los explantes en las repeticiones para cada concentración de
Suhair Abd alkareem Habeeb Inaam soluciones por 1,2 y 4 minutos. Todo el BA y cada genotipo. Se incubó en las
Jawad Alabbasi proceso se llevó a cabo dentro de una mismas condiciones que se encontraba
cámara de flujo laminar. el explante y se tomó nota a los 10 días.

2. Efecto del ácido indol-3- Enriquez Pola Sánchez Las semillas fueron desinfectadas con la Los explantes obtenidos se colocaron en
acético y del tipo de José A. Santiz Gómez inmersión en etanol al 70% durante 30 s frascos de cultivo de 100 mL que
explante en la callogénesis y lavadas tres veces con agua destilada contenían 25 mL de medio MS
de girasol (Helianthus annus estéril para eliminar los residuos de suplementados
etanol. Posteriormente, las con 0.1, 0.5 y 1 mg/L de AIA. Los
L.)
semillas se sumergieron en hipoclorito recipientes de los diferentes tratamientos
de sodio comercial se
(5% p/v) diluida al 20% durante 2 min y mantuvieron en una cámara bioclimática
finalmente se a 25±2 °C con
lavaron tres veces con agua destilada fotoperiodo de 16 h.
estéril.

3. Cultivo de anteras e Eduardo Rodríguez Guzmán Las anteras se colocaron en alcohol Se colocaron en cajas de Petri que
inducción de callo haploide Carlos Ramírez Serrano etílico al 70% por un minuto y luego se fueron previamente esterilizadas en
en germoplasma bc3 de María M. Güitrón López sumergieron en solución de hipoclorito autoclave por 15 minutos a una presión
girasol (Helianthus annuus Paola A. Palmeros Suárez de sodio al 6% diluido en agua destilada de 1.4 kg/cm2, a una temperatura de 121
esterilizada en volumen (1/1) durante °C.
L.) Alejandro Ángeles Espino
seis minutos y, posteriormente, se aplicó
triple enjuague con agua destilada
esterilizada.

4. REGENERATION Clara R. Azzam La superficie de los explantes se lavó Las yemas axilares se cortaron en cuatro
 ABILITY FROM I. M. Amer, A. A. con agua de grifo y luego mediante partes, se cultivaron para la inducción de
SUNFLOWER APICAL Hob Allah esterilización de la superficie callos en medio MS modificados con
MERISTEM AND R. Shabana variaciones de NAA y 6BAP. Se
AXILLARY BUD colocaron 10 yemas axiliares en cada
placa Petri con 25 ml de medio, los
CULTURES AS
explantes se cultivaron en oscuridad a
AFFECTED BY MEDIA
una temperatura de 25±1°C por 10 días.
COMPOSITIONS AND Despues se transfierieron a un medio
GENOTYPES fresco y se incubaron bajo luz
INTERACTION fluorescente blanca fría con 16 h de luz
diaria a una temperatura de 25±1°C.

5. Obtención de callos de Ana Julia Rodríguez Mansito Arlene Semillas desinfectadas con alcohol al 70 Los cultivos se
Helianthus annuus L. Rodríguez Manzan Arlene % durante 2 min. y posteriormente con mantuvieron en un fotoperiodo de 1 4
Rodríguez Nodals bicloruro de mercurio 0,1 % durante 5 horas luz y 25 ± 2 0 C
Reynaldo López Gutiérrez Dayamí min. La esterilización se realizó en una de temperatur
autoclave a una presión
Pérez Hernández Odalys Pérez Díaz
de 1 ,2 atm. durante 20 min. y a 120 °C
Norma Marrero Granado

6. Establishment of Tissue Nadia Binte Obaid Las semillas se lavaron en autoclave ddH2O Todas las semillas descascaradas se
Culture Protocol of Two durante 1 minuto dos veces, luego en etanol cortaron a 3 mm de sus regiones
al 70% durante 3 minutos. Posteriormente, se proximales y se inocularon, con la
Bangladeshi Sunflower lavaron nuevamente con ddH2O durante 1
Varieties (Helianthus porción cortada hacia arriba, en medio
minuto, dos veces, seguido de Cloro al 14%
MS suplementado con hormonas. Los
annuus L.) durante 20 minutos. A continuación, se
lavaron con agua destilada durante 1 minuto matraces se sellaron y se mantuvieron a
4-5 veces para eliminar cualquier Clorox, y 25 ° C con un fotoperiodo de 16 horas
luego se sumergieron en ddH2O y se de luz y 8 horas de oscuridad. Después
almacenaron durante la noche en una caja de 30 días, los cultivos se transfirieron a
para ayudar a la absorción de agua. Al día medios nuevos con la misma
siguiente, las semillas empapadas se lavaron composición hormonal.
tres veces, se descascarillan y se lavaron 5-6
veces más con ddH2O para eliminar la capa
cerosa blanca en la superficie de la
semilla.Cada paso se llevó a cabo dentro de
una cabina de flujo de aire laminar

7. Phytochemical Screening, Rajakannu Subashini Las semillas fueron clasificadas,

Antimicrobial Activity and Sritharan Umamaheswari Rakshitha limpiadas y secadas al aire a temperatura
 In Vitro Antioxidant ambiente durante 2 semanas
Investigation of Methanolic y luego en polvo para preparar el extracto. El
medio se esteriliza en autoclave durante 30
Extract of Seeds from min. y luego se deja enfriar, pero no
Helianthus annuus L. solidificar.
Nota: Obtenido de Hafed et al. (2017), Pola-Sánchez et al. (2019), Azzam et al. (2003), Binte (2018), Rodríguez et al. (2002), Guzmán et al. (2021), Rajakannu, Sritharan
(2012).

Tabla 5. Protocolos de desinfección repetidos

Título del artículo Autores Artículo de protocolo de
desinfección repetido

Evaluación de Thaís Dolfini Alexandrino Efecto del ácido indol-3-acético y

algunas bioactividades in vitro de Marta Gomes da Silva del tipo de explante en la
compuestos fenólicos de girasol Roseli Aparecida Ferrari callogénesis de girasol (Helianthus
Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz annus L.)
Renata Maria Teixeira Duarte
Fernando Moreira Simabuco
Rosângela Maria Neves Bezerra
María Teresa Bertoldo Pacheco

In Vitro Tissue Culture Studies in Dagustu N. Obtención de callos de Helianthus

Sunflower (Helianthus spp.) annuus L.
Nota: Obtenido de Dagustu N. (2017), Alexandrino et al. (2021).