Aislamiento de Arn

Facultad de Ciencias Básicas
Programa de Química
AISLAMIENTO DE ARN
DAYLI LILIANA RANGEL OROZCOa, BRYAN BELEÑO ACOSTAa &

JACKELINE SALGADO PALACIO
Docente. Carlos David Grande Tovar. Ph.D

a
Estudiantes del Programa de Química, Universidad del Atlántico.
Las técnicas de extracción del RNA son unas de las metodologías en conjunto con las técnicas
de extracción del DNA que han aportado un de los mayores avancen para el estudio de
enfermedades asociadas bien a virus, bacterias o mutaciones genéticas, es importante estudiar
las diferentes metodologías que se tienen hoy en día para la obtención de RNA se deben
llevar a cabo con suma precaución, de no ser así se puede desencadenar una contaminación
o la pérdida de la muestra. Estos parámetros fueron discutidos y se planteó una discusión en
base a las técnicas que se tienen hoy en día para extraer el RNA.
Palabras claves: RNA, Extracción, Metodologías, código genético, Trizol.
INTRODUCCIÓN En la sociedad, la extracción del DNA

permitió estudiar cómo estaba construido
El ácido ribonucleico o RNA por sus siglas
esta macromolécula y poder predecir y
en inglés, es la macromolécula que se
explicar enfermedades que se pueden o no
encuentra presente en toda forma de vida
presentar en los individuos [1]. La
(animales, bacterias, virus y otras). Se
extracción de RNA al igual que la
encuentra conformada por una hebra de
extracción de DNA se lleva a cabo a nivel
nucleótidos que están unidos mediante un
de las células que constituyen al
grupo fosfato a una pentosa, este tipo de
organismo a estudiar. Por ende, es
unión es conocida como enlace
importante que se tengan metodologías lo
fosfodiéster y permite la polimerización
suficientemente seguras para emplearla en
del ARN partiendo de los nucleótidos,
diversas investigaciones en biología
estos nucleótidos son característico gracias
molecular, por eso es que se ha buscado la
a que están constituidos por una base
manera en determinar cuál metodología
nitrogenada, que pueden ser adenina,
permite una extracción completa y más
citosina, urálico y guanina.
optima de RNA[2], la metodología del MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivo de Trizol no solo ha permitido
Los materiales y reactivos que son
extraer RNA de muestras provenientes de
requerido para llevar a cabo la experiencia
plantas, sino también permite una óptima
son: Cloroformo, alcohol isopropílico,
extracción del RNA de una célula animal,
etanol al 75%, agua libre de RNasa o
bacteriana o viral[3]. Gracias a las
solución SDS al 0,5%.
diferentes metodologías para extracción de
RNA ha permitido que se logre estudiar el
RNA, ya sea el RNA codificante (cRNA)
o el RNA mensajero (mRNA). Esto
permite que técnicas tales como Northern
Blot den información acerca de la
composición del RNA y con ello una
identificación de los nucleótidos que
conforman al RNA. Las técnicas de
extracción de RNA sirven para hacer
seguimiento de mutaciones en los
organismos que están bajo estudio y con
ello poder entender las posibles causas de
las anomalías que se presenten, de igual
forma[3]–[5]. A día de hoy la extracción
de RNA cumple un rol importante en la
sociedad. Gracias al virus SARS-CoV-2
causante de la emergencia de salud pública
se han buscado metodologías tal que
permitan la detección de este virus
empleando como macromolécula base el
RNA de este virus presente en
pacientes[6], [7].
PROCEDIMIENTO
1. Homogeneización.
Las células se lavaron con 1X PBS enfriado con hielo. Después, la monocapa se cubrió
con 1 ml de trizol y las células se lisan y homogeneizaron mediante pipeteo repetido.
2. Separación de fases. 2. El ARN permanece solo

Se incuban las muestras (5-15 min a 30°C), se añade en la fase acuosa. El
0,2 mL de cloroformo por 0,75 mL de trizol. Se volumen de la fase acuosa
agitan vigorosamente los tubos a mano (15 min) y se es aproximadamente el 70%
incuban (15-30°C durante 2 min). Luego las muestras del volumen de TRIzol
se centrifugan (15 min a 4°C). La fase acuosa se Reactivo LS utilizado para
transfiere a otros tubos. homogeneización
5. Redisolución de
3. Precipitacion de ARN.
4. Lavado de ARN.
ARN.
El sedimento de ARN se Se seco el sedimento del
Se precipita el ARN de anterior paso, y el ARN
lava con etanol al 75%,
la fase acuosa al mezclar se disolvio en agua sin
añadiendo 900 μL por
3 μL de glucogeno 500 ARNasa, pasando la
0,75 mL de trixol.
μL de alcohol solución a través de la
isopropilico. Se centrifuga a 12000 punta de la pipeta unas
rpm durante 30 min a cuantas veces e
La mezcla se centrifuga
4°C.
(30 min de 2 - 8 °C). incubando durante 10
minutos a 55 - 60ºC
ANALISIS DE RESULTADOS
El ácido ribonucleico es sumamente proteínas, pero al mismo tiempo se
importante porque si bien el ADN contiene encarga de mantener la integridad del
la información genética, el que permite ARN en el proceso de homogenización
que esta sea comprendida e interpretada porque evita que actúen las enzimas
por las células es el ARN y juega un papel ARNasas [11].
fundamental en la realización de la síntesis
Posteriormente se adiciona cloroformo a la
de proteínas [8].
muestra que se utiliza para facilitar el
El aislamiento del ARN intacto es esencial proceso de separar las fases con la ayuda
para técnicas de biología molecular de centrifugación, una vez terminada la
empleadas en el análisis de la expresión centrifugación se puede observar que se
génica y para ellos existen diferentes tiene una fase acuosa, una interfase y una
métodos los cuales permiten crear librerías fase orgánica como se muestra en la figura
de ADNc, entre las más empleadas se 1, el ARN solo está presente en la fase
encuentran: Northern Blot, RT-PCR, acuosa y es muy importante tener mucho
hibridación in situ, entre otras [9]. cuidado al retirar la fase de interés para no
generar contaminación o mezclarlas [12],[
Se debe tener mucho cuidado puesto que
13].
el ARN es una molécula muy lábil y es
fácilmente degradado por ARNasa y por
ello se debe evitar la contaminación
cruzada con estas enzimas, para realizar la
inactivación de las ribonucleasas se
emplea el agente dietilopirocarbonato
(DEPC) [10]
Para realizar la extracción del ARN se

emplea el TRIzol que contiene fenol y Figura 1. Separación de fases mediante el
tiocianato de guanidina, el cual es el empleo de cloroformo y centrifugación
responsable de la lisis de la membrana [9].
celular, puesto que es un agente cao
trópico responsable de la
desnaturalización de las macromoléculas y
Una vez obtenida la fase acuosa y separada mayor claridad de esta metodología y
de las otras se adiciona glucógeno y comprender mejor la importancia de cada
alcohol isopropílico y con ayuda de la etapa.
centrifugación se produce la precipitación
del ARN en un pellet o sedimento similar
a una pastilla como se observa en la figura
2, el sobrenadante debe ser desechado con
cuidado de no botar también el pellet [11],
[12].
Figura 2. Formación del pellet en la fase

acuosa utilizando alcohol isopropílico [9].
El sedimento resultante se lavó con etanol Figura 3. Protocolo del método de

al 75% para eliminar las impurezas aislamiento y extracción del ARN
haciendo los lavados por centrifugación, empleando el TRIzol [13].
posteriormente se seca el pellet donde se
tiene el ARN puro y libre de
contaminantes, por esa razón es muy La obtención de ARN puro y libre de
importante ser muy rigurosos al momento impurezas no siempre es un proceso
de realizar cada uno de los pasos. Luego sencillo debido a la presencia de
este ARN puro se disolvió utilizando agua contaminantes tanto exógenos como
libre de ARNasas, que es agua desionizada endógenos y de la baja estabilidad que
libre de enzimas ribonucleasas y de presenta esta molécula, pero el aislamiento
calidad comprobada [11], [13] del ARN es sumamente valioso para el
desarrollo de técnicas moleculares y es por
Este procedimiento se muestra ilustrado
eso que este debe ser altamente puro o de
paso a paso en la figura 3 para tener una
calidad puesto que la presencia de 2006, doi: 10.1038/nprot.2006.143.

contaminantes puede incidir
[3] A. Rentmeister, L. V. J. C.
negativamente al momento de realizar la
Mannack, and S. Eising, “Current
amplificación de los ácidos nucleicos [14].
techniques for visualizing RNA in
cells,” F1000Research, vol. 5, no.
0, pp. 1–8, 2016, doi:
CONCLUSIÓN
10.12688/f1000research.8151.1.
El ARN brinda información crucial a la
[4] R. A. Kroczek, “Southern and
hora de entender la expresión génica y es
Northern analysis,” J. Chromatogr.
ampliamente utilizado, por esta razón es
B Biomed. Sci. Appl., vol. 618, no.
sumamente importante realizar con
1–2, pp. 133–145, 1993, doi:
minucioso cuidado el proceso de
10.1016/0378-4347(93)80031-X.
aislamiento y extracción de este de no
generar ningún tipo de contaminación [5] S. A. Thatcher, “DNA/RNA
cruzada puesto que podría comprometer preparation for molecular
seriamente los resultados obtenidos de detection,” Clin. Chem., vol. 61,
procedimientos que se realizan después de no. 1, pp. 89–99, 2015, doi:
la extracción, los cuales requieren una 10.1373/clinchem.2014.221374.
intensa labor, gasto de tiempo adicional y
[6] F. Colavita et al., “SARS-CoV-2
un incremento en los costos.
Isolation From Ocular Secretions
REFERENCIAS of a Patient With COVID-19 in
Italy With Prolonged Viral RNA
[1] A. M. Parissenti et al., “Tumor
Detection,” Ann. Intern. Med., vol.
RNA disruption predicts survival benefit
173, no. 3, pp. 242–243, 2020, doi:
from breast cancer chemotherapy,” Breast
10.7326/M20-1176.
Cancer Res. Treat., vol. 153, no. 1, pp.
135–144, 2015, doi: 10.1007/s10549-015- [7] S. Omar et al., “Duration of SARS-
3498-9. CoV-2 RNA detection in COVID-
19 patients in home isolation,
[2] E. G. Zoetendal et al., “Isolation of
Rhineland-Palatinate, Germany,
RNA from bacterial samples of the
2020 - an interval-censored
human gastrointestinal tract,” Nat.
survival analysis,”
Protoc., vol. 1, no. 2, pp. 954–959,
Eurosurveillance, vol. 25, no. 30,
pp. 1–8, 2020, doi: 10.2807/1560- for the extraction of DNA and RNA, and
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2. Separación de fases. 2. El ARN permanece solo

Para realizar la extracción del ARN se

Figura 2. Formación del pellet en la fase

El sedimento resultante se lavó con etanol Figura 3. Protocolo del método de

calidad puesto que la presencia de 2006, doi: 10.1038/nprot.2006.143.

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