EVALUACIÒN DEL EFECTO BIOFUNGICIDA DEL JUGO DE FIQUE SOBRE

EL HONGO (Phytophthora infestans) DEL CULTIVO DE PAPA.

ZULMA YELUTH RODRÍGUEZ

MARÍA ISABEL DIAZ FERNÁNDEZ
MABEL YULISSA YUNDA LÓPEZ
MIGUEL ÁNGEL MÉNDEZ

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
POPAYÁN
2021

1
EVALUACIÒN DEL EFECTO BIOFUNGICIDA DEL JUGO DE FIQUE SOBRE
EL HONGO (Phytophthora infestans) DEL CULTIVO DE PAPA.

ZULMA YELUTH RODRÍGUEZ

MARÍA ISABEL DIAZ FERNÁNDEZ
MABEL YULISSA YUNDA LÓPEZ
MIGUEL ÁNGEL MÉNDEZ

ANTE PROYECTO PROPUESTA DE INVESTIGACIÓN

DR. JOSÉ LUIS HOYOS CONCHA

DOCENTE

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
POPAYÁN
2021

2
LISTA DE CUADROS pág.

Cuadro 1. diseño experimental 18

Cuadro 2. cronograma 19
Cuadro 3. presupuesto 20

3
Tabla de contenido

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. ................................................................... 5

1.1 PREGUNTA PROBLEMA. .................................................................................. 6
1.2 HIPÒTESIS. ....................................................................................................... 6
2. JUSTIFICACIÓN. .................................................................................................... 7
3. OBJETIVOS. ........................................................................................................... 8
3.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 8
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................. 8
4. MARCO REFERENCIAL. ....................................................................................... 9
4.1 LOCALIZACIÓN ................................................................................................. 9
4.2 MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 9
4.2.1 La papa (Solanum tuberosum)...................................................................... 9
4.2.2 Fique (Furcraea bedinghaussi) .................................................................. 10
4.3 MARCO HISTÓRICO ...................................................................................... 12
5. METODOLOGÍA .................................................................................................... 14
5.1. CARACTERIZACIÓN DE LAS CUALIDADES FITOQUÍMICAS CON EL
POTENCIAL FÚNGICO PARA MITIGAR EL HONGO (PHYTOPHTHORA
INFESTANS), DE LA PAPA. ................................................................................... 14
5.1.1 Obtención de las hojas de fique. ................................................................. 14
5.1.2 Desfibrado y obtención del jugo de fique. ................................................... 14
5.1.3 Análisis fitoquímico preliminar..................................................................... 14
5.2. MUESTREO. .................................................................................................... 16
5.2.1 Recolección. ............................................................................................... 16
5.2.2 Aislamiento. ................................................................................................ 16
5.3. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL PATÓGENO EN CUESTIÓN. ............. 16
5.3.1 Aislamiento. ................................................................................................ 16
5.3.2 Purificación. ................................................................................................ 16
5.4. EVALUACIÓN IN VITRO. ................................................................................. 17
5.6.1 Aislamiento de microorganismos a partir del jugo de fique.......................... 17
5.3.2 Pruebas de antagonismo. ........................................................................... 18
5.3.3 Diseño experimental ................................................................................. 18
6. CRONOGRAMA ................................................................................................... 19
7. PRESUPUESTO .................................................................................................... 20
8. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 22

4
 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El fique es una planta nativa de Colombia, se ha cultivado desde el siglo XVIII,

su cultivo tiene como objetivo principal la extracción de cabuya, en Colombia el
cultivo de fique es un sector con importantes connotaciones de índole
económica y social, de él dependen económicamente en el país
aproximadamente 11.640 familias (A924-Fique 11092016, n.d.). Los
departamentos productores de fique entre 2016- 2017, se ubican en las
regiones andina y pacífica, son 9 departamentos de los cuales, se calcula que
son 36 los municipios productores de fique. Los cinco principales
departamentos productores son Cauca (42%), Nariño (42%), Santander (7%),
Antioquia (6%), la Guajira (2%), los cuales representan el 99% de la producción
total nacional hasta 2017(Ministerio de Agricultura, 2016)
Actualmente, el departamento del Cauca es el mayor productor de fique en el
país con un aproximado de 7.528 ton/año, encabezando esta producción el
municipio de caldono con 2.385 ton/año y el Tambo con 2.280 ton/año y otros
municipios con una importante participación como Totoró, Jambaló y Silvia, con
producciones anuales de 1.674, 585, 582 toneladas, respectivamente
(Ministerio de Agricultura, 2016)
La fibra del fique representa, aproximadamente, el 4 % del peso de toda la
planta, mientras que el porcentaje restante corresponde mayoritariamente al
zumo (70 %), la estopa y el bagazo (25 %), los cuales aún son manejados, en
la mayoría de los casos, como residuos sin valor (Lozano-Rivas, 2012). El
extracto de la hoja es una suspensión de características variables que son
dependientes de la edad de la planta, la estación del año y las características
del suelo. Presenta un color verde ocre y es de olor fuerte. De forma cualitativa
está conformado por: agua (85 %), celulosa (6 % D-glucosa), sacarosa,
fructosa, proteínas, nitrógeno, fósforo, calcio, potasio, saponinas y sapogeninas
(comprenden el 8 % de materia) y minerales (1 %) (Del & Fiquero, 2016).
Ahora bien, la obtención de fibra de fique no es un proceso netamente
eficiente, ya que como se mencionó anteriormente solo se aprovecha el 4 % de
la planta para generación de valor agregado como fibra y el 96% restante
constituido por jugo y bagazo se desperdicia. Partiendo de estudios que se
han adelantado sobre los diferentes componentes del jugo de fique (De la Cruz
López & Marroquín Bravo, 2011), se requiere el estudio de su implementación
como biofungicida para el control biológico de diferentes enfermedades que
puedan presentarse en cultivos de importancia regional como es el cultivo de
papa. La papa, es un producto de alto consumo alimentario; presenta
susceptibilidad al ataque de plagas y hongos durante su desarrollo, una de
ellas es la enfermedad llamada comúnmente “Gota” una de las enfermedades
más limitantes de este cultivo, es causada por el hongo Phytophthora infestans.
Teniendo en cuenta que la gran mayoría de los agricultores utilizan el control
químico como un método principal para el control de esta enfermedad, la
contaminación del ambiente, la toxicidad en los humanos se incrementa, hasta
la baja de calidad del producto, debido en algunas ocasiones al uso

5
indiscriminado de los químicos a la hora de aplicarlos en el cultivo. De esta
manera nace la iniciativa de buscar una alternativa diferente en donde se
aproveche los beneficios de plantas naturales, como el jugo de fique.(Rojas &
Luque, 2012).

1.1PREGUNTA PROBLEMA. ¿Cuál es el efecto biofungicida del jugo de fique

sobre Phytophthora infestans en cultivo de papa?

1.2 HIPOTESIS. El jugo de fique tendrá un efecto antagónico, sobre el hongo

Phytophthora infestans presente en el cultivo de papa.

6
 2. JUSTIFICACIÓN

La presente investigación parte de las elevadas estadísticas que representan el

porcentaje de subproductos del fique que son desechados, que desde el punto
de vista ambiental son considerados altamente contaminantes, siendo el jugo el
residuo más representativo (70% del 96% que es desechado), puesto que
afecta principalmente las fuentes de agua, por su alto contenido de azucares,
como sacarosa, glucosa y fructosa, además proteínas sapogénicas, esteroides
y minerales que son extremadamente tóxicos para peces y organismos
acuáticos. (Mayssara A. Abo Hassanin Supervised, 2014)
El uso indiscriminado de plaguicidas utilizados agresivamente en cultivos como
la papa (Solanum tuberosum), pretenden inhibir principalmente la enfermedad
de la gota causada por el fitopatógeno Phytophthora infestans, enfermedad que
limita la producción y llega a causar perdidas hasta del 100% de cultivo cuando
se presentan condiciones óptimas para el desarrollo de este hongo. Razón por
la cual el agricultor se ve obligado a realizar aplicaciones de productos
químicos para su control, se debe repetir la fumigación entre lapsos muy cortos
de tiempo, por lo que se incrementa significativamente los costos de
producción y ocasiona una disminución en sus ingresos, sin contar con el
enorme impacto ambiental que esto genera.
En este momento de la historia, se busca más empatía para con el medio
ambiente; existen diversas tecnologías consideradas como agricultura limpia
que incorporan una forma de producción más ética y humana. Un elemento
muy importante para el desarrollo de una agricultura ecológica es el estudio,
desarrollo y uso de biocidas botánicos los cuales al ser aplicados en los
cultivos presentan grandes ventajas comparativas frente a los biocidas
sintéticos: son biodegradables, económicos, fáciles de usar y tienen bajos
niveles de toxicidad (Rojas & Luque, 2012).
Desde hace un tiempo, de forma artesanal los agricultores han implementado
la aplicación del jugo de fique como controlador biológico para contrarrestar
enfermedades como la gota, empíricamente se ha comprobado su efecto
biocida ante este tipo de hongos, sin embargo, actualmente este jugo no está
siendo aprovechado de alguna forma y a medida que aumenta la producción,
también aumentan los desechos y por consiguiente, el impacto ambiental. Al
finalizar esta investigación se pretende tener las bases suficientes, de las
cuales se pueda partir para desarrollar un nuevo producto que sea útil en el
control de la gota (Phytophthora infestans) y que sea amable con el medio
ambiente. (Mayssara A. Abo Hassanin Supervised, 2014)

7
 3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

 Evaluar el efecto biofungicida del jugo de fique como controlador

biológico para la enfermedad de la gota en la papa, causada por el
hongo Phytophthora infestans.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Caracterizar las cualidades fitoquímicas con el potencial fúngico para

mitigar el hongo (Phytophthora infestans), el responsable de la pérdida
de cultivos de papa.

 Evaluar el efecto biofungicida del jugo de fique sobre el hongo

Phytophthora infestans, mediante pruebas in vitro.

8
 4. MARCO REFERENCIAL

4.1 LOCALIZACIÓN

Se recolectará las muestras de fique y de papa, en dos predios dedicados

específicamente a cada uno de estos cultivos, que se encuentran ubicados en
el municipio de Silvia – cauca, situado sobre un valle interandino a 2620 metros
sobre el nivel del mar en la cordillera central, a 59 kilómetros de Popayán, la
capital del departamento del cauca. Posteriormente, las muestras recolectadas
serán trasladadas hacia la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad del
Cauca, la cual se ubica en la ciudad de Popayán, vereda las guacas- km 3 vía
penitenciaria san Isidro.

4.2 MARCO TEÓRICO

4.2.1 La papa (Solanum tuberosum). La papa es una especie vegetal del

género Solanum, que pertenece a la familia Solanácea. Así mismo, este género
tiene más de 2.000 especies, las cuales se cultivan actualmente en el mundo
(Gallo García et al., 2019). La papa o patata es un tubérculo comestible nativo
de las regiones montañosas de los Andes, en América del Sur, donde la planta
(Solanum tuberosum) ha sido cultivada por más de 10.000 años. En la
actualidad, la papa es un alimento básico a nivel internacional, ocupando el
cuarto cultivo alimentario más distribuido del mundo, después del maíz, el trigo
y el arroz.
El método de cultivo que la papa requiere es una textura de suelo fina y una
profundidad efectiva superior de 40 cm, lo cual permite el desarrollo apropiado
de las raíces. Además, demanda una porosidad del 50% con una distribución
equilibrada de macroporos, mesoporos y microporos, garantizando así un nivel
adecuado de almacenamiento de agua y aireación en la zona radicular de la
planta. De igual manera, debe presentar un contenido de materia orgánica
superior al 5%, lo cual disminuye el riesgo de erosión y aumenta la actividad
biológica del suelo manteniendo así la sanidad del mismo. El pH del suelo
juega un papel importante en el desarrollo del cultivo. Éste se establece mejor
entre 5,5 a 7,0; es de resaltar que en suelos con pH inferior a 5,5 pueden
aumentar los niveles de aluminio y manganeso hasta alcanzar niveles tóxicos
para la planta. (Empresarial, 2015).
En Colombia se cultiva una gran variedad de papa, entre ellas: Pastusa
Suprema (29,7 %), Diacol Capiro (25,7 %), Parda Pastusa (13 %), Ica Única
(10,5 %) y Criolla Colombia (6,4 %). (Gallo García et al., 2019). En la actualidad
hay aproximadamente 100 mil familias que se dedican al cultivo de papa en 10
9
departamentos y 283 municipios. El sector genera alrededor de 75 mil empleos
directos y unos 189 mil indirectos. En los últimos 18 años la producción de
papa en Colombia ha aumentado un 8%, con variaciones anuales relacionadas
con el área sembrada y el comportamiento climático. El 90% de área sembrada
de papa en Colombia se concentra en Cundinamarca (37%), Boyacá (27%),
Nariño (20%) y Antioquia (6%).

4.2.1.1 “Gota o Tizón tardío” (Phytophthora infestans). Es la enfermedad

más limitante a nivel mundial. Afecta tanto hojas como tallos aéreos y
tubérculos. En hojas se inicia como pequeñas manchas de color verde claro,
las cuales crecen rápidamente, tornándose de color café grisáceo en el centro
y presentando en algunos casos halos cloróticos. En la medida que la lesión se
expande, si la hùmedad relativa es alta, por el envés de la lesión se presenta
un crecimiento afelpado de color gris, que está compuesto por estructuras
reproductivas del patógeno. En los tallos aéreos se presentan lesiones
irregulares de color café, las cuales presentan el mismo crecimiento superficial
del patógeno; los tallos afectados se rompen fácilmente. Por lo general la
enfermedad empieza en las hojas bajeras, pero rápidamente puede alcanzar la
parte alta de la planta formando focos de infección. En tubérculos la
enfermedad ocasiona lesiones oscuras irregulares, las cuales se desarrollan
durante el almacenamiento o contribuyen a la diseminación del patógeno en el
lugar de siembra.

4.2.2 Fique (Furcraea bedinghaussi). El nombre científico del fique es

Furcraea bedinghaussi, corresponde a la familia botánica: “Agavaceae”; los
nombres comunes agave, pita, maguey, cabuya, fique, mezcal. Es originaria de
México, sin embargo, se cultiva en el sur de Estados Unidos, Venezuela y
Colombia. Existen más de 200 especies, con una gran diversidad en cuanto a
formas tamaños, colores y estrategias de vida. Se especula que el género
surgió hace unos 12 millones de años.
La planta está formada por una rosa de hojas gruesas, largas, puntiagudas,
acanaladas, dentado espinosas, color verde y carnosas; generalmente
terminan en una aguja afilada en el ápice y flores amarillas en ramillete sobre el
astil. El robusto tallo leñoso suele ser muy corto, por lo que las hojas aparentan
surgir de la raíz. La altura del fique varía entre dos y siete metros; el ancho de
las hojas maduras varía entre diez y veinte centímetros y el largo entre uno y
dos metros. Su vida útil de producción comienza entre los 3 y 6 años.
El fique prevalece en lugares donde predominen las condiciones del trópico
durante todo el año, gracias a que sus raíces se extienden, le es fácil conseguir
agua y almacenarla en sus hojas, y tallos. En este sentido, las condiciones
climáticas óptimas para su plantación comercial son. “Temperatura entre los 19

10
y 23 grados centígrados, altura entre 1.300 y 1.900 m.s.n.m.; humedad relativa
entre el 50 y 70%; precipitación de 1.000 a 1.600 m.m anuales y una
luminosidad promedio de 5 a 6 horas diarias. (De la Cruz López & Marroquín
Bravo, 2011)

4.2.2.1 Jugo de fique. Del desfibrado, queda un 96% de residuos y

subproductos que en general se desechan. El jugo constituye el 70%, del cual
hasta el 40% se puede extraer por prensado. Este es una suspensión con
características variables, dependiendo de la edad, la estación del año y la
fertilidad del suelo. De color verde ocre, olor característico fuerte, y es muy
corrosivo. Su densidad media a escala experimental es de 1.02 Kg. /L y su pH
varía entre 4 y 5.
Sus constituyentes se conocen en forma cualitativa, siendo los principales:
• 85% humedad.
• 6% celulosa. (D-glucosa)
• 8% parte orgánica y amorfa (Con sacarosa, proteínas, nitrógeno, fósforo,
calcio, potasio, saponinas y sapogeninas).
• 1% Minerales.
Diversas investigaciones fitoquímicas, reportan que el jugo de fique contiene
cantidades apreciables de: Oxalato de calcio, saponinas, esteroides,
triterpenos, alcaloides, cumarinas quinonas, hecogenina, tigogenina, β-
sitosterol, ácidos grasos (cáprico, láctico, mirístico, palmítico, esteárico, oleico,
linoleico y linolénico), esfingosina-1-fosfato SSP, Ubiquitin y Proteasome.
(Granados Castellanos, 2010)

4.2.2.2 Flora microbiana del jugo de fique. El jugo de fique, por su alto
contenido de moleculas orgànicas y bajo condiciones de almacenamiento
adecuadas, favorece el desarrollo de comunidades microbianas, siendo el caso
de 67 cepas (44 bacterias y 23 levaduras), ocho morfotipos bacterianos y cinco
levaduriformes mostraron mejor actividad antagonica frente a phytophthora
infestans y establecieron que la bacteria que presentò mayor inhibiciòn
corresponde al genero bacillus. (De la Cruz López & Marroquín Bravo, 2011).
Es de señalar que las especies del genero bacillus, como la cepa M46, son de
interès como agentes de control biologico porque tienen rapido crecimiento en
medio liquido, forman endosporas resistentes al calor y producen varios tipos
de metabolitos de naturaleza peptidica y lipopeptidica, razon por la cual, estos
microorganismos se han reportado como eficientes para el control de hongos
fitopatogenos, grupo en el cual se encuentra phytophthora infestans. (Otero et
al., 2014)

11
4.3 MARCO HISTÓRICO

 EVALUACIÓN DEL BIOINSUMO DE FIQUE PULVERIZADO

(FURCRAEA SPP) PARA EL CONTROL IN VITRO DE
PHYTOPHTHORA INFESTANS EN PAPA (SOLANUM TUBEROSUM
L). Condujo a una reducción considerable en el porcentaje de
crecimiento del patógeno Phytophthora infestans. Hubo una reducción
en la actividad de agua, la cual está directamente relacionada con el
grado de inhibición del bioinsumo sobre el fitopatógeno y a su vez con la
conservación del producto. (Solarte et al., 2012)

 BIOFUNGICIDA A PARTIR DEL JUGO DE FIQUE (Furcraea spp.) Y

EVALUACIÓN DE SU EFECTIVIDAD SOBRE LA GOTA (Phytopthora
infestans) EN EL CULTIVO DE PAPA (Solanum tuberosum). El jugo de
fique en una concentración del 11.25% se puede utilizar como un
biofungicida eficiente para prevenir la gota (Phytopthora infestans) en el
cultivo de papa. Las saponinas, alcaloides y flavonoides tienen
incidencia sobre las propiedades fungicidas del jugo de fique (Furcraea
spp).(Rojas & Luque, 2012)

 EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL JUGO DE FIQUE

(FURCRAEA SPP) PARA EL CONTROL IN VITRO DE
PHYTOPHTHORA INFESTANS EN PLANTAS DE PAPA (SOLANUM
TUBEROSUM L). Mediante la concentración se redujo la actividad de
agua e inversamente aumento el periodo de vida útil del jugo de fique.
Los componentes del jugo que han sido reportados con capacidad
antifúngica, (sapogeninas) se mantuvieron en un 79% en el proceso de
concentración del jugo fermentado. (Solarte & Osorio, 2014)

 EVALUACION DEL EFECTO DEL JUGO DE FIQUE (Furcraea spp)

FERMENTADO CON LA LEVADURA NATIVA (CANDIDA
GUILLIERMONDII M2L) CONTRA (Phytophthora infestans) DE LA
PAPA (Solanum tuberosum) EN CONDICIONES IN VITRO. Determinó
que el bioinsumo M2 obtenido de la fermentación del jugo de fique,
suplementado con sacarosa, presentó un efecto de inhibición frente al
patógeno Phytophthora infestans del 93%.(De la Cruz López &
Marroquín Bravo, 2011)

12
 BACTERIAS AISLADAS DEL JUGO DE FIQUE CON ACTIVIDAD
ANTAGÓNICA SOBRE Phytophthora Infestans (Mont.) de Bary.
Probablemente los metabolitos producidos por las comunidades
microbianas presentes en el jugo de fique son las que ejercen control
biológico de P. infestans cuando los agricultores aplican jugo de fique
sobre los cultivos de papa y otras Solanáceas. (Otero et al., 2014)

13
 5. METODOLOGIA

5.1. CARACTERIZACIÓN DE LAS CUALIDADES FITOQUÍMICAS CON EL

POTENCIAL FÚNGICO PARA MITIGAR EL HONGO (PHYTOPHTHORA
INFESTANS), DE LA PAPA.

5.1.1 Obtención de las hojas de fique. Una vez en el cultivo, realizamos las
pruebas previas de calidad, analizando que organolépticamente no haya daños
en la estructura de la penca, seccionamos toda el área cultivada a muestrear
en 4 partes uniformes, con la finalidad de garantizar la aleatoriedad en la toma
de las muestras; las estadísticas promedio que nos ha brindado la literatura
indican que, del desfibrado, queda un 96% de residuos y subproductos, el jugo
constituye el 70% del cual hasta el 40% puede ser extraído. (Mayssara A. Abo
Hassanin Supervised, 2014), partiendo de estas bases, recolectamos pencas
por sección, para finalmente obtener una totalidad de pencas con las cuales
trabajar, garantizando que sea una cantidad suficiente con la cual realizar los
diferentes procesos de la investigación.
Las pencas por cosechar deben ser pencas en su etapa óptima de madurez,
que estén por debajo de los 90º o las que están de forma horizontal respecto al
tallo, retiramos la penca de la planta con una herramienta lo suficientemente
cortante, realizando un corte recto y lo más cerca al tallo posible, teniendo en
cuenta que la planta debe quedar con un mínimo de 15 a 20 hojas para
garantizar que se pueda continuar su proceso biológico sin traumas. (2019-06-
30 Cartilla Técnica Del Cultivo Del Fique.Pdf, n.d.)
5.1.2 Desfibrado y obtención del jugo de fique. Una vez tengamos las
muestras en la planta piloto, separamos la corteza de la fibra, posteriormente
llevamos las pencas de fique de variedad negra común a un molino de rodillos
para mediante este método extraer la mayor cantidad posible de jugo. Vertimos
el jugo dentro de un empaque hermético de vidrio previamente esterilizado en
una autoclave, junto con los demás materiales de laboratorio a utilizar (cajas de
Petri, pipetas, agitadores de vidrio, Erlenmeyer). Estabilizamos el jugo por
medio de un proceso de filtrado al vacío, con siguiente a esto centrifugamos a
8.000 rpm durante 15 minutos (De la Cruz López & Marroquín Bravo, 2011),
pasteurizamos por 30 minutos a 65ºc y adicionamos 1.000 mg/L de sorbato de
potasio, lo cual dará una vida útil de 6 meses al biofungicida, teniendo en
cuenta que para su adecuada conservación, debe estar a una temperatura de
congelación de -10ºc. (Rojas & Luque, 2012)

5.1.3 Análisis fitoquímico preliminar. La muestra de jugo de fique será

sometida a pruebas cualitativas para comprobar la presencia de metabolitos
14
secundarios. Estas pruebas consintieron en reacciones de coloración y
ensayos de detención.

5.1.3.1 Determinación de alcaloides. Se toma una muestra del jugo de fique,

se mezcla con ácido clorhídrico y posteriormente es calentado a baño maría
durante 5 minutos aproximadamente, después se enfría y se filtra. En tubos de
ensayo se coloca 2 ml de la muestra y se añade 2 gotas de los reactivos de
Dragendorff, Wagner y Mayer. La prueba se considera positiva al momento en
el que se evidencia una especie de precipitado o turbidez (Villota Motezuma &
Pantoja Agreda, 2015).

5.1.3.2 Determinación de saponinas: Se disuelve la muestra en agua

caliente, se agita durante 5 minutos y se deja reposar, la formación de espuma
después de aproximadamente 30 minutos indica la presencia de saponinas en
la muestra. (Villota Motezuma & Pantoja Agreda, 2015).

5.1.3.3 Determinación de flavonoides: Prueba de Shinoda: Se coloca varias

limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Se añade 2 ml de la muestra y
por la pared del tubo, gota a gota, se deja caer varias gotas de HCl. La
aparición de colores naranjas, rosado, rojo o violeta, indica que la prueba es
positiva, es decir que hay presencia de flavonoides (Villota Motezuma &
Pantoja Agreda, 2015)

5.1.3.4 Determinación de taninos: Se toma alícuota de 1ml de la muestra

para las pruebas de Cloruro férrico (FeCl3) y acetato de plomo, para ambos
casos se considera positiva la prueba si hay presencia de un precipitado
(Villota Motezuma & Pantoja Agreda, 2015)

5.1.3.5 Determinación de esteroides: Prueba de Lieberman – buchard: se

toma una muestra del juego de fique y se diluye con cloroformo, posteriormente
se agrega gotas de anhídrido acético y varias gotas de ácido sulfúrico
concentrado, la mezcla se agita hasta formar una coloración violeta, azul o
verde(Villota Motezuma & Pantoja Agreda, 2015)

5.1.3.6 Análisis de metabolitos secundarios por medio de cromatografía

de gases acoplada a espectrofotometría de masas (CG-FID)
Las muestras de jugo de fique deben pasar por un análisis mediante
cromatografía de gases acoplada a espectrofotometría de masas con el fin de
determinar la presencia de los anteriores metabolitos secundarios y conocer
cuál o cuáles presentan actividad biocida. Ya identificados los compuestos por
el análisis cromatográfico, se realiza la cuantificación de los metabolitos
15
secundarios por medio de HPLC para determinar alcaloides, taninos y
sapogeninas y finalmente por cromatografía para determinar flavonoides, las
muestras del jugo de fique deben estar previamente filtradas, y pasteurizadas.
(Villota Motezuma & Pantoja Agreda, 2015)

5.2 MUESTREO.

5.2.1 Recolección. Para la recolección del hongo de la papa (Phytophthora

infestans) se retira partes de las muestras sintomáticas de la planta como
hojas, tallo, raíces o frutos. Una vez recolectadas, las conservamos dentro de
un recipiente hermético estéril.

5.2.2 Aislamiento. se corta secciones de tejido de las zonas infectadas, zonas

donde el patógeno está en crecimiento activo. Estos tejidos se siembran sin
desinfestar directamente en medio selectivo en agar centeno B, con ampicilina
(0.10g/L), rifampicina (0.02 g/L) y PCNB (0.025 g/L) para reducir el crecimiento
de microbiota acompañante no deseada. Luego se realizan pases a agar
centeno B hasta obtener cultivos puros de Phytophthora. Las cajas deben
almacenarse en lugares con ausencia de luz a 19.0°C y se realiza pases a
medio de cultivo nuevo cada 5 días para mantener la actividad de los
aislamientos.

5.3 EXTRACCION Y PURIFICACION DEL PATÒGENO EN CUESTIÒN

5.3.1 Aislamiento. se toma muestras de hojas, tallos, raíces, frutos y flores que
tengan una zona de tejido sano frente al avance de la lesión. Parte de la
evaluación de 2 formulaciones diferentes de medios de cultivo: en medio PDA,
que es ideal para el crecimiento de todo tipo de microorganismos (bacterias,
levaduras, hongos) y en medio PDA más cloranfenicol para inhibir bacterias.
5.3.2 Purificación. De las hojas infectadas con el patógeno Phytophthora
infestans, se tomará 1cm3 de tejido enfermo con micelio, el cual se colocará en
cajas de Petri con agar papa dextrosa (PDA), con incubación a 25 °C durante 5
días. como los hongos Phytophthora infestans se encuentran en muestras
sólidas, estas deberán diluirse y sembrarse por cada dilución hasta 10 -6, cada
una por triplicado. Una vez desarrollado el micelio, se tomarán muestras del
patógeno realizando improntas con cinta adhesiva en un portaobjetos, y sobre
estas se colocará una gota de azul de lactofenol. Las preparaciones serán
observadas al microscopio con la finalidad confirmar la presencia de la
enfermedad. (García-Gutiérrez & Rodríguez-Mesa, 2012)

16
5.4 EVALUACION IN VITRO.

5.4.1 Aislamiento de microorganismos a partir del jugo de fique. Se

realizará una fermentación batch del jugo de fique durante 6 días a 30ºC, cada
dos días de fermentación se toman 10 mL de muestra y se realizan diluciones
seriadas hasta 10-6, de las ultimas 3 diluciones se toman 10 uL y se inoculan
en cajas de Agar Plate Count (PCA) suplementadas con jugo de fique. Los
aislados obtenidos son agrupados teniendo en cuenta la descripción de sus
atributos culturales como: forma, margen, elevación, superficie, textura o
consistencia, propiedad óptica, tamaño, configuración y color. Además, se hará
una descripción de sus características microscópicas a través de la respuesta
que presentan a la tinción de gran.

5.4.2 Pruebas de antagonismo contra Phytophthora infenstans. Los

aislados obtenidos del jugo de fique se inoculan en caldo nutritivo
suplementado con glucosa (20 g.L-1) y posteriormente, son sometidos a un
proceso de fermentación por 9 días a 32 ºC y 130 rpm. Se realizó la extracción
de los metabolitos Se realiza la extracción de los metabolitos de acuerdo al
protocolo del Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable con las
siguientes modificaciones: se reemplaza el ácido tricloroacético por ácido
tricloroacético y se agrega acetato de etilo en proporción 1:1. Los extractos
obtenidos serán sometidos a las pruebas de antagonismo contra P. infestans
en agar tomate y aplicando la técnica de sensidiscos, los cuales fueron
impregnados con 150 μL de cada solución de metabolítos que sea obtenida.
Posteriormente, se ubican en cajas de Petri previamente inoculadas con discos
de 1,36 cm de diámetro del patógeno; las cajas se llevan a incubación a una
temperatura promedio de 18°C. haciendo seguimiento al crecimiento del
patógeno durante ocho días, finalmente se mide el halo de inhibición generado
por el sensidisco frente al patógeno.
A continuación, el aislado que presente la mejor inhibición del crecimiento de P.
infestans se someterá a un proceso de fermentación durante 6 días en 100
inoculó con la bacteria seleccionada a una densidad óptica de 0,015 ± 0,01 y
se lleva a incubación a 32°C y 100 rpm. Transcurrido este tiempo para la
evaluación de los antagonistas se utiliza un cultivo previo de P. infestans en
agar-tomate del cual se toman discos de 1,36 cm de diámetro inoculados con el
patógeno y se siembran en cajas de agar tomate, enmendado con 200 μL
(10000 ppm) del caldo fermentado por el aislamiento seleccionado. Después de
ocho días de incubación a una temperatura promedio de 18°C se evalúa el
crecimiento de P. infestans en cada unidad experimental por medición del
diámetro de crecimiento. Los ensayos se realizan por triplicado y como control
se utilizan cajas de agar tomate sin enmendar. (Otero et al., 2014)

17
5.4.3 Diseño experimental.

Cuadro nº 1: diseño experimental

Patógeno A Variables de
Factor Tratamientos Evaluar respuesta
0%

1.000μg mL-1.
Concentración de Phytophthora Capacidad
esporas 10.000 μg mL- infenstans Antagónica
1.
100.000μg
mL-1.
(Santander, Cerón y Hurtado, 2014).

Unidades Replicas
experimentales

12 3

18
6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

CUADRO N.º 2: cronograma de actividades

SEMANA
Actividades
1 2 5 8 10 12 14 16 18 20 22
1 Logística del
laboratorio y lugares
de obtención de las
muestras.
2 Proceso de desfibrado y
obtención del jugo de
fique.
3 Análisis fitoquímico del
jugo de fique.

4 Identificación de cultivos
sintomáticos (PAPA).
Recolección de muestras.
Transporte y
almacenamiento.
5 Inoculación de los
principales patógenos en
cajas de agar.
(Diluciones seriadas,
purificación) Monitorear
crecimiento.
6 Evaluación del efecto
biofungicida del jugo de
fique sobre el patógeno
7 Análisis de resultados.
FUENTE: Elaboración propia

19
 7. PRESUPUESTO

Cuadro Nº 3: presupuesto
FUENTE DE FINANCIACIÓN

CONCEPTO CANTIDAD UNIVERSIDADD ESTUDIANTE. TOTAL.

DELCAUCA.

Matricula 4 1.000.000 1.000.000

Transporte X4 500.000 500.000

Alimentación X4 2.400.000 2.400.000

Impresiones y 100.000 100.000

publicaciones

EQUIPOS

Cajas Petri vidrio 20 83.000 83.000

Agar PDA, YGC 1 298.000 298.000

Erlenmeyer (100 mL) 2 24.800 24.800

Erlenmeyer (500 mL) 4 66.400 66.400

Probetas (10 mL) 3 100.350 100.350

Probetas (100 mL) 3 108.000 108.000

Tubos de ensayo con 15 22.500 22.500

tapa (10 mL)

Micropipeta (1 mL) 1 874.200 874.200

Vasos de precipitado 3 9.500 9.500

Nevera (muestras) 1 25.000 25.000

20
 Escapula 1 20.500 20.500

Papel Kraft 1 28.000 28.000

Papel film 1 6.600 6.600

Papel aluminio 1 19.500 19.500

Perlas (Erlenmeyer 100 g 60.600 60.600

250 mL)

Magneto 1 8.500
8.500

Plancha 1 6.011.500
6.011.500
Caja con puntas 30 30.000
30.000

Reactivos 300 1.473.000

ml
-tinción 1.473.000
12
-pruebas
Porta y cubre objetos 8 6.800
6.800
Análisis 4 650.000 650.000
cromatógrafos

Microscopio 1 24.000.000 24.000.000

Balanza analítica 1 15.000.000 15.000.000

Personal docente 1.000.000 $1.000.000

Imprevistos 150.000 $100.000 $250.000

TOTAL 50.076.750 3.010.000 53.086.750

Fuente: elaboración propia

21
 8. BIBLIOGRAFIA

2019-06-30 Cartilla Técnica del Cultivo del Fique.pdf. (n.d.).

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22
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23