Facultad de Ciencias Naturales

Laboratorio de Biología Celular

Alumno: _______________________________________________ Código: ___________

Alumno: _______________________________________________ Código: ___________

Laboratorio 4: Fraccionamiento subcelular e identificación

de organelos a partir de Elodea y Arveja

OBJETIVOS:

1. Familiarizarse con la teoría de la centrifugación diferencial

2. Determinar las condiciones requeridas para separar diferentes organelos de
las células.
3. Emplear técnicas citoquímicas para diferenciar los organelos presentes en
cada una de las 4 fracciones subcelulares obtenidas a partir de células de
Elodea y Arveja.

INTRODUCCIÓN

Para comprender el funcionamiento celular como un

todo, es importante conocer cada componente de la
célula y sus funciones. Ahora, damos por hecho que el
núcleo es el lugar en la célula donde se almacena el
material genético y que las mitocondrias son las plantas
energéticas de las células; pero, ¿Cómo se llegó a estas
conclusiones?

Nuestro entendimiento de las funciones que llevan a cabo las células y los organelos
presentes en su interior, ha sido posible por una combinación de técnicas bioquímicas y de
microscopía.

La microscopía ha permitido observar las diferentes estructuras subcelulares, entender

cómo están organizadas, y conocer las diferencias en arquitectura que existen entre los
distintos tipos celulares, además de comprender, los cambios que pueden ocurrir bajo
diferentes condiciones, como las de crecimiento. Esta herramienta nos ha dado algunas
pistas sobre las funciones de los componentes intracelulares; pero es el uso de la

Página | 1
microscopía, en conjunto con las técnicas de separación bioquímica y los métodos
citoquímicos, lo que ha permitido la localización de moléculas específicas y reacciones
metabólicas, que ocurren en cada uno de los organelos.
En esta práctica de laboratorio, utilizaremos la técnica de centrifugación diferencial para
separar un homogeneizado celular en varios componentes o fracciones. Inicialmente el
homogeneizado contiene una mezcla de tejidos, organelos celulares y moléculas solubles,
que mediante centrifugaciones secuenciales a velocidades cada vez mayores, se irán
separando según sus características físicas (forma, masa, densidad, etc.). Los organelos con
una mayor velocidad de sedimentación (mayor densidad), se recogerán en el fondo del tubo
(pellet) cuando se somete a centrifugación a bajas velocidades. A medida que se
incrementa la fuerza gravitacional (fuerzas g) y el tiempo de centrifugación, se recogerán
en los pellets, organelos de menor tamaño.

Una vez que el homogeneizado celular ha sido separado en varias fracciones, se pueden
emplear una serie de técnicas para identificar los componentes celulares presentes en cada
fracción; dentro de estas técnicas se encuentran las tinciones específicas, que se utilizan
para identificar las distintas clases de macromoléculas, por ejemplo, sustancias que se unen
específicamente a los ácidos nucleicos, pueden emplearse para identificar la fracción
nuclear. Esto es lo que se conoce con el nombre de citoquímica.

Otro método de identificación es el uso de ensayos bioquímicos, en donde se recurre a

demostrar las reacciones químicas que ocurren en determinados organelos para establecer
la presencia o ausencia de los mismos; por ejemplo, las enzimas implicadas en la
fotosíntesis, se espera que estén localizadas en los cloroplastos, las relacionadas con el ciclo
de Krebs deberían estar restringidas a la mitocondria y estar ausentes en otros organelos,
entonces se proporcionan los sustratos de la enzima para que ocurra la reacción catalítica, si
Página | 2
esta se da, se demuestra la presencia de la enzima y por consiguiente, la del organelo donde
se encuentra.

Seguridad durante la práctica:

Normas de Seguridad: El estudiante debe referirse a la guía de laboratorio 1

Elementos de protección personal:

 Es INDISPENSABLE utilizar Bata de laboratorio durante el desarrollo de

la práctica.
 Utilizar guantes de látex SIEMPRE que se manipulen muestras biológicas.

MATERIALES Y REACTIVOS POR GRUPO DE DOS PERSONAS:

Equipos Cantidad
Microscopio 1 unidad
Centrifuga Eppendorf 5804R 1 unidad por
salón de clase
Centrifuga (Rotofix 32 A) 1 unidad por
salón de clase
Balanza 600 g 3 unidades por
salón de clase
Vortex 3 unidades por
salón de clase

Reactivos Cantidad
Solución salina 0.9 % 10 ml
Lugol 200 µl
Azul de Metileno 200 µl

Página | 3
 Insumos Cantidad
Portaobjetos 5 unidades
Cubreobjetos 10 unidades
Pipeta Pasteur 1 unidad
Tubos de ensayo de (Vidrio) 5 unidades
Mortero 1 unidad
Elodea 20 hojas
Arveja 50 g por salón de
clase
Beaker de 100 ml (Vidrio) 3 unidades por
salón de clase
Recipiente para descartar material 3 unidades por
contaminado salón de clase
Tubos Falcon de 50 ml 3 unidades por
salón de clase
Tubos Falcon de 15 ml 10 unidades por
salón de clase

TENGA EN CUENTA QUE…

Al utilizar la CENTRÍFUGA

 Siempre se debe ubicar en mesones planos y resistentes.

 Al cambiar de rotor es necesario verificar que sea el adecuado para el tipo de
tubo que va a utilizar y que este asegurado.
 Para centrifugar una muestra DEBE preparar un tubo adicional y verificar
que PESE LO MISMO que el tubo con su muestra para que haga contrapeso
(puede utilizar agua o un tubo con otra muestra para equilibrar el peso).
 Al ubicar tubos en la centrífuga tenga en cuenta que el tubo que hace
contrapeso debe estar EXACTAMENTE en la POSICIÓN OPUESTA al
tubo con su muestra.
Si trata de centrifugar tubos que no están
correctamente balanceados éstos se quebrarán y
tendrá que repetir su trabajo.
PELIGRO!!! El mal balance de los tubos en la
centrífuga podría dañarla o hacer que se desplace
lentamente por el mesón y caer al piso.
 En caso de que los tubos hayan quedado mal
balanceados APAGUE INMEDIATAMENTE la
centrífuga y calibre los pesos nuevamente.
 Para operar, la tapa de la centrífuga siempre debe estar cerrada.
 Una vez en operación, nunca mueva ni se apoye contra la centrífuga.

Página | 4
 ACTIVIDAD 1: VISUALIZACIÓN DEL MACERADO DE ARVEJA

Las arvejas contienen grandes cantidades de almidón que

se almacenan en forma de gránulos en organelos
denominados amiloplastos. El objetivo es completar la
separación de un homogeneizado de arveja en 4
fracciones, y luego identificar los organelos presentes en
cada fracción por citoquímica y microscopía. Los
organelos que deberá identificar son los amiloplastos, los
núcleos y los cloroplastos.

A continuación se presenta un diagrama con el tratamiento que se le realizó al

homogenizado de arveja, observe con atención:

A cada grupo de estudiantes realizarán la visualización de los Pellets A1, A3 y el Tubo

A4.

Página | 5
Este procedimiento le permitirá visualizar 3 de los organelos presentes en las células de
arveja. Para cada fracción del homogeneizado se utilizará Lugol para teñir e identificar la
fracción que contiene los amiloplastos.

1. Rotule 3 portaobjetos, A1, A3 y A4. Divida cada portaobjetos a la mitad utilizando

un marcador.
2. Disponga en cada extremo del portaobjetos UNA gota de cada una de las fracciones
(A1, A3 Y A4) (deberá ubicar las gotas lo suficientemente lejos para que una de las
muestras se tiña con colorante y la otra no).
3. Cubra con una laminilla UNA de las gotas; esta corresponderá al control.
4. Adicione a la otra, una gota de Lugol, cubra con una laminilla.

El Lugol teñirá el almidón de los ______________ de color ____________

5. Visualice cada preparación al microscopio para observar los diferentes componentes

subcelulares. Realice dibujos de lo que observa (40x) en cada una de las laminillas
indicando el tipo de muestra, de tinción utilizada y el nombre de cada organelo.

A1 + ________ (40x) A1 Control (40x)

A3 + ________ (40x) A3 Control (40x)

Página | 6
 A4 + ________ (40x) A4 Control (40x)

6. Tome nota de las fracciones en las que aparecen cada uno de los organelos y
complete la Tabla 1. Indique la cantidad relativa de cada uno de los organelos en
cada una de las fracciones (mucho, algo, poco y nada).

Tabla 1. Datos de las observaciones de microscopía de los organelos de las células

de arveja.

Fracción de células de Lugol (amiloplastos) Control sin teñir

arveja (amiloplastos)
Pellet 1 (A1)
Pellet 3 (A3)
Sobrenadante 4 (A4)

ACTIVIDAD 1: CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL Y VISUALIZACIÓN DEL

MACERADO DE ELODEA

La Elodea es una planta acuática que se encuentra en forma abundante en nuestros

ecosistemas; es fotosintéticamente muy activa por lo que contiene grandes cantidades de
cloroplastos. El objetivo de esta actividad es realizar un homogenizado de Elodea y
posteriormente fraccionarlo mediante centrifugación para observar las estructuras básicas
de estas células (núcleos y cloroplastos).

1. Marque 4 tubos de ensayo con los rótulos E1-E4

2. Colecte varias hojas de Elodea y dispóngalas en un mortero.
3. Adicione 3 ml de Solución Salina al 0.9%.
4. Macere fuertemente las hojas de Elodea.
5. Transfiera el macerado en el tubo con el rótulo E1.

Página | 7
 6. Utilizando una balanza, equilibre el tubo E1 (use dos cifras decimales) con otro que
contenga agua. Ubíquelos SIMÉTRICAMENTE en las canastillas de la centrífuga.
7. Centrifugue durante 10 segundos a 500 rpm
8. Transfiera el sobrenadante del tubo E1 a otro tubo rotulado como E2.
9. Resuspenda el pellet del tubo E1, en 3 ml de solución salina (0.9%).
10. Utilizando una balanza, equilibre el tubo E2 (use dos cifras decimales) con otro que
contenga agua. Ubíquelos SIMÉTRICAMENTE en las canastillas de la centrífuga.
11. Centrifugue durante 30 segundos a 2.000 rpm.
12. Transfiera el sobrenadante del tubo E2 a otro rotulado como E3
13. Resuspenda el pellet del tubo E2, en 1 ml de solución salina (0.9%).
14. Utilizando una balanza, equilibre el tubo E3 (use dos cifras decimales) con otro que
contenga agua. Ubíquelos SIMÉTRICAMENTE en las canastillas de la centrífuga.
15. Centrifugue durante 4 minutos a 4.000 rpm
16. Transfiera el sobrenadante del tubo E3 a otro rotulado como E4
17. Resuspenda el pellet del tubo E3, en 1 ml de solución salina (0.9%).

A continuación se presenta el esquema del procedimiento que debe realizar, observe con
atención:

1. Rotule 3 portaobjetos, E1, E3 y E4. Divida cada portaobjetos a la mitad utilizando un

marcador.
Página | 8
2. Disponga dos gotas de cada fracción en el portaobjetos rotulado para cada caso (Tubo E1/
Portaobjetos E1). Coloque una gota en cada extremo.
3. Cubra UNA de las gotas con una laminilla, ésta será la gota control
4. Adicione a la otra, una gota de azul de metileno. Cubra con una laminilla.
5. Visualice cada preparación al microscopio para observar los diferentes componentes
subcelulares. Realice dibujos de lo que observa (40x) en cada una de las laminillas
indicando el tipo de muestra, de tinción utilizada y el nombre de cada organelo

E1 + ________ (40x) E1 Control (40x)

E3 + ________ (40x) E3 Control (40x)

E4 + ________ (40x) E4 Control (40x)

Página | 9
6. Tome nota de las fracciones en las que aparecen cada uno de los organelos y complete
la Tabla 2. Indique la cantidad relativa de cada uno de los organelos en cada una de las
fracciones (mucho, algo, poco y nada)

Tabla 2. Datos de las observaciones de microscopía de los organelos de las células

de Elodea.

Fracción de células de Azul de metileno Control sin teñir

Elodea (núcleos) (cloroplastos)
Pellet 1 (E1)
Pellet 3 (E3)
Sobrenadante 4 (E4)

1. Basado en su conocimiento y en la lectura de la guía, ¿qué organelos esperaría observar

mas abundantemente en:

la fracción #1?

la fracción #3?

la fracción #4?

2. ¿En qué casos sus predicciones concuerdan con las observaciones experimentales?
Discuta porqué si o porqué no.

_______Arveja ________Elodea

Fracción #1:

Fracción #3

Fracción #4:

Página | 10
3. Teniendo en cuenta que Ud. conoce los tamaños relativos de los diferentes
componentes subcelulares, ¿qué fracción esperaría que contuviera la mayor cantidad de
proteína? ¿Por qué

4. El aislamiento de los cloroplastos, es exclusivo de una de las fracciones? Si la respuesta

en NO, cual podría ser la razón de la presencia de un organelo en varias fracciones?

Disposición y Descarte de Materiales

 Cada estudiante es responsable de su área de trabajo.

 Depositar el material de vidrio roto en el tarro de basura blanco.
 En caso de haber utilizado objetos corto-punzantes (lancetas, bisturís, agujas,
etc.) descartarlos en el Guardián.
 Las láminas y laminillas contaminadas con muestras biológicas, deben ser
depositadas en el Recipiente que contiene hipoclorito al 2%.
 Los medios de cultivo, una vez utilizados, deben ser depositados en la bolsa
roja especial para autoclavar.
 Los implementos que contengan fluidos o muestras biológicas (guantes,
toallas de papel, algodón, etc.) deben ser descartados en bolsa roja.

REFERENCIAS

Imágenes:

http://www .microscopico.wordpress.com
http://www.tuelsalvador.com

Elaborado por:

Fecha:

Página | 11
Página | 12