Fuente: Riles USM.

2006
Lorna Guerrero
☺ Los sistemas de tratamiento secundario de aguas residuales son
procesos de fermentación
fermentación.
☺ En este proceso una población heterogénea de microorganismos
degrada la materia orgánica presente en el agua.
☺ Así obtiene materia y energía
g metabólicas para
p su p
propagación
p g y
mantención de viabilidad.
☺ Por ello resulta conveniente conocer ciertos elementos
fundamentales de la teoría de procesos de fermentación.
CINÉTICA

Cuantificación Sólidos Suspendidos

Volátiles SSV

Bacterias:
B t i Fi
Fisión
ió Bi
Binaria
i
Reproducción Levaduras: Yemación
Hongos: Crecimiento Micelial
Las células procariotas bacterianas se reproducen por fisión
binaria: no es posible diferenciar una célula madre y una célula
hija ⇒ cultivo homogéneo

Las levaduras se reproducen por yemación. Se produce una

célula hija y permanece viable la célula madre
madre, por lo que un
cultivo de levaduras se puede considerar heterogéneo.
 En los mohos hay reproducción sexuada y asexuada mediante
esporas, pero es más relevante la formación de hifas (cadenas de
células con envolvente común) y su elongación por la reproducción
de los extremos.

Las hifas p
pueden ser
continuas (cenocíticas) o
tabicadas.
El conjunto de hifas, se
d
denomina
i micelio
i li

Imagen de microscopía
electrónica de barrido de micelio fúngico con las
hifas (verde), esporangio (naranja) y esporas
(azul), Penicillium sp. (aumento de 1560 x).
Cinética de crecimiento microbiano:
El adecuado conocimiento de la cinética de un cultivo permite
una predicción del transcurso de la fermentación, la evaluación
de velocidades, rendimientos y productividades y entrega
información útil para establecer estrategias de producción y
optimización
i i ió d
dell proceso.
El comportamiento cinético de los m.o. está determinado por
un complejo de factores genéticos y ambientales.
Entre estos últimos
E úl i destacan
d llas ll
llamadas
d condiciones
di i d
de
operación (composición del medio, tº, pH y otras) y la
modalidad de cultivo, entre las que se distinguen el cultivo por
lotes (llamado también por cargas o batch), el cultivo por lotes
alimentados y el cultivo continuo o semicontinuo.
El cultivo por lotes es aquel que se realiza sin intercambio de
materia con los alrededores
alrededores, salvo en lo referente a los gases
(aireación, producción de CO2 y otros gases) que se suministran
y retiran del sistema en forma continua.
En esta modalidad de cultivo, se cargan los nutrientes y luego
se inocula una determinada cantidad de células.
Se inicia así el cultivo, el que transcurre de una forma
característica, dada por la llamada curva de crecimiento, hasta
que algún evento
evento, tal como el agotamiento de un nutriente lo
detiene.
La figura siguiente esquematiza la curva de creci-miento. La forma
que se aprecia se da siempre que se cumplan ciertas condiciones:
el cultivo se realiza por lotes, todas las células que componen la
pobla-ción se reproducen a intervalos regulares, no existen en el
medio de cultivo sustancias inhibidoras del crecimiento y su
composición es simple, en especial en relación a las fuentes de
carbono y nitrógeno
nitrógeno.

a b c d e
ación celullar
Ln concentra
(x))

Tiempo
Fase de latencia (a): Se produce inmediatamente después de
inoculado el cultivo. No hay replicación de DNA ni separación
de nuevas células
células. Se reproduce el reacomodo de la
composición macromolecular al nuevo ambiente en que se
encuentran las células inoculadas.
F
Fase d
de crecimiento
i i t exponencial
i l o llogarítmico
ít i (b)
(b): Las
L células
él l
se encuentran en plena reproducción a una velocidad que es la
máxima para el juego de condiciones existentes.
Fase estacionaria (c):
( ) representa un estado
d ddonde
d ell
crecimiento se detiene (puede ocurrir también un equilibrio
dinámico entre replicación y muerte celular) usualmente debido
al agotamiento de un nutriente
nutriente.
Fase de muerte, decaimiento o lisis (d): esta fase se presenta en
aquellos cultivos en los que se inducen enzimas autolíticas en
di i
condiciones d
de iinanición.
i ió
Fase de crecimiento críptico (e): a veces es posible apreciar una
zona de crecimiento lento después de la fase de muerte. El
conte-nido citoplasmático liberado por células lisadas
proporciona nutrientes requeridos para crecer.
 El crecimiento de una población bacteriana puede ser representado
por:
(Ec. 1)
dx = μx
dt
La velocidad específica de crecimiento, μ, es una
constante durante la fase de crecimiento
exponencial y en la figura corresponde a la
pendiente de ese gráfico:
(Ec. 2)

( )
μ = 1 x dx dt = d (ln x) dt

Durante la fase exponencial es posible integrar la

ecuación [1] entre límites adecuados, resultando:
(Ec. 3)
ln⎛⎜ x ⎞⎟ = μt
⎝ x0 ⎠
o bien:

x = x 0 * e μt (Ec. 4)
El parámetro μ es de especial relevancia en el
estudio de la cinética de fermentaciones.
Si se examinan sus dimensiones básicas, éstas
resultan de [tiempo]-1, por lo que se expresa
generalmente en [h]-1, o bien en [min]-1 o [s]-1.
Relacionado con μ existe otro parámetro cuya
interpretación física puede aparecer como más
directa: el tiempo de duplicación
duplicación, tD, definido
como el intervalo de tiempo entre dos
duplicaciones sucesivas.
Si imponemos esos límites
í para integrar la
ecuación [1], resulta:

t D = ln 2 (Ec. 5)
μ
Tiempos de duplicación característicos

Tipo de célula tD (h)

Bacterias 0.3 – 2.0
L
Levaduras
d 1–4
Hongos filamentosos 2-7
Microalgas 18 – 35
Células animales in vitro 20 - 40

Las ecuaciones presentadas en los párrafos prece-dentes,

estrictamente válidos para el caso de fisión binaria, se emplean
también con bastante seguridad en el caso de levaduras y con
reservas para organismos filamentosos
filamentosos, para los cuales se han
propuesto expresiones distintas.
` Partiendo de una analogía con el modelo cinético
enzimático de Michaelis Menten, Monod, en 1942,
propuso la
l ecuación
ó que da
d cuenta de
d la
l dependencia
d d
de la velocidad específica de crecimiento con la
concentración de sustrato S..

S
μ = μ máx
KS + S
á

donde:
μmáx: Velocidad de crecimiento específico máximo
S : Concentración sustrato
Ks : Constante Monod o “velocidad media”
` El parámetro KS (constante de Monod) representa
la afinidad
f de la célula p
por el sustrato.
` μmáx es la máxima velocidad específica de creci-
miento, que es la que se obtiene cuando S > > > KS
` KS es el valor de la concentración ó del nutriente
limite cuando la velocidad de crecimiento específico
es la mitad del valor máximo.
` Un factor que relaciona las condiciones de
operación del reactor, cinética microbiana y
parámetros estequiométricos es el rendimiento del
sustrato en células, Yx/s:

Yx/s= masa de células formadas

masa de
d sustrato consumido
id
` q
Durante el crecimiento equilibrado, sólo el
parámetro μ es requerido para caracterizar la
cinética de crecimiento de población.
` La magnitud de la
l razónó de crecimiento específico
íf μ
es ampliamente usada para describir la influencia
m
del ambiente en el f
funcionamiento
m de la célula..

` Influencia de la Temperatura: tiene un marcado

efecto sobre la cinética de crecimiento microbiano.
Existe una temperatura óptima de crecimiento a la
cuall se obtiene
b ell mayor valor
l ded μmáx.
` La dependencia térmica de μmáx puede ser modelada por
una expresión
p del tipo
p Arrhenius, donde los valores de la
energía de activación, Ea, varían entre 8 y 26 kcal/mol:

(
μ máx =A exp − Ea RT )

Temperatura °C
Grupo Mínimo Óptimo Máximo

Termófilos 40 a 50 55 a 75 60 a 80

Mesófilos 10 a 15 30 a 45 35 a 47

Psicrófilos -5 a 5 15 a 18 19 a 22
` pH: La configuración de proteínas y actividad son
dependientes del pH.
La velocidad de crecimiento bacteriano es usualmente
máximo en el rango de 6.5 a 7.5. Hay excepciones:
bacterias acidofílicas con crecimiento a pH 2.0.
20
El μmáx de las levaduras está entre pH 3.5 y 5.5, la de los
hongos filamentosos entre 3 y 7 y las algas unicelulares
superiores a 7.

Clasificación pH externo pH interno

Acidófilos 1.0 - 5.0 6.5

N t ófil
Neutrófilos 5 5 - 8.5
5.5 8 5 7 5
7.5
Alcalófilos 9.0 - 10.0 9.5
 Requerimientos nutricionales:
` El proceso de reproducción celular puede representarse
esquemáticamente en la forma que muestra la figura.
` Si la situación se examina desde una perspectiva cuanti-tativa, se
deberá concluir que para que la representación a) sea posible, se
deberá cumplir con lo formulado en b), de manera de no
violar los princi
princi-
pios de conserva-
ción de masa y
energía y poder
sintetizar una
nueva célula igual
a la anterior. a) Reproducción celular

MATERIA
CÉLULAS
b) ENERGÍA
PRODUCTOS
INFORMACIÓN
` La información
f requerida
q para la construcción de la
p
nueva célula está contenida en el cromosoma y es
transmitida de generación en generación sin requerir
auxilio externo.
externo
` La materia debe ser suministrada externamente a
través de los componentes del medio de cultivo que son
catabolizadas a un conjunto de compuestos intermedios
que sirven de punto de partida para la síntesis de
macromoléculas.
macromoléculas
` La energía la obtiene la célula a través de reacciones
bioquímicas adecuadas en base a uno o más componentes
del medio de cultivo, llamados fuentes de energía o bien
directamente de la radiación solar en le caso de
organismos
i f t i téti
fotosintéticos.
` Mediante este enfoque es posible representar el
crecimiento
m microbiano como
m m una ecuación q química
m ((o m
más
propiamente bioquímica, porque es catalizada por
enzimas) que se rige por los principios estequiométricos y
cn tc
cinéticos:
CaHbOc + mNH3 + .. + nO2 → qCdHeOfNg + rCO2 + tH2O +
(células) uChHiOjNk (prod)
` La biomasa se representa mediante una fórmula basada en
su composición
p elemental. Así es p posible calcular un PM
promedio aparente, que es un submúltiplo de lo que será el
verdadero peso molecular promedio calculado en base a la
composición
p molecular de la célula.
` Para efectos de cálculo, lo que interesa es que la masa
celular está correctamente representada por el producto
del peso molecular y el coeficiente estequiométrico
respectivo.
 % en peso, base seca
` Para su desarrollo Elemento Bacterias Levaduras Mohos

y reproducción la Carbono 46 – 52 46 – 52 45 – 55

célula necesita de Hidrógeno 8 – 12 8 –12 8 –12

ciertos nutrientes Oxígeno 18 –24 18 – 24 18 – 24

en el medio.
Nitrógeno 10 – 24 5–9 3–7
Magnesio 0.1 – 0.5 0.1 – 0.5 0.1 – 0.3
` Estos deben, a lo Fósforo 2.0 – 3.0 0.8 – 0.25 0.4 – 4.5

menos, aportar
t los
l Azufre 0 1 – 1.0
0.1 10 0 01 – 0.25
0.01 0 25 0 1 – 0.5
0.1 05

elementos de los Calcio 0.01 – 1.0 0.1 – 0.3 0.1 – 1.4

que aquella
q q está Potasio 1.0 – 4.5 1.0 – 4.0 0.2 - 2.5

compuesta.
Hi
Hierro 0 02 – 0.2
0.02 02 0 01 0
0.01 0.5
5 0 1 – 0.2
0.1 02
Otros < 0.01 < 0.01 < 0.01
` En la tabla apare- Compuesto

cen llas composicio- Proteínas 50 – 60 35 – 45 25 – 40

nes típicas de bac- Carbohidratos 6 – 15 30 – 45 40 – 55

terias,, levaduras y Lípidos 5 – 10 5 – 10 5 – 10

mohos
Ac. Nucleicos 15 – 25 5 – 15 2 – 10
Cenizas 4 - 10 4 - 10 4 – 10
` Para ser incorporados
p a la biomasa,, estos elementos
deben ser suministrados en la forma de compuestos
químicos susceptibles a ser metabolizados (las célu-
las deben tener las enzimas para una fácil degrada-
degrada
ción).
` Una
na gran proporción
proporc ón de los m
microorganismos
croorgan smos requiere
requ ere
de una fuente orgánica de carbono (heterótrofos), la
que al mismo tiempo cumple la función de fuente de
energía.
energía
` Los organismos fotosintéticos y autótrofos utilizan
carbono inorgánico y una fuente separada de
energía, que puede ser energía luminosa o
proveniente de la oxidación de una compuesto
inorgánico.
inorgánico
` La fuente de nitrógeno
g puede
p ser amonio, nitrógeno
g
amino de aminoácidos y proteínas, urea, nitrato o
nitrógeno elemental, siendo las dos primeras las
más comunes.
` El resto de los elementos son proporcionados por
sales orgánicas.
` No todas las células microbianas heterótrofas son
capaces de sintetizar todo su material celular a
partir de los compuestos
p p simples
p mencionados.
` Debido a diferencias genéticas en su sistema
enzimático, ciertas cepas requieren de la presencia
en el medio de ciertos factores de crecimiento o
nutrientes esenciales, típicamente vitaminas,
aminoácidos y nucleótidos.
` Existen 2 tipos de medios de crecimiento celular: Medio
Definido y Medio Complejo

` Medio sintético o definido: Es el medio en el cual la

composición química esta bien definida.
` Los medios definidos se formulan en base a compuestos
puros, tales como la glucosa, sulfato de amonio,
metionina, fosfato monoácido de potasio, etc.
` Debido a ello, su composición química es conocida y
reproducible y usualmente contienen una sola fuente de
cada elemento,
elemento además de los nutrientes esenciales que
pueden ser requeridos.
` Este tipo de medio es usado preferentemente en
investigación básica y aplicada y en desarrollo de procesos
de fermentación.
` En el campo industrial se percibe un creciente interés y
utilización de medios definidos.
` Una clase especial de medio definido es el llamado medio
mínimo, que se puede caracterizar como aquel formado
solamente por una fuente de cada elemento. El típico
medio mínimo está compuesto por glucosa, sulfato de
amonio y otras sales minerales.

` Medio complejo: Es aquel en el cual la composición no es

conocida,, ej.
j Caldo de infusión
f sanguínea.
g
` Son formulados en base a desechos o subproductos y
extractos naturales: melaza, licor de maceración de maíz,
extracto de lavadura,
lavadura peptona y otros.
otros
` Por ello su composición química es compleja y variable,
existiendo en ellos varias fuentes de cada elemento.
elemento
` Estos medios requieren muchas veces ser suplemen-
p
tados con compuestos que p
q proporcionen
p cantidades
adicionales de algunos elementos tales como N, Mg y P.
` Los medios complejos son extensamente utilizados en
microbiología
i bi l í analítica,
lí i microbiología
i bi l í d
de aguas y
alimentos y en fermentaciones industriales.

` Que el medio sea rico en nutrientes no significa un

éxito en el crecimiento celular, ya que concentraciones
altas de nutrientes pueden inhibir el crecimiento.
` Una ppráctica común es limitar el crecimiento, limitando
la cantidad de un nutriente en el medio.
 Medio definido A Medio definido B
Glucosa 18.0 Glucosa 50.0

(NH4)2SO4 3.2 NH4Cl

6.0
M SO4 x 7H2O
MgSO 0 39
0.39 MgSO
M SO4
0.4
K2HPO4 0.68 K2HPO4 1.2

NaCl 0.008 NaCl 0.02

FeSO4 x 7H2O 0.02 FeSO4 x 7H2O 0.02

CuSO4 x 5H2O 0.01 CH3)-COONa 40.0

ZnSO4 x 7H2O 0 03
0.03 15 aminoácidos 0
0.11 – 0 6
0.6

CaCl2 0.028 4 nucleótidos 0.002

C Cl
CoCl
A: Medio
2 0 0002
0.0002 10 vitaminas
it i 2*10-66 – 2*10-33
mínimo calculado para 6 g/L, con (NH4)2SO4 como nutriente
limitante y biomasa de 7.5% de nitrógeno.
B: Medio para ensayo de lisina.
 MEDIOS COMPLEJOS ORIGEN

Melaza Industria azucarera

Subproducto de procesamiento de
Li
Licor d maceración
de ió de
d maíz
í
maíz
Desecho de la industria de pulpa y
Licor
L cor de sulf
sulfito
to
papell
Subproducto del procesamiento
Permeado de suero
del suero de leche
Subproducto de la producción de
Vinazas
etanol por fermentación
Industrialización de soya y
Harinas de soya y pescado
pescado
Hidrolizado y extracto de Industria productora de levadura
levadura y forrajera y de panificación
` Para el diseño de un medio mínimo se debe conocer (o
estimar) la composición de la célula del microorganismo
que se quiere fermentar.
` Además, se debe conocer la concentración de células
que se quiere tener. Generalmente:
Peso seco
1 g/L : Recomendable a nivel de laboratorio.
10 g/L : Lo menos en fermentaciones industriales.
20 g/L : Lo típico en fermentaciones industriales
50 g/L : Lo máximo en fermentaciones industriales.
100 g/L : A nivel de experimentación
` Ejemplo: Supongamos una célula con la siguiente
composición: 50% C,
C 10% N,
N 1% S,
S Mg,
Mg P y trazas.
trazas
` Supóngase que se requiere 2 g/L (máximo) de células.
` E necesario
Es i definir
d fi i las
l fuentes
f t de
d los
l elementos:
l t
Fuente de C: Glucosa
Fuente de N
N: (NH4)2SO4
Fuente de S, Mg: MgSO4
Trazas: Solución de sales.
` Con todos estos datos y con la definición de YX/S se
puede calcular el medio de cultivo.
` (NH4)2SO4 contiene 21% de N y la célula contiene 10%
de N, por lo tanto:
YX/S = 0.21/0.1 = 2.1 g de célula
é / g (NH4)2SO4
` Se debe agregar entonces, de (NH4)2SO4:
(NH4)2SO4 = 2 / 2.1
2 1 = 1 g/L
` Para hacer los cálculos se supuso que todo el nutriente
que se agrega forma por parte de biomasa.
biomasa Esto puede
ser cierto, salvo para la fuente de carbono.
` El YX/S experimental
p es el mejor
j q que se ppuede obtener.
Si no es posible, para el caso de la fuente de C es
necesario hacer una estimación: entre el 50% y 60% del
nutriente va a biomasa (que es lo que interesa en el
ejemplo), el resto es utilizado por la célula para
obtención de energía (para metabolismo aerobio).
` Por lo tanto:
Yglucosa = 0.8 x 0.6 = 0.5
Valor calculado igual que % que va a biomasa
en caso de fuente de N
` Para el ejemplo, la cantidad de glucosa que se
requiere
q es:
Glucosa = 2 / 0.5 = 4 g/L
` De este mismo modo se calcula para cada uno de los
nutrientes escogidos.
` Según el ejemplo,
ejemplo el medio mínimo será:
1 g/L de (NH4)2SO4
4 g/L
/L de glucosa
lucosa
Sales minerales

` Para un metabolismo anaerobio, se considera que

aproximadamente
i d t un 10% de
d la
l fuente
f t de
d carbono
b va
a biomasa
 SISTEMAS Y MODALIDAD DE CULTIVO

SISTEMAS
SS S DE CULTIVO
CU O

Fermentación Industrial Tratamiento de aguas

Cultivo sumergido Biomasa suspendida
Cultivo en superficie Biomasa adherida (fija)

MODALIDAD DE CULTIVO

Por lotes
Por lotes alimentados
Cultivo continuo
Fermentación industrial Por lotes o lotes alimentados
Biotratamiento de efluentes Continuo.
Cultivo Continuo
Continuo:: aquel que se alimenta al fermentador en forma
permanente una corriente de medio de cultivo, y se retira,
también
m permanentemente,
p m m , una corriente de caldo f fermentado
m
conteniendo las células microbianas.
Es posible manejar el sistema de modo de mantener el volumen
de fermentación constante y obtener un estado estacionario en
el que la velocidad con las que las células se propagan en el
fermentador corresponde a aquella con que son retiradas.
` La mezcla de estos reactores es con agitadores,
inyección de burbujas de gas o ambos.
ambos
` Se asume: un mezclado vigoroso, el medio se
encuentra con una composición uniforme, la
concentración de la mezcla no varía con el flujo de
entrada al reactor. La concentración en el reactor es
la misma del efluente.
` A diferencia de lo que ocurre en un cultivo por lotes, en
un cultivo continuo (CC) es posible controlar la
velocidad específica de crecimiento y mantener la
población microbiana en un estado fisiológico definido,
constante y seleccionable,
seleccionable que corresponde a algún
punto de su ciclo de crecimiento.
` Un balance de materia de células (x) y nutrientes (sus
(sus-
trato S) al fermentador operando en EE, conduce a:
dx / dt = (F / Vr) x0 - (F / Vr) x + μx = 0 (Ec. 1)

dS / dt = (F / Vr) S0 - (F / Vr) S – (μ
μ x) / Yx/s = 0 (Ec. 2)
` Para un medio estéril ((x0 = 0)) y con la velocidad de
dilución, D, definida como un cuociente entre el flujo
de alimentación (F) y el volumen de fermentación
(Vr) de la ecuación (1) se obtiene:
(Vr),

μ=D (Ec 3)
(Ec.

` Y de la ecuación (2):

x = Yx/s (S0 – S) (Ec. 4)

` Considerando esta última ecuación (4) y Monod, las
expresiones
xpr si n s para
p r lal concentración
c nc ntr ción ded sustrato
sustr t S,S y la
l
concentración de biomasa o células “x” en EE, quedan:

D Ks
S = ⎯⎯⎯⎯
μmax - D
D Ks
x = Yx/s ⎨ So - ⎯⎯⎯⎯ ⎬
μmax - D
` Estas dos últimas ecuaciones son fundamentales, ya que
describen completamente el sistema, evaluando la concen-
tración celular y de S en el fermentador en función de
parámetros operacionales (D, So) y cinéticos (μmáx, Yx/s).
` La ecuación (3) tiene una gran significación p práctica, y
ya
que establece que la velocidad específica de crecimiento
de la población microbiana puede manipularse a través de
la velocidad de dilución.
` Esta ecuación sin embargo, es válida sólo para D < μmáx. Al
aproximarse D a ese valor, el cultivo será lavado, debido a
la incapacidad de las células de crecer a una velocidad que
compense la velocidad de remoción desde el fermentador.
` Si la velocidad específica de crecimiento de la población
i bi
microbiana ñ lla anterior
es pequeña, t i iigualdad
ld d es un serio
i
inconveniente operacional, siendo necesario establecer
condiciones qque p
permitan operar
p el sistema a D > μmáx.
` Esto puede lograrse mediante recirculación parcial de
células al fermentador.
 F F
V

F´
F sin
i reciclo
i l
D =μ
D=
V
D μ
V con reciclo
TRH =
F D>μ
 APLICACIÓN DE PRINCIPIOS DE INGENIERÍA DE
FERMENTACIONES AL TRATAMIENTO DE
AGUAS RESIDUALES
Fermentación Tratamiento
Sistema microbiano Cultivo puro Cultivo
homogéneo
P á t
Parámetros cinéticos
i éti Sentido
S tid Sentido
S tid
(Yx/s, μmax, Ks) fundamental operacional
Cuantificación biomasa Turbidimetría, NMP Estimación ⇒ SSV
Sustrato Identificable DBO o DQO
Yx/s
pH, temperatura Controlados Se ajusta rango
Modalidad de cultivo Por lotes o CLA Continuo
Transferencia de O2 Limitante Eficiente
 Análisis comparativo entre una fermentación industrial tipo y un
sistema de lodo activo

Lodo Activo Fermentación

Reología Newtoniana (no) Newtoniana

Viscosidad (cp) 1 – 10 1 – 1000
S (ppm DBO) 100 – 2000 5000 – 40000
X (g/l) 0.5 – 5 10 – 100
T ((ºC9 10 – 30 20 – 50
μ (h-1) 0.05 – 0.1 1.– 1
V (m3) 200 – 1500 20 – 150
P/V (HP/m3) 0.02 – 0.1 0.3 – 2.5
Na (mg O2 / (L h)) 50 – 300 500 – 4000
η (kg
(k O2 / (HP h)) 1 – 2.2
22 1 1.2
1.– 12
kLa α (P/V) > 1 α (P/V) < 1