39 TEMAS | septiembre - diciembre 2001

Notas
Resumen
El ajo (Allium sativum L.), es una especie hortcola
de gran importancia en Cuba por su alta demanda por
la poblacin tanto con fines culinarios como medicina-
les. Es una especie estrictamente agmica, est afec-
tada por diferentes enfermedades fungosas, bacterianas
y principalmente virales, por lo que el mejoramiento
tradicional est muy limitado y hay que acudir a las tc-
nicas biotecnolgicas para la obtencin de semilla de
alta calidad fitosanitaria. Teniendo en cuenta lo antes
expuesto se desarroll este trabajo en la Divisin de
Biotecnologa, Fisiologa y Resistencia del Instituto
de Investigaciones Hortcolas Liliana Dimitrova de
Cuba, con el objetivo de informar algunos de los resulta-
dos alcanzados en Cuba y en el mundo relacionados con
la tecnologa del cultivo, los pincipales virus que lo afec-
tan y la importancia del empleo de tcnicas de cultivo
de tejidos como tcnica auxiliar al mejoramiento gen-
tico para aumentar los rendimientos y calidad de la se-
milla que se obtenga por esta va.
Introduccin
El ajo (Allium sativum L.), figura entre las plantas
que ms antiguamente se consume por el hombre con
fines culinarios o medicinales (Kotlinska et al., 1990;
Koch, 1993; Cabrera y Elliot, 1996). En el mundo se cul-
tivan 813 000 ha. con una produccin de 7.9 millones
de toneladas y un rendimiento de 9.7 t/ha. (FAO, 1995).
Esta especie es de gran importancia econmica para
nuestro pas, ya que su demanda por la poblacin cre-
ce cada da ms; sin embargo, debido a las dificultades
que se confrontan con su cultivo se realizan numero-
sos esfuerzos para obtener nuevos genotipos mejores
adaptados a nuestras condiciones climticas y que ga-
ranticen rendimientos superiores a las 2 t/ha. (Savn y
Marrero, 1997).
El mejoramiento gentico por mtodos tradiciona-
les es muy difcil, ya que es una especie de reproduc-
cin asexual y estricta apomixia, por lo que la nica
va de propagacin es mediante los bulbillos o dien-
tes que se forman anualmente en el bulbo (FAO,
1991); cada ao se siembran dientes provenientes de
bulbos cosechados el ao anterior para obtener nue-
vas cosechas. En estas condiciones las enfermedades
se transmiten ms fcilmente a la descendencia, lo que
provoca un debilitamiento progresivo e irreversible de
las variedades. Son varios los problemas fitosanitarios
involucrados capaces de causar prdidas del 50 % o
ms del rendimiento, ya sea por la presencia de ne-
mtodos, enfermedades fungosas y bacterianas, as
como virales, que son las que ms influyen en el de-
terioro del cultivo (Abiko et al., 1980; Messiaen, 1993),
siendo el virus del enanismo amarillo de la cebolla
(OYDV), el virus del estriado amarillo del puerro
(LYSV) y el virus latente del chalote (SLV) los ms fre-
cuentes y el primero el ms difcil de erradicar (Pea-
Iglesias y Ayuso, 1983; Hernndez et al., 1995). Es aqu
donde el empleo de las tcnicas biotecnolgicas co-
bran su real dimensin.
La Biotecnologa Vegetal es una rama de la Biolo-
ga que se est expandiendo rpidamente porque es
producto de varias disciplinas que, hasta hace relati-
vamente poco tiempo, se consideraban independien-
tes: la Biologa Molecular, el cultivo de tejidos, la
Ingeniera Gentica y la Patologa Vegetal; abarca una
serie de tcnicas, entre las que se encuentra el culti-
vo de clulas y tejidos in vitro, que se ha convertido
en una valiosa herramienta en el mejoramiento gen-
tico de especies de importancia econmica (Lindsey,
1992; J imnez, 1998 b).
De gran importancia para el ajo, es el desarrollo y la
aplicacin de la biotecnologa, que permite establecer
un programa de saneamiento, que tiene como objetivo
la obtencin de plantas libres de patgenos y la poste-
rior propagacin in vitro de las mismas para aumentar el
nmero de individuos a partir de un explante inicial.
La micropropagacin de plantas es sin dudas la ms
popular de las aplicaciones del cultivo in vitro, sus ba-
ses se establecieron desde los aos 50 y 60, pero no
fue hasta la dcada del 70, en que se estableci una
verdadera industria (Kitto, 1997). Esta tcnica, ha tras-
cendido de forma exitosa de los experimentos a nivel
de laboratorio a la aplicacin prctica, es muy valiosa
en plantas con una produccin pobre de propgulos,
as como una propagacin vegetativa insuficiente (J i-
mnez, 1998 b; Orellana, 1998 b).
Obtencin de semilla de ajo
mejorada mediante el empleo de tcnicas biotecnolgicas
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Notas
Para el desarrollo exitoso de esta tcnica se debe
ser muy estricto en el cumplimiento de cada fase,
desde la preparacin del explante hasta la aclimatiza-
cin de las vitroplantas (Agramonte et al., 1998; Orella-
na, 1998 b).
Los mtodos biotecnolgicos han sido aplicados al
ajo en diferentes pases, con el objetivo de obtener y
caracterizar genotipos mejorados y de proveer una tc-
nica de propagacin vegetativa que facilite el mante-
nimiento de materiales de inters (Conci y Nome,
1991; Luciani et al., 1998 a). Sin embargo, los resulta-
dos que se han alcanzado no siempre son extrapola-
bles, lo que puede deberse a diferencias en cuanto a
las caractersticas genticas y fisiolgicas de los clones
o variedades que se cultivan y a su adaptacin a otras
condiciones ecolgicas.
El ajo, aunque es una planta anual, presenta la li-
mitante de que slo se reproduce de forma asexual,
por lo que la aplicacin de estas tcnicas sera de gran
importancia para su cultivo en Cuba, ya que est muy
reducido o no se cuenta con clones o variedades de
alta calidad biolgica para iniciar su propagacin in vi-
tro y la posterior adaptacin de los microbulbillos que
se obtienen en el laboratorio, que constituyen la se-
milla prebsica.
Debido a la alta demanda que tiene el ajo por la
poblacin, es necesario profundizar en las investigacio-
nes que se han realizado y para ello se ha desarrollado
el siguiente trabajo con el objetivo de informar algu-
nos resultados obtenidos en este cultivo en Cuba y el
mundo relacionados con su tecnologa de cultivo, los
virus que lo afectan y con mayor profundidad la impor-
tancia del empleo de tcnicas biotecnolgicas para au-
mentar el rendimiento y la calidad de la semilla.
El cultivo del ajo
Origen y distribucin
El ajo, fue domesticado por el hombre para ser usa-
do primero como condimento y luego como planta
medicinal. Su centro de origen es Asia Central (Kaza-
jastn, Uzbekistn y Turmenistn) y se ha encontrado
silvestre en las montaas Altaicas de Siberia y en la parte
sur del macizo de los Urales, cerca de donde se une el
Volga con el Mar Caspio, de donde se expandi hacia
Egipto y China (McCollum, 1976; Cabrera y Elliot, 1996).
Se introdujo en Amrica por los conquistadores espa-
oles probablemente a travs de Mxico, desde don-
de fue diseminado hasta Chile por el Sur y posterior-
mente fue introducido en el hemisferio Norte, donde
constituye en la actualidad un cultivo de importancia
econmica (FAO, 1988).
El nombre romano del ajo es Allium y sativum pro-
viene del latn y quiere decir cultivado (Cabrera y Elliot,
1996). Es una especie que depende de las condiciones
termofotoinductoras y se encuentra distribuida desde
el Ecuador hasta los 40
0
LS y desde el nivel del mar has-
ta los 3 700 m.s.n.m., lo que demuestra su amplia capa-
cidad de adaptacin (Burba, 1992).
Taxonoma y relaciones filogenticas
Allium, es un gnero muy diverso de la familia Allia-
cea, entre las especies ms populares y domesticadas
estn la cebolla (Allium cepa), el chalote (Allium asca-
lonium), el puerro (Allium porrum) y el ajo (Allium sa-
tivum), todos con x=8 cromosomas (Traub, 1968).
No se conocen formas silvestres, sino slo cultiva-
das, siendo Allium longicuspis su probable ancestro. La
domesticacin del ajo desarroll un camino diferente
al de la cebolla y el puerro, que poseen grandes canti-
dades de semillas para su propagacin; ste, en cam-
bio se propaga exclusivamente por bulbillos o dientes
(Koul y Gohil, 1970). Algunos genotipos forman flores
entremezcladas con bulbillos, pero nunca producen se-
millas viables, aunque Etoh (1983), reporta la germina-
cin de semillas provenientes de la floracin in vitro
de algunos materiales.
Esta hortaliza presenta una interesante variabili-
dad en materiales cultivados en el mundo, diferen-
cindose en madurez, dormancia, requerimientos de
fro, tamao del bulbo y nmero de bulbillos, color
de la hoja protectora, facilidad de emitir vara floral,
entre otras (Burba y Blanco, 1986). No se conoce
cunta variabilidad fue seleccionada cuando Allium
sativum o su ancestro todava se multiplicaba sexual-
mente o cunto ha surgido por mutaciones en las
yemas luego de que se convirtiera en una planta ex-
clusivamente agmica y estril. El presunto ances-
tro, Allium longicuspi, es tambin de reproduccin
asexual y no tiene semillas viables.
Principales caractersticas botnicas
El ajo es una planta anual de reproduccin vegeta-
tiva, que al finalizar su ciclo de vida muere, quedando
con vida las yemas que se forman en los dientes, me-
diante las cuales realiza su reproduccin. Su sistema ra-
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Notas
dical es de tipo barba, muy parecido al de la cebolla;
las races son adventicias y crecen del tallo verdade-
ro, alcanzan una profundidad de 5-45 cm (Cuba. MI-
NAG, 1983).
El tallo es compuesto, presenta tnicas exterio-
res e interiores, disco o plato, tallo verdadero de la
planta madre y dientes. El tallo verdadero es muy cor-
to, se encuentra en la base de la planta y muere to-
talmente al final del ciclo vegetativo. Las hojas se
forman despus de terminado el estado de reposo
de los dientes y constan de limbo y vaina en forma
de canal (Cuba. MINAG, 1983).
El bulbo es el rgano donde se acumulan las sus-
tancias nutritivas; las tnicas externas envuelven el
bulbo entero y las internas a los dientes, estos lti-
mos se componen de: tnica apergaminada, tnica
carnosa, yema y tallo verdadero. Los dientes en el
bulbo pueden ser simples o compuestos; los simples
tienen una sola yema y los compuestos dos o ms y
su nmero en el bulbo o cabeza depende de la va-
riedad, en el ajo Criollo oscila entre 15-30, pero el
Vietnamita slo tiene ocho o nueve. El proceso de
acumulacin de sustancias nutritivas se intensifica
despus que cesa la formacin de las yemas y el cre-
cimiento intenso de las hojas (Cuba. MINAG, 1983;
Giaconi, 1993).
Requerimientos del cultivo
Este cultivo requiere clima fresco a fro durante
el desarrollo inicial y caluroso y luminoso desde que
comienza a formarse el bulbo hasta la cosecha. Cuan-
do la planta no ha estado sujeta a bajas temperatu-
ras, esto puede traducirse en que el bulbo no se
forme, aun cuando los das sean largos; con tempe-
raturas medias diarias muy prximas o por debajo de
los 21C durante 40 das se obtienen los mejores ren-
dimientos, pero cuando el descenso de las mismas
ocurre durante los primeros 30 das de la plantacin
o 70 das despus de la siembra los rendimientos dis-
minuyen considerablemente (Cuba. MINAG, 1983;
Savn et al., 1987; Giaconi, 1993).
Las mejores fechas de plantacin estn entre el
21 de octubre y el 21 de noviembre; requiere para su
cultivo suelos profundos y frtiles, de consistencia
media, permeables, con una proporcin equilibrada
de Nitrgeno (N), Fsforo (P) y Potasio (K). Los rie-
gos tienen gran importancia, ya que interactan con
otros factores, tales como los bioclimticos y la ferti-
lizacin, por lo que para lograr un crecimiento satisfac-
torio y una produccin aceptable es conveniente man-
tener el suelo prcticamente a capacidad de campo
durante todo el perodo (Savn et al., 1987; Len, 1991;
Giaconi, 1993).
La madurez se conoce por el cambio de color de
las hojas y el falso tallo, existiendo diversos criterios,
ya sea la presencia de slo dos o tres hojas nuevas ver-
des, o la flexin de la planta para realizar la cosecha
del cultivo. Cuando se trata de ajo para semilla, y siem-
pre que las condiciones lo permitan, la cosecha debe-
r efectuarse a madurez plena, es decir, cuando la
planta no slo se pone amarilla sino que se seca, ga-
rantizando el traslado de todos los productos de snte-
sis al bulbo (Burba, 1992; Giaconi, 1993). El curado es
la etapa posterior, que consiste en someter a los bul-
bos a temperaturas entre 25-30C de cuatro a siete das
al sol y humedad relativa entre 60-70 % (Burba, 1992;
Engeland, 1996). Posteriormente los bulbos se alma-
cenan en lugares ventilados y en mazos (Cuba. MINAG,
1983). Salgado et al. (1997), encontraron una disminu-
cin de las prdidas postcosecha en el ajo Hov-1 al
aplicar Biobras-6.
Los rendimientos en este cultivo varan de acuerdo
a la variedad, densidad de poblacin y condiciones de
cultivo, en nuestro pas no superan las 3 t/ha (Cuba. MI-
NAG, 1983) mientras que en California exceden las 20
toneladas, llegando a 22-24 t/ha. (Giaconi, 1993).
Importancia socioeconmica
El ajo se ha cultivado desde los tiempos prehist-
ricos y se ha extendido por todo el mundo, es un cul-
tivo ampliamente utilizado como ingrediente
fundamental en diversos alimentos, tambin fue po-
pularizado como planta medicinal, recomendada y
empleada contra distintas enfermedades, ya que se ha
demostrado cientficamente la accin bactericida de
sus sustancias fitocidas presentes en sus aceites esen-
ciales, los cuales matan o detienen el desarrollo de
bacterias tuberculosas, tficas, disentricas, diftricas,
colricas y muchas otras. Se usa como tratamiento pre-
ventivo contra la arterioesclerosis, catarro, asma, tuber-
culosis, trastornos del sistema digestivo, adems
previene los cogulos y disuelve el colesterol, es muy
beneficioso para los varicoseles y las hemorroides.
(Cuba. MINAG, 1983; Pai y Platt, 1995; Fellner et al.,
1996; Cabrera y Elliot, 1996).
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Notas
Las reas destinadas a la produccin mundial as-
cienden a 1 075 000 ha con un rendimiento promedio
de 11.07 t/ha. (Tabla 1).
TABLA 1. PRODUCCIN MUNDIAL DEL AJO
Como se puede observar en la tabla anterior, el con-
tinente asitico es el de mayor produccin, donde es
muy comn se sequen los dientes al sol y se almace-
nen en sobres de nylon, el sabor no es tan fuerte como
el del ajo normal, pero es otra forma de conservarlo y
consumirlo; en Chile tiene una alta demanda y consti-
tuye un producto de exportacin, se deshidrata para
obtener ajo en polvo y se elaboran extractos con dife-
rentes propsitos (Giaconi, 1993; Cabrera y Elliot, 1996;
FAO, 1999).
En Cuba, esta especie fue introducida desde prin-
cipios del siglo pasado, se encuentra en algunas locali-
dades de La Habana y en la actual provincia de Sancti
Spritus, cultivndose en todo el pas, aos ms tarde;
junto a la cebolla y el aj son los condimentos indispen-
sables en casi todas las recetas (Savn y Marrero, 1997).
Gmez et al. (1991) y Gmez y Savn (1992), eva-
luaron la variabilidad gentica existente en materiales
provenientes de zonas productoras de ajo de la provin-
cia La Habana, con el fin de aprovechar dicha variabili-
dad en posteriores programas de mejoramiento. El clon
Vietnamita, introducido en Cuba en la dcada del 80
tambin ha sido estudiado y algunas de sus caracters-
ticas son: bulbos de forma irregular con pocos dientes
y ciclo de vida ms corto que el de las variedades y
clones Criollo (Marrero y Savn, 1997; Fernndez, 1999;
Figueredo et al., 1999).
A partir de los resultados que se obtuvieron se re-
comend continuar trabajando con los clones 6; 3 y 9
junto con los clones Martnez (4) y Vietnamita (Anexo
1) para someterlos a saneamiento in vitro mediante cul-
tivo de meristemos, ya que estaban infectados al me-
nos con OYDV y en el pas no haba en ese momento
material libre de virus para iniciar un programa de ob-
tencin de semilla mediante tcnicas biotecnolgicas
(Gmez y Savn, 1992).
El ajo, es rico en sustancias nutritivas, las plantas
verdes contienen: 7.5-10 % de slidos; 1-2.5 % de az-
cares; 1.6-2.1 % de protenas crudas; 1.4-2.2 % de celu-
losa; 0.7-0.8 de cenizas y 22-23 mg % de vitamina C.
Los bulbos maduros contienen: 36-40 % de slidos; 1.5-
1.8 % de cenizas; 15.6-20.5 mg % de vitamina C y 0.06-
0.19 % de aceites esenciales. De la cantidad de aceites
esenciales depende el gusto picante y su accin bac-
tericida (Cuba. MINAG, 1983). Segn Rodrguez et al.
(1998), la mayor acumulacin de materia seca tiene
lugar en los bulbillos o dientes, seguida por las hojas y
Gimnez et al. (1998), informan que la materia seca
en el genotipo de ajo Colorado proveniente de la zona
centro-norte de Mendoza (Argentina) oscil entre
36.32-37.54 % para las diferentes fechas de observa-
cin y entre 35.46-37.65 % para las condiciones de con-
servacin que se ensayaron.
Problemtica del cultivo
Las principales dificultades que presenta esta espe-
cie son: su reproduccin asexual; la afectacin de dife-
rentes plagas y enfermedades que provocan grandes
prdidas en su rendimiento; y la imposibilidad de for-
mar hbridos sexuales con especies afines (Burba, 1992;
Van der Valk et al., 1992; Giaconi, 1993). Por lo que el
nico mtodo disponible es la seleccin y posterior
multiplicacin de los genotipos con caracteres distinti-
vos (Burba, 1992; Prez, 1998).
Entre las plagas y enfermedades que ms afectan
el cultivo se encuentran el nemtodo Ditylenchus dip-
saci y los hongos Penicillium corymbiferum, Alternaria
porri y Sclerotium cepivorum y los virus que pueden
provocar prdidas econmicas en el rendimiento del
50 %, esto se debe a que la contaminacin atribuida
antiguamente a un solo virus, se produce por lo gene-
ral por un complejo viral compuesto por lo menos por
dos o ms carlavirus y potyvirus, entre los que se en-
cuentran: virus del mosaico del ajo (GMV), virus laten-
te del ajo (GLV), virus del estriado amarillo del ajo
(GYSV), virus latente del clavel (CLV), virus latente del
chalote (SLV), virus del estriado amarillo del puerro
(LYSV) y virus del enanismo amarillo de la cebolla
(OYDV). Este ltimo es el ms difcil de erradicar (Cuba.
MINAG, 1983; Conci et al., 1987; Van Dijk et al., 1991;
Burba, 1992; Engeland, 1996).
Las variedades no reaccionan frente al saneamien-
to y posterior propagacin in vitro de la misma mane-
Continente Area
(1 000 ha.)
Rendimiento
(t/ha.)
Produccin
(1 000 t)
Africa 21 12.3 261
Asia 866 11.9 10 343
Europa 80 5.7 462
Norte y Centroamrica 26 12.7 329
Sur Amrica 35 6.7 235
Mundo 1 075 11.07 11 905
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Notas
ra, pudiendo existir casos en que el material libre de
virus no supera al enfermo crnico, situacin sta que
podra explicarse por la tolerancia natural del genoti-
po (Walkey y Antill, 1989; Gmez,1992; Hernndez et
al., 1994).
Otro inconveniente en la adaptacin de las vitroplan-
tas provenientes del cultivo in vitro es la aparicin de
enfermedades. Herrera et al. (1994), informan que el
damping-off o marchitez de las posturas, es una enfer-
medad que aparece en las plntulas de ajo expuestas
a riego excesivo, a baja luminosidad y temperaturas. Una
vez que estn dadas estas condiciones se presentan los
hongos fitopatgenos Rhizoctonia solani y Phythium
spp., la presencia del primero origina lesiones necrti-
cas a nivel de la base del tallo, estrangulamiento, seca-
do y muerte de la planta; y el segundo provoca una
pudricin acuosa de color negruzca que abarca desde
la base del tallo hasta las hojas, y causa igualmente la
muerte de la planta.
Cultivo de tejidos
Antecedentes
Aun cuando es difcil determinar un punto de par-
tida en el origen del cultivo de tejidos, importantes an-
tecedentes se remontan a los aos 1838 y 1839, en que
los bilogos alemanes Shleiden y Schwann, dejaban
implcitamente el concepto de totipotencia de las c-
lulas, a travs de la Teora Celular, la cual explicaba la
complejidad de los organismos celulares sugiriendo que
cada clula es una unidad independiente capaz de for-
mar un organismo completo si se le pone en condicio-
nes favorables (Krikorian y Berqueam, 1969 citados por
Smith, 1992). Sachs en 1860 y Knops en 1861 citados
por Litz y J arret (1991) descubrieron que las sustancias
ms importantes que absorban las plantas eran los
compuestos orgnicos. El resultado de estas observa-
ciones fue la elaboracin de una sustancia nutritiva (so-
lucin Knops) que se emplea actualmente y que
histricamente se us como componente bsico de los
medios de cultivo.
Haberland, asimil todos esos conceptos existentes
en aquel momento y en 1902 discuti la posibilidad de
demostrar que todas las clulas vegetales tienen la ca-
pacidad para formar plantas completas, es decir, que
tienen totipotencialidad (Pierik, 1990). Esta hiptesis no
pudo ser demostrada hasta que White en 1934 citado
por Villalobos (1990), comprob que era factible culti-
var con xito rganos vegetales, y utiliz para ello ra-
ces de tomate (Lycopersicon esculentum) y Nobercourt
en 1939 citado por Villalobos (1990), obtuvo races ad-
venticias de un callo de zanahoria (Daucus carota). Es-
tos experimentos respaldaron indirectamente la teora
de la totipotencialidad celular.
Otros acontecimientos importantes fueron: el culti-
vo de pices de dalia infectados con algn virus y la
obtencin de plantas sanas por Morel y Martn en 1952
citados por Navarro (1991); en 1958 y 1959, Steward
y Reinert, respectivamente (citados por Christianson y
Warnick, 1988), informaron la Embriognesis Somtica
en la zanahoria; la hibridacin interespecfica median-
te la fusin de protoplastos entre dos especies de Ni-
cotiana y la regeneracin de hbridos (Carlson et al.,
1972) y ms recientemente se han empleado tcnicas
de transformacin gentica de plantas, que han provo-
cado un salto considerable en las dos ltimas dcadas,
dado por la unin de los adelantos en la biologa mole-
cular y el cultivo in vitro, en la actualidad se ha demos-
trado la posibilidad de transformar clulas intactas
mediante electroporacin en caa de azcar y caf
(Arencibia et al., 1995 y Barbn, 1997).
Aplicaciones
El concepto original de cultivo de tejidos vegeta-
les se ha extendido, abarcando adems, el cultivo
asptico de clulas y rganos, por lo tanto, el trmino
cultivo de tejidos in vitro comprende un heterogneo
grupo de tcnicas mediante las cuales un explante se
cultiva aspticamente en un medio qumicamente de-
finido y bajo condiciones ambientales controladas (J i-
mnez, 1998 a).
Constituye dentro de la biotecnologa, la tcnica que
mayor aporte prctico ha brindado. Sus aplicaciones se-
gn diferentes autores (Pierik, 1990; Misawa, 1994; Va-
sil, 1994; Kitto, 1997; J imnez, 1998 a) son:
1.- Saneamiento y micropropagacin de plantas con in-
ters econmico y comercial.
2.- Mejoramiento gentico.
3.- Conservacin e intercambio de germoplasma.
4.- Obtencin de haploides y lneas isognicas
5.- Produccin de metabolitos secundarios.
6.- Crioconservacin
7.- Cultivo de clulas y protoplastos
8.- Semilla artificial.
9.- Ingeniera gentica.
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Notas
Es preciso sealar que el cultivo in vitro no es tan
simple como a veces se expresa, como gran sistema
en el que interactan varios procesos; cometer errores
o subestimar a cualquiera de ellos conlleva al fracaso
del objetivo propuesto.
Factores a tener en cuenta
para la micropropagacin
Para cultivar clulas, tejidos u rganos in vitro, se si-
guen una serie de principios bsicos que no se pueden
violar (J imnez, 1998 b), estos son:
Seleccin del explante:
Prcticamente se puede utilizar cualquier porcin o
parte de la planta; para iniciar los trabajos de cultivo in
vitro en primera instancia dicha seleccin est deter-
minada por el objetivo perseguido y la especie vegetal
que se trate. Generalmente, se emplean plantas sanas
y vigorosas y dentro de stas, las zonas que se encuen-
tran en activa divisin, como los meristemos. Las plan-
tas jvenes son las que aportan los explantes ms
reactivos, ya que la potencialidad disminuye con la edad
y el tamao del explante, es otro aspecto que se debe
tener en cuenta, pues la dificultad para iniciar un culti-
vo aumenta con su disminucin (Mroginski, 1991).
Desinfeccin:
La contaminacin por microorganismos provoca
cuantiosas prdidas en la propagacin masiva de plan-
tas y hace ineficientes econmicamente muchos pro-
cesos. Existen formas para controlar la contaminacin,
pero es necesario conocer los microorganismos y las
fuentes que lo introducen (Alvarado et al., 1998 a y b).
Diversos compuestos qumicos se utilizan para
desinfectar superficialmente los explantes, se emplean
con mayor frecuencia el etanol (70 % v/v) y el hipoclo-
rito de sodio (1-3 %) y con menor frecuencia se utili-
zan el hipoclorito de calcio (6-12 %) y el bicloruro de
mercurio (0.1-1.25 %), aunque con este compuesto por
lo general se obtienen mejores resultados, es altamen-
te txico y no se remueve con facilidad del explante.
Conjuntamente con los desinfectantes se pueden aa-
dir algunas gotas de Tween 20 para reducir la tensin
superficial y eliminar las burbujas que se forman en
la superficie y cavidades del explante (Margara, 1988;
J imnez, 1998 b). No obstante, las concentraciones del
agente esterilizante y la duracin se deben escoger en
funcin de minimizar los daos para los explantes, y se
debe tener en cuenta la especie vegetal y tipo de ex-
plante, ya que no existe un procedimiento nico (Mar-
gara, 1988; Roca, 1991; Mroginski, 1991). Despus de apli-
car los desinfectantes, los explantes se deben enjuagar
varias veces con agua destilada estril (Gonzlez y San-
tana, 1988; Capote, 1993; Quintana, 1995).
Segn Serrano (1993), una vez desinfectado el ma-
terial vegetal que se va a utilizar como fuente de ex-
plante, resulta muy importante evaluar su crecimiento
posterior, ya que los vapores del cloro pueden afectar
las capas celulares externas y necrosarlas porque pe-
netran profundamente y, aunque por lo general, se ob-
tiene una buena desinfeccin, tambin pueden afectar
los tejidos internos y darse el caso que el tratamiento
utilizado para la desinfeccin del explante sea efecti-
vo, pero afecte el crecimiento del explante.
Medios de cultivo:
El medio de cultivo sinttico le debe propiciar al ex-
plante (clulas, tejidos u rganos) los requerimientos
nutricionales esenciales en proporcin y dosis espec-
ficas (Smith, 1992). Su efectividad depende tanto de los
ingredientes bsicos, como del pH del medio y del
agente solidificante (Margara, 1988).
Para el cultivo de meristemos y pices no existe
un medio universal, sin embargo el medio MS basal
propuesto por Murashige y Skoog (1962), con algunas
modificaciones en sus ingredientes ha sido el ms fre-
cuentemente utilizado en la mayora de las especies
propagadas in vitro. Tambin se han empleado pero
con menor frecuencia el Wh (White, 1943), B
5
(Gam-
borg et al., 1968), BDS (Dunstan y Short, 1977) citados
por Mroginski (1991), J imnez (1998 b) y Luciani et al.
(1998 a y b).
Los reguladores del crecimiento en pequeas can-
tidades aumentan, inhiben o modifican de una u otra
forma cualquier proceso fisiolgico del vegetal (Prez,
1994). Un balance apropiado entre auxinas y citoquini-
nas es necesario para la formacin de plantas a partir
de meristemos, pices o yemas. Este balance est de-
terminado por las concentraciones endgenas de auxi-
nas y citoquininas presentes en el explante, las cuales
dependen de la especie y del tipo de explante. Se con-
sidera que si la relacin auxina/citoquinina en el me-
dio de cultivo es favorable a la segunda, se favorece la
formacin de brotes y lo contrario promueve el enrai-
zamiento y la callognesis (Smith, 1992; Dixon, 1994; J i-
mnez, 1998 b).
Usualmente en los meristemos y pices la citoqui-
nina endgena es baja debido a que el principal sitio
45 TEMAS | septiembre - diciembre 2001
Notas
de sntesis son las races, por lo que la adicin exge-
na de citoquininas en los medios de establecimiento
es generalizada, se utilizan en el medio de cultivo a
concentraciones que oscilan entre 0.03-30 mg/L y se ha
demostrado su efecto en el crecimiento y morfogne-
sis in vitro (Mroginski, 1991; Dixon, 1994).
Al contrario sucede con las auxinas, ya que las zo-
nas de crecimiento activo, los pices y meristemos que
se emplean como material inicial para el cultivo in vi-
tro, son los lugares de sntesis, se adicionan al medio
de cultivo a concentraciones que oscilan entre 0.001-
10 mg/L (Krikorian, 1991; J imnez, 1998 b).
Tambin se han empleado en los medios de culti-
vo las giberelinas (GA
3
), cido abscsico, etileno (Mro-
ginski, 1991; Smith, 1992; Cevallos, 1998), y con mayor
frecuencia los brasinoesteroides y oligosacarinas, que
ejercen una accin similar o superior a los reguladores
del crecimiento tradicionales, y adems, tienen la ven-
taja que se adicionan en los medios de cultivo en bajas
concentraciones (Nez, 1996; Rodrguez et al., 1996;
Fujioka y Sakurai, 1997; Cabrera et al., 1998).
Condiciones ambientales de incubacin:
Este requisito se debe cumplir rigurosamente para
el xito en el establecimiento de los cultivos in vitro.
Para ello es conveniente que los explantes se incuben
en ambientes controlados de luz (1 000-5 000 lux) y
temperatura (20-28C), as como de humedad relativa
(70-80 %) acordes con los objetivos de trabajo. Estos
efectos influyen prcticamente en todos los tipos de
procesos: absorcin de agua, evaporacin, fotosnte-
sis, respiracin, crecimiento, floracin, cuajado del fru-
to, entre otros (Pierik, 1990; Roca, 1991). No obstante,
se debe tener en cuenta que cada cultivo tiene sus
propias especificidades.
Propagacin in vitro
El trmino de micropropagacin segn Krikorian
(1991), se utiliz por primera vez en 1968 por Hartmann
y Kester, y se defini como cualquier procedimiento
asptico que comprenda la manipulacin de plantas,
rganos, tejidos o clulas que produzcan un mayor n-
mero de plntulas fenotpica y genotpicamente idn-
ticas a la planta original.
Segn Mroginski (1991) y Kitto (1997), entre las ven-
tajas ms importantes de este mtodo de propagacin
cuando se compara con los convencionales estn:
1.- Altos coeficientes de multiplicacin que permiten
manipular volmenes elevados de plantas en cor-
tos perodos de tiempo.
2.- Rpida introduccin de nuevas variedades o clones.
3.- Reduccin del tiempo de multiplicacin.
4.- Produccin independiente de las condiciones am-
bientales.
5.- Incremento en los rendimientos debido al rejuve-
necimiento y saneamiento.
6.- Uniformidad en las plantaciones producidas.
7.- Mejor facilidad para la comercializacin.
Todo lo anterior est ntimamente relacionado con
procesos de morfognesis, que no es ms que el re-
sultado de una organizada divisin y diferenciacin ce-
lular con patrones definidos, que depende bsicamente
de la actividad y expresin de algunos genes. Este pro-
ceso est ntimamente relacionado con mltiples fac-
tores que son imposibles de definir aisladamente, ya
que varan en dependencia de los tipos celulares, teji-
dos, especies y variedades. Adems, actan directa e
indirectamente a nivel gentico, desencadenando pro-
cesos de sntesis especficos como consecuencia de
cambios metablicos y bioqumicos (DAmato, 1990;
Novak, 1990 b).
Segn Murashige (1974; 1977), la embriognesis so-
mtica, los brotes adventicios y axilares, son tres pro-
cesos morfogenticos por los cuales puede ocurrir la
multiplicacin clonal in vitro.
A travs de la embriognesis somtica, ms de 140
especies vegetales han mostrado su capacidad regene-
rativa, entre las que se encuentran los ctricos, caf,
yuca, gramneas y solanceas (Santana et al., 1988; Lo-
zoya, 1990 a; Luckse et al., 1997; Medero et al., 1997).
Es la tcnica ms rpida terica y potencialmente para
el clonaje in vitro de plantas; sin embargo, sus desven-
tajas radican en el desconocimiento que existe sobre
los parmetros que regulan este proceso y todava en
algunas especies se presentan caractersticas diferen-
tes a las de sus progenitores (Gmez, 1998).
La organognesis es un evento morfogentico, ha
sido la base fundamental de la multiplicacin vegetativa,
dentro de ella pueden diferenciarse dos vas: la forma-
cin de yemas adventicias y axilares (J imnez, 1998 a).
Mediante los brotes adventicios se puede obtener
un elevado nmero de plantas a travs de la forma-
cin de tejido meristemtico y su posterior diferen-
TEMAS | septiembre - diciembre 2001 46
Notas
ciacin en pices, que surgen a partir de rganos o ca-
llos, y dan lugar con cierta frecuencia a plantas con va-
riaciones genticas, lo que constituye una dificultad
por la inestabilidad de la descendencia obtenida. Es
posible producir un mayor nmero de plantas por uni-
dad de tiempo en comparacin con el mtodo de ye-
mas axilares. En la literatura se hace referencia a la
micropropagacin por brotes adventicios en zanaho-
ria, papa, cebolla, ajo, clavel y lechuga (Smith y Street,
1974; Roest y Bokelbann, 1976; Villalobos, 1991; Ca-
pote, 1993; Izquierdo et al., 1995).
Los brotes axilares surgen del pice del tallo y las
yemas laterales; los sucesivos subcultivos traen consi-
go un incremento de la proliferacin de brotes. Ade-
ms, por esta va se reducen las anormalidades o
variaciones en el genotipo de las plntulas micropro-
pagadas. La eficiencia de este sistema est dada en que
el nmero de plantas que se obtienen est determina-
do por el nmero de yemas axilares pre-existentes en
el inculo, las cuales se estiman por las condiciones in
vitro, por lo que se forma una plntula por cada yema.
Esta forma de propagacin se aplica en col, tomate, le-
chuga, banano, pepino, calabaza y melisa (Kartha et al.,
1976; Koevary et al., 1978; Handley y Chambliss, 1979;
Villalobos, 1991; Daz et al., 1995; Takayama y Akita, 1996;
Tavares et al., 1996).
La propagacin masiva de plantas ser til siem-
pre que se cuente con un material de partida de alta
calidad biolgica, es decir, libre de virus que se haya
obtenido por una o la combinacin de varias tcnicas
biotecnolgicas, tales como: cultivo de meristemo
slo o combinado con la termoterapia, quimioterapia
o electroterapia y el diagnstico posterior mediante
antisueros especficos para comprobar la sanidad del
material que se vaya a propagar posteriormente (No-
vak, 1990 a; Cionci, 1991; Conci y Nome, 1991; Vishni-
chenko et al., 1993; Prez et al., 1995; Bernal, 1997;
Hernndez et al., 1997).
Etapas de la micropropagacin clonal
Muchas cosas han cambiado desde que Murashige
(1974), propuso las tres fases para la micropropagacin
de plantas. Debido a la informacin acumulada, la ma-
yora de los investigadores y micropropagadores de plan-
tas estn de acuerdo en que realmente se pueden
diferenciar cinco fases para lograr una exitosa multipli-
cacin (Orellana, 1998 a).
Fase 0: Preparativa
Segn Deberh y Maene en 1981 citados por Orella-
na (1998 a), es una etapa importante, o casi indispen-
sable, en el desarrollo de un esquema de
micropropagacin, ya que es la fase en que se selec-
ciona la planta donadora de los explantes y se deter-
minan todas las condiciones para el posterior
establecimiento de los mismos.
Fase 1: Establecimiento del cultivo asptico
El propsito general debe ser lograr un cultivo ax-
nico y viable; incluye la seleccin del explante adecua-
do y su desinfeccin, as como su sobrevivencia.
Fase 2: Multiplicacin
Hay un incremento del nmero de brotes por pln-
tulas que darn lugar a la formacin de una planta; aqu
se involucran un nmero determinado de subcultivos
hasta el punto que no exista variabilidad gentica. Para
este fin es necesario establecer el medio de cultivo p-
timo que se ajuste a los principales requerimientos de la
especie vegetal, al tipo de explante, al sistema de culti-
vo, a la relacin auxina/citoquinina presente en el me-
dio de cultivo y los factores ambientales.
Fase 3: Enraizamiento
Los propgulos de algunas variedades necesitan una
etapa de cultivo adicional pues an cuando la sobrevi-
vencia no sea un problema, es necesaria esta etapa para
el enraizamiento individual de los brotes, el incremen-
to de su resistencia al estrs de humedad y enferme-
dades, para el establecimiento de las reservas de
alimentos necesarios en el perodo de transicin y para
el desarrollo de la capacidad autotrfica, debido a que
la apariencia verde de las plantas no es suficiente para
poder realizar la fotosntesis, ya que aunque los pigmen-
tos fotosintetizadores estn presentes, las enzimas es-
tn en ocasiones ausentes o inactivas.
Fase 4: Adaptacin
El mayor obstculo para el establecimiento de las
plntulas que se obtienen por mtodos in vitro es
usualmente la transicin del cultivo asptico a casa de
cristal no estril y condiciones de campo (Novak,
1980), por lo que esta etapa reviste una gran impor-
tancia. En ella se realiza el trasplante de las plntulas
al suelo y su posterior adaptacin al medio ambiente.
Para lograr un alto ndice de sobrevivencia se necesita
que las plantas tengan un sistema radical bien desa-
rrollado y una alta humedad, necesaria para su protec-
cin lo que evita su desecacin en los das posteriores
al trasplante a suelo.
47 TEMAS | septiembre - diciembre 2001
Notas
Empleo de las tcnicas biotecnolgicas
en las aliceas
Los primeros trabajos que se publicaron relaciona-
dos con la obtencin de plantas de ajo libres de virus
mediante el empleo de tcnicas biotecnolgicas fue-
ron los de Wang y Huang en 1974 y Kehr y Schcuffer
en 1976 citados por Walkey et al. (1987).
Bhojwani (1980), evalu el comportamiento in vi-
tro del clon de ajo francs Rose-de-Kakylis previa-
mente saneado a virus. Desinfecta los dientes con
etanol 30 segundos seguido de flameo, aisl los pi-
ces caulinares entre 5-8 mm y los inocul en el medio
basal B
5
suplementados con 0.5 mg/L de 2-iP y 1 mg/L
de ANA, obteniendo 5.8 brotes/explante como prome-
dio en un mes mientras que con 0.5 mg/L de 6-BAP
slo obtuvo entre 2-4 brotes mientras que con el me-
dio MS basal con las mismas concentraciones de ANA
y 2-iP solamente logr 2.6 brotes/explante. Al transfe-
rir las plntulas al medio B
5
con 0.2 mg/L de ANA como
suplemento hormonal logr el 100 % de enraizamien-
to; la adaptacin a campo de las vitroplantas se realiz
en una casa de cristal en potes que contenan como
sustrato pumita:turba (4:1), pero slo poco ms del
50 % logr sobrevivir.
Posteriormente Walkey et al. (1987), obtienen plan-
tas de Allium sativum y Allium ascalonicum libres de
virus por cultivo de meristemos. Los explantes entre
0.5-0.8 mm crecieron mejor en el medio B
5
que en el
MS cuando el mismo se enriqueci con AIA (2.5 mg/L)
y 6-BAP (4-8 mg/L) o KIN (4-8 mg/L) siendo superior
la combinacin AIA y KIN, que form entre 4-5 bro-
tes/explante.
Uno de los primeros informes relacionados con la
microbulbificacin sincronizada in vitro en ajos de sa-
nidad controlada fue realizado por Racca (1989). Este
autor plantea que es posible utilizar como fuente de
explante inicial pices caulinares o meristemos y ob-
tienen una tasa de multiplicacin de 1:8 aproximada-
mente cada 60 das para los clones Rosado Paraguayo
y Blanco cuando se cultivan en un medio MS diluido
a la mitad suplementado con 0.3 ppm de ANA y 3 ppm
de 2-iP, un volumen de medio de 20 cm
3
/explante, un
fotoperodo corto (10 horas luz) y temperaturas frescas
(18C), pero las prdidas fueron superiores al 70 % cuan-
do se transfirieron las plntulas propagadas in vitro di-
rectamente a macetas. Este inconveniente lo solucion
transfiriendo las vitroplantas despus de la fase de mul-
tiplicacin a un medio MS diluido a la mitad sin suple-
mento de auxinas ni citoquininas, un volumen de me-
dio de cultivo de 25 cm
3
/explante, das largos (16 horas
luz) y clidos (22C); a los 90 das obtuvo un 62 % de
bulbificacin con 60 g/L de sacarosa sin cloruro de clo-
rocolina (CCC), que es un retardante y un 61 % con
40 g/L de sacarosa y 500 ppm de CCC. Informa tam-
bin, que los microbulbillos alcanzan una sobreviven-
cia superior al 85 % en campo, siempre y cuando su
tamao sea superior a los 3 mm de dimetro. Poste-
riormente Racca et al. (1989), informan que es ms efi-
ciente la induccin de los microbulbillos in vitro en un
medio MS suplementado con 50 g/L de sacarosa.
La FAO (1991), plantea, que los microbulbillos de
ajo que se obtienen por cultivo in vitro poseen gran va-
riabilidad de tamao, que puede ser definido por su di-
metro transversal o por su peso unitario, existiendo una
alta correlacin exponencial entre ambos parmetros.
Agrega, que los microbulbillos mayores de 4 mm tie-
nen mayor posibilidad de implantarse, crecer y formar
minibulbillos de 10-25 mm de dimetro. Plantea tam-
bin, que la produccin de semilla bsica debe reali-
zarse inicialmente en condiciones protegidas y
posteriormente en zonas aisladas para evitar la reinfec-
cin de los materiales en poco tiempo.
Gmez (1992), informa entre 88-90 % de sobrevi-
vencia cuando los dientes de los clones Criollo se
desinfectaron con Ca(OCl)
2
al 5 % durante 15 minu-
tos y alrededor del 85 % en el Vietnamita y entre
16-53 % de establecimiento in vitro de los meriste-
mos en un medio compuesto por los macroelemen-
tos MS, los microelementos de Heller y las vitaminas
de Morel suplementado con 1 mg/L de 6-BAP; las vi-
troplantas despus de establecidas se transfirieron a
un medio de enraizamiento sin 6-BAP donde se man-
tuvieron de 1-4 meses. La fase de adaptacin se rea-
liz colocando las vitroplantas en potes con materia
orgnica durante 6 meses a la luz natural para obte-
ner la semilla prebsica.
Van der Valk et al. (1992), informa la regeneracin
de plantas a partir de embriones cigticos provenien-
tes del cultivo de callo de diferentes variedades y ac-
cesiones de Allium cepa, Allium fistulosum, Allium
porrum y el hbrido interespecfico Allium fistulosum x
Allium cepa. Los callos embriognicos se indujeron en
el medio MS enriquecido con 5 mM de 2,4-D. En todos
los casos se obtuvo regeneracin de plantas cuando se
transfirieron los callos al medio anterior suplementado
con 5.1 mM de KIN y 1 mM de cido abscsico.
TEMAS | septiembre - diciembre 2001 48
Notas
Fig
Ashalata y Bong (1993), informan que los mejores
resultados en la desinfeccin de yemas florales de
Allium senescens var. Minor es empleando en NaOCl
al 5 y 9 %.
Capote (1993), establece una metodologa para la
micropropagacin in vitro de genotipos cubanos de ce-
bolla, en la que utiliza una doble desinfeccin para las
yemas, despus de lavadas las mismas con agua co-
rriente se sumergieron en etanol (70 %-10) y NaOCl (5
%-20), despus de retirarle las hojas ms externas se
colocaron en NaOCl (5 %-10) y se enjugaron con agua
destilada estril, logrando un 90 % de desinfeccin. Es-
tas yemas se inocularon en un medio MS reducido a la
mitad, que se suplement con 0.5 mg/L de ANA y 4
mg/L de 6-BAP; la induccin de brotes en el primer sub-
cultivo fue de 12.8 y en el segundo de 6.2 para la varie-
dad Caribe-72, diferencindose estadsticamente del
resto de los genotipos; los brotes enraizaron en un me-
dio basal antes expuesto en estado lquido enriqueci-
do con 0.5 mg/L de ANA y la adaptacin a las
condiciones de campo se realizarn mediante siembra
directa en organopnico con 50 % de suelo y 50 % de
materia orgnica y la aplicacin de oniobiostn.
INTA (1993), informa que diferentes lneas de ajo
Colorado presentan un mejor comportamiento in vi-
tro que los Blanco, mientras que en su primera etapa
in vivo los genotipos Blanco se comportan mejor que
los Colorado. Agrega, que los microbulbillos de ms
de 6 mm manifiestan una actitud de brotacin tres ve-
ces mayor para los materiales de tipo Blanco y de has-
ta 14 veces mayor para los Colorado, que los inferiores
a 2 mm.
Ravnikar et al. (1993), estudian la influencia del ci-
do jasmnico (AJ ) en la formacin de brotes y bulbos
por cultivo in vitro en Allium sativum cv. Ptuj. La des-
infeccin la realizaron con etanol 70 % y posteriormen-
te con NaOCl (2.4 %-15) y le agregaron una gotas de
Tween 80 y luego lavaron los dientes con agua destila-
da estril tres veces. Los mejores resultados los alcan-
zaron con el medio B
5
suplementado con 10 mM de AJ
y 5 mM de 2-iP con 18 brotes/explante y un 55.8 % de
bulbificacin in vitro.
Posteriormente Gmez et al. (1993), hacen referen-
cia a la obtencin de diferentes genotipos de ajo libres
de virus mediante cultivo de meristemos, que en con-
diciones de campo alcanzaron un porcentaje de bulbi-
ficacin entre 67-88 % para los clones Criollo y 75 %
para el Vietnamita.
Marrero y Agramonte (1994), informaron la obten-
cin de plantas de ajo a partir de callos cuando em-
plearon explantes directamente del diente e incubados
en la oscuridad y cultivndose en presencia de 1 mg/L
de 2,4-D combinado con 2 mg/L de AIA y KIN de cada
uno. Los callos que se formaron con menores niveles
de 2,4-D dieron lugar a mayor nmero de plantas cuan-
do se cultivaron en ausencia de 2,4-D. Agregan, que a
medida que aumenta el nmero de subcultivos en el
medio de formacin de callos, aumenta el porcentaje
de callos que dan lugar a plantas y stas ltimas alcan-
zaron un 73.6 % de sobrevivencia cuando se sembra-
ron en cajas de poliespuma que contenan 70 % de
suelo y 30 % de casting (humus de lombriz).
Hernndez et al. (1994), utilizan como explantes me-
ristemos y pices caulinares en diferentes clones y va-
riedades de ajo y obtienen entre 29-75 % de
establecimiento de los meristemos en la variedad Crio-
llo y entre 5.2-36.3 % con la Vietnamita mientras que
con los pices alcanzan un 82.9 % (Criollo) y 50 % (Viet-
namita) cuando se inician en un medio basal suplemen-
tado con 0.1 mg/L de ANA y 0.5 mg/L de 2-iP. En relacin
con el coeficiente de multiplicacin, los resultados para
la variedad Criollo fueron de 4.6; 3.3; 2.6; 1.5 y 1 brotes/
explante en cada subcultivo respectivo cuando se indu-
jeron en un medio basal enriquecido con 0.1 mg/L de
ANA y 1 mg/L de 2-iP mientras que el mayor porcentaje
de bulbificacin in vitro fue de 80 % en un medio MS
con 1 m/L de AIA y 50 g/L de sacarosa.
Castillo et al. (1998), cultivaron meristemos in vitro
de diferentes clones de ajo seleccionados, llegando a
obtener rendimientos, en algunos casos 100 % supe-
rior con respecto al material no saneado; la tasa de mul-
tiplicacin oscil entre 3.5-6 brotes /explante en
dependencia del genotipo y no hubo diferencias entre
los medios de cultivo que se evaluaron para la fase de
multiplicacin y de bulbificacin. Las diferentes res-
puestas se debieron al efecto del genotipo.
Curvetto et al. (1998), indujeron la produccin de
brotes mltiples desde las axilas de las hojas de pln-
tulas provenientes de semilla; se extrajeron asptica-
mente los embriones de las semillas de cebolla
variedad Valcatorce INTA, que se cultivaron en el me-
dio BDS suplementado con 30 g/L de sacarosa; los me-
jores resultados se obtuvieron con 1 mg/L de ANA y 10
mg/L de 6-BAP; en el primer subcultivo se obtuvieron
plntulas simples en todos los tratamientos, que pos-
teriormente se dividieron a la mitad para estimular
49 TEMAS | septiembre - diciembre 2001
Notas
g. 4
la brotacin de yemas axilares y adventicias, los dos l-
timos subcultivos se obtuvieron 8.3 vstagos/explante
con un 62% de explantes en multibrotacin (ms de 5
vstagos/explante).
Gidekel y Valladares (1998), desarrollaron un siste-
ma de regeneracin in vitro va organognesis directa
en ajo, los explantes se desinfectaron con etanol al 50
% durante 30 segundos, posteriormente se pasaron a
NaOCl (10 %-15) y despus se colocaron en
captan:benlate (1.5:0.5 g/L) durante 20 minutos. Se di-
sectaron las plantas en forma longitudinal y se seccio-
naron las yemas cada 5 mm desde la base hasta el
pice. Obtuvieron como resultados que el hipoctilo
cuando se utiliz como explante form callo en un 70
% en un medio MS suplementado con 0.5 mg/L de 2,4-
D, 3 mg/L de KIN y 1.5 mg/L de picloran, mientras que
la regeneracin de plantas se obtuvo cuando se trans-
firieron los callos al medio anterior enriquecido con 5-
6 mg/L de 6-BAP con un 60 % de eficiencia.
Lpez y Lara (1998), estudiaron diferentes explan-
tes: semillas, raz y parte basal de bulbos de cebolla en
las variedades Santa Elena (SE), Santa Teresa (ST) y el
genotipo Cojumatln (CO). El medio MS suplementa-
do con 2,4-D y ANA promovi la formacin de callos
no embriognicos, los cuales en presencia de KIN re-
generaron brotes; la mejor respuesta fue observada en
el genotipo ST. Los callos embriognicos se obtuvieron
en presencia de 2,4-D y KIN a los 30 das. El 90 % de los
embriones en condiciones limitadas de nitrgeno, al-
canzaron la etapa bipolar a los 25 das, mientras que los
que se desarrollaron en un medio con nitrgeno, slo
desarrollaron un 20 % de embriones bipolares y el res-
to se mantuvo en etapa globular.
Luciani et al. (1998 a), evaluaron el efecto de la apli-
cacin exgena de cido jasmnico (AJ ) y de diferen-
tes reguladores del crecimiento en la formacin de
brotes y bulbillos de los clones de ajo colorado ESA e
I50. Ellos observaron diferencias entre los clones en la
proporcin de la multiplicacin, as como entre los sub-
cultivos, los reguladores del crecimiento y el AJ . Las
mejores proporciones promedios fueron de 18 y 33 bro-
tes/explante en un medio BDS basal enriquecido con
10 mM de AJ en el tercer subcultivo para los genotipos
I50 y ESA, respectivamente mientras que el porcen-
taje de bulbificacin oscil entre 20-40 % cuando se le
agreg 50 mM de AJ al medio basal, y se obtuvieron
bulbillos entre 10-600 mg. Adems, el AJ ejerci un efec-
to positivo tanto en la formacin de brotes como de
bulbillos y el 2-iP supera la combinacin 6-BAP y ANA
en la proporcin de multiplicacin.
Luciani et al. (1998 b), estudiaron el efecto de la
aplicacin exgena de cido traumtico (AT) en la mi-
cropropagacin de ajo (Allium sativum L. cv. Espaol,
seleccin Mdanos). Los mejores resultados se alcan-
zaron cuando se suplement el medio BDS basal con
1 g/L de Ca
2
(NO
3
)
2
, 7 g/L de agar, 30 g/L de sacarosa,
5 mM de ANA y 10 mM de 6-BAP con 7.2, 12.3 y 7 bro-
tes/explante en los tres subcultivos que se realizaron;
al aumentar la concentracin de AT disminuye la induc-
cin de brotes mltiples y se incrementa la bulbifica-
cin, que oscila entre 26-30 % y el AT interviene en los
mecanismos de estrs y bulbificacin.
Quezada et al. (1998), disectaron meristemos api-
cales, que se cultivaron en los medios MS, B
5
y MS+B
5
,
durante seis semanas, los mejores resultados se obtu-
vieron con el ecotipo Rosado de Italia, que alcanz
una altura promedio de 108.9 mm y 26.5 % de dece-
sos, mientras que el ecotipo Colorado de Mendoza
alcanz un promedio de altura de 83.2 mm y 33.8 %
de decesos, el medio basal en que se desarrollaron
mejor los explantes fue en el MS+B
5
. Durante la eta-
pa de multiplicacin de brotes, el ecotipo Colorado
de Mendoza produjo 3.1 brotes, mientras que el Ro-
sado de Italia slo produjo 1.4 brotes cuando se culti-
varon en el medio MS+B
5
suplementado con 2-iP (1-3
mg/L) y ANA (0.1-0.3 mg/L) o AJ (1-2 mg/L). En la eta-
pa de microbulbificacin, se obtuvieron microbulbillos
de 3-10 mm de dimetro, con pesos que oscilaron en-
tre 0.025-0.555 g, similares a pequeos dientes de un
bulbo de ajo normal en el mismo medio basal citado
anteriormente pero enriquecido con sacarosa (50 g/
L) y AJ (1-2 mg/L).
Izquierdo (2000), estudi los clones Criollo-3, Crio-
llo-6, Criollo-9, Martnez y Vietnamita en cada fase
para la micropropagacin del cultivo y obtuvo como re-
sultados que tanto el hipoclorito de calcio (5 %-20)
como el hipoclorito de sodio (10 %-15, con 5 % de Cl
2
activo) son efectivos en la desinfeccin de los explan-
tes, sobrevivencia y vigor de las plntulas; los explan-
tes se establecen mejor y en menor tiempo en un
medio MS basal suplementado con ANA (0.1 mg/L) +
KIN (0.1 mg/L); se obtienen entre 4.9-7.3 brotes/explan-
tes, en dependencia del subcultivo y del clon en el me-
dio anterior enriquecido con ANA (0.1 mg/L) + 2-iP (4
mg/L); el mayor porcentaje de bulbificacin in vitro se
induce en el medio basal antes citado cuando se le adi-
TEMAS | septiembre - diciembre 2001 50
Notas
cionan 75 g/L de sacarosa y los microbulbillos son su-
periores a las vitroplantas, alcanzan entre 95.35-99.40 %
de sobrevivencia cuando se plantan en cepellones que
contengan un sustrato compuesto por Zeolita (25 %)
+ M.O (75 %). En la fase de campo el nmero de dien-
tes/bulbo, dimetro del bulbo, masa media y anchura
del diente fueron los que ms contribuyeron a la varia-
bilidad. El rendimiento alcanzado por estos genotipos
fue: Criollo-3 (13.28 t/ha), Criollo-6 (13.52 t/ha), Crio-
llo-9 (15.01 t/ha), Martnez (14.00 t/ha) y Vietnamita
(11.43 t/ha) durante la fase de produccin de semilla
bsica de alta calidad biolgica durante el perodo 1997-
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nueva metodologa para la propagacin in vitro de es-
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Humberto Izquierdo Oviedo
y Yovany Quiones Oceguera
Divisin de Biotecnologa, Fisiologa y Resistencia del
Instituto de Investigaciones Hortcolas Liliana Dimitrova.
Facultad de Biologa
de la Universidad de La Habana, Cuba.