Agrociencia

ISSN: 1405-3195
[email protected]
Colegio de Postgraduados
México

Quintana Sierra, M. Elena; Robledo Paz, Alejandrina; Santacruz Varela, Amalio; Gutiérrez Espinosa,
M. Alejandra; Carrillo Castañeda, Guillermo; Cabrera Ponce, J. Luis
Regeneración in vitro de plantas de cebolla (Allium cepa L.)
Agrociencia, vol. 39, núm. 6, noviembre-diciembre, 2005, pp. 647-655
Colegio de Postgraduados
Texcoco, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=30239608

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 REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.)

In vitro REGENERATION OF ONION (Allium cepa L.) PLANTS

M. Elena Quintana-Sierra1, Alejandrina Robledo-Paz1, Amalio Santacruz- Varela1, M. Alejandra Gutiérrez-Espinosa1,

Guillermo Carrillo-Castañeda1 y J. Luis Cabrera-Ponce2

1
Genética. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.
([email protected]). 2Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del I.P.N. Unidad Irapuato.
km 9.6. Libramiento Norte Carretera Irapuato-León Apartado Postal 629. 36500. Irapuato, Guanajuato.
México.

RESUMEN ABSTRACT
La cebolla (Allium cepa L.) es una de las principales hortalizas Onion is one of the main vegetable crops in México; however, there
cultivadas en México; sin embargo, no hay estudios relacionados are no studies related to in vitro regeneration of varieties of
con la regeneración in vitro de variedades comerciales sembradas commercial importance, grown in our country. In this paper, the
en nuestro país. En este trabajo se presenta una metodología que development of a methodology for in vitro plant regeneration of
permite la regeneración de plantas de las variedades Cristal y El Cristal and El Toro onion varieties, is presented. Root tip explants
Toro. Explantes de ápices de raíces de plántulas de 2 d de edad se of two-day-old seedlings were cultured in Chu et al. medium (N6)
cultivaron en el medio de Chu et al. (N6) más dos concentraciones plus two concentrations of 2, 4- dichlorophenoxy acetic acid (2,
de ácido 2, 4-diclorofenoxiacético (2, 4-D) (0.5 ó 1.0 mg L−1) y con 4-D) (0.5-1.0 mg L−1) and with or without 6- furfurylaminopurine
o sin 6-furfurilaminopurina (cinetina) (0.5 ó 1.0 mg L−1). El por- (kinetin) (0.5-1.0 mg L−1). Response, regarding the percentage of
centaje de explantes que formaron plantas y el número de plantas explants producing plants, and the number of plants produced
formadas por explante no fue estadísticamente diferente (p>0.05) per explant, was not statistically different (p>0.05) amongth four
entre los cuatro medios evaluados. La variedad Cristal mostró evaluated media. Cristal variety showed higher percentage of both,
mayor porcentaje de explantes con plantas y mayor número de explants producing plants and number of plants produced per
plantas por explante. Se obtuvieron plantas después de 16 sema- explant. Plants were obtained 16 weeks after initiating the culture,
nas de haber iniciado el cultivo y éstas formaron microbulbos3, and all of them formed microbulbs3, that reached up to 3 cm in
los cuales alcanzaron hasta 3 cm de diámetro (bulbos)4 cuando se diameter (bulbs)4 as they were transplanted to the greenhouse.
transplantaron en invernadero. El protocolo desarrollado permi- The developed protocol allows for the propagation of cultivars of
te la propagación de variedades de importancia económica para economic importance for México. The observed in vitro response
nuestro país. La respuesta in vitro obtenida superó a la reportada exceeded that reported by other authors. The embryogenic calluses
por otros autores. Los callos embriogénicos obtenidos pueden em- obtained may be utilized to incorporate transgenes to the onion
plearse para incorporar transgenes a la planta de cebolla. plant.

Palabras clave: Allium cepa, ápices de raíz, callos embriogénicos, Key words: Allium cepa, root tips, embryogenic calluses, tissue
cultivo de tejidos, reguladores del crecimiento. culture, growth regulators.

INTRODUCCIÓN INTRODUCTION

L O
a cebolla (Allium cepa L.) es uno de los principa- nion (Allium cepa L.) is one of the main edible
les cultivos comestibles del género Allium, y la crops of genus Allium and the second most
segunda hortaliza más producida en el mundo des- produced vegetable in the world after tomato
pués del tomate (Lycopersicon esculentum L.) (Lycopersicon esculentum L.) (SAGARPA, 2004). In
(SAGARPA, 2004). En México, la cebolla ocupa el cuarto México, onion occupies the fourth production place
lugar de producción entre las hortalizas y se cultiva en among vegetables and is cultivated nearly all over the
country; moreover, the country is the principal exporter
of this vegetable to the United States.
Recibido: Octubre, 2004. Aprobado: Septiembre, 2005.
One of the objectives of vegetal genetic improvement
Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 39: 647-655. 2005. is to incorporate resistance to diseases and pests, or to

3
Bulbos pequeños que se forman en la base de las plantas durante el cultivo in vitro y que tienen un diámetro no mayor de 0.7 cm.
4
Estructuras que se originan de los microbulbos cuando éstos son cultivados en invernadero.

647
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005

casi todo el país; y, además, es el principal exportador de adverse environmental conditions, as well as to improve
esta hortaliza a los EE.UU. flavor, color, shape, and size in the organs of
Uno de los propósito del mejoramiento genético ve- anthropocentric importance. In the programs of genetic
getal es incorporar resistencia a enfermedades y a pla- improvement of Allium species, hybridization has been
gas, o a condiciones adversas del ambiente, así como the classical way permitting genetic variation in the new
mejorar sabor, color, forma y tamaño de los órganos de varieties. However, it is difficult to overcome pre and
importancia antropocéntrica. En los programas de mejo- post-fertilization barriers to hybridization, like disorders
ramiento genético de especies de Allium, la hibridación in the pollen tube, limited recombination among
ha sido la vía clásica que ha permitido la variación genomes, and the production of an insignificant amount
genética en las nuevas variedades. Sin embargo, es difí- of seeds.
cil superar barreras pre y post fertilización para la hibri- In vitro propagation allows for the regeneration of
dación, como desórdenes en el tubo polínico, limitada plants of desirable genotype in aseptic conditions and is
recombinación entre los genomas, y producción de una utilized with the intention to produce plants free from
insignificante cantidad de semillas. diseases, achieve clonal propagation, the conservation
La propagación in vitro permite la regeneración de of germ plasma, the rescue of sterile interspecific hybrids,
plantas de un genotipo deseable en condiciones asépticas and genetic transformation (Eady, 1995).
y se utiliza con la intención de producir plantas libres de In vitro regeneration of onion has been practiced
enfermedades, lograr la propagación clonal, la conser- through organogenesis (Kamstaityte and Stanys, 2002)
vación de germoplasma, el rescate de híbridos and somatic embryogenesis (Saker, 1997; Zheng et al.,
interespecíficos estériles y la transformación genética 1998; Tanikawa et al., 1998), employing different plant
(Eady, 1995). parts as explant; nevertheless, regeneration frequency has
La regeneración in vitro de cebolla se ha practica- been low (1 to 6 plants per explant). The protocols for
do vía organogénesis (Kamstaityte y Stanys, 2002) y obtaining explants imply laborious procedures (dissection
embriogénesis somática (Saker, 1997; Zheng et al., of sexual embryos, of shoot tips, or of the basal plate), or
1998; Tanikawa et al., 1998) empleando distintas par- only consider the in vitro phase. The culture of root tips
tes de la plantas como explante; no obstante, la fre- may be considered as an option in the establishment of
cuencia de regeneración ha sido baja (de 1 a 6 plantas in vitro regeneration protocols of onion, since such organs
por explante). Los protocolos para obtener explantes can be easily obtained from seedlings as well as from
implican procedimientos laboriosos (disección de em- bulbs of adult plants. Likewise, the culture of tips has
briones sexuales, de ápices de vástago o de la placa already allowed the plant regeneration of some onion
basal), o sólo contemplan la fase in vitro. El cultivo de varieties (Dunstan and Short, 1978) and of other species
ápices de raíces puede considerarse como una opción of the Allium genus, such as garlic (Allium sativum L.)
en el establecimiento de protocolos de regeneración (Myers and Simon, 1998; Robledo-Paz et al., 2000).
in vitro de cebolla, pues tales órganos pueden obtenerse Although onion plants of varieties sown in Japan, South
fácilmente de plántulas y de bulbos de plantas adul- Korea, New Zealand, Brazil, and the United States have
tas. Asimismo, el cultivo de ápices ha permitido la re- been regenerated in vitro, results of this type of research
generación de plantas de algunas variedades de cebo- in varieties sown in México are not known. As the
lla (Dunstan y Short, 1978) y de otras especies del response to in vitro culture depends on the genotype (Van
género Allium, como el ajo (Allium sativum L.) (Myers der Valk et al., 1992; Saker, 1997; Zheng et al., 1998), it
y Simon, 1998; Robledo-Paz, et al. 2000). Si bien se is necessary to generate a specific methodology for the
han regenerado in vitro plantas de cebolla de varieda- genotypes of interest.
des que se siembran en Japón, Corea del Sur, Nueva Regarding the aforesaid, the present research had
Zelanda, Brasil y Estados Unidos, no se conocen re- the objective to develop a system of in vitro regeneration
sultados de investigaciones de este tipo en variedades of two varieties of commercial importance for México,
que se siembran en México. Dado que la respuesta al Cristal and El Toro, by means of the culture of root
cultivo in vitro depende del genotipo (Van der Valk et tips.
al., 1992; Saker, 1997; Zheng et al., 1998), es necesa-
rio generar una metodología específica para los MATERIALS AND METHODS
genotipos de interés.
Por lo anterior, la presente investigación tuvo como Vegetal material and culture media
objetivo desarrollar un sistema de regeneración in vitro
de dos variedades de importancia comercial para Méxi- Allium cepa L. seeds of the varieties Cristal White Wax and El
co, Cristal y El Toro, mediante el cultivo de ápices de Toro (vacuum packed) were utilized, of WESTAR Seed International
raíces. Inc. originated from El Centro, California, U.S..

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 REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.)

MATERIALES Y MÉTODOS The composition of the culture media used in the present research
is described in Table 1. The pH of the media was fitted to 5.8±0.1, and
Material vegetal y medios de cultivo these were sterilized in autoclave at 1.05 kg cm−2 and 121 °C during
15 minutes. To all the media, 0.7% (p/v) of purified agar-agar, free
Se utilizaron semillas de Allium cepa L. de las variedades Cristal from inhibitors, was added (Merck, Darmstadt, Germany).
White Wax y El Toro (envasada al vacío) de la marca WESTAR Seed
International Inc., proveniente de El Centro, California, EE.UU. Induction of embryogenic calluses
La composición de los medios de cultivo usados en la presente in-
vestigación se describe en el Cuadro 1. El pH de los medios se ajustó a The seeds were put in a solution containing 1 g L−1 of Fungimycin
5.8±0.1 y éstos se esterilizaron en una autoclave a 1.05 kg cm−2 y 121 °C 100 [18.1% (p/v) streptomycin and 2.0% (p/v) oxytetracycline], and
durante 15 min. En todos los medios se agregó 0.7% (p/v) de agar-agar, 1 g L−1 of Daconyl [75% (p/v) Chlorothallonyl tetrachloride
purificado y exento de inhibidores (Merck, Darmstadt, Alemania). isothallonitrile] (Química Industrial Agrícola, S.A. México) during
15 h. The seeds were transferred to a solution of 1.8% of active chlorine
Inducción de callos embriogénicos (v/v) (Cloralex®, México), to which 4 mL L−1 of Tween 20 (Sigma
Chemical, USA) were added. In this solution the seeds remained for
Las semillas se colocaron en una solución que contenía 1 g L−1 20 min; then they were rinsed three times with sterile distilled water.
de Fungimycin 100 [18.1% (p/v) estreptomicina y 2.0% (p/v) The seeds were put in 100 mL jars with 25 mL of A culture medium
oxitetraciclina], y 1 g L−1 de Daconil [75% (p/v) Clorotalonil tetracloro and incubated in a growth room at 26±2 °C in the dark. After 2 days,
isotalonitrilo] (Química Industrial Agrícola, S. A., México) durante the root tips, which were approximately 3 mm long, were cut with a
15 h. Las semillas se transfirieron a una solución de 1.8% de cloro scalpel and placed in Petri dishes with 30 mL of four induction media
activo (v/v) (Cloralex®, México), a la cual se adicionaron 4 mL L−1 de (B, C, D, and E), which were incubated in the dark during eight weeks,
Tween 20 (SIGMA Chemical, USA). En esta solución las semillas changing them to a fresh medium every four weeks.
permanecieron 20 min; después se enjuagaron tres veces con agua
destilada estéril. Development of embryos and microbulb formation
Las semillas se colocaron en frascos de 100 mL con 25 mL del
medio A, y se incubaron en un cuarto de crecimiento a 26±2 °C en The explants with callus were transferred to a medium without
obscuridad. Después de 2 d, los ápices de las raíces que medían 3 mm regulators (F), where they remained during three weeks. They were
de longitud aproximadamente, se cortaron con un bisturí y se coloca- cultured in 100 mL jars with 25 mL of G medium (1.0 mg L−1 BA)
ron en cajas Petri con 30 mL de cuatro medios de inducción (B, C, D during three weeks, then transferred to the H medium (0.5 mg L−1
y E), los que se incubaron en oscuridad durante ocho semanas, cam- BA) for another two weeks, and the differentiated plants were returned
biándolos a un medio fresco cada cuatro semanas.

Cuadro 1. Composición de los medios de cultivo utilizados para la

Desarrollo de los embriones y formación de microbulbos regeneración de plantas de las variedades Cristal y El
Toro, a partir de explantes de ápices de raíces obteni-
Los explantes con callo se transfirieron a un medio libre de regu- das de plántulas de 2 d de edad.
Table 1. Composition of the culture media utilized for regeneration
ladores (F) donde permanecieron tres semanas. Se cultivaron en fras-
of plants of the varieties Cristal and El Toro, from explants
cos de 100 mL con 25 mL de medio G (1.0 mg L−1 BA) durante tres of root tips obtained from 2-day-old seedlings.
semanas, se transfirieron al medio H (0.5 mg L−1 BA) por dos sema-
nas más y las plantas diferenciadas se regresaron al medio F para Reguladores del
Medio Sales Vitaminas Sacarosa crecimiento
continuar su desarrollo. Los cultivos se colocaron en una cámara de inorgánicas (%)
(mg L−1)
ambiente controlado a 26±2 °C con fotoperíodo de 16 h luz (lámpa-
ras de luz blanca fría fluorescente, con intensidad lumínica de 25 µmol A 50% MS 50% MS 1.5
m−2 s−1) y 8 h de oscuridad. B N6 MS 2.0 2, 4-D, 1.0
C N6 MS 2.0 2, 4-D, 0.5
Las plantas regeneradas se sometieron a un período de frío (4 °C)
D N6 MS 2.0 2, 4-D, 0.5
por dos semanas, condición necesaria para la formación de cinetina, 0.5
microbulbos, cuya presencia se logró después de un periodo de E N6 MS 2.0 2, 4-D, 1.0
incubación en una cámara de crecimiento a 26±2 °C. Las plantas que cinetina, 1.0
F MS MS 3.0
formaron microbulbos se transplantaron a invernadero para la fase
G MS MS 3.0 BA, 1.0
final de establecimiento. H MS MS 3.0 BA, 0.5

Diseño experimental y análisis estadístico MS, Murashige y Skoog (1962); N6, Chu et al. (1975); 2, 4-D, ácido
2, 4-diclorofenoxiacético; cinetina, 6-furfurilaminopurina; BA, N6 -
benciladenina ❖ MS, Murashige and Skoog (1962); N6, Chu et al.
Se empleó un diseño experimental completamente al azar con (1975); 2,4-D, 2,4- dichlorophenoxyacetic acid; kinetin, 6-
tres repeticiones en arreglo factorial, de dos factores: variedades (dos) furfurylaminopurine; BA, N6- benzyladenine.

QUINTANA-SIERRA et al. 649

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y medios de cultivo (cuatro), o sea ocho tratamientos. La unidad ex- to medium F in order to continue their development. The cultures
perimental fue un grupo de 20 explantes. Las variables analizadas were placed in a chamber of controlled environment at 26±2 °C with
fueron el porcentaje de explantes que formaron callos embriogénicos, photoperiod of 16 h light (lamps of fluorescent cold white light, with
el porcentaje de explantes que regeneraron plantas a las 12 semanas luminous (light) intensity of 25 mmol m−2 s−1) and 8 h of dark.
de haber iniciado el cultivo, y el número promedio de plantas produ- The regenerated plants were subjected to a cold period (4 °C) for
cidas por explante a las 16 semanas de haber iniciado el cultivo. Se two weeks, condition necessary for the formation of microbulbs, which
efectuó un análisis de varianza con las variables explantes que rege- emerged after an incubation period in a growth chamber at 26±2 °C.
neraron plantas y número promedio de plantas producidas por explante, The plants that formed microbulbs were transplanted into a greenhouse
dado que la variable porcentaje de explantes que formaron callos for the final phase of establishment.
embriogénicos registró un valor del 100% para todos los tratamien-
tos. La variable porcentaje de explantes que regeneraron plantas pre- Experimental design and statistical analysis
viamente fue transformada a logaritmo base 10. La comparación de
medias se efectuó la prueba de la diferencia mínima significativa A completely randomized experimental design was employed,
(DMS, 0.05), y los promedios se presentan en las unidades originales. with three replications in factorial arrangement of two factors: varieties
Los datos se analizaron con SAS (1999). (two) and culture media (four), this is, eight treatments. The
experimental unit was a group of 20 explants. The analyzed variables
Transferencia al suelo de las plantas con microbulbos were: percentage of explants forming embryogenic calluses, percentage
of explants regenerating plants at 12 weeks after initiating the culture,
Las plantas que formaron microbulbos in vitro se extrajeron de and the average number of plants produced by explant at 16 weeks
los frascos y se lavaron con agua corriente con el objeto de eliminar after having initiated the culture. An analysis of variance was made
los residuos de medio de cultivo. Luego, las plantas se sumergieron with the explant variables that regenerated plants, and the average
en una solución de Daconil 1% (p/v) durante 2 min y se transfirieron number of plants produced by explant, since the variable, percentage
a vasos de unicel de 240 mL conteniendo como sustrato tierra negra of explants forming embryogenic calluses, recorded a value of 100%
de monte, tierra lama y tierra de hoja en proporción equivalente for all the treatments. The variable percentage of explants having
(GARDEN’S, México). Las plantas se cubrieron con una bolsa de regenerated plants previously, was transformed to logarithm base 10.
polietileno transparente de 0.5 kg de capacidad, donde se hizo 15 a The means comparison was done with the minimum significant
20 perforaciones con una aguja. Los vasos se mantuvieron dos sema- difference test (DMS, 0.05), and the means are presented in the original
nas en una cámara de crecimiento a 26±2 °C con 16 h de iluminación. units. The data were analyzed utilizing SAS (1999).
Después se pasaron a bolsas de 10 kg de capacidad y se llevaron a un
invernadero donde se fertilizaron con la mitad de la fórmula 15:30:15 Transferring of the plants with microbulbs to soil
(N, P, K) de Miracle-Gro® (Scotts Co., EE.UU.) por dos semanas, y
después con la dosis completa cada semana, con el fin de que los The plants having formed microbulbs in vitro were extracted from
microbulbos se convirtieran en bulbos. the jars and rinsed under running water with the purpose of eliminating
Los bulbos obtenidos a partir de los microbulbos se secaron 30 d the residues of culture medium. Then the plants were submerged in a
a temperatura ambiente para retirar las hojas y la raíz (cura), se some- 1% (p/v) Daconyl solution during 2 min to be later transferred to
tieron a frío (10 °C) por 30 d más, se pasaron a suelo y se llevaron a 240 mL Styrofoam mugs containing a substratum of black mountain
una cámara de crecimiento a 22±1 °C, donde emitieron el vástago y soil, sludge, and forest soil (humus) in equivalent proportion (Garden’s,
las raíces. México). The plants were covered with transparent 0.5 kg polyethylene
bags pierced by a needle making 15 -20 holes. The mugs were kept in
RESULTADOS Y DISCUSIÓN a growth chamber at 26±2 °C with 16 h light for two weeks. Afterwards,
they were put in 10 kg bags and taken to a greenhouse, where they
Los cuatro medios de cultivo (B, C, D y E), permitie- were fertilized with half of the 15:30:15 (N, P, K) formula of Miracle-
ron la formación de callos embriogénicos en 100% de Gro® (Scotts Co., U.S.) for two weeks, and later on, every week with
los ápices de raíz cultivados para ambas variedades. En the complete dose, to let the microbulbs grow to bulbs.
el Cuadro 2 se muestran los resultados del análisis de The bulbs obtained from the microbulbs were dried during 30 d
varianza. En el porcentaje de explantes que formaron at room temperature in order to remove leaves and root (cure), they
plantas y el número promedio de plantas producidas por were subjected to cold (10 °C) for another 30 d, then transplanted to
explante hubo diferencias altamente significativas entre soil and taken to a growth chamber at 22±1 ºC, where they emitted
variedades; sin embargo, no hubo significancia para the shoot and the roots.
medios de cultivo ni para la interacción entre variedades
y medios de cultivo. RESULTS AND DISCUSSION
En el Cuadro 3 se presentan los promedios de ambas
variables para los factores variedades y medios de culti- The four culture media (B,C,D, and E) allowed the
vo. La variedad Cristal casi duplicó el porcentaje de formation of embryogenic calluses in 100% of the root

650 VOLUMEN 39, NÚMERO 6

 REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.)

Cuadro 2. Cuadrados medios para las variables porcentaje de Cuadro 3. Promedios de explantes con plantas y plantas forma-
explantes con plantas y número promedio de plantas das por explante inducidos en variedades de cebolla
por explante. crecidos en cuatro medios de cultivo.
Table 2. Mean squares for the variables percentage of explants Table 3. Means of explants with plants and plants formed by
with plants and average number of plants per explant. explant induced to onion varieties grown in four culture
media.
Cuadrados medios
Factor Grados de Variedades
de variación libertad Porcentaje de Plantas por Medio Promedio
de cultivo
explantes con plantas explante Cristal El Toro

Variedades (V) 1 3.129 ** 223.26 ** Explantes con plantas (%)

Medios de cultivo (M) 3 0.364 ns 7.67 ns
V×M 3 0.230 ns 3.18 ns B 73.3 40.0 56.7 a
Error 16 0.255 16.86 C 66.7 35.0 50.9 a
Total 23 D 50.0 38.3 44.2 a
CV (%) 14 82 E 55.0 21.7 38.4 a
Promedio 61.3 a 33.8 b 47.6
** = altamente significativo ❖ highly significant.
ns = no significativo ❖ non significant. Plantas por explante

B 10.6 2.7 6.6 a

C 8.0 1.9 5.0 a
explantes que regeneraron plantas y produjo casi cuatro
D 6.5 1.8 4.2 a
veces más plantas por explante que la variedad El Toro E 7.9 1.3 4.6 a
(Cuadro 3). Esto indica que existen factores genéticos Promedio 8.3 a 1.9 b 5.1
involucrados en la respuesta a dichas variables, por lo
Promedios entre variedades o entre medios de cultivo con diferente
que la caracterización y ubicación en el genoma repre-
letra son estadísticamente diferentes (p≤0.05). B, (N6+2, 4-D, 1.0
sentaría un campo de estudio de gran interés. mg L−1); C, (N6+2, 4-D, 0.5 mg L−1); D, (N6+2, 4-D, 0.5 mg L−1 y
La presencia de las sales del medio N6, así como cinetina 0.5 mg L−1), y E (N6+2, 4-D, 1.0 mg L−1 y cinetina 1.0 mg
de los fitorreguladores, en los medios de cultivo em- L−1) ❖ Means among varieties or among culture media with different
letter are statistically different (p≤0.05) B, (N6+2, 4-D, 1.0 mg L−1);
pleados, fue suficiente para inducir callos
C, (N6+2, 4-D, 0.5 mg L−1); D,(N6+2, 4-D, 0.5 mg L−1 and kinetin
embriogénicos, lo que concuerda con lo reportado para 0.5 mg L−1), and E (N6+2, 4-D, 1.0 mg L−1 and kinetin 1.0 mg L−1).
otras monocotiledóneas como maíz (Zea mays)
(Armstrog y Green, 1985) y ajo (Allium sativum L.)
(Robledo-Paz et al., 2000). Posiblemente el medio tips cultured for both varieties. In Table 2, the results of
N6 incluye nutrientes factibles de ser usados con éxi- the analysis of variance are shown. There were highly
to en distintas monocotiledóneas (Robledo-Paz et al., significant differences between varieties with respect to
2000), lo que sería corroborado con los resultados del the percentage of explants developing plants and the
presente trabajo. average number of plants produced by explants; however,
La respuesta morfogénica de los explantes se inició there was no significant difference for culture media,
con un incremento de hasta cinco veces su tamaño des- neither for interaction among varieties and culture media.
pués de 30 d de cultivo en el medio de inducción. La The means of both variables for the factors varieties
proliferación celular se detectó en sitios específicos, con- and culture media are shown in Table 3. Cristal variety
centrándose en las zonas meristemáticas del explante (Fi- nearly doubled the percentage of explants which
gura 1 A). Haque et al. (1997) y Robledo-Paz et al. (2000) regenerated plants, and produced almost four times more
también observaron formación de callo sólo en la zona plants per explant than El Toro variety (Table 3). This
meristemática de la punta de la raíz. Los callos produci- indicates that there are genetic factors, involved in the
dos después de ocho semanas fueron de dos tipos, uno response to said variables, and that is why characterization
de color amarillo claro, compacto y translúcido y otro and location in the genome would be a field of study of
amarillo intenso, opaco, fácilmente disgregable (friable), great interest.
o sea, con características similares a los reportados por The presence of salts of the N6 medium as well as of
Van der Valk et al. (1992) y Zheng et al. (1998) en Allium the phytoregulators employed in the culture media, was
cepa. Además, los callos de la variedad Cristal fueron sufficient to induce embryogenic calluses, which agrees
más friables y de color amarillo más intenso que los de with the reports on other monocotyledons, such as corn
la variedad El Toro; es decir, hubo diferencias entre (Zea mays) (Armstrong and Green, 1985) and garlic
genotipos lo que concuerda con lo mencionado por (Allium sativum L.) (Robledo-Paz et al., 2000). Possibly,
Novák et al. (1986), quienes encontraron pigmentación the N6 medium includes nutrients, feasible of being used
diferencial entre genotipos. successfully in different monocotyledons (Robledo-Paz

QUINTANA-SIERRA et al. 651

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005

A B C

10 mm

1 mm
10 mm
5 mm

E F

10 cm

1 mm

Figura 1. Regeneración in vitro de plantas de cebolla (Allium cepa L.). A: ápices de raíz después de cuatro semanas en el medio de
inducción B. B: callo embriogénico después de ocho semanas de cultivo en el medio B. C: plantas regeneradas después de 16
semanas de iniciar el cultivo. D: formación de microbulbos en las plantas regeneradas in vitro. E: bulbo después de 12 semanas
de estar creciendo en invernadero. F: plantas obtenidas a partir de bulbos obtenidos en el invernadero.
Figure 1. In vitro regeneration of onion plants (Allium cepa L.), A: root tips after four weeks in induction medium B. B: embryogenic
callus after eight weeks of culture in medium B. C: regenerated plants after 16 weeks of initiating the culture. D: microbulb
formation in plants regenerated in vitro. E: bulb after 12 weeks growing in greenhouse. F: plants obtained from bulbs produced
in greenhouse.

Se obtuvieron callos embriogénicos (Figura 1B) tan- et al., 2000),which would be corroborated by the results
to en presencia únicamente de 2, 4-D y en combinación of the present study.
con cinetina. Sin embargo, la formación de plantas a partir The morphogenic response of the explants began with
de estos callos fue numéricamente menor cuando los an increment of up to five times their size after 30 d of
callos embriogénicos fueron inducidos en los medios que culture in the medium of induction. Cellular proliferation
contenían 2, 4-D y cinetina (Cuadro 3). Estos resultados was detected at specific sites, being concentrated in
contrastan con lo reportado por Robledo-Paz et al. (2000) meristematic zones of the explant (Figure 1A). Haque et
y Van der Valk et al. (1992) para tejidos de ajo y cebolla, al. (1997) and Robledo-Paz et al. (2000) also observed
pero concuerdan con lo observado en cultivos callus formation only in the meristematic zone of the root
embriogénicos de cacahuate (Arachis hypogaea L.) tip. The calluses, produced after eight weeks, were of
(Baker y Wetzstein, 1994) y chile (Capsicum annuum two types, one, light yellow, compact, and translucent,
L.) (Steinitz et al., 2003). La poca influencia de la cinetina and the other, of intense yellow color, opaque, easily being
en la regeneración de plantas de cebolla podría deberse a disintegrated (friable); in other words, with characteristics
que los niveles usados de este fitorregulador fueron ma- similar to those reported by Van der Valk et al. (1992)
yores o menores que las concentraciones requeridas para and Zheng et al. (1998) for Allium cepa. Furthermore,

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 REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.)

establecer el nivel hormonal endógeno adecuado que in- calluses of the Cristal variety were more friable and more
fluyera positivamente en las células de los ápices de raíz intensely yellow than those of El Toro variety, this means,
en su capacidad para regenerar plantas. Lo anterior obe- there were differences among genotypes, which agrees
dece a que la respuesta del explante está en función de with Novák et al. (1986), who found differential
los niveles hormonales endógenos de éste durante el cul- pigmentation among genotypes.
tivo in vitro (Fehér et al., 2003). La función inductora Embryogenic calluses (Figure 1B) were developed
del 2, 4-D en la embriogénesis somática ha sido obser- in presence of 2,4-D alone, as well as in combination
vado por otros autores (Van der Valk et al., 1992; Zeng with kinetin. However, plants produced by these calluses
et al., 1998; Myers y Simon, 1998), y se confirma con were less numerous when embryogenic calluses were
los resultados del presente trabajo. Se ha demostrado que induced to media containing 2, 4-D and kinetin (Table
el 2, 4-D estimula la síntesis de otras auxinas como el 3). These results contrast with those reported by Robledo-
ácido indol acético (AIA) en células de zanahoria (Daucus Paz et al. (2000) and Van der Valk et al.(1992) for garlic
carota L.) (Michalczuk et al., 1992). Asimismo, se ha and onion tissues, but agree with what was observed in
propuesto que el 2, 4-D podría actuar no sólo como una embryogenic cultures of peanut (Arachis hypogaea L.)
auxina, sino también como un herbicida, el cual induce (Baker and Wetzstein, 1994) and pepper (Capsicum
respuestas a estrés (Grossmann, 2000). Lo anterior se annuum L.) (Steinitz et al., 2003). The insignificant
fundamenta en el hecho de que la presencia del 2, 4-D influence of kinetin on onion plant regeneration might
en el medio de cultivo induce la expresión de varios genes be due to the fact that the utilized levels of this
relacionados con el estrés en células de alfalfa (Medicago phytoregulator were higher or lower than the
sativa) (Györgyey et al., 1991; Davletova et al., 2001). concentrations, required to establish an adequate
Tres semanas después de que los callos se transfirie- endogenous hormone level, that could have a positive
ron al medio F (libre de reguladores del crecimiento) effect on the cells of the root tips in their capacity of
triplicaron su tamaño, advirtiéndose la presencia de al- regenerating plants. The previous is due to the fact that
gunos embriones de los cuales emergían el vástago y la the response of the explant is a function of its endogenous
raíz para convertirse en plantas. El estudio anatómico, hormone levels during in vitro culture (Fehér et al., 2003).
que permitirá corroborar la ontogenia y bipolaridad de The inductive function of 2, 4-D in somatic
los embriones, está en proceso. El mantener las plantas embryogenesis has been observed by other authors (Van
en los medios G (1 mg L−1 de BA), H (0.5 mg L−1 de der Valk et al., 1992; Zheng et al., 1998; Myers and
BA) y F promovió su crecimiento hasta un tamaño en el Simon, 1998) and is confirmed by the results of the
cual pudieron someterse a un tratamiento que indujera la present paper. It has been demonstrated that 2, 4-D
formación de microbulbos. stimulates the synthesis of other auxins, like indoleacetic
Las plantas regeneradas in vitro que se mantuvieron acid (AIA) in carrot (Daucus carota L.) cells (Michalczuk
a 4 °C por 15 d, formaron microbulbos en su base dos et al., 1992). Likewise, it has been suggested that 2, 4-D
semanas después de retiradas de esta condición. Los might act not only as an auxin, but also as herbicide,
microbulbos continuaron su crecimiento hasta conver- which generates responses to stress (Grossmann, 2000).
tirse en bulbos que alcanzaron un tamaño de 3 cm de The aforesaid is based on the fact that 2, 4-D presence in
diámetro después de 32 semanas de haber iniciado el the culture medium originates the expression of several
cultivo de ápices (Figura 1E), y a las 52 semanas de tal genes related to stress in cells of alfalfa (Medicago sativa)
inicio, las plantas de cebolla obtenidas de estos bulbos (Györgyey et al., 1991; Davletova et al., 2001).
aún continuaban su crecimiento en el invernadero (Figu- Three weeks after the calluses had been transferred
ra 1F). to medium F (without growth regulators), they tripled
Aunque Dunstan y Short (1978) emplearon ápices their size, and the presence of some embryos was
de raíces para regenerar plantas de algunas variedades perceived, whose shoot and root emerged to become
de cebolla (Giant Zittau e Inai Early Yellow), era necesa- plants. The anatomic study, which will permit to
rio establecer las condiciones de cultivo in vitro que in- corroborate ontogeny and bipolarity of the embryos, is
dujeran la mejor respuesta en variedades de interés para being conducted. Keeping the plants in media G (1mg
México como Cristal y El Toro. Asimismo, aunque se ha L−1 of BA), H (0.5 mg L−1 of BA), and F, promoted their
reportado la regeneración de plantas de cebolla a partir growth until reaching a size where they could be subjected
de otros explantes (Van der Valk et al., 1992; Mohamed- to a treatment, which would induce microbulb formation.
Yasseen y Splittstoesser, 1992; Saker 1997; Zheng et al., Plants regenerated in vitro, being maintained at 4 °C
1998), la mayoría de estos protocolos sólo contemplan la for 15 days, formed microbulbs at their base, two weeks
fase in vitro, por lo que no proporcionan información acerca after being removed from this condition. The microbulbs
de el tiempo requerido para el establecimiento de las plan- continued their growth until they turned to bulbs, reaching
tas en suelo, ni se ha dado seguimiento al desarrollo de la a diameter of 3 cm after 32 weeks of initiating the culture

QUINTANA-SIERRA et al. 653

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005

planta hasta la formación del bulbo. Estos aspectos me- of tips (Figure 1E), and 52 weeks after this start, the onion
recen ser considerados, puesto que la respuesta evaluada plants obtained from these bulbs still continued growing
in vitro no garantiza el éxito de las plantas cuando cre- in the greenhouse (Figure 1F).
cen en invernadero o campo. Though Dunstan and Short (1978) utilized root tips
Las ventajas que ofrece el presente protocolo de re- to regenerate plants of some onion varieties (Giant Zittau
generación in vitro, no reportado con anterioridad, son: and Inai Early Yellow), it was necessary to establish the
1) permite la propagación de variedades cebolla de im- conditions of in vitro culture to create the best response
portancia económica para México; 2) la respuesta in vitro in varieties of interest for México, such as Cristal and El
supera la reportada por Dunstan y Short (1978), quienes Toro. Likewise, although the regeneration of onion plants
al usar ápices de raíces como explante sólo regeneraron from other explants has been reported (Van der Valk et
un promedio de 4.5 brotes adventicios por ápice, mien- al., 1992; Mohamed-Yasseen and Splittstoesser, 1992;
tras que en el presente protocolo se obtuvieron ocho plan- Saker, 1997; Zheng et al., 1998), most of these protocols
tas promedio por explante, y algunos explantes lograron only considered the in vitro phase; therefore, they do not
formar hasta 19 plantas; 3) las plantas regeneradas pue- provide information about the time required for the
den formar microbulbos a 20 semanas de iniciado el cul- establishment of the plants in soil, and the plant
tivo de los ápices y los microbulbos pueden usarse como development until bulb formation has not been monitored
propágulos o semilla sana de genotipos seleccionados, either. These aspects deserve to be considered, since the
que podría complementar la propagación a través de se- response evaluated in vitro does not guarantee the success
milla botánica; 4) las raíces emitidas de cada microbulbo of the plants when they grow in greenhouse or in the
producido in vitro también pueden emplearse como field.
explantes para producir nuevas plantas, lo que potencia The present protocol of in vitro regeneration, not
la eficiencia de regeneración de este protocolo; 5) los reported previously, offers the following advantages: 1)
callos morfogenéticos inducidos con las condiciones de is permits the propagation of onion varieties economically
cultivo desarrolladas en el presente estudio, muestran una important for México; 2) the in vitro response surpasses
alta velocidad de crecimiento cuando se cultivan a inter- the ones reported by Dunstan and Short (1978), who
valos regulares (15 d), lo que indica que las células de − using root tips as explant− only regenerated an average
estos callos tienen la capacidad para integrar y expresar of 4.5 adventitious shoots per tip, whereas in the present
genes introducidos por ingeniería genética a la cebolla, protocol, eight plants per explant on average were
considerada una especie difícil de manipular por esta tec- obtained, and some explants were able to form up to 19
nología (Eady, 1995). Si la fuente de explantes (ápices plants; 3) the regenerated plants may produce microbulbs
de raíces) no fuera una plántula sino un bulbo (que pue- at 20 weeks of having initiated the culture of tips, and
de formar cerca de 70 raíces), sería posible regenerar hasta the microbulbs can be used as propagules or healthy seed
581 plantas por bulbo en cuatro meses. of selected genotypes, which could complement
propagation through botanical seed; 4) the roots emitted
CONCLUSIONES by each microbulb produced in vitro, also can be utilized
as explants for the production of new plants, which
Se estableció un protocolo para regenerar in vitro reinforces the regeneration efficiency of this protocol; 5)
plantas de las variedades de cebolla Cristal y El Toro. the morphogenetic calluses, induced under the culture
Los ápices de raíces obtenidos de plántulas fueron ade- conditions developed in the present study, present high
cuados como explantes. El sistema establecido permite growth rate, when they are cultured at regular intervals
obtener plantas en cuatro meses las cuales pueden desa- (15 d), which indicates that the cells of these calluses
rrollarse hasta la formación de bulbos. La capacidad de have the capacity to integrate and express genes
regeneración fue mayor en Cristal que en El Toro. introduced by genetic engineering to onions, considered
a species difficult to manipulate by this technology (Eady,
LITERATURA CITADA 1995). If the origin of explants (root tips) were not a
seedling, but a bulb, (being able to produce approximately
Armstrog, C. L., and C. E. Green. 1985. Establishment and 70 roots) it would be possible to regenerate up to 581
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654 VOLUMEN 39, NÚMERO 6

 REGENERACIÓN in vitro DE PLANTAS DE CEBOLLA (Allium cepa L.)

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