Aplicación de Irradiación Gamma

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE INGENIERÍA
APLICACIÓN DE IRRADIACIÓN GAMMA,

ULTRASONIDO Y ANTIMICROBIANOS
NATURALES PARA EL ASEGURAMIENTO
DE LA CALIDAD INTEGRAL E INOCUIDAD
DE BEBIDAS A BASE DE FRUTAS Y
VERDURAS
TESIS DE GRADO INGENIERÍA DE ALIMENTOS
Tesista: Casco, María de los Ángeles
Directoras: Dra. Ing. Fernández, María Verónica
Dra. Ing. Agüero, María Victoria
BUENOS AIRES, 18 de junio de 2021

ÍNDICE
ÍNDICE ................................................................................................................................... 2
AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................... 5
RESUMEN.............................................................................................................................. 6
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 7
1.1. DIETA SALUDABLE Y CONSUMO DE FRUTAS Y VERDURAS......................................... 7
1.1.1. Algunos Problemas por el bajo consumo de frutas y verduras ............................................ 8
1.1.2. Demanda de alimentos saludables ....................................................................................... 9
1.1.3. Bebidas naturales ............................................................................................................... 10
1.2. APROVECHAMIENTO DE RECURSOS PARA LA INDUSTRIA ........................................ 12
1.3. CALIDAD E INOCUIDAD DE FRUTAS, VERDURAS Y BEBIDAS .................................... 14
1.3.1. Calidad Microbiológica ..................................................................................................... 14
1.3.2. Calidad Fisicoquímica, Sensorial y Nutricional ................................................................ 19
1.4. TECNOLOGÍAS NO TÉRMICAS ............................................................................................ 25
1.4.1. Irradiación gamma ............................................................................................................ 26
1.4.2. Ultrasonido ........................................................................................................................ 30
1.5. ANTIMICROBIANOS NATURALES ..................................................................................... 32
1.5.1. Nisina ................................................................................................................................. 34
1.5.2. Natamicina ......................................................................................................................... 37
1.5.3. Extracto de Té Verde .......................................................................................................... 40
1.6. TECNOLOGÍAS DE OBSTÁCULOS ...................................................................................... 41
2. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 44
3. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................ 45
3.1. MATERIA PRIMA.................................................................................................................... 45
3.2. PREPARACIÓN DEL BATIDO ............................................................................................... 46
3.3. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y TÉ VERDE PARA LA PRESERVACIÓN DEL
BATIDO ................................................................................................................................................ 46
3.3.1. Preparación de las muestras .............................................................................................. 46
3.3.2. Tratamiento con extracto de té verde ................................................................................. 47
3.3.3. Tratamientos de irradiación............................................................................................... 47
3.3.4. Almacenamiento y muestreo............................................................................................... 48
3.3.5. Indicadores de calidad ....................................................................................................... 48
a. Calidad microbiológica ........................................................................................................................ 48
i. Bacterias aerobias mesófilas ............................................................................................................ 48
ii. Enterobacterias ............................................................................................................................... 48
iii. Mohos y Levaduras ....................................................................................................................... 48
b. Capacidad antioxidante ....................................................................................................................... 49
c. Actividad enzimática ........................................................................................................................... 50
d. Calidad sensorial ................................................................................................................................. 51
3.3.6. Análisis estadísticos ........................................................................................................... 52
3.4. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y NISINA PARA LA PRESERVACIÓN DEL BATIDO
............................................................................................................................................................... 52
3.4.1. Radioresistencia de Listeria innocua y Listeria monocytogenes ....................................... 52
a. Preparación de los inóculos ................................................................................................................. 52
i. Listeria innocua............................................................................................................................... 52
ii. Listeria monocytogenes .................................................................................................................. 53
b. Preparación de las muestras ................................................................................................................. 53
2
c. Tratamientos de irradiación ................................................................................................................. 53
d. Recuentos de Listeria y determinación de radioresistencia ................................................................. 53
3.4.2. Efecto de la combinación de irradiación y nisina sobre la calidad microbiológica del
batido ................................................................................................................................................. 53
a. Preparación del inóculo ....................................................................................................................... 54
c. Tratamientos con nisina ....................................................................................................................... 54
d. Tratamientos de irradiación ................................................................................................................. 55
e. Almacenamiento y muestreo ............................................................................................................... 55
f. Recuentos microbiológicos .................................................................................................................. 55
i. L. innocua ........................................................................................................................................ 55
ii. Microbiota nativa ........................................................................................................................... 55
g. Análisis estadísticos ............................................................................................................................ 55
3.5. TRATAMIENTOS DE ULTRASONIDO PARA LA PRESERVACIÓN DEL BATIDO......... 55
3.5.1. Efecto de tratamientos de ultrasonido sobre la calidad del batido .................................... 56
a. Preparación de muestras ...................................................................................................................... 56
b. Tratamientos de US ............................................................................................................................. 56
c. Perfil térmico ....................................................................................................................................... 57
d. Indicadores de calidad ......................................................................................................................... 57
i. Indicadores fisicoquímicos (pH, SST) ............................................................................................. 57
ii. Actividad enzimática ...................................................................................................................... 57
iii. Contenido de polifenoles totales y capacidad antioxidante ........................................................... 58
iv. Contenido de betalaínas ................................................................................................................. 58
v. Calidad microbiológica................................................................................................................... 59
3.5.2. Optimización de tratamientos de US .................................................................................. 59
a. Preparación de muestras ...................................................................................................................... 59
b. Tratamientos de US ............................................................................................................................. 60
c. Indicadores de calidad ......................................................................................................................... 60
i. Indicadores fisicoquímicos (pH, SST) ............................................................................................. 60
iii. Contenido de betalaínas ................................................................................................................ 60
iv. Calidad microbiológica ................................................................................................................. 60
d. Análisis estadísticos ............................................................................................................................ 60
3.6. COMBINACIÓN DE ULTRASONIDO Y ANTIMICROBIANOS NATURALES PARA LA
PRESERVACIÓN DEL BATIDO ......................................................................................................... 61
3.6.1. Preparación de muestras ................................................................................................... 61
3.6.2. Tratamientos de US y agregado de AN .............................................................................. 61
3.6.3. Almacenamiento y muestreo............................................................................................... 62
a. Indicadores fisicoquímicos (pH, SST, Apariencia visual) ................................................................... 62
b. Contenido de polifenoles totales y capacidad antioxidante ................................................................. 62
c. Contenido de betalaínas ....................................................................................................................... 62
d. Calidad microbiológica ....................................................................................................................... 62
3.6.5. Efecto de la combinación de US y AN frente a L. innocua y E. coli .................................. 63
a. Preparación de los inóculos ................................................................................................................. 63
i. L. innocua ........................................................................................................................................ 63
ii. E coli .............................................................................................................................................. 63
c. Tratamientos de US y agregado de AN ............................................................................................... 63
d. Almacenamiento y muestreo ............................................................................................................... 63
e. Recuentos microbiológicos ................................................................................................................. 64
i. L. innocua ........................................................................................................................................ 64
ii. E. coli ............................................................................................................................................. 64
3.6.6. Análisis estadísticos ........................................................................................................... 64
3
4. RESULTADOS................................................................................................................. 65
4.1. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y TÉ VERDE PARA LA PRESERVACIÓN DEL
BATIDO ................................................................................................................................................ 65
a. Calidad microbiológica ........................................................................................................................ 65
b. Capacidad antioxidante (DPPH y FRAP) ............................................................................................ 67
c. Actividad enzimática ........................................................................................................................... 70
d. Calidad sensorial ................................................................................................................................. 72
4.2. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y NISINA PARA LA PRESERVACIÓN DEL BATIDO
............................................................................................................................................................... 74
4.2.1. Radioresistencia de Listeria innocua y Listeria monocytogenes ....................................... 74
4.2.2. Efecto de la combinación de irradiación y nisina sobre la calidad microbiológica del
batido ................................................................................................................................................. 76
4.3. TRATAMIENTOS DE ULTRASONIDO PARA LA PRESERVACIÓN DEL BATIDO......... 81
4.3.1. Efecto de tratamientos de ultrasonido sobre la calidad del batido .................................... 81
a. Perfil térmico ....................................................................................................................................... 82
................................................................................................................................................................. 83
b. Indicadores de calidad ......................................................................................................................... 83
i. pH .................................................................................................................................................... 83
ii. Sólidos Solubles Totales (SST) ...................................................................................................... 84
iii. Actividad enzimática ..................................................................................................................... 85
iv. Contenido de polifenoles totales (CPT) y capacidad antioxidante (DPPH y FRAP) ..................... 88
v.Contenido de betalaínas ................................................................................................................... 92
vi. Calidad microbiológica ................................................................................................................. 95
4.3.2. Optimización de tratamientos de ultrasonido .................................................................... 98
a. Indicadores de calidad ......................................................................................................................... 99
i. Indicadores fisicoquímicos (pH, Sólidos Solubles Totales (SST)) .................................................. 99
iii. Contenido de betalaínas .............................................................................................................. 100
iv. Calidad microbiológica ............................................................................................................... 101
4.4. COMBINACIÓN DE ULTRASONIDO Y ANTIMICROBIANOS NATURALES PARA LA
PRESERVACIÓN DEL BATIDO ....................................................................................................... 103
4.4.1. Tratamientos de ultrasonido y agregado de antimicrobianos naturales .......................... 103
4.4.2. Indicadores de calidad ..................................................................................................... 104
a. Indicadores fisicoquímicos (pH, Sólidos Solubles Totales (SST), Apariencia visual) ....................... 104
c. Contenido de polifenoles totales (CPT) y capacidad antioxidante (DPPH y FRAP) ......................... 108
d. Contenido de betalaínas ..................................................................................................................... 111
............................................................................................................................................................... 112
............................................................................................................................................................... 112
e. Calidad microbiológica ...................................................................................................................... 112
4.4.3. Efecto de la combinación de ultrasonido y antimicrobianos naturales frente a Listeria
innocua y Escherichia coli............................................................................................................... 117
5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 121

6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 124
4
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
A mis directoras María Verónica Fernández y María Victoria Agüero, por la enseñanza,
paciencia y dedicación durante el desarrollo de esta Tesis. Gracias al apoyo constante y las
palabras de aliento de ambas, esta Tesis pudo desarrollarse en tiempo y forma, y por sobre todo,
disfrutando el proceso de trabajo.
A Rosa Jagus, Carolina Ollé, Sofía Berti, Cintia García, Samanta Nievas y Pablo Perez
por compartir conmigo su espacio y materiales de trabajo.
A mi mamá, papá y hermano, gracias a mi mamá por sus palabras siempre positivas y
acompañarme ante cualquier situación adversa; a mi papá por su apoyo, bondad y por ser el sostén
de la familia; y a mi hermano por ser mi cómplice en el día a día.
A Gustavo, profesor particular con quien hice química por UBAXXI, una de las primeras
personas que tuvo confianza en mí y me ayudó en los primeros años de la carrera.
A mis amigas, las que están a mi lado en todo momento, las que no te dejan abandonar tus
sueños nunca y, además, te van a brindar su ayuda siempre. Gracias por ser tan incondicionales.
¡Imposible nombrar a todas!.
A mis amigos/as del CBC, por mantener la amistad, salidas a comer y cumpleaños a pesar de
que todos/as seguimos carreras diferentes.
A mis amigos/as de toda la carrera de ingeniería, en especial a Caro, Agus, Luli, Tomi, Nana
y Juampi. Son quienes hicieron la carrera mucho mas divertida, cada cual con sus
particularidades. ¡Gracias infinitas!.
A Tomás Ben y a todo el equipo de trabajo de BEGROUND, por brindarme mi primer

empleo, por la confianza, comprensión, inclusión y solidaridad que tuvieron conmigo.
A la Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ingeniería, Facultad de Ciencias Exactas

y Naturales y Facultad de Farmacia y Bioquímica, por permitir que tantos estudiantes puedan
llegar a la realización de su carrera. Gracias a todos/as los/as que hacen posible la educación
pública.
A la Beca Estímulo UBACyT, por el apoyo financiero brindado para la realización de esta
Tesis.
5
Resumen
RESUMEN
Recientemente, la tendencia hacia la búsqueda de alimentos más nutritivos, saludables y

prácticos ha posicionado al sector de bebidas de frutas y verduras (F&V) como uno de los sectores
de mayor crecimiento de la industria alimentaria. Sin embargo, estos productos tienen una vida
útil corta, asociada al deterioro microbiano y enzimático. La búsqueda de métodos alternativos de
preservación que permitan no solo prolongar la vida útil de los productos, sino también preservar
su calidad y garantizar su inocuidad ha impulsado el interés en las tecnologías no térmicas. En
general, las tecnologías no térmicas son capaces de inactivar tanto microorganismos patógenos y
de deterioro como las principales enzimas deteriorativas, proporcionando alimentos seguros y
frescos con cambios mínimos en sus propiedades nutricionales, fisicoquímicas y sensoriales. A
su vez, la aplicación de tratamientos combinados de preservación constituye un excelente enfoque
para mejorar la calidad general de los productos ya que requiere intensidades más "suaves" que
cuando los tratamientos se aplican de manera individual, logrando muchas veces efectos
sinérgicos. Sin embargo, es bien sabido que los efectos de los tratamientos dependen fuertemente
de la matriz alimentaria. En este sentido, el estudio de los efectos de las tecnologías no térmicas
sobre batidos de F&V ha sido limitado, siendo un área de vacancia, especialmente en lo referido
a la aplicación de tecnologías combinadas.
En el marco de esta Tesis se estudió y optimizó el proceso de conservación de un batido mixto

de F&V mediante la aplicación de dos tecnologías de preservación no térmicas, la radiación
gamma y el ultrasonido, en combinación con el agregado de los antimicrobianos naturales, té
verde, nisina y natamicina, con el objetivo de minimizar factores de deterioro y maximizar
atributos de calidad. Se evaluó tanto el efecto de los tratamientos combinados seleccionados sobre
la estabilidad y vida útil de los batidos, como su efectividad para asegurar su inocuidad frente a
posibles contaminaciones con microorganismos de interés.
6
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
1.1. DIETA SALUDABLE Y CONSUMO DE FRUTAS Y VERDURAS
En los últimos años, ha resultado evidente la importancia de llevar una dieta y vida saludable,
dado que su carencia genera un gran impacto negativo en la salud, para todos los rangos etarios y
clases sociales. En este sentido, y con el objetivo de obtener información sobre el estilo de vida
de los ciudadanos, en Argentina se han llevado a cabo dos Encuestas Nacionales de Nutrición y
Salud (ENNyS y ENNyS 2), de manera de describir el estado nutricional y de salud de la
población, y de sus factores asociados (como actividad física, consumo de sodio), útiles para el
diseño y evaluación de políticas y programas de salud. Adicionalmente, para caracterizar los
hábitos y patrones de consumo alimentario de la población, tanto en niños como en adolescentes
y adultos (ENNyS 2, 2019). Este tipo de seguimiento tiene una gran importancia social, debido a
la existencia de grupos con necesidades nutricionales especiales a las que es preciso atender. Por
ejemplo, el caso de personas que padecen enfermedades crónicas, como hipertensión y/o
colesterol alto; los niños, para los que la malnutrición puede impactar fuertemente en su
desarrollo; las embarazadas, siendo esencial tanto para la salud de la madre como para el
desarrollo del niño; y las personas de edad avanzada, entre otros (PNUD/UNFPA, UNICEF y
PMA, 2009).
Uno de los hechos que ha influido fuertemente en los hábitos alimenticios de cientos de
millones de personas, fue la creciente migración de la población desde zonas rurales hacia las
grandes ciudades. De esta manera, las personas se alejaron de las zonas de producción de
alimentos primarios, dificultando su acceso a una dieta variada y nutritiva con suficientes frutas
y verduras (F&V). En su gran mayoría, comenzaron a satisfacer sus necesidades alimentarias, en
una medida considerable, mediante alimentos procesados y preparados, de pobre valor nutritivo
(OMS/FAO, 2003).
La importancia e influencia de la dieta sobre la salud es indiscutible. Hoy en día, es bien sabido
que las enfermedades crónicas, como las que generan afecciones coronarias y ciertos tipos de
cáncer, en su mayoría están ligadas a excesos o desequilibrios dietéticos. Entre las
recomendaciones dietarias de los organismos gubernamentales y prestigiosas asociaciones
nacionales e internacionales de profesionales de la salud, se encuentran una menor ingesta de
grasas (especialmente las saturadas), azúcares, sodio y colesterol, un mayor consumo de frutas y
hortalizas y, en consecuencia, el mantenimiento de un nivel de peso adecuado (FDA, USDA,
1998). Con respecto al consumo de F&V, es sabido que resulta fundamental para garantizar una
dieta diversificada y nutritiva, dado que son una rica fuente de nutrientes, fibra alimentaria y
diversos compuestos bioactivos que desempeñan un papel importante en la salud (Mytton y col.,
2014). La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda consumir más de 400 gramos de
frutas y verduras al día para mejorar la salud general (OMS, 2002). Al tratarse de alimentos de
bajo contenido calórico y con gran proporción de agua en general, se ha demostrado que el
incremento de su consumo en corto plazo (sin especificación de cambios en otros alimentos de la
dieta) no tiene relación con una ganancia de peso corporal, a la vez que pueden ser beneficiosos
para prevenir la obesidad y mantener un peso saludable (Mytton y col., 2014). Sin embargo, a
pesar de las recomendaciones y las numerosas campañas realizadas en los últimos años, su
consumo sigue siendo bajo (Martins y col., 2013; Moubarac y col., 2014; Crovetto y col., 2012).
Los obstaculizadores más importantes a destacar son: que no satisfacen el hambre de manera
7
Introducción
prolongada, que la gente prefiere productos con alto contenido en grasa, azúcar y sal, que su
consumo diario no está incluido en los hábitos de la población y también suele estar relacionado
el elevado precio de éstos (Olavarría y Zacarías, 2011).
En Argentina, los patrones alimentarios han empeorado en las últimas décadas. El consumo
de frutas y verduras es muy bajo, los resultados de la ENNyS 2, mencionada en los primeros
párrafos, sobre la frecuencia del consumo de F&V reflejaron una carencia nutritiva en la
población: se observó que 3 de cada 10 individuos refirió haber consumido frutas frescas al menos
una vez al día durante los tres meses de duración del seguimiento de la encuesta. En cuanto a
verduras el 37,8% de la población reportó haberlas consumido al menos una vez al día. También
se vio que las personas con mayor nivel adquisitivo son las que más consumen estos productos
frescos. Por otro lado, el 36,7% de la población refirió haber consumido bebidas artificiales con
azúcar al menos una vez al día. En este sentido, los datos indican que la proporción de población
que refiere haber consumido diariamente los alimentos recomendados como F&V, se encuentra
por debajo de las recomendaciones de consumo de las Guías Alimentarias para la población
argentina (GAPA) y con un déficit notable. Por el contrario, la proporción de la población que
refiere consumir diaria o frecuentemente alimentos no recomendados por poseer alto contenido
de azúcar, grasas y sal y bajo valor nutricional, es considerado alarmante (ENNyS 2, 2019).
1.1.1. Algunos Problemas por el bajo consumo de frutas y verduras
A principios del 2002 se realizó la Consulta Mixta OMS/FAO de Expertos en Régimen

Alimentario, Nutrición y Prevención de Enfermedades donde se retomaron los trabajos de un
grupo de estudio de la OMS sobre Dieta, Nutrición y Prevención de Enfermedades No
Transmisibles, que se había reunido en 1989 para formular recomendaciones destinadas a prevenir
las enfermedades crónicas y reducir sus efectos (OMS, 1990). La consulta reconoció que la
epidemia creciente de enfermedades crónicas que afecta tanto a los países desarrollados como a
los países en desarrollo está relacionada con los cambios de los hábitos alimentarios y del modo
de vida. Por ello, se han llevado a cabo investigaciones donde se examinaron y analizaron
detalladamente datos científicos sobre la índole y la solidez de las relaciones entre la dieta y las
enfermedades crónicas, junto con las modalidades de trabajo, el ocio y el envejecimiento de la
población mundial, demostrando que son factores que aumentan la incidencia de cáncer,
enfermedades cardiovasculares (ECV), accidentes cerebrovasculares, enfermedades mentales,
diabetes y otras afecciones vinculadas a la obesidad, las cuales son conocidas como Enfermedades
No Transmisibles (ENT) (OMS/FAO, 2003).
Se ha constatado que la carga de enfermedades crónicas ha aumentado rápidamente en todo el

mundo con el correr de los años. En 2002, se atribuyeron al bajo consumo de F&V 2,7 millones
de defunciones (4,9%). De la carga atribuible a ese bajo consumo, aproximadamente el 85% se
debía a enfermedades cardiovasculares, y el 15% a cánceres (OMS, 2002). Con respecto a los
datos informados por la OMS y la FAO (OMS/FAO, 2003), se esperaba que la proporción de
enfermedades crónicas aumente del 46% al 57% para 2020, haciendo evidente la necesidad de
tomar acción de manera inmediata y eficiente. Sin embargo, publicaciones recientes (ENNyS 2,
2019) estiman que 1 de cada 5 muertes a nivel global se siguen atribuyendo a una alimentación
inadecuada. Solo en 2017 en 195 países, y sin contar la obesidad, se produjeron 11 millones de
muertes causadas por dietas inadecuadas y, entre las principales causas independientes, se
8
Introducción
encontraron que el alto consumo de sodio y el bajo consumo de frutas ocasionaron la mayoría de
las muertes por ECV, cáncer y diabetes.
A nivel global, tanto la desnutrición clásica como el exceso de peso son abordados como
manifestaciones de un mismo problema, estrechamente vinculado al sistema global de producción
industrial de alimentos. Según la OMS, la desnutrición definida en salud pública como un estado
antropométrico deficiente, es principalmente la consecuencia de un régimen de alimentación
inadecuado y de infecciones frecuentes, que dan lugar a carencias de calorías, proteínas, vitaminas
y minerales. No obstante, el enfoque sobre el derecho humano a la alimentación y su relación con
el derecho a la salud se ha modificado para incluir la perspectiva de alimentación adecuada y
nutritiva, ampliando la concepción histórica que consideraba el derecho a la alimentación como
una garantía de protección contra el hambre (ENNyS 2, 2019). Las Guías Alimentarias para la
población argentina establecen recomendaciones de consumo para cada grupo de alimentos en la
población mayor de 2 años (GAPA, 2016). En este contexto, también se pueden encontrar las
campañas mundiales de los organismos internacionales como, por ejemplo, el programa "5 al
día", una campaña de marketing social cuyo objetivo es promover el consumo de frutas y verduras
en 5 o más porciones al día (Olavarría y Zacarías, 2011). Recientemente y con el objetivo de
disminuir esta problemática sanitaria global, el tema se ha puesto en la agenda internacional. Es
así como, los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS) adoptados en 2015 instan a poner fin a
la malnutrición en todas sus formas y para todas las personas en el año 2030. Las principales
medidas recomendadas en estos instrumentos internacionales incluyen: la promoción de sistemas
alimentarios sostenibles para mejorar la disponibilidad y asequibilidad de alimentos frescos como
frutas y verduras; las prohibiciones integrales de publicidad, promoción y patrocinio de alimentos
y bebidas no saludables; la mejora de la calidad nutricional de las políticas sociales alimentarias,
entre otras (ENNyS 2, 2019).
En el análisis de las promociones del consumo saludable, se constata una importante

desventaja, los recursos son muy limitados como para hacer una fuerte campaña publicitaria.
Expertos en marketing afirman que la imagen que tiene un producto en la mente del consumidor
constituye la esencia del marketing exitoso, de esta forma las reacciones de las personas se ajustan
al posicionamiento que se logró con la promoción del producto en vez de tener en cuenta sus
características reales. Adicionalmente, estos programas compiten con una fuerte y abundante
cantidad de publicidad sobre alimentos altos en grasa, azúcar y sal provenientes de empresas que
disponen de una importante cantidad de recursos para ello y profesionales expertos en el área de
las comunicaciones (Olavarría y Zacarías, 2011).
Es por ello que resulta evidente la necesidad, no solo de seguir trabajando y reforzar las
campañas de concientización sobre la importancia de llevar una dieta saludable y el consumo de
frutas y verduras, sino en poder ofrecer a la población alimentos nutritivos, saludables y
accesibles. Como tecnólogos de alimentos es de gran relevancia poder hacer un aporte en este
sentido.
1.1.2. Demanda de alimentos saludables
Los incentivos para la comercialización y producción de alimentos más saludables deberían

ser un enfoque de salud pública y prioridades de las políticas públicas, las cuales demandan
criterios generales para con la industria alimentaria que se resumen en lo siguiente: menos grasas
saturadas, sal y azúcares, más frutas y verduras, y etiquetado eficiente de los alimentos
9
Introducción
(OMS/FAO, 2003). No obstante, no solo los organismos nacionales e internacionales son los que
demuestran preocupación por el consumo saludable en la sociedad. La importancia adquirida por
el binomio alimentación-salud ha desarrollado una particular sensibilidad en los individuos frente
a la posible relación entre su estado de salud y los alimentos que consume. De hecho, en los
últimos años, se estableció un nicho de consumidores que es cada vez más influyente (o más
predominante), altamente informados y conscientes del impacto de la dieta en la salud que buscan
alimentos más naturales, nutritivos, saludables y libres de aditivos químicos. Asimismo, debido
al ajetreado ritmo de vida actual, los consumidores buscan practicidad en la preparación y
consumo de los productos que eligen. En tal sentido, se considera como saludable a todo producto
alimenticio cuya ingestión conlleva algún tipo específico de efecto positivo sobre la salud, además
del nutritivo. Es sabido que hay una gran diversidad de alimentos que están compuestos por miles
de sustancias bioactivas y compuestos antioxidantes tales como vitaminas, ácidos fenólicos,
flavonoides, carotenoides, minerales, aminoácidos y ácidos grasos que ejercen actividades
reguladoras en el cuerpo humano (Zulueta y col., 2007).
En respuesta a la demanda de estos consumidores más informados, la industria alimentaria,

comercializa desde finales del siglo XX productos alimenticios calificados como saludables,
capaces de optimizar las funciones corporales y de alcanzar niveles aceptables de bienestar y de
buena salud; los elaboradores y tecnólogos de alimentos han tenido la necesidad de identificar
todos los compuestos de estos productos, aclarar cuáles son los mecanismos implicados en los
efectos que producen, diseñar nuevas formulaciones que sigan cumpliendo estos objetivos, y
poner a punto tecnologías que permitan dar una forma comercial a las nuevas formulaciones
establecidas (Bello, 2006).
Por otro lado, una manera de apoyar y fomentar patrones de alimentación saludable es
disminuir la venta de productos ultra-procesados, mediante regulaciones legales, aumentando el
desarrollo y la oferta de productos más saludables en el mercado y, por ende, lograr patrones de
alimentación más favorables para la salud de las personas. En esta línea, actualmente existen
muchas categorías de alimentos saludables comercializados, por ejemplo, productos destinados a
una alimentación especial, alimentos enriquecidos y fortificados, alimentos funcionales, entre
otros. En los últimos años, ha habido un interés creciente en los productos “ready-to-eat”, es decir,
listos para el consumo. Como ejemplo se pueden nombrar las frutas y vegetales frescas
mínimamente procesadas, las cuales ofrecen al consumidor una alta calidad nutricional,
conveniencia, y sabor mientras se mantiene su característica de producto fresco y natural, a la vez
que se garantiza su seguridad. Adicionalmente estos productos cumplen con las altas exigencias
de los consumidores actuales a precios generalmente accesibles, fundamentalmente en los países
desarrollados (Artés y col., 2011). Otros productos saludables cuyo mercado está creciendo
ampliamente, son los jugos de F&V, las mezclas de jugos, los batidos y las bebidas fermentadas,
las cuales se han vuelto una forma cada vez más popular de consumir frutas y verduras
(Bevilacqua y col., 2018).
1.1.3. Bebidas naturales
Las bebidas a base de frutas y verduras se han posicionado en un sector de la industria

alimentaria muy demandado, por ser nutritivas, saludables y prácticas. Son una excelente fuente
de compuestos beneficiosos para la salud, con sabores y colores atractivos para todos los grupos
de edad y además son muy refrescantes. Representan una de las áreas de más rápido crecimiento
10
Introducción
en lo que refiere a productos alimenticios, tal es así que hoy en día, casi el 60% de los adultos
consumen jugos de frutas (Morales de la Peña y col., 2016).
Generalmente, los jugos de frutas comercializados tienen un porcentaje mínimo de fruta

natural impuesto por regulaciones internacionales o de cada país, junto con otros compuestos
(agua, azúcares, conservantes). Si bien estas bebidas han sido muy publicitadas por sus envases y
etiquetas, ya sea por las imágenes y/o el color, y a la vez el color del jugo mismo, que
proporcionan la idea de un producto saludable, no son bebidas 100% naturales, por la presencia
de agregados generalmente en mayor proporción; además de poseer un alto grado de
procesamiento, lo cual está siendo cada vez más rechazado por los consumidores. Esto ha
motivado a científicos y tecnólogos a crear los llamados “batidos”, los cuales son mezcla de frutas
y/o verduras que logran particulares texturas, estabilidad física y química, colores, aromas y
frescura, y además, a diferencia de los jugos, los batidos conservan las fibras de las frutas, que
son las que generan saciedad al consumidor; también se han probado combinaciones con leches
de origen vegetal o animal, proporcionando así una concentración considerable de diferentes
compuestos bioactivos que pueden mejorar las propiedades funcionales de la mezcla y, en algunos
casos, mejorar sus características fisicoquímicas, haciéndolos más atractivos (Morales de la Peña
y col., 2016).
Sin embargo, los métodos de preservación tradicionales que logran satisfactoriamente tanto la
inactivación de microorganismos como de enzimas presentan como desventaja una significativa
pérdida nutritiva y sensorial, entre otros atributos característicos de los jugos frescos (Rickman y
col., 2007).
Recientemente, añadiendo información sobre la relevancia que han cobrado estos batidos, se
han desarrollado soluciones alternativas a los productos probióticos consumidos mediante
productos derivados de la leche (queso, yogur, helados, entre otros), especialmente a través del
diseño de bebidas de frutas y/o vegetales, siendo esta una iniciativa factible y de gran interés
dentro de la industria de alimentos. El objetivo que se plantea en el trabajo de Bernal y col. (2017)
es revisar las condiciones de adición de microorganismos probióticos y de agentes prebióticos en
productos de origen vegetal y analizar las características que permiten el uso de estas matrices
alimentarias como vehículos de inclusión en el desarrollo de bebidas funcionales. Sin embargo,
como contraparte existen diversos factores como la composición fisicoquímica y bioactiva,
además de algunos desafíos tecnológicos y el efecto sensorial que limitan la viabilidad del
microorganismo y la estabilidad del producto en almacenamiento. Aun así, estas matrices
vegetales han demostrado ser excelentes sustratos para la síntesis celular (Hill y col., 2014), ya
que son fuentes fundamentales de agua, vitaminas (vitamina C, vitaminas del grupo B,
provitamina A) y fitoquímicos, entre otros componentes de gran importancia, que pueden resultar
en un ambiente propicio y agradable para la supervivencia de probióticos que fuesen inoculados.
Por otro lado, Genevois (2017) desarrolló un producto a base de polvo de calabaza conteniendo
L. casei y lo utilizó como suplemento dietario en dos bebidas comerciales, obteniendo resultados
prometedores como, un incremento de la viscosidad y un porcentaje de supervivencia >78% del
probiótico después de la digestión gastrointestinal in vitro (DGI), además de buenas calificaciones
de aroma, textura y aceptabilidad global de las bebidas.
Sin dudas el mercado de bebidas naturales a base de F&V presenta grandes ventajas
competitivas y versatilidad. Según el último reporte de Nielsen (2016), Argentina representa un
nicho importante para este tipo de producto. De hecho, una tendencia global que se encuentra en
auge en nuestro país, es la comercialización de bebidas 100% naturales, a base de F&V, sin
pasteurizar y sin conservantes (Research, 2020). En este sentido, es muy importante avanzar no
11
Introducción
solo en el desarrollo de formulaciones nutritivas y atractivas, sino también en el estudio e

implementación de tecnologías que permitan asegurar su calidad e inocuidad a la vez que se
mantiene su característica de producto natural.
1.2. APROVECHAMIENTO DE RECURSOS PARA LA INDUSTRIA
En el año 2013, la FAO aseguró que el 54% del desperdicio de alimentos en el mundo se
produce en las etapas iniciales de la producción, manipulación y almacenamiento postcosecha y
el 46% restante en las etapas de procesamiento, distribución y consumo de los alimentos (FAO,
2013). Por su parte, existen numerosas investigaciones que demuestran altas tasas de pérdida y
desperdicio de frutas, verduras y/o porciones de estas; dejando en evidencia su mal
aprovechamiento y el desperdicio de nutrientes esenciales para la población. Como ejemplo, en
Argentina, el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), afirma que sólo se consume
la mitad de las frutas y hortalizas que se cosechan. Las causas son variadas, pero entre ellas se
destacan dificultades de acceso a la tecnología e innovación en los procesos, limitaciones en
términos de conservación y transporte, necesidad de desarrollar procesos alternativos para
productos perecederos, deber de educar y concientizar a la población respecto la reutilización de
los excedentes.
En contraste, la utilización de estos subproductos que pueden resultar nutritivos y beneficiosos

ha adquirido un gran interés en la actualidad, siendo objeto de investigación en muchos países.
De esta manera, se han encontrado diversas utilizaciones de los subproductos de F&V, dado el
potencial de sus fitoquímicos y fibras dietéticas (Schieber y col., 2001; O'Shea y col., 2012).
Un ejemplo de esto puede apreciarse en México, donde se consumen altas cantidades de

papaya y su procesamiento genera muchas pérdidas. Por ello, se llevaron a cabo estudios donde
se desarrollaron nuevas alternativas para la utilización de los subproductos, dando valor agregado
a los mismos para ofrecer al mercado, manteniendo así una gran diversidad de uso: papaya fresca,
papaya deshidratada, en polvo, cristalizada y en cubo, puré de papaya, mermelada y almíbar, jugo
de papaya y papaína (Bolom y col., 2017).
En España, se realizó un estudio de caracterización y aprovechamiento de tubérculos andinos

inexplorados y subproductos industriales de remolacha azucarera y naranja. Los extractos
metanólicos de los tubérculos revelaron la presencia de flavonoles, derivados hidroxicinámicos,
carotenos, vitamina C y antocianinas, con importantes propiedades antioxidantes. Mediante el
consumo del residuo fresco, pienso y pectina cítrica se identificaron mejoras fisiológicas en
ratones previamente inducidos a enfermedades inflamatorias intestinales. Finalmente, los
resultados obtenidos representaron un aporte valioso para su uso como fuentes de compuestos
bioactivos no convencionales, promoviendo el crecimiento de pequeños agricultores y
contribuyendo al desarrollo sostenible (Pacheco Tigselema, 2019).
En Argentina, se puede citar el caso de las hojas y tallos de remolacha, subproductos de la

comercialización de la raíz de remolacha, que representan gran parte de la masa cosechada y que
hoy en día constituyen una porción de la planta que no es explotada y se gestionan como un
subproducto de desecho. Se ha demostrado que estos subproductos son fuente de fitoquímicos
(clorofila, carotenoides, polifenoles totales, betacianinas, betaxantinas, entre otros) del orden, o
ligeramente superiores, de los informados para otros vegetales de hoja de consumo habitual,
destacándose por sus altos contenidos en fibra alimentaria, hierro y su elevada capacidad
12
Introducción
antioxidante (70%RSC) (Fernandez y col., 2014). Asimismo, se demostró que su calidad

microbiológica es adecuada desde el punto de vista sanitario, con recuentos de microflora nativa
similares a los encontrados en otros vegetales de hojas de consumo común. Teniendo en cuenta
estas características, se han realizado estudios que demuestran la posibilidad y las ventajas de su
uso en la elaboración tanto de un producto mínimamente procesado (hojas de remolacha
desinfectadas, cortadas, envasadas en atmósferas modificadas con o sin agregado de
antimicrobianos naturales), como en la elaboración de un batido de F&V conteniendo este
subproducto y estabilizado por altas presiones hidrostáticas. Asimismo, para este subproducto se
desarrollaron procesos de extracción de bioactivos y estos extractos fueron utilizados para
enriquecer una bebida de frutas y verduras (Fernandez y col., 2017; 2018; 2019).
También, en Argentina, se han proporcionado diversos usos a la calabaza y sus subproductos;

por ejemplo, la calabaza (Cucurbita moschata Duchesne ex-Poiret) fue utilizada para formular
un snack fortificado con hierro y Lactobacillus casei ATCC-393. Se determinó que el 55% del
hierro resultó bioaccesible a nivel intestinal, y que su presencia y el almacenamiento afectaron
tanto la viabilidad del probiótico (>107 UFC/g) de calabaza durante 14 días a 8°C, como su
tolerancia a la digestión gastrointestinal in vitro (DGI). El producto fortificado obtuvo buena
aceptabilidad global y el agregado de hierro no fue percibido. Además, los subproductos del
proceso anterior, pulpa y cáscara de calabaza, fueron satisfactoriamente utilizados como sustrato-
soporte de Lactobacillus casei presentando un recuento viable >108 UFC/g. La supervivencia del
probiótico luego de la estabilización y de la DGI fue >74% durante 28 días de almacenamiento a
temperatura ambiente (Genevois, 2017). Finalmente, en estos estudios llevados a cabo por
Genevois (2017) se presenta evidencia sobre la potencial utilización de tejido vegetal de calabaza
(Cucurbita moschata Duchesne ex-Poiret) para la fortificación con hierro y L. casei ATCC-393,
obteniendo un producto con buenas características nutricionales y organolépticas; y la utilización
de los subproductos como sustrato y soporte del probiótico para la obtención de un nuevo
ingrediente con mayor resistencia a factores de estrés tecnológicos y biológicos, buenas
propiedades funcionales, y con alto contenido en fibra dietaria.
Estos resultados posicionan a una gran variedad de subproductos como materias primas de
valor para el desarrollo de procesos de revalorización. Adicionalmente, se está promoviendo la
realización de nuevos estudios sobre microrganismos nativos de alimentos vegetales para ser
utilizados como starters o iniciadores de alimentos probióticos. Sin embargo, actualmente, la
información disponible sobre el aislamiento de este tipo de microorganismos beneficiosos
provenientes de fuentes vegetales es menor en comparación con los hallados mediante los
productos lácteos (Bernal Castro y col., 2017).
De esta forma, con nuevos trabajos y hallazgos de esta índole, se espera un mayor
aprovechamiento tecnológico dentro de la cadena agroindustrial evitando las pérdidas
postcosecha y promoviéndose el uso de las mismas para nuevas formulaciones. Al ser Argentina
un país productor en este campo alimenticio donde las pérdidas postcosecha son altas es
imprescindible generar nuevas estrategias tecnológicas que permitan el desarrollo de nuevos
productos aprovechando los recursos de la biodiversidad.
13
Introducción
1.3. CALIDAD E INOCUIDAD DE FRUTAS, VERDURAS Y

BEBIDAS
La mayor parte de la calidad de las bebidas, batidos o jugos depende de su materia prima o
calidad de los ingredientes, es decir, frutas, vegetales, agua, edulcorantes, aditivos, conservantes,
y otros componentes aportadores del flavor. Para la obtención de productos de primera calidad,
se necesitan frutas frescas de alta calidad, que estén libres de lesiones o contaminación, deben
estar libres de cualquier riesgo microbiano, como la presencia a simple vista de mohos, o cualquier
microorganismo patógeno que comprometa la calidad final y la seguridad del producto. El control
de todos los parámetros fisicoquímicos y sensoriales como la textura, la acidez, los °Brix, la
concentración de pulpa, los niveles de aditivos, el sabor, color, etc., deben realizarse
adecuadamente de acuerdo con el tipo de producto final (Grumezescu y Holban, 2019). De esta
forma, cuando se busca desarrollar un nuevo producto o modificar un producto existente, ya sea
por los ingredientes utilizados o las operaciones aplicadas en su elaboración y conservación, es
necesario evaluar los parámetros fisicoquímicos, microbiológicos, y sensoriales con el fin de
establecer la factibilidad de aplicación de las operaciones. Además de asegurar tanto la inocuidad
del producto como su buen valor nutricional y la futura aceptabilidad por parte de los
consumidores.
1.3.1. Calidad Microbiológica
Las frutas y vegetales frescos tienen una carga microbiológica natural que normalmente no es
patógena para los seres humanos (Ahvenainen, 1996). Los tipos de microorganismos y la cantidad
en la que están presentes en estos productos frescos son altamente variables. Los vegetales frescos
luego de la cosecha contienen poblaciones de bacterias mesófilas de alrededor de 103–109 UFC/g,
esto depende del tipo de producto y de las condiciones de crecimiento (Oliveira y col., 2010). Las
bacterias Gram negativas (G-) predominan en la microflora natural asociada con la mayoría de
las verduras, mientras que los mohos y levaduras generalmente predominan en la microflora
natural de frutas (Burnett y Beuchat, 2001). La microflora natural de los productos frutihortícolas
se compone en gran parte de bacterias como Pseudomonas spp, Erwinia herbicola,
Flavobacterium agglomerans, Xanthomonas y Enterobacter, así como varias especies de mohos
tales como Alternaria, Penicillium, Fusarium y Aspergillus. Las Pseudomonas spp. normalmente
predominan en productos vegetales, representando en muchos casos entre un 50-90% de la
población microbiana (Ramos y col., 2013). Las bacterias acido lácticas como Leuconostoc
mesenteroides y Lactobacillus spp. también se encuentran comúnmente en estos productos.
Finalmente, levaduras tales como Torulopsis, Saccharomyces y Candida son parte de los
microorganismos dominantes, sobre todo en las frutas debido a su alto contenido de azúcar
(Caponigro y col., 2010).
Esta microflora nativa puede ser la causa del deterioro microbiológico de los productos. Así,
por ejemplo, para la naranja entera el deterioro microbiológico es principalmente fúngico,
producido en mayor grado por Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Alternaria citri,
Fusarium spp. y Trichoderma viride (Ferreyra, 2004), mientras que en frutillas los hongos más
encontrados son Botrytis cinerea, Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Fusarium y Rhizopus.
El melón también es deteriorado principalmente por Rhizopus y la manzana por Penicillium,
Botrytis, Colletetrichum, Mucor y Monilinia (Barth y col., 2009). Otros microorganismos
14
Introducción
deteriorativos menos frecuentes son mohos de los géneros Trichoderma, Aureobasidium

pullulans y algunas levaduras (Tournas y Katsoudas, 2005). Estos microorganismos proliferan en
estos productos dependiendo de parámetros intrínsecos (pH, actividad del agua, contenido de
nutrientes, componentes antimicrobianos u obstáculos físicos y estructura biológica de alimentos)
y parámetros extrínsecos (humedad relativa, temperatura, embalaje, almacenamiento, condiciones
de transporte y entorno); no obstante, es indispensable garantizar su inocuidad y seguridad
(Grumezescu y Holban, 2019).
Adicionalmente, estos mohos, levaduras y bacterias han demostrado ser un gran desafío en los
jugos de frutas (Bevilacqua y col., 2015). Por ejemplo, se encontró que Alicyclobacillus
acidoterrestris produjeron olor o sabor fenólico, o antiséptico, con o sin sedimento ligero en jugos
de frutas pasteurizados (bebida de manzana y arándano, jugo de manzana, concentrado de jugo
de naranja, bebidas de frutas mixtas) (Grumezescu y Holban, 2019). Además, los mohos y
levaduras contribuyen al deterioro de los alimentos que son altamente nutritivos, así como
también en bebidas ricas en azúcares. Las principales levaduras relacionadas con el deterioro de
las bebidas incluyen Lachancea, Cándida, Torulaspora, Saccharomyces y Zygosaccharomyces
(Arias y col., 2002), mientras que los mohos reportados son Aspergillus, Penicillium, Rhizopus y
Mucor spp. En particular, Penicilliumexpansum, Mucor plumbeus, Cándida albicans, P.
funiculosum y Saccharomyces cerevisiae que se han encontrado de manera recurrente en jugos de
manzana (Grumezescu y Holban, 2019).
Por otro lado, estos productos pueden ser portadores de microorganismos patógenos
responsables de gran parte de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA). La
Organización Mundial de la Salud (OMS) reporta que la carga mundial ETA es comparable con
las principales enfermedades infecciosas (VIH/SIDA, paludismo y tuberculosis). De allí que la
OMS desarrolló las 5 claves de la Inocuidad de los Alimentos, cuya implementación constituye
una manera accesible de evitar las ETA (OMS, 2004). Estas recomendaciones se basan en
conservar la higiene; separar alimentos crudos y cocinados; cocinar completamente los alimentos;
mantener los alimentos a las temperaturas recomendadas y usar agua potable y materias primas
seguras. Las causas más frecuentes de ETA son producidas por agentes de enfermedades
diarreicas (norovirus, Campylobacter spp., Salmonella entéricas, Salmonella typhi, Taenia
soliumP, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, E. coli O157:H7, Shigella sp., L.
monocytogenes y el virus de la hepatitis A) responsables de una alta mortalidad (Zuñiga Carrasco
y Caro Lozano, 2017). Los alimentos ácidos, como los jugos y batidos de frutas, no fueron
reconocidos como vehículo de enfermedades transmitidas por alimentos, hasta que en los Estados
Unidos y Australia desde 1991, como lo reporta Ferrario (2016), se documentaron varios brotes
de Escherichia coli O157:H7, diferentes serotipos de Salmonella entérica y el parásito protozoario
Cryptosporidium parvum asociados a jugo de manzana y jugo de naranja no pasteurizados
(Mazzotta, 2001; Sivapalasingam y col., 2004; Vojdani y col., 2008), y L. monocytogenes en
tomate, apio y lechuga (Ho y col., 1986).
En esta misma línea de investigación, se ha constatado el vacío existente en algunos países

con respecto a la calidad microbiológica de jugos y batidos comercializados, pasteurizados y/o
no pasteurizados, en las cuales cierta población de microorganismos sobrevivió a este tratamiento
por no haber llegado a la temperatura adecuada o bien porque son MO no vulnerables a la
15
Introducción
pasteurización1 y no se ven afectados. Muchos de los casos reportados fueron a causa de

patógenos tales como E. coli O157:H7, L. monocytogenes y Salmonella (Pina Pérez, 2014;
Callejón y col., 2015). Por otro lado, ha sido demostrada la frecuente contaminación alimenticia
mediante intoxicaciones o infecciones bacterianas, parasitarias o una combinación de estas
(infecto-intoxicación), en los alimentos preparados para la venta al público o en el ámbito del
hogar, debido a las deficientes prácticas higiénicas utilizadas para prepararlos, manipularlos y
consumirlos (Zuñiga Carrasco y Caro Lozano, 2017). Como ejemplo se puede citar un estudio
llevado a cabo en mercados minoristas de Grecia donde vendían jugos de frutas pasteurizados.
Allí se analizaron 120 muestras, el pH de los jugos probados fue de 2,4 a 4,8, se aislaron bacterias
de 51 muestras (42,5%) y hongos de 78 muestras (65%). De esta forma, se detectó E. coli O157:
H7 en cuatro de las muestras analizadas (3,34%) y Staphylococcus aureus en otras cuatro
muestras (3,34%) diferentes a las que se halló E. coli, además en 11 muestras (9,1%) el número
total de los microorganismos detectados fue de 125 UFC/mL; reportándose así, una significativa
presencia de microorganismos, muchos de ellos causantes de ETA (Vantarakis y col., 2011). Otro
ejemplo donde se ha observado una falencia dentro del proceso de elaboración de batidos de frutas
fue en un mercado central de Ecuador, estos puntos de ventas son importantes de analizar ya que
suelen promover gran cantidad de alimentos preparados listos para consumirse, elaborados por
los propios vendedores y que muchas veces no cumplen con las Buenas Prácticas de Manufactura
(BPM) y la higiene suficiente. Los parámetros y factores analizados arrojaron los siguientes
resultados: un escaso aseo de las materias primas utilizadas en la elaboración de las bebidas (50%
lo realizan con un paño húmedo); el 58% utiliza agua embotellada para la preparación de los
batidos, el 25% utilizan agua hervida, mientras que el 17% prefieren utilizar agua del grifo;
concluyéndose en este estudio que el 75% de los vendedores deberían informarse a través de
programas de capacitación sobre las buenas prácticas higiénicas (Minaya Pérez, 2007).
Muchos incidentes como estos llevaron a que la Administración Federal de Drogas y

Alimentos de los Estados Unidos (FDA) estableciera normativas a implementarse a partir de 2002
para asegurar la sanidad de estos productos, según el tamaño de la planta productora. Como
medidas preventivas se pueden nombrar la implementación de los principios del Análisis de
Riesgos y Puntos Críticos de Control (HACCP) en la producción de jugo fresco, y la aplicación
de tratamientos que aseguren la reducción de al menos 5 ciclos logarítmicos del microorganismo
de significación pública identificado como el más resistente al tratamiento particular aplicado. La
norma no especifica el tipo de tratamiento a aplicar, sino que considera la letalidad acumulada
por la utilización de más de un tratamiento, posibilitando la aplicación del concepto de barreras y
la obtención de productos mínimamente procesados. La implementación de HACCP es
obligatoria tanto en EE.UU como en la Unión Europea. En el mercado internacional constituye
una exigencia que se materializa en forma de barreras al comercio. En nuestro país, aunque el
requerimiento de plan HACCP no es obligatorio, el SENASA homologa los sistemas para
productos elaborados de origen animal. Para el resto de los alimentos el aval sólo puede
conseguirse a través de una certificadora privada (FDA, 2001; Ferrario, 2016). A pesar de ello,
autores como Callejón y col. (2015) y Zuñiga Carrasco y Caro Lozano (2017) aseguran que los
brotes de enfermedades transmitidas por alimentos asociados con frutas y verduras frescas siguen
siendo frecuentes en todo el mundo. Ambos han realizado exhaustivos estudios de estas ETA y
los MO relacionados a las mismas que demuestran que la cantidad de brotes reportados
1
Art. 166 CAA: “Se entiende por Pasteurización o Pasterización, someter los alimentos a la acción de temperaturas
inferiores a 100°C y por tiempos suficientes para destruir las formas vegetativas de los tipos comunes de
microorganismos patógenos y una cierta proporción de las de los no patógenos que los contaminan”.
16
Introducción
anualmente no muestran tendencias a disminuir, siendo evidente que la contaminación de

productos frescos con patógenos continúa siendo un problema de gran relevancia.
Este trabajo de Tesis está enfocado en el análisis de la microbiota nativa de deterioro y otras
bacterias no patógenas presentes en los batidos, bajo el seguimiento de grandes grupos como:
bacterias aerobias mesófilas, enterobacterias y, mohos y levaduras. Además, se evaluó la
inocuidad de los batidos y el efecto de los tratamientos propuestos frente a posibles
contaminaciones con microorganismos de interés, como es el caso de Listeria monocytogenes y
Escherichia coli O157:H7, de forma que el objetivo no solo sea prolongar la vida útil de los
productos alimenticios sino también asegurar su inocuidad en el caso de contaminaciones con
patógenos. Algunas características importantes de las cepas patógenas de E. coli y Listeria se
mencionan a continuación:
Escherichia coli O157:H7:
Es una bacteria patógena, dentro de grupo de las Gram negativas (G-), que se encuentra
comúnmente en el sistema digestivo de los animales de sangre caliente y de los seres humanos.
Se transmite a través de la contaminación fecal de los alimentos y del agua, así como también de
la contaminación cruzada o por contacto humano directo durante la preparación de los alimentos
(FAO, 2010), donde aparecen también estrechamente relacionados otras enterobacterias como
Campylobacter, Yersinia enterocolitica. La carne molida cruda o poco cocida, y productos
cárnicos son los alimentos comúnmente contaminados por esta bacteria, sin embargo, debido a
que algunas cepas son ácido-resistentes, puede encontrarse o se ha encontrado en alimentos como
yogures, mayonesa, salchichas fermentadas, quesos, jugos de frutas no pasteurizados. Asimismo,
los casos asociados al consumo de vegetables frescos como hojas de lechuga y espinaca son cada
vez más recurrentes (FDA, 2012).
Listeria monocytogenes:
Es una bacteria dentro del grupo de las Gram positivas (G+), microscópicamente presenta
forma de varilla, y movilidad a causa de flagelos en el exterior de su pared celular. Es un patógeno
muy resistente debido a que es tolerante a las bajas temperaturas (T) (escaso o nulo crecimiento
a T<1°C) y a sales; es decir que estos MO pueden crecer a temperaturas de refrigeración y a bajas
actividades de agua, lo que hace que sean un problema particular para la industria alimentaria
(FDA, 2012). Se ha encontrado que la bacteria L. monocytogenes puede sobrevivir por 21 días a
4°C y 5 días a 30°C en jugos de naranja con pH a 3,6 (Parish ME y Higgins DP, 1989). Otros
alimentos en los cuales se puede encontrar esta bacteria son carnes (todos los tipos) y vegetales
crudos, embutidos de carne fermentada, leche cruda, leche pasteurizada inadecuadamente o sin
pasteurizar, helados y quesos (particularmente blandos), entre otros productos derivados.
También caracterizada por su naturaleza ubicua en el medio ambiente, se la encuentra en
ambientes húmedos, suelo y vegetación en descomposición. Por ello, se han hecho varias
investigaciones donde se trata de controlar el desarrollo de estos MO en alimentos (Glass y col.,
1992; Miller y Kaspar, 1994; Jordan y col., 2001; Ferrante y col., 2007; Palgan y col., 2011; 2012;
Altuntas y col., 2010; Bevilacqua y col., 2018).
Por otro lado, Listeria innocua es un microorganismo no patógeno, pero en muchas

características como su fisiología, metabolismo, crecimiento, características bioquímicas y la
respuesta a tratamientos químicos y físicos (cambios de pH, aw, secado, calentamiento) es similar
a la Listeria monocytogenes y, por lo tanto, es un subrogante para el patógeno transmitido por los
alimentos (L. monocytogenes). Tales propiedades hacen que L. innocua sea un excelente
17
Introducción
indicador para realizar estudios de crecimiento y supervivencia sin tomar el riesgo de trabajar con
la cepa patógena. La contaminación con L. monocytogenes es un problema crítico de la salud
pública, ya que los brotes de listeriosis presentan altas tasas de mortalidad y representa una de las
principales causas de retiro de productos en todo el mundo (Ollé Resa y col., 2016). De manera
similar, muchas cepas de E. coli son inofensivas y coinciden en muchos de los aspectos
mencionados con las cepas patogénicas, respecto a estas últimas, existen seis grupos patógenos
reconocidos: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC o E. coli O157:H7), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli
enteroagregativa (EAEC) y E. coli de adherencia difusa (DAEC); de los cuales, los primeros
cuatro grupos se transmiten a través de alimentos o agua contaminados (FDA, 2012). Por lo tanto,
las cepas más comúnmente utilizadas son L. innocua y E. coli no patogénico como
microorganismos modelo en diversos estudios (Buzrul y Alpas, 2004; Alighourchi y col., 2014).
De acuerdo con Buzrul y col. (2008), para tener un mejor control de supervivencia de los MO
es muy importante optimizar las condiciones de almacenamiento (tiempo y temperatura) luego de
la aplicación de tratamientos de preservación. Es sabido que la presencia del microorganismo en
el alimento no lleva directamente a causar algún tipo de infección o intoxicación en los
consumidores; existen factores que se deben tener en cuenta para que ello ocurra, éstos varían con
el tipo de organismo, la edad y el estado del huésped. En algunos casos es necesario que haya más
de un millón de bacterias patogénicas por gramo o cm2 de superficie del alimento para que se
produzca una enfermedad. Sin embargo, algunos patógenos pueden provocar enfermedades en
cantidades mucho menores, para trazar una comparativa: las especies de Shigella son agentes
altamente infecciosas, con una dosis infectiva de tan sólo 10 células, las cepas de Escherichia coli
O157:H7 poseen un rango de dosis infecciosa que va desde 10 a 100 células, y en el caso de
Listeria se necesitan un poco menos de 1000 células para causar infección en individuos
susceptibles (FDA, 2012).
Tabla 1.1 - Especificaciones microbiológicas de hortalizas y frutas frescas.

Parámetro Método de
Criterios microbiológicos
referencia(1)
E. coli NMP/g N=5, c=2, m=10, M=100 BAM-FDA: 2002
(método I o II)
Salmonella spp. N=5, c=0, Ausencia en 25g BAM-FDA: 2011
ISO 6579: 2002,
Co: 2004
E. coli 0157: H7/NM N=5, c=0, Ausencia en 25g BAM-FDA: 2011
ISO 16654: 2001
E. coli no 0157 (2) N=5, c=0, Ausencia en 25g ISO 13136: 2012
BAM-FDA: 2014
(1)
O su versión más actualizada
(2)
E. coli productor de toxina Shiga de los serogrupos: 0145, 0121, 026, 0111 y 0103. Se tendrán en cuenta sólo los aislamientos
positivos para los genes stx y eae, de los serogrupos mencionados.
En este contexto, los procesadores de alimentos y la comunidad científica que están

interesados en el desarrollo de bebidas funcionales a base de frutas y verduras buscan cumplir con
los estándares de seguridad alimentaria (reducción de 5 ciclos log de los patógenos transmitidos
por los alimentos), y con una degradación mínima de los perfiles nutricionales y organolépticos
(Pina Pérez y col., 2014). En Argentina deben cumplirse las especificaciones microbiológicas de
la Tabla 1.1 y la Tabla 1.2 según el Artículo 156 tris del CAA, para productos frescos o
procesados sin tratamiento térmico y listos para ser consumidos, respectivamente.
18
Introducción
Tabla 1.2 – Especificaciones microbiológicas de alimentos preparados listos para el

consumo sin tratamiento térmico.
Parámetro Criterios de aceptación Metodología(1)
Recuento de Enterobacterias(2) N=5, c=2, m=103, M=104 ISO 21528-2:2004
(UFC/g) ICMSF
Recuento de E. coli N=5, c=0, m<3 ISO 16649-3:2005
(NMP/g) ICMSF (método I)
BAM-FDA:2002 (método I)
Recuento de Estafilococos N=5, c=1, m=102, M=103 ISO 6888-3:1999
Coagulasa positiva (NMP/g) ICMSF
Salmonella spp. N=5, c=0, Ausencia en 25g ISO 6579:2002

Co: 2004
BAM-FDA:2011
USDA-FSIS:2011
L. monocytogenes N=5, c=0, Ausencia en 25g ISO 11290-1:1996
Amd: 2004
BAM-FDA:2011
USDA-FSIS:2009
Recuento de Clostridium N=5, c=1, m=102, M=103 ISO 7937:2004
perfringens(3) (UFC/g)
Recuento de presuntos N=5, c=1, m=102, M=103 ISO 7932:2004
Bacillus cereus(4) (UFC/g)
E. coli 0157:H7/NM(5) N=5, c=0, Ausencia en 65g ISO 16654:2001
BAM-FDA:2011
USDA-FSIS:2010
E. coli no 0157(5)(6) N=5, c=0, Ausencia en 65g ISO 13136:2012
BAM-FDA:2014
(1)
O su versión más actualizada.
(2)
En caso de llevar como ingredientes vegetales crudos, no realizar esta determinación.
(3)
Incluir solo en alimentos con carnes.
(4)
Incluir solo en alimentos con cereales, papas, amiláceos.
(5)
En alimentos a base de carne picada y/o vegetales crudos.
(6)
E. coli productor de toxina Shiga de los serogrupos: 0145, 0121, 026, 0111 y 0103. Se tendrán en cuenta sólo los aislamientos
positivos para los genes stx y eae, de los serogrupos mencionados.
1.3.2. Calidad Fisicoquímica, Sensorial y Nutricional
La aceptabilidad de las bebidas a base de F&V está directamente relacionada con la calidad
organoléptica, ya que es el consumidor final quien decide comprar o no el producto. Es decir, que
uno de los principales objetivos de los productores de bebidas es controlar las propiedades
fisicoquímicas y sensoriales del producto desarrollado. Los posibles problemas de calidad en las
bebidas pueden incluir sedimentación química (materiales polifenólicos, taninos y polisacáridos),
turbidez (polímeros insolubles), efectos indeseables debido a la actividad enzimática, cambios de
sabor, aroma y color, y fluctuaciones en la textura y/o formación de flóculos microbiológicos
(generalmente en bebidas de frutas) durante el almacenamiento, entre tantos otros aspectos
indeseables (Grumezescu y Holban, 2019).
El pH, los Sólidos Solubles Totales (SST) y la consistencia son parámetros fisicoquímicos
habitualmente determinados durante el desarrollo de las bebidas de F&V, así como también el
seguimiento de la actividad enzimática mediante mediciones de la presencia de enzimas de
deterioro, como peroxidasa (POD) causantes de pardeamientos, color amarronado, oxidación de
pigmentos; polifenoloxidasa (PPO) actuante sobre polifenoles, los neutraliza impidiendo su
actividad; y pectinmetilesterasa (PME) que degrada la pared celular de células presentes en frutas
y verduras generando separación de fases en los batidos, asociadas al rápido deterioro y corta vida
útil de estos productos (Pina Pérez y col., 2014; Fernandez y col., 2019; Chakraborty y col., 2014).
19
Introducción
En cuanto a los análisis sensoriales, existen dos tipos: los subjetivos (intervienen los sentidos
humanos) y los objetivos (análisis instrumental) que se utilizan para medir las características
organolépticas de cualquier producto alimenticio. Los métodos sensoriales deben adoptarse con
cuidado porque cada método evalúa diferentes aspectos y deben evaluarse todos aquellos atributos
que son determinantes para la aceptabilidad del producto por parte del consumidor.
Recientemente, debido a que los análisis sensoriales hechos por grupos de expertos son muy caros
y llevan mucho tiempo, se han desarrollado algunas técnicas nuevas e innovadoras (sensor
cromatográfico, espectroscópico, rápido y confiable) que son mucho más confiables que los
métodos analíticos rápidos usualmente utilizados en las industrias, que ha mejorado el proceso de
control al proporcionar mejores resultados informativos y reducir el tiempo de análisis (Borras y
col., 2015). Por otro lado, los jugos y batidos de frutas y/o verduras tienen una reología compleja,
que consiste en una dispersión de fase insoluble en una solución viscosa, y sus interacciones
pueden crear una propiedad textural específica reflejada en su estructura y sensación en la boca.
Burbujeante, efervescente, frío, fibroso, espumoso, granulado, grumoso, viscoso, liso, suave son
atributos de textura que definen la calidad de la bebida (Augusto y col., 2012, a,b).
El color es el primer atributo sensorial que atrae a los consumidores, que suele ser utilizado
como un parámetro para estimar su frescura, al asociar fuertemente su pérdida con la disminución
de la calidad general (Grumezescu y Holban, 2019). El color de un producto natural está
determinado por la presencia de distintos pigmentos naturales que son característicos de cada
producto y que se ha demostrado que muchos de ellos tienen características bioactivas. Por
ejemplo, en las hojas verdes la clorofila, en la zanahoria los carotenos, en los frutos rojos la
antocianina y, en particular, en la remolacha y sus subproductos se encuentran las betalaínas.
Las betalaínas han despertado un gran interés como pigmentos naturales para ser utilizados
como colorantes alternativos en los productos alimenticios. Las betalaínas son pigmentos
nitrogenados, solubles en agua, que de acuerdo con su estructura química y propiedades de
absorción de luz se dividen en dos grupos: las betacianinas (Bc) de color rojo-violeta y las
betaxantinas (Bx) de color amarillo, característica atribuida por los dobles enlaces resonantes
(Figura 1.1). Son compuestos que exhiben una fuerza tintórea significativamente alta en
comparación con otros pigmentos y generalmente son estables en el rango de pH de 3 a 7, lo que
los hace más adecuados para la aplicación en alimentos ácidos y neutros. Investigaciones sobre
la química, bioquímica y la función de las betalaínas ha sido limitada en comparación con otros
pigmentos naturales como las antocianinas, los carotenoides o las clorofilas. No obstante, debido
a la amplia variedad de posibles usos y aplicaciones de las betalaínas, junto con la presencia
limitada de especies productoras en la naturaleza, particularmente un número pequeño de frutas,
verduras y otras plantas comestibles como: raíz, tallo y hojas de la remolacha, fruta del dragón
(pitahaya), acelga, entre otras semillas y especias como el amaranto y cúrcuma, respectivamente,
han impulsado a mejorar el rendimiento de betalaínas en remolacha, explorar especies alternativas
de plantas y cultivos celulares para la extracción, y desarrollar nuevas fuentes de betalaínas
mediante ingeniería metabólica de plantas y microbios (Polturak y Aharoni, 2017).
20
Introducción
Figura 1.1 – A: Estructura de resonancia de betalaínas; B: Estructura básica de

betacianinas; C: Estructura básica de betaxantinas (Gengatharan y col., 2015).
En cuanto a las propiedades nutricionales y beneficiosas para la salud humana, los alimentos
ricos en betalaínas tienen un gran potencial como alimentos funcionales (Gengatharan y col.,
2015). Además de sus atractivos colores, también se descubrió que las betalaínas tienen una fuerte
actividad antioxidante. Por lo tanto, se han estudiado sus posibles propiedades fisiológicas,
incluidas las actividades anticancerígenas, hipolipidémicas, hepatoprotectoras, antiinflamatorias,
antidiabéticas y antimicrobianas (Polturak y Aharoni, 2017).
Otros compuestos que resultan de gran interés en cuanto a análisis nutricionales son los
compuestos fenólicos. Estos varían ampliamente en estructura, desde los más simples
(monómeros y oligómeros) hasta los polímeros complejos de peso molecular alto (taninos), todos
ellos poseen anillo aromático de uno o más hidróxidos (-OH). Su capacidad antioxidante depende
del número y la posición del grupo -OH y el pH (Belitz y col., 2009). Se han identificado más de
4000 compuestos polifenólicos individuales, los cuales se han dividido en dos grandes grupos:
los flavonoides y los no flavonoides (Vázquez Flores y col., 2012). Ambos grupos de fitoquímicos
presentan un papel importante en el crecimiento y reproducción de las plantas, actúan como
protectores contra los patógenos y depredadores de éstas (Escobar Tovar, 2017). Además, los
fenólicos son componentes generalizados de los alimentos vegetales (frutas, verduras, cereales,
aceitunas, legumbres, chocolate, etc.) donde se encuentran en su mayoría como glucósidos, y una
parte también como ésteres. De manera que han sido identificados varios cientos de polifenoles
presentes en este tipo de alimentos, los cuales son clasificados de acuerdo con el número de anillos
fenólicos y su enlace, que incluyen a los flavonoides y algunos grupos de los no flavonoides
(ácidos fenólicos, taninos hidrolizables y, los menos comunes, estilbenos y lignanos). En bebidas
(té, café, cerveza, vino, etc.) son parcialmente responsables de las propiedades organolépticas
generales; por ejemplo, los fenólicos contribuyen al amargor y astringencia de los jugos y batidos
de frutos y vegetales, debido a la interacción entre los fenólicos, principalmente procianidina, y
la glicoproteína en la saliva. Las antocianinas, uno de los seis subgrupos de un gran grupo de
21
Introducción
componentes de polifenoles vegetales conocidos como flavonoides, son responsables de los

colores naranja, rojo, azul y morado de muchas frutas y verduras como manzanas, bayas,
remolacha y cebollas. Se sabe que los compuestos fenólicos son los compuestos más importantes
que afectan la diferencia de sabor y color entre los vinos blancos, rosados y tintos; reaccionan con
el oxígeno y son fundamentales para la conservación, maduración y envejecimiento del vino (Dai
y Mumper, 2010).
En cuanto al grupo de los flavonoides, éstos son los polifenoles más abundantes de la dieta
humana. La estructura básica de éstos es el núcleo flavano que contiene 15 átomos de carbono
reordenados en 3 anillos (C6-C3-C6) (Figura 1.2). A su vez, los flavonoides se dividen en seis
subgrupos: flavonas, flavonoles, flavanonas, antocianos, flavanoles e isoflavonas. Algunos de los
flavonoides más comunes incluyen a la quercitina que es un flavonol abundante en cebolla,
brócoli y manzana, otro es la catequina (flavonol) encontrado en té y varias frutas, entre otros
presentes en más frutas, vegetales y legumbres como naringenina (flavanona), cianidin-glucósido
(antocianina), daidzeina, genisteína y gliciteína (isofllavonas) (Escobar Tovar, 2017). Algunos
compuestos flavonoides y sus estructuras químicas básicas se muestran en la Figura 1.2.
Figura 1.2 - Estructura química de compuestos polifenólicos flavonoides. Los esqueletos

básicos constan de tres anillos: dos aromáticos y un heterociclo oxigenado.
22
Introducción
Ciertos flavonoides, al polimerizar, forman taninos condensados que también son muy
abundantes en la dieta humana. Los taninos son compuestos que no solo poseen un elevado peso
molecular, sino además presentan suficientes grupos hidroxilo unidos a estructuras fenólicas que
les confieren la característica de formar complejos con proteínas, minerales y otras
macromoléculas (Vázquez Flores y col., 2012). Estudios subrayan la importancia de llevar a cabo
constantes investigaciones para la identificación de las estructuras de los taninos en vegetales, ya
que su estructura química condiciona su actividad biológica (Gonçalves y col., 2011) y su afinidad
por ciertas moléculas del organismo (Cala y col., 2010). Las frutas y vegetales tienen la capacidad
de acumular taninos en la totalidad de la planta de la que provienen: semillas, frutos, madera, raíz,
hojas. En condiciones normales, los taninos vegetales representan del 2 al 7% del peso fresco de
la planta. Esta cantidad representa la suma de todos los tipos de taninos presentes en el vegetal.
No obstante, las concentraciones pueden aumentar debido al estrés producido por el ataque de
patógenos (Vázquez Flores y col., 2012).
Por otro lado, los no flavonoides incluyen a las moléculas más sencillas, como los ácidos
fenólicos con esqueletos químicos de seis carbonos (C6), ligados o no con esqueletos de dos hasta
cuatro carbonos (C6 -C4). Los ácidos fenólicos forman parte de este grupo de no flavonoides y
se pueden dividir en dos clases: derivados del ácido benzoico, como el ácido gálico, y derivados
del ácido cinámico, como el ácido cumarico, cafeico y ferúlico. El ácido cafeico es el ácido
fenólico más abundante en muchas frutas y verduras, con mayor frecuencia esterificado con ácido
quínico como en el ácido clorogénico, que es el principal compuesto fenólico del café. Otro ácido
fenólico común es el ácido ferúlico, que está presente en los cereales y se esterifica a
hemicelulosas en la pared celular (Dai y Mumper, 2010). En la Figura 1.3, se presentan los
subgrupos en que son divididos los compuestos no flavonoides.
A causa de la amplia distribución y abundancia en la dieta que tienen los compuestos fenólicos,
en su generalidad, han llamado la atención tanto de nutricionistas como de investigadores y
fabricantes de alimentos. Los intereses principales se centran en sus potentes propiedades
antioxidantes, el poder modular la actividad de una amplia gama de enzimas y receptores
celulares, además de varias otras acciones biológicas específicas en la prevención o el tratamiento
de diversas enfermedades asociadas al estrés oxidativo (Dai y Mumper, 2010). Éstos pueden
detener la cadena de radicales libres de reacciones oxidativas por medio de la donación de átomos
de hidrógeno de sus grupos hidroxilo, formando radicales libres relativamente estables que no
inician o propagan la oxidación de lípidos (de la Torre, 2007). Por tal razón, su consumo se ha
asociado con posibles beneficios para la salud, por ser agentes que pueden contrarrestar el
deterioro del organismo (Velásquez y col., 2004)
La idea de combinar frutas y/o verduras, y también con otros alimentos para dar origen a los
batidos parecería ser simple, sin embargo, ha tenido un gran desarrollo científico en el mundo a
lo largo de los años, ya que se ha presentado como un gran desafío optimizar estas mezclas para
lograr un producto aceptable de manera microbiológica, sensorial y lograr la retención de los
nutrientes más importantes durante el procesamiento y vida útil (Morales de la Peña y col., 2016).
Como ejemplo, es de destacar la investigación de Fernandez y col. (2018) quienes buscaron
preservar los diferentes atributos de calidad de un batido mixto de jugo de naranja (59%),
manzanas verdes (15%), zanahorias (15%), hojas de remolacha (6%) y tallos de remolacha (5%);
el trabajo de Kumar y Saraswathi (2010) quienes lograron maximizar atributos de calidad
sensorial con el diseño de una bebida mixta altamente aceptable combinando naranja (33%),
mango (66%) y limón (1%); otro ejemplo se encuentra en el estudio de Torregrosa y col. (2006)
donde se propuso una mezcla de jugo de naranja que tiene un alto contenido de vitamina C, con
23
Introducción
jugo de zanahoria que contiene una concentración elevada de β-caroteno y así obtener una bebida
rica en antioxidantes. Otros autores que también han desarrollado estudios de gran interés en el
campo son informados en el trabajo de revisión realizado por Morales de la Peña y col. (2016),
por ejemplo, Jensen y col. (2008) determinaron que una mezcla de jugos de frutas y bayas resultó
como una fuente de antioxidantes para los consumidores, de modo que podrían proteger células
vivas del organismo de los daños oxidativos. Los investigadores adjudicaron estos efectos a las
antocianinas que provienen principalmente de las bayas. Además, recientemente, investigadores
han examinado los efectos de la combinación de néctares de papaya y fresa que podrían dar como
resultado relaciones sinérgicas entre sus diferentes compuestos bioactivos, como el ácido
ascórbico y los carotenoides, generando una mayor capacidad antioxidante (Morales de la Peña y
col., 2016).
Figura 1.3 - Estructura química de compuestos polifenólicos no flavonoides.
A pesar de la gran cantidad de bebidas mixtas de F&V disponibles actualmente en el mercado,

todavía existe un gran desafío para desarrollar nuevos productos con alto contenido en
compuestos antioxidantes y bioactivos que cumplan con los requisitos del consumidor. De esta
manera, la aplicación de tecnologías de conservación adecuadas es necesaria para prolongar su
vida útil sin comprometer sus características de estabilidad fisicoquímica, nutricionales y
sensoriales.
24
Introducción
1.4. TECNOLOGÍAS NO TÉRMICAS
El desarrollo y la optimización de las formulaciones de bebidas son pasos muy importantes

dentro del proceso de innovación. Como ya se ha mencionado anteriormente, los hábitos
alimenticios de las personas han cambiado debido al estilo de vida que se lleva hoy en día, con
largas horas fuera del hogar y menos disponibilidad de tiempo para organizar una dieta saludable,
llevando muchas veces a la elección de alimentos ultraprocesados, de escaso valor nutricional.
Estos hábitos han impactado en la salud de la población, aumentado las enfermedades crónicas y
degenerativas a causa de una mala alimentación, sin los nutrientes y bioactivos necesarios; es por
ello que la industria alimenticia actual apuesta al desarrollo de nuevos productos que cubran tanto
las necesidades nutricionales como la necesidad de practicidad.
Actualmente, la pasteurización térmica es el tratamiento comúnmente aplicado para la

conservación de bebidas; sin embargo, las altas temperaturas alcanzadas durante el procesamiento
generalmente producen efectos perjudiciales en sus componentes nutritivos, lo cual hace que
disminuya su calidad y aceptabilidad (Bevilacqua y col., 2018). Por lo tanto, las tecnologías no
térmicas se han estudiado durante las últimas décadas como una alternativa a los tratamientos
convencionales para obtener productos seguros con un potencial funcional elevado, siendo un
desafío para los investigadores, científicos y la industria buscar tratamientos de preservación que
logren minimizar la degradación de compuestos bioactivos, produciendo un mínimo cambio
inducido por la tecnología aplicada, manteniendo la calidad sensorial característica en este tipo
de producto (Chakraborty y col., 2014; Bevilacqua y col., 2015; Morales de la Peña y col., 2016).
Nuevos procesos de preservación con tecnologías no térmicas están siendo estudiados, dentro de
los cuales se encuentran la aplicación de Altas Presiones Hidrostáticas (HHP), Campos Eléctricos
Pulsados de Alta Intensidad (HIPEF), Ultrasonido (US), Irradiación Gamma (IG), Irradiación UV
(IUV) y Ozono (O), entre otras (Morales de la Peña y col., 2016). Algunos de ellos actualmente
se utilizan para aplicaciones industriales, mientras que otros todavía están a nivel de laboratorio,
y muchas veces el cambio de escala es un paso crítico (Chakraborty y col., 2014). Diferentes
estudios han demostrado la efectividad de estos tratamientos en la preservación de varios
alimentos, contra los microorganismos patógenos, de deterioro y enzimas, proporcionando un
producto fresco, seguro, de calidad nutricional, fisicoquímica y sensorialmente aceptado
(Martínez y col., 2007; Soliva y col., 2009).
Aunque el tratamiento no térmico parece menos perjudicial que el térmico, los efectos
dependen en gran medida de la matriz alimentaria; es decir, de los componentes del alimento y
sus relaciones moleculares. Es por ello que para optimizar el tratamiento de conservación en cada
matriz es necesario evaluar el efecto de distintas tecnologías y/o diferentes combinaciones de
ellas, ya sea en simultáneo o siguiendo un orden de procedimiento, teniendo en cuenta las dosis
aplicadas, para poder seleccionar el más adecuado desde el punto de vista de su efecto en la
calidad general del producto, de su impacto económico, entre otros aspectos (Alves Filho y col.,
2016).
A pesar de que hubo un aumento de las investigaciones relacionadas tanto con las bebidas a
base de frutas y verduras así como con la aplicación de nuevas tecnologías de preservación,
debido a su complejidad matricial y a la demanda por el reciente éxito comercial, la aplicación de
estas tecnologías en estas bebidas es un campo en el que queda mucho por explorar (Fernández y
col., 2019). Por lo tanto, se requieren más esfuerzos para implementar estas metodologías y
equilibrar el deseo de una mayor calidad nutricional y la economía del proceso, ya que el alto
25
Introducción
costo sigue siendo un inconveniente y limita la difusión de estos enfoques (Chakraborty y col.,
2014). Se puede mencionar una extensa lista bibliográfica de proyectos de investigación llevados
a cabo con el objetivo de lograr el resultado óptimo para este tipo de producto (Buzrul y col.,
2008; Yun y col., 2010; Jo y col., 2012; Alighourchi y col., 2014; Alves Filho y col., 2016;
Morales de la Peña y col., 2016; Finten y col., 2017; Bevilacqua y col., 2013; 2014; 2015; 2016;
2018; Fernández y col., 2019; entre otros). La principal motivación para los procesadores de
alimentos es seleccionar la tecnología más adecuada junto con las condiciones de procesamiento
óptimas para lograr un producto inocuo, retener los componentes nutritivos y los atributos de
color, sabor y flavor (Bevilacqua y col., 2018).
En esta Tesis se aplicaron ultrasonido e irradiación gamma como técnicas de preservación

físicas, junto con el agregado de antimicrobianos naturales como extracto de té verde, nisina y
natamicina para mejorar la calidad general del alimento. A continuación, se presentan las
características más relevantes de estos métodos de preservación.
1.4.1. Irradiación gamma
La irradiación gamma (IG) de productos alimenticios se ha utilizado en más de 60 países y su

seguridad ha sido aprobada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), el Centro para el
Control y la Prevención de Enfermedades (Centers for Disease Control and Prevention o CDC),
el Departamento de Agricultura del Estado de los Estados Unidos (United States Department of
Agriculture o USDA) y la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug
Administration o FDA) (Alighourchi y col., 2014).
La irradiación tiene los mismos objetivos que otros métodos de preservación de alimentos:
reducir las pérdidas debidas a la alteración y la descomposición, eliminando insectos, parásitos y
evitando el crecimiento de MO en particular bacterias, mohos y levaduras, incluyendo a aquellos
causantes de enfermedades de transmisión alimentaria. De la misma manera, se ha informado que
esta tecnología es potencialmente efectiva para la inactivación de enzimas (Song y col., 2007).
De modo que, además de ser eficaz para la seguridad microbiológica, también se ha demostrado
que mantienen o incluso mejoran la actividad antioxidante (Song y col., 2006; Finten y col.,
2017).
De acuerdo con el Artículo 174 del CAA “Se entiende por conservación con radiación o
energía ionizantes, someter los alimentos a la acción de radiación electromagnética o partículas
de alta energía”. La unidad de dosis absorbida se denomina gray (Gy) y se define como la energía
media comunicada por la radiación ionizante a la materia por unidad de masa (1 Gy equivale a 1
J/kg).
Actualmente, la dosis de radiación recomendada por la Comisión FAO/OMS del Codex

Alimentarius para la irradiación de alimentos no excede los 10 kGy. Se trata de una cantidad muy
pequeña de energía, que equivale a la cantidad de calor necesaria para elevar 2,4°C la temperatura
del agua (OMS, 1989). Sin embargo, en las últimas reuniones de expertos internacionales no se
fijaron límites a la dosis de irradiación, considerándose esta dosis como estándar para evitar
posibles pérdidas organolépticas y de nutrientes. Se recomienda que se realicen estudios para cada
matriz alimentaria para lograr la máxima eficiencia con la dosis adquirida por el producto (OIEA,
2017). En el Artículo 174 del Código Alimentario Argentino (CAA) se definen las clases de
26
Introducción
alimentos que pueden ser tratadas con radiaciones ionizantes (Tabla 1.3) y las dosis máximas
aceptadas para cada uno.
Los microorganismos son inactivados por IG principalmente debido al daño en el ADN y

ARN; sin embargo, factores como la composición del medio, el contenido de humedad, la
presencia o ausencia de oxígeno, podrían afectar la resistencia a la radiación, particularmente en
el caso de las células vegetativas. Además, para lograr la eliminación de MO esporulados es
necesaria la aplicación de dosis elevadas (ver Tabla 1.3) (Jiménez Sánchez y col., 2017a). A su
vez, se debe considerar que algunos componentes como las proteínas, ejercen un efecto protector
frente a las radiaciones (como también frente a ciertos agentes antimicrobianos y al calor) (OIEA,
2017). Una ventaja de este método es que no está limitado para la eliminación de MO en
superficies (Niemira, 2007), también se pueden reducir los MO que están protegidos en las grietas
y pliegues que presentan los alimentos (Prakash y col., 2000).
Tabla 1.3 - Dosis máximas de kGy aplicable a los alimentos autorizados en Argentina
para ser irradiados (Art. 174, CAA).
CLASE DE ALIMENTOS Y PROPÓSITOS DE LA LÍMITE
IRRADIACION MÁXIMO (kGy)
CLASE 1 – BULBOS, TUBÉRCULOS Y RAÍCES 0,2
Propósito:
Inhibir la brotación durante el almacenamiento
CLASE 2 – FRUTAS Y VEGETALES FRESCOS (distintos de los de la clase 1) 1,0
Propósitos: 1,0
a) Retrasar la maduración. 2,5
b) Des infestación de insectos. 1,0
c) Control de microorganismos alterantes.
d) Control cuarentenario.
CLASE 3 – CEREALES Y SUS HARINAS, LEGUMBRES, SEMILLAS OLEAGINOSAS, 1,0
FRUTAS SECAS 5,0
Propósitos:
a) Des infestación de insectos.
b) Control de microorganismos alterantes y patógenos.
CLASE 4 – VEGETALES Y FRUTAS DESECADOS O DESHIDRATADOS, CONDIMENTOS 10
VEGETALES(*), TÉ Y HIERBAS PARA INFUSIONES 1,0
Propósitos:
a) Control de microorganismos patógenos.
b) Des infestación de insectos.
CLASE 5 – HONGOS DE CULTIVOS COMESTIBLES, FRESCOS 3,0
Propósitos:
a) Control de microorganismos alterantes.
CLASE 6 – PESCADOS Y MARISCOS, Y SUS PRODUCTOS (FRESCOS Y CONGELADOS) 5,0(**)
Propósitos: 2,0(***)
a) Control de microorganismos alterantes y patógenos.
b) Control de parásitos.
CLASE 7 – AVES, CARNES BOBINA, PORCINA, CAPRINA, OTROS Y SUS PRODUCTOS 7,0(**)
(FRESCOS Y CONGELADOS) 3,0(***)
Propósitos:
a) Control de microorganismos alterantes y patógenos.
b) Control de parásitos.
CLASE 8 – ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL DESECADOS 1,0
Propósitos: 3,0
a) Control de insectos.
b) Control de hongos.
(*) La dosis media global absorbida no deberá ser mayor de 30kGy.
(**) La dosis mínima es definida sobre la base de la calidad higiénica del producto.
(***) La dosis mínima puede ser definida sobre la base del tipo de parasito.
En cuanto a las dosis aplicadas, los mohos y levaduras se consideran, en general, claves en la
IG porque requieren un valor más elevado de dosis que las bacterias patógenas; se han reportado
valores de 3 kGy y 0,3-0,7 kGy, respectivamente, para su eliminación (Alighourchi y col., 2014).
Las bacterias Gram Negativas (G-) han demostrado ser las más sensibles a este tratamiento. Por
27
Introducción
lo tanto, algunos microorganismos de deterioro y cepas de Salmonella, E. coli,y Campylobacter,

entre otras bacterias pertenecientes a este grupo de G- son los que principalmente se logran
controlar e inactivar por este método. (FDA, 2010).
La radiación gamma es una técnica física de preservación muy eficaz ya que, además de la
eliminación de MO, se utiliza para prolongar el tiempo de conservación de las frutas frescas y las
hortalizas porque controla los cambios biológicos asociados a la maduración, la germinación y,
por último, el envejecimiento. Así, la irradiación retrasa la maduración de los plátanos verdes,
inhibe la germinación de las patatas, ablanda las legumbres (habas y judías), y con ello acorta el
tiempo de cocción. También aumenta el contenido de jugo de las uvas y acelera la desecación de
las ciruelas (OMS, 1989).
Se encontró que en la aplicación de esta tecnología a bebidas a base de frutas y/o verduras es
muy importante tener en cuenta la cantidad de sólidos presentes, a medida que en el alimento se
registra un mayor número de grados Brix (solidos solubles totales disueltos en 100 mL de
solución), la reducción de esporas (log UFC/mL) disminuye, es decir, es menos efectiva
(Bevilacqua y col., 2018).
También existen cambios organolépticos, químicos y físicos, que en muchos casos son
favorables y en otros desfavorables, que se pueden dar en diferentes tipos de alimentos, de acuerdo
a su matriz, a la dosis aplicada, características intrínsecas y extrínsecas del producto irradiado;
por ejemplo, en jugo de col rizada se notó que se había mantenido el intenso flavor con dosis de
rayos gamma hasta 5 kGy, sin embargo un aumento de intensidad podría generar pérdidas de
color y sabor (Yun y col., 2010). La leche y algunos productos lácteos figuran entre los alimentos
más sensibles, ya que se ha probado que con dosis tan bajas como 0,1 kGy adquiere un sabor que
no es aceptado por los consumidores (OMS, 1989).
Esta tecnología de preservación ha sido estudiada y analizada por organismos internacionales

para la aplicación en distintos tipos de alimentos; y es importante destacar que el Comité Mixto
FAO/OIEA/OMS de Expertos en Comestibilidad de los Alimentos Irradiados recomendó en 1980
que se restringieran las fuentes de radiación empleadas en el tratamiento de alimentos a aquellas
cuyos niveles de energía se encuentren muy por debajo de los que inducen radiactividad en los
alimentos tratados. Es decir, que los alimentos irradiados bajo restricciones del Comité no
adquieren radiactividad inducida. En la Tabla 1.4 se detallan algunas dosis de irradiación gamma
estipuladas según estos organismos (OMS, 1989).
Los posibles cambios nutricionales dependen principalmente de la dosis aplicada a los

alimentos, puede producirse cierta pérdida de vitaminas, especialmente de los compuestos
expuestos al aire durante la irradiación o el almacenamiento. Algunas vitaminas (riboflavina,
niacina y vitamina D) son bastante resistentes a la irradiación. Otras, como las vitaminas A, B1,
E, y K, se destruyen más fácilmente (OMS, 1989). En estudios como los de Finten y col. (2017)
en el cual se analizaron las mejoras en seguridad y retención de calidad con la aplicación de IG
en hojas de espinaca; se demostró que con dosis de 1,5 kGy se redujo la microbiota nativa durante
el almacenamiento por 15 días bajo refrigeración y, a pesar de que componentes antioxidantes,
polifenoles, carotenoides, clorofilas fueron preservados, se produjo una reducción del 80% de
ácido ascórbico (Vitamina C). Similar disminución de esta vitamina fue reportada en el estudio
de Jo y col. (2012) donde se analizaron propiedades sensoriales, cambios químicos y
microbiológicos en jugo de col rizada y ashitaba fresca. En este último, también fueron
sensorialmente más aceptadas las muestras tratadas con IG que las muestras control (sin
tratamiento) al cabo de 3 días para el jugo de col (Jo y col., 2012).
28
Introducción
Tal como fue mencionado anteriormente, la aplicación de irradiación gamma ha llamado la

atención de muchos investigadores como estrategia para la obtención de un alimento seguro con
la eliminación de MO patógenos y de deterioro, reteniendo sus principales nutrientes y
propiedades y, en muchos casos, agregando valor al producto. Durante las últimas dos décadas,
esta tecnología no térmica fue utilizada en frutas y vegetales frescos (Fan y col. 2008), jugos de
caña de azúcar (Mishra y col., 2011), lechuga (Fan y col., 2012), jugo de granada (Alighourchi y
col., 2014), hojas de espinaca (Finten, 2017) y bebidas a base de F&V (Bevilacqua y col.,2018),
entre otras aplicaciones.
Tabla 1.4 - Distintas dosis de irradiación gamma necesarias para el aseguramiento de la

inocuidad de distintos productos (OMS, 1989).
Propósito Dosis (kGy) (a) Productos
Dosis reducida (hasta 1 kGy)
a) Inhibir germinación 0,05-0,15 Patatas, cebollas, ajos, raíz de
jengibre, etc.
b) Eliminar insectos y parásitos 0,15-0,50 Cereales y legumbres, frutas

frescas y secas, pescados y
carne frescos y secos, cerdo
fresco
c) Retrasar procesos fisiológicos 0,50-1,00 Frutas y hortalizas frescas

(maduración)
Dosis media (1-10 kGy)
a) Prolongar el tiempo de 1,0-3,0 Pescado fresco, fresas, etc.
Conservación
b) Eliminar microorganismos de 1,0-7,0 Marismo fresco y congelado,
la descomposición y patógenos aves de corral y carne cruda o
congelada, etc.
c) Mejorar propiedades tecnológicas 2,0-7,0 Uvas (aumenta la producción de

del alimento zumo), verduras deshidratadas
(disminuye el tiempo de
cocción), etc.
Dosis elevada(b)
a) Esterilización industrial 30-50 Carne, aves, mariscos,
(combinada con calor suave) alimentos preparados, dietas
hospitalarias, estériles
b) Descontaminar ciertos aditivos 10-50 Especias, preparaciones

Alimentarios e ingredientes enzimáticas, goma natural, etc.
(a)
Gy: gray (unidad que mide la dosis absorbida).
(b)
Solo se usa con fines especiales. La comisión FAO/OMS de Codex Alimentarius aún no ha respaldado la aplicación
de dosis elevadas.
En Argentina existen dos instalaciones de irradiación en funcionamiento, una de ellas

operando desde 1970 (Centro Atómico Ezeiza, CAE) y la otra desde 1989 (Ionics Inc.); sin
embargo, hay pocos productos alimenticios irradiados disponibles en almacenes y mercados. Es
importante mencionar que la aplicación de la tecnología de irradiación en la industria alimentaria
es limitada debido a la percepción del consumidor de que la irradiación de alimentos es una
tecnología nuclear (Zhang y col., 2018). Por lo cual, en esta Tesis se desea, además de seguir
fomentando la importancia de la irradiación gamma como una posible estrategia de
descontaminación no térmica, cambiar la percepción del consumidor e incentivar a que compre
alimentos irradiados demostrando que se utilizan equipos seguros y confiables para garantizar la
inocuidad de los productos frescos, que son cada vez más buscados por los consumidores. A su
vez, también se busca la obtención de resultados alentadores para la adopción a gran escala de
esta tecnología por parte de la industria. Adicionalmente, a pesar de que varios estudios
29
Introducción
presentados en esta sección han demostrado la alta eficiencia de esta tecnología aplicada en
diferentes vegetales para controlar patógenos típicos, como contraparte se encuentra que la
tolerancia de los vegetales a la radiación puede variar, por lo que se requiere la validación del
proceso en cada caso.
1.4.2. Ultrasonido
El tratamiento con ultrasonido (US) ha sido reconocido como una de las tecnologías no
térmicas que logra reducir significativamente la carga microbiana, y a la vez preserva las
propiedades organolépticas de los productos alimenticios frescos (Alighourchi y col., 2014).
Disminuyendo los efectos negativos sobre la calidad y mejorando o manteniendo los atributos
funcionales de los productos tratados (Morales de la Peña y col., 2016), e incluso observándose
en algunos casos el aumento del contenido de compuestos bioactivos. Así mismo, se han logrado
diversos niveles de inactivación en las principales enzimas de deterioro de jugos de F&V (Cao y
col., 2018).
La aplicación de US es una técnica de preservación que está siendo muy estudiada como una
alternativa a la pasteurización y esterilización de alimentos líquidos. El mecanismo de
inactivación de MO está basado en una serie de factores físicos y químicos producto de la
influencia de las ondas ultrasónicas en el producto (Alighourchi y col., 2014). Las aplicaciones
de las ondas ultrasónicas se dividen en dos grupos: baja y elevada intensidad. Las de baja
intensidad son aquellas cuyo objetivo es obtener información acerca del medio de propagación
sin producir ninguna modificación en su estado. Por el contrario, las aplicaciones de elevada
intensidad son aquellas en la que la energía ultrasónica se utiliza para producir cambios
permanentes en el medio tratado (Robles Ozuna y Ochoa Martínez, 2012). En referencia a estos
cambios producidos en los alimentos, además de ser utilizados para la conservación, lo son para
la extracción de nutrientes y otros tipos de procesamientos.
La propagación de las ondas ultrasónicas en el alimento líquido induce la cavitación de

burbujas debido a cambios de presión. Estas microburbujas resultantes colapsan e inducen un
aumento local de temperatura y presión. Por lo tanto, la intensa energía local y la alta presión
provocan un efecto de pasteurización localizada que podría causar una elevación sustancial de la
temperatura del líquido tratado, y además afectar la estructura de las células situadas en el
microentorno (Jiménez Sanchez y col., 2017a); sin embargo, cuando los efectos térmicos no son
deseables se puede controlar este parámetro utilizando baños térmicos. Entre los efectos físicos
se mencionan el adelgazamiento de las membranas celulares, calentamiento localizado y cambio
de presión; y en cuanto a efectos químicos, se presentan la producción de radicales libres como
iones hidróxidos (OH-) y protones ( H+) debido a reacciones fotoquímicas (Koda y col., 2009).
Dependiendo de la frecuencia (Hz) y potencia (W) empleadas, se pueden generar diferentes

cambios físicos, químicos y bioquímicos que pueden emplearse en un sin número de aplicaciones
en los diferentes campos industriales (Herrero y Romero, 2006). Ambos son parámetros que
deben ser especialmente evaluados para el producto que se pretende estudiar. Las frecuencias más
empleadas están entre 20-100 kHz en un intervalo de potencia de 100-800 W. A bajas frecuencias
(20 kHz) prevalecen los efectos físicos del US por un incremento de la transferencia de masa sin
que se produzcan fenómenos de degradación de los metabolitos presentes (Rodríguez Riera y col.,
2014). En general, la sonicación de baja potencia tiende a aumentar el nivel de bioactivos en los
30
Introducción
sistemas alimenticios tratados debido a la extracción de estos compuestos beneficiosos para la

salud, o bien lograr la extracción de pigmentos intracelulares, como resultado de la disrupción de
la pared celular (Bevilacqua y col., 2018); como ejemplo de ello, estudios reportan la extracción
de ácidos málico y tartárico de las semillas de uvas, polifenoles de la cáscara de naranja y
pigmentos naturales de semillas de avellanas, entre otras aplicaciones (Rodríguez Riera y col.,
2014).
Continuando con lo mencionado al principio de la sección, la sonicación ha sido ampliamente

investigada como un medio utilizado para preservar jugos de frutas y/o verduras, con resultados
prometedores, como en: la aplicación de US (20 kHz; 50% a 100%; 0 a 15 min; 25 ° C) en la
inactivación de E. coli y S. Cerevisiae en jugo de granada, donde se observó que a niveles de
amplitudes más altos la velocidad de desactivación de bacterias y levaduras aumentaba, de esta
forma se mostró que los niveles de amplitud más bajos (50% y 75%) no inactivaron E. coli y S.
cerevisiae significativamente (<1,5 log en reducción registrada), mientras que al 100% de
potencia durante 15 minutos, la población de ambos microorganismos tuvo una reducción de 3,2
log UFC/mL (Alighourchi y col. 2014); se reportaron reducciones significativas de
Alicyclobacillus Acidoterrestris en jugo de manzana (Yuan y col., 2009), L. monocytogenes en
jugo de naranja (Ferrante y col., 2007), S. Cerevisiae en jugos naturales de naranja y granada
(Sánchez; Rubio y col., 2016), y otros MO de deterioro incluyendo esporas en jugos naturales y
comerciales de manzana (Ferrario y col., 2015); el recuento de aerobios totales fue
significativamente menor en las muestras de un jugo de manzana y zanahoria que fue sonicado
(1000W; 20 kHz; 10 minutos; 25 ° C) con un pH más bajo en comparación a las muestras con pH
más alto, ambas analizadas después de un mes de almacenamiento a 4°C (Gao y Rupasinghe,
2012 ); el análisis de la calidad nutricional del jugo de zanahoria y jugo de naranja, ambos tratados
bajo las mismas condiciones (100W; 50%; 20 kHz; 15 minutos; <30 ° C), demostró resultados
muy similares al de los jugos frescos (Khandpur y Gogate, 2015); con la aplicación de US
(200W; 70% y 100%; 20 kHz; 10 y 15 min; 25 ° C) se logró un aumento significativo en el
contenido total de fenoles y actividad antioxidante en el jugo de bayas rojas y/o azuladas, al 70%
de la potencia mostró un menor efecto sobre las antocianinas y sobre el color del jugo en
comparación con el tratamiento térmico (Farhadi Chitgar y col., 2017); también en un jugo del
nectar de manzanas y arándanos donde se estudió el efecto del US (600 W; 60 a 120 μm; 20 kHz;
3 a 9 min; 20°C) sobre las propiedades reológicas determinándose que tanto las muestras sin tratar
como las tratadas presentaban reología de fluidos no newtonianos específicamente caracterizados
como dilatantes (Simunek y col., 2014).
De esta forma, queda en evidencia el potencial del US para distintos objetivos en los diferentes
sistemas alimenticios. Finalmente, se mencionan a continuación algunas ventajas de la aplicación
esta tecnología en la industria alimentaria (Robles Ozuna y Ochoa Martínez, 2012):
• Efectividad contra células vegetativas y esporas

• Reducción de los tiempos y temperaturas de procesos
• Incrementos de los fenómenos de transferencia de calor
• Posible modificación de la estructura y textura en alimentos
• Empleabilidad en procesos continuos o intermitentes
• Efectividad sobre la actividad enzimática
La efectividad de esta técnica depende de:

• Las propiedades fisicoquímicas de los alimentos
31
Introducción
• El volumen de alimentos procesados

• Tipos de microorganismos
• Temperatura del tratamiento
• La frecuencia y amplitud que se utiliza en el tratamiento
• La posición de la sonda ultrasónica
• Geometría del reactor
• Geometría y ubicación de sonda
• Densidad de energía acústica (DEA)
• Nivel de potencia
• Duración del tratamiento
Como se puede notar, son muchos los parámetros que se deben tener en cuenta para que la
utilización de esta técnica logre la máxima eficiencia que se busca en la preservación de los
alimentos. En general, autores aseguran que las células vegetativas son más susceptibles al US
que las esporas, además, las bacterias Gram negativas son más susceptibles que las Gram
positivas, posiblemente debido a las paredes celulares más gruesas que se encuentran en las
bacterias G+ las cuales les brindan una mejor protección contra los efectos de los ultrasonidos.
Las diferencias en la sensibilidad celular también podrían deberse a las capas de peptidoglicanos
más fuertemente adheridas en las paredes de las células bacterianas G+. A su vez, las células más
grandes, con mayor superficie, parecen ser más sensibles al US que las pequeñas. De acuerdo con
esto, se vio que los cocos son más que los bacilos debido a la relación entre la superficie celular
y el volumen. Por otro lado, se informa que las enzimas son inactivadas debido al efecto de
despolimerización/desnaturalización de las proteínas (Perera y Alzahrani, 2021). Sin embargo,
resulta evidente que como único método de preservación no ha tenido total eficacia, no se
destruyen todos los MO y además la aplicación de altas potencias pueden resultar un efecto
negativo para los nutrientes y aceptabilidad sensorial del producto. Por lo cual, se ha sugerido que
el ultrasonido podría ser más efectivo cuando se usa en combinación con otras tecnologías.
1.5. ANTIMICROBIANOS NATURALES
Actualmente los antimicrobianos sintéticos o químicos como benzoatos, propionatos,

sorbatos, sulfitos, nitritos, citratos, acetatos, extractos cítricos, ácidos orgánicos, quitosano, etc.
siguen siendo muy utilizados en la industria. Muchos de los compuestos sintéticos están presentes
como antimicrobianos naturales (AN) en ciertos alimentos (por ejemplo, benzoico en berries).
Los conservantes químicos, si bien son aceptados por los organismos reguladores, presentan
ciertas restricciones en cuanto a su uso; éstas se muestras en la Tabla 1.5 de acuerdo con el CAA.
Con respecto a los conservantes químicos, es importante mencionar la resistencia a los

antimicrobianos (AMR, por sus siglas en inglés), la cual es un tema de gran interés por sus
múltiples consecuencias a nivel global. Describe un fenómeno natural por el cual
microorganismos como bacterias, virus, parásitos y hongos ganan resistencia a los efectos de los
fármacos antimicrobianos, como los antibióticos, que van disminuyendo o pierden totalmente su
acción antimicrobiana en el tratamiento de infecciones. Es considerada una amenaza global
significativa para la salud pública, la seguridad alimentaria e inocuidad de los alimentos. Los
organismos resistentes a los antimicrobianos pueden ser más difíciles y costosos de tratar. Si los
32
Introducción
antibióticos no se usan adecuadamente, los residuos de antimicrobianos en los alimentos también

pueden representar un peligro para la salud de los consumidores (FAO/OMS, 2019).
En los últimos años el uso de estos conservantes en los alimentos ha disminuido su

aceptabilidad por parte de los consumidores y como consecuencia se incrementó la demanda de
componentes naturales como una alternativa muy pujante (Rodríguez Sauceda, 2011).
Los antimicrobianos naturales son compuestos capaces de inhibir el crecimiento de

microorganismos como bacterias, virus y hongos, constituyen una forma de garantizar alimentos
seguros e inocuos. Se ha determinado su potencial como técnica de preservación capaz de mejorar
las propiedades nutricionales y sensoriales (Pina Pérez y col., 2014). Además, ha sido demostrado
que la combinación de antimicrobianos, como ácidos orgánicos (málico, tartárico y benzoico),
bacteriocinas como nisina y agentes quelantes como EDTA producen efectos sinérgicos contra
los MO en productos frescos (F&V) (Perumalla y Hettiarachchy, 2011).
Tabla 1.5 - Asignación de aditivos químicos y sus concentraciones máximas en

“preparaciones culinarias industriales listas para consumo, congeladas o no, a base de
ingredientes de origen vegetal y/o animal, procesados o no (Resolución GMC N.º 51/00,
CAA).
ANTIOXIDANTE
Todos los autorizados

quantum satis
como BPF en MERCOSUR
Azufre Dióxido, Anhidrido
220 0,02
Sulfuroso
221 Sodio Sulfito 0,02 (como SO2)
Sodio Bisulfito, Sodio Sulfito
222 0,02 (como SO2)
Ácido
223 Sodio Metabisulfito 0,02 (como SO2)
224 Potasio Metabisulfito 0,02 (como SO2)
225 Potasio Sulfito 0,02 (como SO2)
226 Calcio Sulfito 0,02 (como SO2)
Calcio Bisulfito, Calcio Sulfito
227 0,02 (como SO2)
Ácido
228 Potasio Bisulfito 0,02 (como SO2)
Tocoferoles: concentrado
306 0,03 sobre materia grasa
mezcla
307 Tocoferol: Alfa-Tocoferol 0,03 sobre materia grasa
310 Propil Galato 0,02 sobre materia grasa
Ter-Butil Hidroxiquinona,
TBHQ, Butilhidroquinona Terciaria
Butil Hidroxianisol, BHA,
Hidroxianisol butilado
Butil Hidroxitolueno, BHT,
Hidroxitolueno butilado
CONSERVADOR
(excepto para productos congelados)
Todos los autorizados como
quantum satis
BPF en MERCOSUR
200 Ácido Sórbico 0,10
201 Sodio Sorbato 0,10 (como ácido sórbico)
202 Potasio Sorbato 0,10 (como ácido sórbico)
203 Calcio Sorbato 0,10 (como ácido sórbico)
El principal objetivo del procesamiento de alimentos es proveer bienestar al ser humano por
medio de alimentos seguros, nutricionalmente adecuados y cubrir las expectativas de sabor, aroma
33
Introducción
y apariencia; por lo cual el uso de aditivos alimentarios de origen natural está aumentando
considerablemente (Rodríguez Sauceda, 2011).
El origen de los antimicrobianos naturales puede ser vegetal, bacteriano o animal. Se ha

constatado que diferentes frutos, vegetales, extractos de plantas y metabolitos microbianos han
sido considerados como una potencial fuente de bioactivos y bioconservadores (Kim y col., 2011).
Como ejemplo de ello se pueden nombrar a los provenientes de vegetales, como los ácidos
orgánicos (cítrico, tartárico, succínico, benzoico, málico), compuestos fenólicos (catecol, DOPA,
ácido cafeico, eugenol, timol, flavonoides), compuestos tipo proteínas (similares a taumatina y
zeamatina), entre otros; también se encuentran los producidos por microorganismos lácticos como
la nisina y pediocina; los producidos por otros microorganismos como la natamicina, subtilina,
diacetilo, bacteriófagos, levaduras productoras de toxinas u otros metabolitos como etanol y
peróxido de hidrógeno; y a los provenientes de animales, como la lactoperoxidasa, lactoferrina,
lactoglobulinas y lactolípidos provenientes más específicamente de la leche; por último, también
se mencionan los particulares del huevo como la lisozima, avidina, ovoglobulina y ovotransferrina
(Sofos y col., 1998; López Malo y col., 2000; Naidu, 2000).
Algunos factores que influyen sobre la efectividad de los AN, los cuales deben considerarse
para la selección y el diseño del sistema de preservación son:
• Tipos de microorganismos a controlar y concentración en la que se encuentra

• Modo de acción del antimicrobiano
• Propiedades fisicoquímicas
• Interacciones aditivas, sinérgicas o antagónicas con otros antimicrobianos o por su
combinación con otros factores de estrés
• Composición del alimento (pH, aw, grasas, proteínas, etc.) e interacción con la
matriz alimentaria
• Estabilidad del antimicrobiano a las condiciones de procesamiento y
almacenamiento
• Otras propiedades funcionales del antimicrobiano además de la actividad
antimicrobiana
• Aspectos toxicológicos
1.5.1. Nisina
Según reportes de la FAO, el conservante natural de mayor potencial utilizado en matrices

alimentarias es la nisina, la que consiste en una mezcla de polipéptidos estrechamente
relacionados producidos por cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis (Figura 1.5) (FAO, JECFA
Monographs 7, 2009; Delves y col., 2011).
Desde hace cinco décadas este AN ha llamado la atención de muchos investigadores. El

Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) evaluó la nisina en
1969 y estableció una ingesta diaria aceptable (IDA) de 33000 UI (0,825mg/kg pc/d) (pc: peso
corporal; d: día) y en 1988 la FDA (Food and Drug Administration) le confirió el estatus de
sustancia GRAS (Generally Regarded As Safe) debido a sus propiedades antibacterianas, a su
impacto mínimo con relación a los cambios en las propiedades organolépticas de los alimentos y
a que desde el punto de vista del consumo humano las enzimas digestivas pueden degradarla sin
alterar la flora intestinal (Gómez Cárdenas y col., 2013). Es la única bacteriocina que ha sido
34
Introducción
aprobada por la OMS para ser utilizada como conservante en la industria alimentaria (Cano Serna
y col., 2015).
El uso de este aditivo cumple los principios generales sobre la inocuidad de los aditivos
alimentarios de la Sección 3.1 del preámbulo de la Norma General de Aditivos Alimentarios
(NGAA); en 2006 el Panel Experto Científico de la Unión Europea la declaró conservante seguro
y útil en alimentos. En 2009 se prepararon especificaciones para la nisina y se publicaron en
Monographs 7 del JECFA para la FAO (2009). La nisina ha sido asociada a la función tecnológica
de "conservante" y se la conoce por el Sistema Internacional de Numeración (SIN, CAC/GL 36-
1989) con el Nº (SIN) 234 (CX/FA 13/45/10, 2013).
En cuanto a su composición, el mayor polipéptido presente es la nisina A (Figura 1.4). La

producción de la nisina es a través de un medio esterilizado de sólidos lácteos sin grasa o de una
fuente de fermentación sin leche, como extracto de levadura y sólidos de carbohidratos. La nisina
se puede recuperar del medio de fermentación por varios métodos, como la inyección estéril,
filtración por membrana, acidificación, salazón y secado en seco. Pueden quedar presentes en el
producto, sólidos de leche sin grasa o sólidos provenientes de otras fermentaciones. Este
conservante está disponible en el comercio como preparación que consiste en nisina y cloruro de
sodio, y es estable a temperatura ambiente y también al calentar en condiciones ácidas (estabilidad
máxima a pH=3). Es un péptido soluble en agua y no soluble en solventes no polares; se describe
como un polvo micronizado de coloración blanca a tonalidades de marrón claro (FAO JECFA
Monographs 7, 2009).
A continuación, en las Figura 1.4 y Figura 1.5, se muestran las estructuras de los dos péptidos:
Figura 1.1 – Estructura química de la nisina A.
35
Introducción
Figura 1.5 – Estructura química de la nisina.
La inhibición del crecimiento de microorganismos es el efecto más comúnmente adjudicado a

la nisina, el cual es llevado a cabo por un mecanismo de acción que desestabiliza las funciones de
la membrana citoplasmática debido a la formación de poros especialmente en las bacterias Gram
positivas (G+), la nisina se une a la pared celular del MO mediante interacciones electrostáticas
gracias a la carga positiva de este antimicrobiano, los peptidoglicanos en las membranas celulares
poseen el precursor lípido II (lípido aniónico) que actúa en acoplamiento con la nisina para
traspasar la membrana, interfiriendo así con la síntesis correcta de la célula bacteriana, lo que a
su vez induce la formación de un poro transmembranal que permite la salida de aminoácidos,
sales y ATP, un proceso que conduce a la muerte celular (Beristain y col., 2012). En bacterias
Gram negativas (G-) el uso de agentes quelantes u otros antimicrobianos, puede disminuir las
propiedades de barrera de la membrana lipoproteica externa, sensibilizándolos a las bacteriocinas.
De esta forma, se ha reportado la efectividad de nisina principalmente contra bacterias G+

como, por ejemplo, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum y Bacillus cereus. Se ha
constatado que este antimicrobiano natural es inocuo y apropiado para utilizarlo en productos
cárnicos en control de L. monocytogenes, es un conservante efectivo y normalmente se aplica en
la superficie del producto inmediatamente antes de ser envasado (Vignolo y col., 2000; CX/FA
13/45/10, 2013). Sin embargo, presenta poca efectividad contra Salmonella Spp. y Escherichia
coli, las cuales pertenecen al grupo de las G-; y en el caso de levaduras y mohos tampoco han
tenido resultados significativos de inhibición. Ampliando el espectro microbiológico, de acuerdo
con Delves y col. (2011), la nisina es efectiva contra bacterias esporuladas mesófilas, por ejemplo,
Bacillus, Alicyclobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, y esporas termófilas como
Geobacillus y Thermoanaerobacterium. Por lo tanto, se concluye que tanto las células vegetativas
como esporuladas son sensibles frente a la nisina, y también es relevante mencionar que
generalmente se requiere mayor cantidad de este antimicrobiano para inhibir vegetativas en
comparación a esporuladas (Delves y col., 2011). Tal acción de la nisina contra las esporas ha
sido de gran importancia en la preservación de alimentos, estos resultados pueden deberse a la
homeostasis pasiva de las esporas, de forma que el daño estructural que realizan estas
bacteriocinas son la clave del efecto antibacteriano. También se ha demostrado su eficiencia
contra bacterias ácido-lácticas, debido a que es especialmente activa en alimentos de matriz ácida
(mayor solubilidad), por lo tanto, su eficaz poder de inhibición a bajos pH como en quesos
acidificados, aderezos para ensaladas y variedad de bebidas a base de F&V y alcohólicas. En
relación con estas últimas, dado que la nisina tiene efecto casi nulo contra levaduras, es utilizada
36
Introducción
en el proceso de fabricación de bebidas alcohólicas para el control de las bacterias ácido-lácticas,

por ejemplo, en cervezas y vino.
Se han realizado extensas investigaciones sobre la aplicación de la nisina, en el estudio de

Cano Serna (2015) se documentan algunas de ellas, donde el objetivo principal del autor fue
recopilar la información ya existente acerca de la utilización de la nisina como antimicrobiano en
diferentes matrices alimentarias. En el mismo, se muestra que la nisina ha sido estudiada por
ejemplo en carnes, embutidos, pescados, quesos, frutas y verduras, jugos de caña de azúcar, jugo
de tomate, aderezos, entre otros alimentos. Se reportó que la dosis de nisina requerida para la
inhibición completa de bacterias en el jugo de caña de azúcar fue directamente proporcional al
número de estas células bacterianas; además, inhibe las bacterias a 30ºC con mejor eficiencia que
a 4ºC de temperatura. Por ende, en la utilización de la nisina como conservante de alimentos se
debe tener en cuenta su dependencia con las especies de bacterias, el número de células
bacterianas contaminantes y la temperatura del proceso (Punyauppa Path y col., 2015). Por su
parte, con respecto a su uso en jugos a base de F&V se reportaron resultados muy prometedores
en combinación con otras técnicas de preservación. Como ejemplo de ello, se estudió la
incorporación de nisina en el jugo de naranja tratado previamente con la tecnología de campos
eléctricos pulsados (PEF por sus siglas en inglés) para inactivar MO de deterioro y MO patógenos
(E. coli y Listeria spp.). Esta combinación mostró un efecto sinérgico sobre los niveles de
inactivación, produciendo una reducción de hasta 5 log UFC/mL o más en todos los
microorganismos estudiados (McNamee y col., 2010). Se usaron altas presiones hidrostáticas
(HHP por sus siglas en inglés) con nisina para inactivar totalmente una carga microbiana de
esporas (más de 6 log) en jugo de manzana (Sokołowska y col., 2012a). Se trató el jugo de pepino
por HHP con nisina, obteniendo así una mayor vida útil en condiciones refrigeradas en
comparación con otras muestras tratadas (Zhao y col., 2013) demostrando el potencial de su uso
en combinación con otras tecnologías.
1.5.2. Natamicina
La natamicina es un antifúngico producido mediante el cultivo puro de bacterias Streptomyces

natalensis siguiendo un proceso estrictamente controlado de fermentación. La natamicina
pertenece al grupo de antimicóticos macrólidos de polieno, se caracteriza por la presencia de un
largo anillo macrólido conteniendo cuatro dobles enlaces conjugados y un residuo de azúcar
(Figura 1.6). Su fórmula molecular es C33H47NO13 (Capitan Vallvey, 2000), tiene un peso
molecular de 665,7 Da y presenta una ingesta diaria admitida (IDA) de 0-0,3 mg/kg/pc/d
(Hammond y Lambert, 1978). Se la utiliza para el tratamiento tópico de las infecciones por
hongos, y también en la industria alimentaria para evitar la contaminación de los productos por
una amplia variedad de levaduras y mohos (Te Welscher y col., 2010).
Entre las características que se mencionan en el Código Alimentario Argentino, ésta semeja a
partículas tamaño polvo cristalino blanco a blanco cremoso, casi insípido e inodoro, es
prácticamente insoluble en agua y en aceites grasos o minerales, ligeramente soluble en metanol
y soluble en ácido acético glaciar y en dimetilformamida (Res 19, 30.01.95, CAA, 2014).
37
Introducción
Figura 1.6 – Estructura química de la natamicina.
La membrana celular eucariótica de los hongos contiene lípidos, fosfolípidos, proteínas y

esteroles. El método de acción de la natamicina consiste en la unión irreversible a esteroles de
esta membrana, principalmente al ergosterol, pero sin permeabilizar la membrana plasmática.
Esto conduce a una rápida fuga de iones esenciales y pequeños péptidos produciendo lisis celular.
Es sabido que los esteroles tienen función estructural en la membrana de hongos y levaduras. El
ergosterol (esterol) no está presente en las membranas celulares de virus, bacterias y protozoos
(Hamilton-Miller, 1973), y se piensa que residen en dominios específicos estando involucrados
en procesos de endocitosis, exocitosis, fusión vacuolar (Wachtler y Balasubramanian, 2006),
señalización de feromonas (Jin y col., 2008), compartimentalización de membranas (Klose y col.,
2010), y el apropiado funcionamiento de las proteínas de membrana (Zhang y col., 2010). De
acuerdo con Athar y Winner (1971), la modificación estructural y/o la disminución de la expresión
del ergosterol disminuye sustancialmente la actividad fúngica de la natamicina in vivo. Te
Welscher y col. (2010) observaron que, a través de la interacción específica con el ergosterol, la
natamicina es capaz de interferir en las primeras instancias de fusión vacuolar. Durante esta fase,
se genera un reordenamiento de los diferentes complejos proteicos de las membranas. Por lo tanto,
esto sugiere que el modo de acción de la natamicina es perturbar los reordenamientos de proteínas
como resultado de su unión al ergosterol. Por esta razón es activa frente a los hongos y levaduras,
pero no contra bacterias, virus o protozoos (Te Welscher y col., 2008; Te Welscher y col., 2010).
Su falta de actividad contra las bacterias es especialmente beneficiosa en los alimentos madurados
o fermentados con bacterias. El antifúngico es activo en concentraciones muy bajas: la mayoría
de los mohos se inhiben en 0,5 a 6,0 µg/mL, aunque algunas especies requieren concentraciones
más altas. Las levaduras se inhiben generalmente entre 1,0 y 5,0 µg/mL (Delves y col, 2008).
La natamicina ha sido aprobada como aditivo alimentario en más de 40 países, y a su vez, es

reconocida como conservante natural por la Unión Europea (UE) mediante la identificación CEE
(Comunidad Económica Europea) N°235. El uso de natamicina para el tratamiento superficial de
quesos y embutidos está permitido en la UE y en muchos otros países a un nivel máximo de 1 mg
de natamicina/dm2 con una profundidad de penetración de no más de 5 mm. En Argentina, el
CAA establece que la natamicina puede ser empleada para el tratamiento de cáscara de quesos de
pasta dura o semidura o de sus cubiertas protectoras, en envolturas de embutidos secos que deban
sufrir un proceso de maduración (Res 19, 30.01.95; Art. 3, RESOLUCIÓN GMC N° 079/94,
CAA), en el dulce de leche de manera superficial (Art. 592, CAA). Adicionalmente, la natamicina
puede ser empleada en los alimentos que específicamente permita su uso como sustancia
38
Introducción
antimicótica la Autoridad Sanitaria Nacional (Res 19, 30.01.95, CAA). Otras aplicaciones
existentes o potenciales que tienen una autorización más limitada son el uso en la superficie de
productos horneados y en jugos de frutas, bebidas de malta y vino. La aplicación en vino es
principalmente en vinos endulzados al final de la fermentación para evitar que ocurran
fermentaciones secundarias (Thomas y col., 2005).
En productos como frutas y jugos enlatados, embotellados o envasados en cartón, se puede

dar la presencia de un moho, Byssochlamys, el cual puede tolerar condiciones de oxígeno reducido
y/o dióxido de carbono elevado. Estas características le dan una ventaja selectiva en este tipo de
alimentos. En presencia de niveles muy bajos de oxígeno, estas especies parecen crecer
anaeróbicamente y producir dióxido de carbono, lo que provoca hinchazón y deterioro del
producto. Este deterioro se ha observado en el jugo de piña pasteurizado fabricado en Arabia
Saudita, lo cual fue controlado eficazmente mediante la adición de 25 ppm de natamicina (como
50 mg/L de NatamaxTM) (Delves y col., 2008).
Aunque fue demostrado que la natamicina reduce eficazmente la viabilidad de Saccharomyces

en suero de queso (Gallo y Jagus 2006; Ollé Resa et al. 2014), no hay muchos informes que
prueben este antifúngico contra otras levaduras que causan serios problemas en la industria
alimenticia, un ejemplo de éstas son las cepas de Candida spp. en bebidas. Se encontró que éstas
se adhieren y desarrollan biopelículas o biofilms en membranas de ultrafiltración (UF) utilizadas
en la clarificación de bebidas (Tarifa y col., 2013) y también en equipos de procesamiento de pre
y post UF (Brugnoni y col., 2007). Es por ello que Candida spp. se encuentran entre las especies
de levadura más comunes asociadas a las membranas de UF en las plantas de procesamiento de
jugos de frutas (Tarifa y col., 2018). Por ejemplo, C. tropicalis L5, una cepa previamente aislada
de las membranas de UF, se adhiere fuertemente a la superficie del acero inoxidable, formando
biopelículas resistentes. Adicionalmente, se ha demostrado que los procedimientos de limpieza
no pueden eliminar fácilmente la levadura en dichos sitios y se asumió que esta comunidad puede
persistir a lo largo del tiempo en las superficies de producción de alimentos (Brugnoni y col.,
2007; Tarifa y col., 2013; Tarifa y col., 2018). Recientemente, se llevaron a cabo estudios en
muestras provenientes de un jugo de manzana de una planta elaboradora a gran escala ubicada en
Río Negro, Argentina, obteniéndose como resultado que la natamicina incorporada de forma
directa en altas concentraciones (0,3 a 1,2 mmol l-1) provocó una fuerte disminución en el número
de células y una alteración de la estructura en las biopelículas de C. tropicalis. Además, la
combinación de farnesol (compuesto orgánico de origen natural que se encuentra presente en
numerosos aceites esenciales de plantas) en concentración de 0,6 mmol l-1 y natamicina en una
concentración menor (a la mencionada anteriormente) de 0,01 mmol l-1 (concentración máxima
de natamicina aceptada para la adición directa en jugos de frutas) redujo efectivamente el recuento
de células y rompió la estructura de las biopelículas de C. tropicalis. Destacándose, de esta forma,
que el farnesol (0,6 mmol l-1) aumentó significativamente la inhibición ejercida por la natamicina
(0,01 mmol l-1, ∼5 ppm) reduciendo el desarrollo de estas biopelículas (provenientes del jugo)
extraídas de las superficies de acero inoxidable. De esta forma, los autores destacaron
prometedores resultados para el diseño de nuevos conservantes y productos de limpieza para la
industria alimentaria basados en enfoques combinatorios (Agustín y col., 2019).
39
Introducción
1.5.3. Extracto de Té Verde
La utilización de extractos de plantas como alternativa de conservantes químicos o

antimicrobianos sintéticos para combatir las ETA a causa de patógenos y la microflora nativa
presente en los alimentos, o bien su rol como antioxidantes inhibidores de la oxidación de lípidos,
es una tendencia en crecimiento en la industria alimentaria (Perumalla y Hettiarachchy, 2011).
Además, también han sido estudiados como antioxidantes para el organismo debido a sus
componentes principales y las funciones de estos sobre las células del cuerpo (Young y col.,
2002). Los compuestos químicos presentes en estos extractos naturales (EN) son polifenoles,
quinonas, flavonoides, alcaloides y lecitinas (Cowan, 1999).
Tradicionalmente, el té (verde, rojo, negro y blanco) ha sido una bebida extensamente

consumida, y ha sido objeto de un considerable número de investigaciones por sus beneficiosas
implicaciones para la salud, ya que posee capacidad antioxidante, anticancerígena y
antibacteriana entre otras (Cooper y Morre, 2005; Matthews, 2010). Se han llevado a cabo
numerosos estudios de preservación en carnes (vaca, cerdo, pollo, entre otras) y se ha constatado
la efectividad de los extractos naturales, en especial el extracto de té verde (ETV), frente a las
reacciones lipídicas (Young y col., 2002). Éstas últimas son consideradas unos de los problemas
inherentes con mayor importancia para la aceptabilidad y calidad de los productos de alto
contenido graso en general, debido a la producción de especies reactivas de oxígeno que quedan
presentes en estos alimentos y flavores desagradables provenientes de ácidos grasos insaturados
(Perumalla y Hettiarachchy, 2011).
En particular, el extracto de té verde posee una gran variedad de componentes fenólicos con
capacidad de ejercer su actividad antioxidante de distintas formas, por ejemplo, actuando como
dadores de hidrógeno, agentes reductores, eliminando especies reactivas de oxígeno y como
quelante de iones metálicos en diferentes tipos de alimentos (Gramza y col., 2006). Por otro lado,
en cuanto a la actividad antimicrobiana que poseen estos compuestos extraídos del té verde,
Perumalla y Hettiarachchy (2011) informaron que los mismos son capaces de inhibir tanto
bacterias Gram positivas como Gram negativas. El grado de susceptibilidad de las bacterias al
ETV está relacionada al tipo de membrana celular que estas presenten, las cuales se componen
esencialmente de una bicapa de fosfolípidos y proteínas, y es el principal sitio de interacción con
los compuestos antimicrobianos; ya que estos aumentan la permeabilidad de membranas celulares
debido a la hidrofobicidad de éstas, con pérdida de iones y otros componentes celulares (ribosa y
glutamato de sodio), producen alteración del flujo de electrones, disminución de la fuerza motriz
de protones e interacción con las proteínas de las membranas, concluyendo así en la degradación
de las paredes celulares. La presencia de la capa de peptidoglicano en la pared celular de las
bacterias G+ podría explicar la mayor eficiencia que tienen los polifenoles contra estas. En cuanto
a la acción de los isotiocianatos, Delaquis y Mazza (1995) han reportado la relación de estos con
la inactivación de enzimas extracelulares a través de la oxidación de enlaces disulfuro y que la
presencia de radicales activos de tiocianatos fueron causantes del efecto antimicrobiano. De esta
forma, como lo demuestran los desarrollos en el campo, en varias cepas de Staphylococcus (cocos
Gram Positivas) y bacilos Gram Negativos, incluyendo E. Coli, Klebsiella pneumoniae y
Salmonella, se ha reportado el efecto antibacteriano, encontrando que se necesitan 50-100 μg/mL
de ETV para inhibir el crecimiento de Staphylococcus y 800 μg/mL para lograr la inhibición de
las bacterias bacilos Gram negativos (Yoda y col., 2004).
Por otro lado, el color amarronado que producen ciertas enzimas sobre frutas y verduras y/o
sus productos es un factor importante que disminuye su calidad y aceptabilidad por parte de los
40
Introducción
consumidores. Por ello, también se han realizado investigaciones sobre la influencia que tienen
los compuestos del ETV frente a la actividad enzimática principal causa de estos pardeamientos
indeseables. Se investigó el efecto de cinco extractos de té verde a distintas concentraciones (1g/L-
1
, 2g/L-1 y 3g/L-1) sobre la actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en jugo de manzana fresco.
Además, se estudió la inhibición de la PPO y la estabilidad del color del jugo durante el
almacenamiento refrigerado a corto plazo. Como resultado, todos los extractos inhibieron la
actividad de PPO en jugo de manzana fresco de manera dependiente de la concentración. La
actividad de PPO en jugo de manzana control (sin té) disminuyó en un 7% después de 48 hs,
mientras que la actividad de PPO en muestras con 1g/L-1, 2g/L-1 y 3g/L-1 de extracto de té
disminuyó en un 53%, 74% y 96%, respectivamente. El color amarronado del jugo de manzana
durante el almacenamiento disminuyó con una mayor concentración de extracto de té verde.
Después de 48 hs, el extracto a 1g/L-1, 2g/L-1 y 3g/L-1 inhibió el pardeamiento del jugo en un 48%,
60% y 86%, respectivamente, en comparación con el jugo de manzana control. En conslusión se
obtuvo que el extracto de té verde puede ser un agente anti-pardeamiento eficaz para jugos de
manzana frescos almacenados por poco tiempo (Klimczak y Gliszczynska-Swigło, 2017).
Se ha constatado que la acción de los compuestos fenólicos como antimicrobianos depende de

la concentración en la que se encuentran, a bajas concentraciones afectan la actividad de enzimas
asociadas a la producción de energía y a altas concentraciones producen desnaturalización de las
proteínas de las membranas de las bacterias (coagulación del citoplasma) (Tiwari y col., 2009).
Las catequinas de té verde son consideradas GRAS (Generally Regarded As Safe) para su uso
en alimentos; ETV puede ser utilizado en varias matrices alimentarias como carnes de vaca, pollo
y pavo, en productos vegetales como espinaca, en productos probióticos, en las distintas
variedades de jugos a base de frutas y/o verduras. Sin embargo, el problema persiste en que la
cantidad agregada de ETV a ciertos productos, necesaria para lograr un alimento inocuo resulta
en efectos sensoriales negativos, cambios en el gusto, color, flavor. Debido a esto se han llevado
adelante numerosos estudios que buscan combinar este antimicrobiano con otros métodos de
preservación, para poder disminuir las dosis utilizadas y con ello los efectos sensoriales
indeseables (Perumalla y Hettiarachchy, 2011; Klimczak y Gliszczynska-Swigło, 2017;
Fernandez y col., 2018).
1.6. TECNOLOGÍAS DE OBSTÁCULOS
El avance de las investigaciones y las tecnologías han llevado a los consumidores a ser más
exigentes en cuanto a diversidad de productos, vida útil suficiente y bajo contenido calórico, bajo
costo y credenciales ambientales de los productos que consumen. Las características que definen
la calidad de los alimentos, como la apariencia, la textura, el sabor y el contenido nutricional, se
ven fuertemente afectadas por la forma en que se procesan los alimentos. Para satisfacer estas
demandas de los consumidores, el procesamiento de alimentos se está volviendo cada vez más
desafiante y diverso, implicando modificaciones en las técnicas de procesamiento de alimentos
vigentes y el desarrollo y adopción de nuevas tecnologías de procesamiento innovadoras
(Priyadarshini y col., 2018). Se ha demostrado la deficiencia que presentan algunos métodos por
sí solos. De esta forma, para cubrir estas limitaciones, surgieron las “tecnologías de obstáculos”
(Hurdle Technology) que se basan en la aplicación de factores de estrés combinados en baja
intensidad o tratamientos suaves, los cuales interaccionan de forma aditiva o sinérgica, siendo
eficientes para reducir la carga microbiana, eliminando así los efectos adversos de los tratamientos
41
Introducción
severos proporcionados por un solo tipo de técnica de preservación. Algunos de los beneficios
que proporciona este modelo de “preservación multiblanco” en cuanto a la reducción de MO son:
• Dificulta la respuesta homeostática del MO

• Evita síntesis de proteínas resistentes (“stress shock proteins”)
• Conduce a agotamiento metabólico de los MO
• Afecta simultáneamente distintos blancos (membrana, ADN, enzimas)
También llamada “tecnología de barrera”, ésta interfiere con los mecanismos homeostáticos
activos de las células vegetativas y los mecanismos homeostáticos pasivos de las esporas
bacterianas en un número de sitios o de manera cooperativa, es decir que se lleva a cabo la
perturbación múltiple de la homeostasis. Por lo tanto, la combinación inteligente y deliberada de
esta técnica permite mejorar no solo la estabilidad y la seguridad microbiológica sino también la
calidad sensorial, nutricional y los aspectos económicos de un alimento.
La combinación de obstáculos físicos con antimicrobianos representa el enfoque básico de la

teoría de obstáculos. En primer lugar las técnicas físicas permiten la reducción de la microflora
natural y luego el control de los MO sobrevivientes se logra químicamente, ya sea de manera
biológica (antimicrobianos naturales) o con compuestos químicos (antimicrobianos sintéticos o
químicos) (Bevilacqua y col., 2015). La aplicación de estos métodos combinados se ha estudiado
utilizando una diversa gama de nuevas tecnologías de preservación, como lo demuestra Paparella
y col. (2016), quienes demostraron que mientras la técnica de envase con atmósfera modificada
(MAP) no reducía el crecimiento de L. monocytogenes en el tratamiento de carne de cerdo fresca,
sí se obtuvo un resultado alentador cuando se combinó con quitosano, reduciendo la población de
MO en 2 ciclos log e inhibiendo el crecimiento durante 15 días de almacenamiento bajo
refrigeración (4°C). Por otra parte, el tratamiento con modificación de la atmósfera incial (MIA)
en combinación con antimicrobianos naturales como la nisina (Ni) y/o extracto de té verde (ETV),
presentó efectos de sinergia en la reducción de la microbiota natural de hojas de remolacha
comparando solamente con MIA; resultado alentador no solo desde el punto de vista económico
por lograr la combinación más sustentable, sino también por la disminución del impacto sensorial
negativo que produce el agregado de aditivos (Fernández y col., 2018).
Siguiendo con esta línea, más centrado hacia el área de interés para este trabajo, se ha evaluado
la combinación de la tecnología de IG con compuestos antimicrobianos. Mishra y col. (2011)
estudiaron la combinación de distintos compuestos con actividad antimicrobiana (ácido cítrico,
benzoato de sodio, sorbato de potasio y sacarosa) en un jugo de caña de azúcar irradiado con rayos
gamma para extender su vida útil a 15 días a temperatura ambiente y 35 días a 10°C. Como
resultado se encontró que la carga microbiana estaba por debajo del límite detectable dentro de
los períodos y condiciones evaluadas, con algún efecto sobre los parámetros de calidad. Además,
los puntajes de la evaluación sensorial mostraron que el jugo con este tratamiento combinado fue
altamente aceptable (Mishra y col., 2011). Otro estudio de la combinación de IG con AN fue el
de Severino y col. (2014), donde se evaluó el efecto antilisterial de tratamientos no térmicos
(inluida la IG) en combinación con cápsulas bioactivas (recubrimientos de quitosano nativo y
modificado) conteniendo nanoemulsiones de aceites esenciales de carvacrol, bergamota, limón y
mandarina. Estas cápsulas fueron aplicadas a flores de brócoli previamente inoculadas con
Listeria monocytogenes. Como primer resultado se obtuvo que el recubrimiento a base de
quitosano modificado que contenía aceite esencial de mandarina fue el mejor tratamiento, el cual
provocó una reducción de carga de Listeria de 1,46 log UFC/g después de 6 días de
42
Introducción
almacenamiento. Luego se vio que la mejor actividad antilisterial se obtuvo con la combinación
de este recubrimiento (conteniendo aceite esencial de mandarina) y la radiación gamma (0- 2,24
kGy), mediante que se comprobó un aumento de la sensibilidad relativa a la radiación de L.
monocytogenes en 1,33 veces, resultado de una regresión lineal con valores de D10=0,24 (con las
cápsulas) vs D10=0,32 (solo irradiación). Además, garantizó la seguridad microbiana durante el
almacenamiento con una reducción de L. monocytogenes en 2,5 log UFC/g después de 13 días
(Severino y col., 2014).
Por otro lado, se encuentra el estudio de la combinación de US con otras tecnologías, por
ejemplo, antimicrobianos como benzoato, extractos cítricos (Bevilacqua y col., 2013; Bevilacqua
y col., 2014), ácidos orgánicos (Muñoz y col., 2012; de São Jose y col., 2014), y quitosano
(Guerrero y col., 2005) lográndose resultados prometedores. En un estudio para controlar el
crecimiento de L. monocytogenes en un jugo de naranja se aplicó US + temperatura controlada
(45°C) + antimicrobianos (citral y/o vainillina, por separado o combinando ambos), logrando un
tratamiento efectivo tanto en efecto bactericida como en la aceptación de los consumidores
(Ferrante y col., 2007). La sonicación también ha sido utilizada en el tratamiento sanitizante junto
con agentes clorados y ácido peracético, y además en este estudio también se reportó el resultado
de la incorporación en el almacenamiento de un AN como es el extracto natural proveniente de la
pimienta dioica, para determinar efectividad contra L. monocytogenes y la microbiota natural
(bacterias psicotróficas, acido lácticas y mohos y levaduras) de una ensalada de verduras, en el
cual los resultados demostraron ser muy diferentes dependiendo del tipo de MO que se trate
(Suprani Marques y col., 2019).
Adicionalmente, otras investigaciones demuestran que combinaciones de antimicrobianos

sintéticos y/o naturales pueden tener efecto de letalidad múltiple contra patógenos como Listeria
monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 y Salmonella Typhimurium como ha sido reportado
en Perumalla y Hettiarachchy (2011); lo que resulta de gran atracción para los consumidores, al
obtener un producto con imagen más saludable, no tóxico, con mayor concentración de
componentes naturales y sin aumento del precio (Perumalla y Hettiarachchy, 2011). Se reporta en
Pina Pérez y col. (2014), ejemplos de estas combinaciones; además de los ácidos comúnmente
agregados (por ejemplo, ácido málico) a los jugos naturales de melón y sandía, se ha estudiado la
mejora en cuanto a seguridad microbiológica adicionando extractos de aceites esenciales (de
limón, canela y geraniol), logrando inactivar por completo Salmonella Typhimurium (>8 ciclos
log) en el sustrato a pH 5,91. El agregado de terpenos encapsulados y el D-limoneno contra S.
cerevisiae, E. coli y Lactobacillus demostró no solo un mayor efecto de los compuestos nano-
encapsulados como antimicrobianos específicos, sino también una mejora de la calidad de la
bebida como resultado de una mejor preservación de las propiedades sensoriales de los jugos de
pera y naranja estudiados (Pina Pérez y col., 2014). Otro estudio (McNamee y col., 2010), se ha
centrado en la seguridad microbiológica, la conservación y la mejora de la calidad incorporando
nisina (2,5 ppm), natamicina (10 ppm), ácido benzoico (100 ppm) o ácido láctico (500 ppm) en
jugo de naranja procesado por tecnología PEF, logrando inactivar el deterioro por Pichia
fermentans y microorganismos patógenos como E. coli y Listeria spp.
Es así como la combinación de tecnologías se encuentra actualmente en auge siendo estudiada

en diferentes matrices alimenticias demostrándose los posibles efectos sinérgicos aún en bajas
intensidades, por ejemplo, menor dosis de IG, disminución en el nivel de amplitud o tiempo de
tratamiento de US, o una menor dosis de agentes antimicrobianos utilizados en la conservación
de jugos de frutas y/o verduras (Bevilacqua y col., 2015, 2018).
43
Objetivos
2. OBJETIVOS
Objetivo general
Estudiar y desarrollar, en sus aspectos básicos y aplicados, procesos que permitan obtener
alimentos nutritivos, más naturales y seguros, mediante la aplicación de métodos de preservación
que maximicen la seguridad y minimicen el deterioro de su calidad nutritiva y sensorial.
Objetivos específicos
1. Optimizar el proceso de conservación de un batido mixto de frutas y verduras a través

de la aplicación de tecnologías no térmicas de preservación (radiaciones gamma o
ultrasonido) en combinación con antimicrobianos naturales (té verde, nisina o
natamicina), seleccionando las combinaciones que resulten más efectivas en la
inactivación de factores de deterioro y en la preservación o mejora de indicadores de
calidad.
2. Estudiar el efecto de los tratamientos combinados seleccionados sobre la estabilidad

y vida útil de los batidos mixtos durante su almacenamiento en refrigeración.
3. Estudiar la efectividad de los tratamientos combinados seleccionados para asegurar la

inocuidad de los batidos frente a posibles contaminaciones con microorganismos de
interés.
44
Materiales y Métodos
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIA PRIMA
Las materias primas (MP) utilizadas para la preparación de los batidos (Figura 3.1), objeto de
estudio en esta Tesis, fueron: naranjas (cv. Salustiana, Argentina), manzanas (cv. Granny Smith,
Argentina), zanahorias (cv. Flakee, Argentina), hojas de remolachas (HR) y tallos de remolacha
(TR) (cv. Detroyt, Argentina). Éstas fueron adquiridas en mercados locales de la ciudad de
Buenos Aires, Argentina, y trasladadas inmediatamente hasta el laboratorio. Una vez allí, se
almacenaron a 5°C hasta su procesamiento.
Figura 3.1 – Materia prima para preparación del batido.
45
3.2. PREPARACIÓN DEL BATIDO
La composición (en peso) de los ingredientes para la formulación del batido (jugo de naranja:
59%, manzanas: 15%, zanahorias: 15%, hojas de remolacha: 6% y tallos de remolacha: 5%) fue
establecida en estudios previos del grupo de investigación donde se desarrolló esta Tesis (Denoya
y col., 2017). Esta formulación se seleccionó frente a otras conteniendo distintos porcentajes de
subproductos de remolacha y otras frutas y/o verduras tradicionales, ya que demostró tener
excelentes características nutricionales y, en pruebas sensoriales donde se consideraron
propiedades como color, apariencia, sabor, separación de fases, entre otras, presentó los mejores
resultados, valorándose positivamente características como el color rojo intenso, sabor a frutas
frescas y estabilidad de partículas en suspensión.
Para la preparación del batido, en primer lugar, se seleccionó la materia prima, descartándose
las frutas, raíces y hojas defectuosas. La MP seleccionada fue desinfectada por inmersión en una
solución de hipoclorito de sodio (concentración 200 ppm) durante 5 minutos según la metodología
utilizada por Fernandez y col. (2018). Transcurrido ese tiempo, se retiró la materia prima de la
solución desinfectante, dejando escurrir el remanente de solución y se procedió a procesar cada
uno de los ingredientes: las zanahorias y las manzanas fueron peladas manualmente y se cortaron
en trozos pequeños junto con las hojas y tallos de remolacha, mientras que por otro lado se
exprimieron las naranjas utilizando un exprimidor doméstico de acero inoxidable. Luego, se
pesaron los ingredientes según la fórmula previamente mencionada y se colocaron en la batidora
(JTC OmniBlend, Guangdong, China) donde se procesó durante un minuto hasta lograr la
consistencia deseada. Por último, se dejó reposar el batido por unos minutos, y se retiró parte de
la espuma para asegurar la homogeneidad de todas las muestras.
3.3. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y TÉ VERDE PARA LA

PRESERVACIÓN DEL BATIDO
La irradiación gamma (IG) es una tecnología alternativa, que ha mostrado efectividad frente a
microorganismos de deterioro y patógenos, además de lograr mejoras en las características
sensoriales y prolongación de vida útil de los productos tratados (Bevilacqua y col., 2018). Por
otro lado, el té verde no sólo posee numerosos beneficios para la salud del consumidor, sino que
adicionalmente posee actividad antimicrobiana y antioxidante (Perumalla y col., 2011). Su
aplicación combinada en sistemas complejos como los batidos mixtos de frutas y verduras se
encontraba inexplorada hasta el momento. Este estudio se realizó con el objetivo de explorar los
efectos de la tecnología de la IG con o sin agregado de extracto de té verde (ETV), en la calidad
microbiológica nutricional y sensorial de los batidos sistema de estudio de esta Tesis.
3.3.1. Preparación de las muestras
Se utilizaron las materias primas especificadas en la sección 3.1, con ellas fue preparado el
batido de acuerdo a lo detallado en la sección 3.2. Una vez obtenido el batido, se prepararon las
muestras por duplicado según el esquema de la Tabla 3.1 colocando el mismo en frascos de
polietilentereftalato (PET) de 33mL. En el caso de las muestras tratadas con té verde el mismo se
46
preparó según se detalla en la sección 3.3.2. y se agregó previo al cierre de los frascos. Todos los
frascos se cerraron con tapas de goma minimizando el espacio de cabeza, y posteriormente se
almacenaron bajo refrigeración (5°C) hasta su llegada al Centro Atómico Ezeiza donde se
realizaron los tratamientos con irradiación según se detalla en la sección 3.3.3.
Tabla 3.1 – Tratamiento combinado de irradiación y extracto de té verde.

Té verde Irradiación
TRATAMIENTO
(%) (kGy)
Control 0 0
Control + Té(0,5%) 0,5 0
1,5 kGy 0 1,5
1,5 kGy + Té(0,5%) 0,5 1,5
3,0 kGy 0 3,0
3 kGy + Té(0,5%) 0,5 3,0
3.3.2. Tratamiento con extracto de té verde
Para la obtención del ETV (Sunphenon 90 LB, Taiyo, Japón) se preparó una solución stock de
Sunphenon 90 LB mezclando 8g de té verde comercial junto con 20mL de agua destilada estéril
en tubos Falcon, luego se agitó en vórtex hasta lograr una solución homogénea estándar (40%) de
color rojo intenso. Una vez listo el ETV, se agregaron 375 µL del mismo a las muestras en frascos
PET obteniéndose la concentración deseada de 0,5% en cada una de ellas, y en las muestras
control y en las que solo fueron irradiadas se agregó una alícuota similar de agua estéril. Éstas se
agitaron vigorosamente para asegurar la correcta disolución del té en la muestra y luego fueron
almacenadas bajo refrigeración (5°C) hasta su próximo tratamiento.
Respecto al extracto comercial de té utilizado, éste posee una concentración elevada de

catequinas (-) que incluyen: epicatequina (EC), (-)-galato de epicatequina (ECG), (-)-
epigalocatequina (EGC) y (-)-galato de epigalocatequina (EGCG) (Kajiya y col., 2004). A su vez,
es interesante mencionar que la concentración elegida para el tratamiento llevado a cabo en esta
sección fue en base al estudio de trabajos previos de otros autores (Theivendran y col., 2006; Cho
y col., 2007; Lavelli y col., 2010; Chiu y col., 2010; von Staszewski y col., 2011; Perumalla y
col., 2011; Siripatrawan y col., 2012; Fernandez y col., 2014; Ozvural y col., 2016; Fernandez y
col., 2018). En estos trabajos, se mencionan los posibles beneficios del ETV para mejorar la
seguridad y la calidad de los productos alimenticios, pero también teniendo en cuenta que los
datos de eventos adversos en humanos informan que el nivel de seguridad observado es de 704
mg EGCG/día para preparaciones de té en forma de bebida (Hu y col., 2018).
3.3.3. Tratamientos de irradiación
Una vez preparados todos los frascos con y sin el agregado de té, todas las muestras fueron
enviadas a la Planta semi-industrial de 60Co de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CAE-
CNEA), bajo refrigeración (5°C), donde se realizaron los tratamientos de irradiación. En este
ensayo se aplicaron dosis de 0, 1,5 y 3 kGy, las dosis elegidas fueron de acuerdo a algunos
estudios (Kim y col., 2007; Jo y col., 2012; Alighourchi y col., 2014; Morales de la Peña y col.,
2016; Finten y col., 2017), donde se demostraron actividades antimicrobianas, mejoras en el color
y características sensoriales de los productos irradiados con las dosis bajas generalmente usadas
47
en los alimentos (<5 kGy). Al día siguiente, todas las muestras fueron devueltas al laboratorio
bajo las mismas condiciones que fueron enviadas.
3.3.4. Almacenamiento y muestreo
Las muestras se almacenaron a 5ºC. Se evaluó el efecto inicial del tratamiento (a día 2) y el
efecto en el tiempo (a día 15) sobre los indicadores de calidad que se detallan en las siguientes
secciones.
3.3.5. Indicadores de calidad
a. Calidad microbiológica
Se analizó la calidad microbiológica de las muestras mediante el recuento de microorganismos

propios de la microflora natural (nativa) de las frutas y verduras tales como, bacterias aerobias
mesófilas (BAM), enterobacterias (EB) y mohos y levaduras (M&L).
Para cada muestra se colocaron 5g de batido, en bolsa estéril de muestreo microbiológico para
Stomacher, se añadieron 45mL de agua peptona (0,1%) y se procedió a realizar un homogenato
en Stomacher BagMixer 400 (Interscience, Francia) durante 60 segundos. Se tomó una alícuota
del homogenato y se realizaron diferentes diluciones seriadas (1/10) en agua peptona. Luego, se
sembraron las diluciones de cada muestra en los medios para recuentos microbianos y los
resultados se expresaron como la media de todas las repeticiones junto con la desviación estándar.
De esta forma, se determinó la viabilidad de las células por el método de recuento en placa por
siembra en gota y/o en superficie, informándose los recuentos obtenidos como el número
logarítmico de unidades formadoras de colonias por mililitro (log UFC/mL). El límite de
detección (LD) para la siembra en gota es 2,7 log UFC/mL, y para la siembra en superficie es 2,0
log UFC/mL.
i. Bacterias aerobias mesófilas

El recuento de bacterias aeróbicas mesófilas se realizó en placas conteniendo agar Plate Count
(PC, Biokar Diagnostics, Francia) incubadas a 37°C durante 24 horas.
ii. Enterobacterias
Se determinó el recuento de enterobacterias en agar Mac Conkey (Biokar Dignostics, Francia)
incubados a 37°C durante 24 horas.
iii. Mohos y Levaduras

Se utilizaron placas conteniendo extracto de levadura glucosa cloranfenicol agar (YGC, Biokar
Diagnostics, Francia). Las placas sembradas fueron incubadas a 28ºC durante 48-72 horas para
su posterior recuento.
48
b. Capacidad antioxidante
La capacidad antioxidante se determinó mediante dos ensayos complementarios. Por un lado,

se determinó la capacidad de captura de radicales libres a través de la técnica de DPPH, y por otro
lado la capacidad de reducción férrica a través de la técnica de FRAP, ambos fueron realizados
según Viacava y col. (2015) y Chen y col. (2018).
En primer lugar, se realizó una extracción de cada muestra siguiendo el protocolo sugerido por
Fernández y col. (2018) con algunas modificaciones. En tubos Falcon de 50mL se agregaron 5g
de batido, luego 20 mL de solución extractora (etanol en agua al 80 %) y se agitó en vortex por 1
minuto. Una vez trascurrido el tiempo de extracción, se realizó una centrifugación colocando los
tubos Falcon durante 10 minutos a 10000 rpm y 5ºC en una centrífuga 5804R (Eppendorf,
Alemania). Los sobrenadantes, fuentes de polifenoles y antioxidantes, fueron utilizados para
realizar las determinaciones descriptas a continuación.
1. DPPH
En su forma de radical libre, el DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) absorbe a 517 nm y

cuando sufre reducción por un antioxidante, esta absorción desaparece. En consecuencia, la
desaparición del DPPH• proporciona un índice para estimar la capacidad del compuesto de prueba
para atrapar radicales. Mediante la siguiente reacción se explica la actividad de un compuesto
antioxidante:
DPPH • +(AH)n → DPPH − H + (A)n
donde (AH) es un antioxidante que actúa donando átomos de hidrógeno, dando como
resultados radicales con estructuras moleculares estables que detendrán la reacción en cadena, tal
es el caso de los fenoles. El nuevo radical formado (A) puede interactuar con otro radical para
formar moléculas estables.
En primer lugar, se debe preparar una solución madre 1000 µM (400 mg/L) de DPPH con
etanol 96º. La misma se debe mantener en agitación durante 2 a 3 horas para que se disuelva bien.
Esta solución se mantiene en refrigeración (5°C). A partir la solución madre, se prepara
diariamente la cantidad necesaria de DPPH (40mg/L) que será utilizada en los ensayos. Se debe
verificar que la absorbancia a 517 nm de la solución preparada sea de 0,99. Para cada muestra se
utilizan tres celdas en la microplaca: 2 para la muestra y su duplicado (muestra + DPPH) y 1 para
el blanco (muestra + solvente); y una sola celda para el cero (solvente + DPPH). En las celdas de
la muestra se colocan 15 µL de la muestra junto con 285 µL del DPPH. En las celdas del blanco
se colocan 15 µL de la muestra junto con 285 µL de la solución extractora. En las celdas del cero
se colocan 15 µL de solución extractora junto con 285 µL del DPPH. Se agita la placa suavemente
y se lleva a incubar 1 hora a 20ºC (o temperatura ambiente). Finalmente, se procede a medir la
absorbancia a 517 nm. Para expresar los resultados de la capacidad antioxidante de cada muestra,
se utilizó una curva estándar preparada a partir de una solución de Trolox 1500 μM, y las
correspondientes actividades se expresaron como μM Trolox/100g de batido.
2. FRAP
Por este método se evaluó la capacidad antioxidante de las muestras de acuerdo con su
capacidad para reducir el hierro férrico (Fe+3) presente en un complejo con la 2,4,6-tri(2-piridil)-
49
s-triazina (TPTZ) (Sigma- Aldrich, St. Luis, Estados Unidos) hasta la forma ferrosa (Fe+2). Este
ensayo se llevó a cabo en un buffer acetato 0,3 M (pH 3,6), junto con TPTZ 10 mmol/L (en HCl
40mmol/L) y cloruro férrico 20 mmol/L (en agua destilada). La relación de volúmenes en la
solución FRAP debe ser de 10:1:1 de Buffer:TPTZ:FeCl3. Luego se dejó atemperar la solución
FRAP antes de empezar a trabajar. Para cada muestra se utilizaron dos pocillos en la microplaca
para hacer la determinación por duplicado (muestra + FRAP); y una celda para el cero (solvente
+ FRAP). De esta forma, se coloca en las celdas: 50 µL de la muestra, seguido de 250 µL de
solución FRAP y 50 µL de solvente junto con 250 µL de solución FRAP, para las celdas de
muestra y cero, respectivamente. Luego de 10 min de reacción a 37ºC, se midió la absorbancia a
una longitud de onda de 595 nm. Para expresar los resultados de la capacidad antioxidante de
cada muestra, se utilizó una curva estándar preparada a partir de una solución de Trolox 1500 μM,
y las correspondientes actividades se expresaron como μM Trolox/100g de batido.
c. Actividad enzimática
Se realizó una extracción de cada muestra siguiendo el protocolo sugerido por Fernández y
col. (2018) para obtener las correspondientes mediciones de las enzimas polifenoloxidasa (PPO)
y peroxidasa (POD). Se mezclaron en partes iguales, el batido y la solución buffer de fosfatos
0,2M (pH 6,5) con 4% de PVPP. Se extrajo 1 hora a 4°C (con agitación magnética) y luego la
mezcla fue centrifugada a 11000 rpm por 15 minutos a 4°C. Por último, se separó el sobrenadante
obtenido para realizar los análisis de actividad enzimática.
Las determinaciones realizadas con espectrofotómetro de microplacas fueron:
1. PPO
En primer lugar, se procura tener los reactivos atemperados (25°C) por lo cual se los colocó
en estufa media hora antes de comenzar con el ensayo. Una vez listos, se procedió a realizar la
mezcla para la reacción, se colocaron 80 μL de extracto enzimático y 200 μL de pirocatecol 0,07M
(disuelto en buffer fosfato 0,2 M a pH 6,5) en las celdas de una microplaca, seguido de una breve
agitación y de inmediato se realizó la lectura en espectrofotómetro a 480 nm; cada muestra por
duplicado y una celda cero con buffer fosfato 0,2M. La lectura de absorbancias fue realizada cada
20 segundos durante un lapso de 140 segundos. Una unidad de actividad enzimática fue definida
como el cambio de 0,001 de absorbancia a la longitud de onda correspondiente. De forma que los
resultados de actividad de PPO fueron calculados en base a la pendiente de la porción lineal de la
curva de reacción a 480nm, en unidades de 1/min.
2. POD
De igual forma que la PPO, se procura tener los reactivos atemperados (25°C). Luego, la
mezcla para la reacción fue hecha directamente en las celdas de una microplaca, donde se agregó
20 μL de extracto enzimático, 200 μL de guaiacol (1% v/v, disuelto en buffer fosfatos 0,2M a pH
6,5) y 20 μL de H2O2 (1,5% v/v, disuelto en agua destilada recién hecha). Seguido de una breve
agitación, y de inmediato se realizó la lectura en espectrofotómetro a 470 nm; cada muestra por
duplicado y una celda cero con buffer fosfato 0,2M. La lectura de absorbancias fue realizada cada
20 segundos durante un lapso de 140 segundos. Una unidad de actividad enzimática fue definida
como el cambio de 0,001 de absorbancia a la longitud de onda correspondiente. De forma que los
50
resultados de actividad de PPO fueron calculados en base a la pendiente de la porción lineal de la

curva de reacción a 470nm, en unidades de 1/min.
d. Calidad sensorial
El análisis sensorial fue realizado por un panel compuesto por 8 miembros con experiencia en
el análisis sensorial de productos a base de frutas y verduras, entre 24 y 62 años. Las muestras
codificadas se presentaron aleatoriamente a los jueces, las mismas fueron presentadas en frascos
PET de 33mL, los cuales evaluaron los parámetros sensoriales (color, textura, sabor, nivel de
agrado general y aroma) utilizando una escala hedónica del 1 al 9 (ASTM, 1996), donde 9: ”Me
gusta muchísimo”; 5: límite de aceptación “Ni me gusta ni me disgusta”; 1: “Me disgusta
muchísimo” (Figura 3.2).
Edad:___________ Género: F M
Prueba de aceptabilidad en batido de frutas y hortalizas

Pruebe las muestras e indique su opinión mediante una cruz en las siguientes escalas
MUESTRA N°:________
COLOR:
Me Me gusta
Ni me gusta ni
disgusta muchísimo
me disgusta
muchísimo
TEXTURA:
Me Me gusta
Ni me gusta ni
disgusta muchísimo
me disgusta
muchísimo
SABOR:
Me Me gusta
Ni me gusta ni
disgusta muchísimo
me disgusta
muchísimo
NIVEL DE AGRADO EN GENERAL:
Me Me gusta
Ni me gusta ni
disgusta muchísimo
me disgusta
muchísimo
AROMA:
Me Me gusta
Ni me gusta ni
disgusta muchísimo
me disgusta
muchísimo
Figura 3.2 - Planilla de análisis sensorial con escala hedónica del 1 al 9 (ASTM, 1996).
51
3.3.6. Análisis estadísticos
Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. Los resultados se expresaron como la
media de todas las repeticiones junto con la desviación estándar. Los resultados se analizaron
utilizando el software estadístico Origin®8 (OriginLab®, USA). Se realizaron análisis de
varianza (ANOVA) teniendo en cuenta los factores TRATAMIENTO y TIEMPO. Las diferencias
significativas se determinaron mediante test de Tukey (p<0,05).
3.4. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y NISINA PARA LA

3.4.1. Radioresistencia de Listeria innocua y Listeria monocytogenes
Se ha demostrado que la irradiación gamma (IG) tiene distinto efecto sobre distintos tipos de
microorganismos (MO) y que, entre estos, los Gram positivos suelen ser más resistentes, por lo
que entre los patógenos de mayor interés relacionados con el consumo de jugos/batidos de frutas
y verduras L. monocytogenes sería un MO de diseño adecuado. Por otro lado, también se sabe que
L. innocua presenta comportamiento similar, de forma que, en el LITA, se suele utilizar L.
innocua como subrogante de la cepa patogénica para distintos tratamientos. Dion y col. (1994)
quienes estudiaron modelos de radioresistencia de diferentes microorganismos, informaron la
mayor resistencia de la Listeria innocua (ATCC 33090) en comparación a L. monocytogenes
frente a la aplicación de la misma dosis de irradiación (Cabeza y col., 2007; Cabeza y col, 2009).
Lo cual significó la posibilidad de trabajar normalmente con L. innocua en lugar de L.
monocytogenes para evitar el riesgo derivado que implica el uso rutinario de esta última en
experimentos. Sin embargo, es sabido que el efecto de la irradiación puede ser distinto para
distintas cepas, o que la eficiencia varía en función del estado fisiológico de la cepa utilizada, la
matriz de desarrollo, la temperatura, la composición del medio en el momento del tratamiento,
entre otras variables (Dion y col., 1994). Por ello, se ensayó la radioresistencia de ambas (L.
monocytogenes y L. innocua) en este batido, objeto de estudio de esta Tesis, con la expectativa
de probar que ante este tratamiento es válido el uso de L. innocua como subrogante y continuar
los ensayos posteriores con este MO en los laboratorios del LITA sin ningún tipo de riesgo.
a. Preparación de los inóculos
i. Listeria innocua
El cultivo fresco se obtuvo mediante la inoculación de Listeria innocua CIP 80.11 en caldo de
triptona de soja estéril fresco enriquecido con 0,6% de extracto de levadura (TSYE, Biokar
Diagnostics, Allonne, Francia) e incubado en un agitador continuo con temperatura controlada a
28ºC durante 16-18 horas. Luego, una alícuota de este pre-cultivo fue inoculado en un caldo
TSYE fresco y agitado hasta obtener la concentración final deseada de células (aproximadamente
8 log UFC/mL), determinado por densidad óptica cuando se logra una absorbancia de 0,05 a 540
nm. El mismo fue preparado en el LITA y trasladado a CNEA bajo refrigeración el día del ensayo.
52
ii. Listeria monocytogenes

El cultivo de L. monocytogenes (colección de cultivos microbianos argentinos Nº29 código
CCMA-29-Lm-1271) se preparó de manera similar al anterior, con la diferencia de que el mismo
fue preparado en el laboratorio de Bioseguridad microbiológica Tipo 3 de las instalaciones de
CNEA ya que su manejo es riesgoso si no se tienen todas las precauciones necesarias.
b. Preparación de las muestras
Las muestras fueron preparadas en el LITA por triplicado y trasladadas al CNEA bajo
refrigeración de acuerdo a la sección 3.3.1. Una vez allí, se realizaron las inoculaciones
correspondientes simulando una contaminación de 108 UFC/g aproximadamente con L. innocua
o L. monocytogenes.
c. Tratamientos de irradiación
Una vez inoculadas las muestras, se procedió al tratamiento de irradiación, las dosis promedio
aplicadas a los batidos fueron 0, 0,32, 0,62, 0,82 y 1,16 kGy. Luego, se almacenaron todas en
refrigeración (5ºC) hasta el momento de su análisis.
d. Recuentos de Listeria y determinación de radioresistencia
Se realizaron los homogenatos para los correspondientes análisis microbiológicos según las
especificaciones de la sección 3.3.5.a. La siembra fue realizada en gota y cada muestra se sembró
por duplicado. El recuento de Listeria se realizó en placas conteniendo agar para recuento en
placa “Oxford” (Biokar Diagnostics, France) incubado a 37°C durante 48 horas.
Para el estudio de radioresistencia de Listeria se determinó la cinética de inactivación de este

microorganismo mediante un ajuste de primer orden. De esta forma, se buscó hallar el valor
característico de D10 en las condiciones de este ensayo; la cual representa la dosis de irradiación
requerida para reducir un 90% de la población de bacterias, es decir un ciclo logarítmico. En este
sentido, se considerará más radioresistente aquella cepa que presente un D10 mayor.
3.4.2. Efecto de la combinación de irradiación y nisina sobre la calidad

microbiológica del batido
Con el objetivo de completar el estudio de la acción de la irradiación sobre la microflora nativa

y/o contaminante de este tipo de producto y en base a resultados previos propios del grupo del
laboratorio y trabajos externos (Ross y col., 2003; Mishra y col., 2011; Delves y col., 2011;
Fernandez y col., 2014; Pina Perez y col., 2015; Jagus y col., 2016; Fernandez y col., 2018) donde
se han ensayado diferentes combinaciones de tecnologías no térmicas como la irradiación junto
con el agregado de antimicrobianos, en este ensayo se evaluó la combinación de irradiación y
53
nisina sobre las bacterias aerobias mesófilas y frente a Listeria en el batido mixto de frutas y
verduras.
a. Preparación del inóculo
Se utilizó un inóculo de L. innocua (CIP 80.11) preparado de acuerdo a lo detallado en la

sección 3.4.1.a.i.
Las muestras fueron preparadas en el LITA por triplicado de acuerdo a la sección 3.3.1. En
este caso, previo al cierre de los frascos, los batidos se inocularon simulando una contaminación
de aproximadamente 6-7 log UFC/mL con L. innocua. Luego se aplicaron los tratamientos
(agregado de nisina según sección 3.4.2.c e irradiación según 3.4.2.d) que se presentan en la Tabla
3.2.
Tabla 3.2 – Tratamiento combinado de irradiación y nisina.

Nisina Irradiación
TRATAMIENTO
(UI/mL) (kGy)
Control 0 0
Ni100 100 0
Ni300 300 0
1 kGy 0 1
2 kGy 0 2
1 kGy + Ni100 100 1
1 kGy + Ni300 300 1
2 kGy + Ni100 100 2
2 kGy + Ni300 300 2
c. Tratamientos con nisina
Para la preparación de la solución stock de nisina, se pesaron en balanza analítica 250 mg de

nisina comercial y se la disolvió en 5 mL de ácido clorhídrico 0,02 N con vigorosa agitación en
vortex, obteniéndose una concentración de 50000 UI/mL (5104 UI) de la misma. Una vez lista la
solución stock, se agregaron 60 µL y 180 µL a las correspondientes muestras para obtener
concentraciones de 100 y 300 UI/mL, respectivamente. Éstas se agitaron vigorosamente para
asegurar la correcta disolución de la nisina en la muestra y luego fueron almacenadas bajo
refrigeración (5°C) hasta su próximo tratamiento. En el caso de las muestras sin nisina se agregó
una alícuota similar de agua estéril.
54
d. Tratamientos de irradiación
Una vez obtenidas las muestras con y sin agregado de nisina, las mismas se almacenaron bajo
refrigeración (5°C) y se trasladaron a esa temperatura hasta el Centro Atómico Ezeiza donde se
realizaron los tratamientos con irradiación como en la sección 3.3.3. Se informó desde el
organismo irradiador que los tratamientos fueron realizados al día siguiente, las dosis de
irradiación gamma aplicadas fueron de 1 y 2 kGy y las muestras fueron devueltas al LITA al día
siguiente bajo las mismas condiciones que fueron enviadas.
e. Almacenamiento y muestreo
A continuación, una vez tratadas las muestras, se almacenaron a 5ºC y se evaluó el efecto
inicial del tratamiento (a día 2) y el efecto en el tiempo (a día 21) sobre la calidad microbiológica.
f. Recuentos microbiológicos
Se realizaron los análisis microbiológicos según las especificaciones de la sección 3.3.5.a. En

este caso, la siembra fue realizada en gota.
i. L. innocua
El recuento de Listeria innocua fue realizado según especificaciones de la sección 3.4.1.d.
ii. Microbiota nativa

El recuento de BAM fue realizado según especificaciones de la sección 3.3.5.a.i.
g. Análisis estadísticos
Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como la
3.5. TRATAMIENTOS DE ULTRASONIDO PARA LA

Es sabido que las verduras y frutas son fuentes importantes de vitaminas, compuestos
fenólicos, fibra dietética y flavonoles. La tecnología de ultrasonido (US) puede causar notables
mejoras en cuanto a los indicadores de calidad nutricional obteniendo mejoras o efectos mínimos
sobre sus características sensoriales, al tiempo que garantiza altos estándares de condiciones de
seguridad mediante reducciones significativas tanto de la microflora nativa como la contaminante
55
(Zhang y col., 2018). Sin embargo, no ha habido muchos trabajos en relación a su efecto sobre
matrices más complejas como son los batidos, donde se ven implicadas varias frutas y verduras.
Por lo tanto, se propuso explorar el efecto de esta tecnología para el tratamiento del batido, sistema
de estudio de esta Tesis.
3.5.1. Efecto de tratamientos de ultrasonido sobre la calidad del batido
a. Preparación de muestras
Se utilizaron las materias primas especificadas en la sección 3.1., con ellas fue preparado el
batido de acuerdo a la sección 3.2. Una vez obtenido el batido, fue colocado en vasos de
precipitados, allí se cargaron muestras de 200g cada una para ser tratadas con el equipo de
Ultrasonido (Vibra-cell sonics, modelo VCX-750) según la sección 3.5.1.b. Adicionalmente,
previo al tratamiento, se separó una muestra control de batido recién hecho que fue almacenada
en frascos PET de 33mL bajo refrigeración a 5°C.
b. Tratamientos de US
Se trataron muestras de batido con la sonda de ultrasonido, como se muestra en la Tabla 3.3,
durante 15 minutos, a distintas amplitudes (100%, 50%, 30%), con o sin el uso de baño de hielo
para controlar la temperatura y asegurar que ésta se mantenga por debajo de los 25°C.
Inmediatamente después del tratamiento las muestras tratadas se trasvasaron a los frascos PET de
33mL, cerrados con tapas de goma; las cuales fueron enfriadas hasta 5°C utilizando un baño de
hielo en caso de ser necesario y posteriormente almacenadas bajo refrigeración (5°C) hasta su
análisis.
Tabla 3.3 – Tratamiento con US a distintas amplitudes (%).

US
TRATAMIENTO*
(%)
Control 0
100% 100
50% 50
30% 30
100%+H 100
50%+H 50
30%+H 30
*+H hace referencia al uso de baño de hielo para control de la temperatura.
Algunas cuestiones que se tuvieron en cuenta fueron las de mantener la sonda siempre a la
misma altura dentro del vaso con la muestra, colocar la punta de medición del termómetro en el
batido sin que toque las paredes de los vasos, ni la sonda ultrasónica y mantener el atemperado
con hielo de manera uniforme. De esta forma, se asegura el empleo correcto del ultrasonido y la
obtención de resultados reproducibles.
56
c. Perfil térmico
Durante cada tratamiento con US (100% (137W), 50% (52W), 30% (26W), 100%+H (151W),
50%+H (55W), 30%+H (27W)), periódicamente se tomaron mediciones de la temperatura (T)
observada. De esta manera, durante los 15 minutos que duraron los tratamientos en total se
tomaron mediciones cada 30 segundos hasta un lapso de 2 minutos, luego cada 1 minuto hasta
llegar a los 5 minutos y por último se midió a los 7, 9, 10, 12 y 15 minutos, finalizando en este
último tiempo.
d. Indicadores de calidad
Inmediatamente después del tratamiento y, en aquellos parámetros que se consideraron

relevantes, luego de 15 días de tratamiento se evaluaron los indicadores que se detallan a
continuación.
i. Indicadores fisicoquímicos (pH, SST)

1. pH
Las determinaciones de pH se realizaron a temperatura ambiente (25 ± 1°C) utilizando un pH-

metro HI99163 (Hanna, Rumania) con electrodo FC232D (Italia). El mismo fue calibrado
únicamente antes de comenzar con las mediciones, con las correspondientes soluciones buffer de
pH 7,01 y 4,01. Las medidas fueron tomadas directamente sobre las muestras, limpiando el
electrodo con agua destilada entre muestra y muestra.
2. SST
Para las mediciones de contenido de Sólidos Solubles Totales (SST) se utilizó un refractómetro
Milwaukee MA871 (Milwaukee Instrument, Rocky Mount, USA). Si bien el instrumento
utilizado es para medir ° Brix de fluidos (porcentaje de sacarosa en solución), las muestras tratadas
contienen otras sustancias además de sacarosa tales como sales, minerales y proteínas. Por lo cual,
el porcentaje de °Brix representa la concentración total de todos los sólidos solubles en la muestra.
Al igual que para las mediciones de pH, se calibró el equipo (en este caso con agua destilada)
previamente a la toma de medidas, limpiando correctamente con la misma entre muestra y
muestra.
ii. Actividad enzimática

Para la determinación de la actividad enzimática, se llevaron a cabo ensayos midiendo la
actividad de PPO, POD y PME (pectinmetilesterasa). Los ensayos correspondientes a PPO y POD
fueron realizados de acuerdo a la sección 3.3.5.c. En el caso de PME se empleó la metodología
de Vicente y col. (2005) que se presenta a continuación.
De acuerdo con esta metodología de medición de actividad enzimática, el ensayo debe

comenzarse siempre al mismo pH para que los cambios de color sean reproducibles. Para
conseguir esto, todas las soluciones a utilizar (pectina, bromotimol blue indicador de la variación
de pH y muestra) deben ajustarse a pH 7,5 con NaOH 0,01M y 1M antes de comenzar los ensayos.
Para comenzar se preparó el extracto enzimático, para ello se pesaron 5g de batido y se agregó a
57
un Erlenmeyer junto con 15 mL de NaCl 1M y 10 g/L de PVPP. La suspensión obtenida se

mantuvo en agitación durante 4 horas a 4°C y luego, se centrifugó a 10000 rpm por 30 minutos a
4°C. A continuación, el sobrenadante obtenido se ajustó a pH 7,5 con el alcalino nombrado
anteriormente. Finalmente, se colocaron 175µL de pectina (0,5%), 40 µL de bromotimol blue
(0,01%) y 85 µL de muestra (sobrenadante) en una microplaca; además una celda cero con agua
destilada, y de inmediato se realizó la lectura en espectrofotómetro a 620 nm. La lectura de
absorbancias fue realizada cada 20 segundos durante un lapso de 140 segundos. La pendiente de
la parte lineal de la curva (velocidad inicial de la reacción) se tomó como actividad enzimática
(Rudra Shalini y col., 2008). Los resultados se expresaron como el cambio en la densidad óptica
por minuto (∆Abs/min). También se obtuvieron datos de la actividad residual enzimática (AR),
que se define como la relación entre la actividad de la enzima después del tratamiento y la
actividad que tenía antes del mismo. Su cálculo se realiza utilizando la Ecuación 2.1, reportada
por Tiwari y col., (2009) en términos de porcentaje.
%AR= (At/A0)*100
Ecuación 2.1 – Cálculo de actividad enzimática residual en porcentaje (%).
At = Actividad enzimática del batido tratado.
A0= Actividad enzimática del control.
iii. Contenido de polifenoles totales y capacidad antioxidante

En primer lugar, se realizó la extracción correspondiente sugerida por Fernández y col. (2018)
como se especifica en la sección 3.3.5.b.
Para la cuantificación del contenido de polifenoles totales (CPT) se utilizó la técnica de Folin-
Ciocalteu (Fan y col., 2012). A cada celda se agregaron 20µL de muestra y 100µL del reactivo
de Folin-Ciocalteu (diluido 1/10 con agua destilada). Se dejó reposar durante 5 minutos y a
continuación se agregaron 80µL de carbonato de sodio (Na2CO3). Además, se realizó un cero para
determinar la absorbancia inicial del sistema sin muestra. Para ello se utilizaron las mismas
proporciones de reactivo de Folin-Ciocalteu, carbonato de sodio y se remplazó la muestra por el
solvente de extracción (etanol al 80%). Finalmente, se dejó en la oscuridad por 1 hora a 20ºC (o
temperatura ambiente), luego se midió la absorbancia a 765 nm. Como resultado se determinó la
concentración de polifenoles totales utilizando una curva estándar con ácido gálico (AG) y se
expresó como mg AG/100 g de batido. Las muestras con mayor contenido de CPT desarrollan un
color azulado más intenso y, por ende, mayor absorbancia. Los volúmenes de muestra y agua se
ajustaron en cada caso de manera de obtener lecturas de absorbancia a 765 nm menores a
1,00±0,05, considerando luego estas proporciones en el cálculo de resultados.
Para la determinación de la capacidad antioxidante, las determinaciones de DPPH y FRAP se

llevaron a cabo de acuerdo a las especificaciones de la sección 3.3.5.b.
iv. Contenido de betalaínas

Se realizó una cuantificación espectrofotométrica del contenido de pigmentos betalámicos
según el método de Mobhammer y col. (2006). En tubos Falcon se mezclaron 2,5 g de batido
junto con 10 mL de buffer McIlvaine (pH 6,3). A continuación, se agitó en vortex y centrifugó
por 10 minutos a 10000 rpm y 5ºC. De esta forma, se obtuvo el sobrenadante de cada muestra, de
58
los cuales se extrajo 300 µL de muestra que fueron colocadas en las celdas de una microplaca y
se procedió a la lectura de medición a la absorbancia 600, 536 y 476 nm, con el debido cuidado
de que las lecturas tomadas no sobrepasen un valor de 1,00±0,05 (motivo por el cual se prepara
la dilución del batido 2,5 en 10 mL de buffer).
El contenido de las betacianinas totales (Bc) se calculará como Betanina equivalente y el

contenido de betaxantinas (Bx) como Vulgaraxantina I equivalente.
Contenido de betacianinas:
𝑚𝑔 A ∗ F ∗ Mw
𝐵𝑐 ( )= ∗ 1000
𝐿𝑏𝑎𝑡𝑖𝑑𝑜 e∗l
Donde A corresponde al valor de absorbancia de la betanina a 536 nm, corregida con la lectura
a 600 nm (línea de base), F es el factor de dilución, Mw es el peso molecular de la betanina (550
g/mol), e es el coeficiente de extinción molar de la betanina (60000 L/mol.cm) y l es el paso óptico
de la cubeta (1.0 cm).
Contenido de betaxantinas:
𝑚𝑔 A ∗ F ∗ Mw
𝐵𝑥 ( )= ∗ 1000
𝐿𝑏𝑎𝑡𝑖𝑑𝑜 e∗l
Donde A corresponde al valor de absorbancia de la Vulgaraxantina I a 476 nm, corregida con

la lectura a 600 nm (línea de base), F es el factor de dilución, Mw es el peso molecular de la
Vulgaraxantina I (339 g/mol), e es el coeficiente de extinción molar de la betanina (48000
L/mol.cm) y l es el paso óptico de la cubeta (1,0 cm).
v. Calidad microbiológica
El recuento de BAM, EB y M&L se realizó de acuerdo a las especificaciones de la sección
3.3.5.a.
3.5.2. Optimización de tratamientos de US
a. Preparación de muestras
batido de acuerdo a la sección 3.2. Una vez obtenido el batido fue colocado en vasos de
precipitados, allí se cargaron muestras de 200g para luego ser tratadas con el equipo de
Ultrasonido (Vibra-cell sonics, modelo VCX-750) según la sección 3.5.2.b. Adicionalmente,
previo al tratamiento, se separó una muestra control de batido recién hecho, por duplicado, que
fue almacenada en frascos PET de 33mL bajo refrigeración a 5°C.
59
b. Tratamientos de US
Se propusieron nuevos ensayos con el objetivo de optimizar el tratamiento, considerando las

pruebas realizadas en la sección 3.5.1. En base a los resultados previos encontrados allí, se
procedió a llevar a cabo un diseño factorial. De esta forma, los ensayos consistieron en tratar las
muestras con la sonda de ultrasonido a dos amplitudes diferentes (30% y 70%) con el agregado
de hielo por fuera de los vasos para evitar sobrepasar la temperatura ambiente, de manera de
asegurar que no haya efectos térmicos involucrados (25°C), y variando para cada amplitud el
tiempo de tratamiento. Así, los tratamientos resultantes fueron 30%-2 min; 30%-4 min; 30%-8
min y 70%-2 min; 70%-4 min; 70%-8 min. Inmediatamente después del tratamiento, las muestras
fueron trasvasadas a frascos PET de 33mL, cerrados con tapas de goma, enfriadas hasta 5°C
utilizando un baño de hielo en caso de ser necesario y posteriormente almacenadas bajo
refrigeración (5°C) hasta su utilización.
Con respecto al modo de utilización del US, se tuvieron las mismas consideraciones
especificadas en la sección 3.5.1.b.
c. Indicadores de calidad
Inmediatamente después de los tratamientos se analizaron los indicadores que se detallan a

continuación.
i. Indicadores fisicoquímicos (pH, SST)

Las determinaciones de pH y SST fueron realizadas de acuerdo a la sección 3.5.1.d.i.

Para la determinación de la actividad enzimática, se llevaron a cabo ensayos midiendo la
actividad de PPO y POD. Los ensayos fueron realizados de acuerdo a la sección 3.3.5.c.
iii. Contenido de betalaínas

El contenido de betalaínas fue determinado según la sección 3.5.1.d.iv.
iv. Calidad microbiológica

3.3.5.a.
d. Análisis estadísticos
varianza (ANOVA) teniendo en cuenta el factor TRATAMIENTO. Las diferencias significativas
se determinaron mediante test de Tukey (p<0,05).
60
3.6. COMBINACIÓN DE ULTRASONIDO Y ANTIMICROBIANOS

NATURALES PARA LA PRESERVACIÓN DEL BATIDO
Este estudio se realizó con el objetivo de explorar los efectos de la tecnología de US con o sin
agregado de AN como el extracto de té verde (ETV), nisina (Ni) y natamicina (Na) sobre la
calidad microbiológica, nutricional y sensorial de los batidos, sistema de estudio de esta Tesis.
3.6.1. Preparación de muestras
batido de acuerdo a la sección 3.2. Una vez obtenido el batido, fue colocado en vasos de
precipitados, allí se cargaron muestras de 200g cada una para ser tratadas con el equipo de
Ultrasonido (Vibra-cell sonics, modelo VCX-750) según la sección 3.6.2. Adicionalmente, previo
al tratamiento, se separó una muestra control de batido recién hecho, por duplicado, que fue
almacenada en frascos PET de 33mL bajo refrigeración a 5°C.
3.6.2. Tratamientos de US y agregado de AN
Teniendo en cuenta los resultados hallados luego del análisis de los tratamientos especificados
en la sección 3.5.2., se seleccionó el tratamiento óptimo, resultando de interés probar su
combinación con antimicrobianos naturales que podrían alargar y/o mejorar la vida útil.
De esta forma, el ensayo llevado a cabo consistió en tratar las muestras con la amplitud y
tiempo de tratamiento seleccionados en el ensayo anterior y el agregado de hielo por fuera de los
vasos para evitar sobrepasar la temperatura ambiente, de manera de asegurar que no haya efectos
térmicos involucrados (25°C). Inmediatamente después del tratamiento, las muestras fueron
trasvasadas a frascos PET de 33mL, cerrados con tapas de goma y enfriadas hasta 5°C hasta su
posterior procesamiento (o tratamiento). Con respecto al modo de utilización del US, se tuvieron
las mismas consideraciones especificadas en la sección 3.5.1.b.
A continuación, se procedió con la preparación de los AN que fueron agregados a las muestras
luego del tratamiento con US. La preparación de la solución stock de nisina fue realizada como
se especificó anteriormente en la sección 3.4.2.c., pero en este caso se agregaron 150 µL a las
muestras para obtener una concentración de 250 UI/mL en cada una. El extracto de té verde fue
preparado según las indicaciones de la sección 3.3.2., y se adicionó 150 µL de éste a las
correspondientes muestras para obtener una concentración de 0,2% en cada una de ellas. Por
último, para la preparación de la solución stock de natamicina (concentración estándar de 24
mg/mL), se pesaron en balanza analítica 240 mg de natamicina comercial y se la disolvió en 5
mL de agua destilada estéril con vigorosa agitación en vortex. De esta solución stock, se agregaron
los 125 µL necesarios en las muestras correspondientes, para obtener una concentración de 100
ppm de natamicina en cada una. En el caso de las muestras sin los AN (nisina, extracto de té verde
y natamicina) se agregó una alícuota similar de agua estéril. Éstas se agitaron vigorosamente para
asegurar la correcta disolución de los AN en la muestra y luego fueron almacenadas bajo
refrigeración (5°C) hasta su próximo análisis.
De esta forma, se obtuvieron los 5 tratamientos, por duplicado, mostrados en la Tabla 3.4.
61
Tabla 3.4 – Tratamiento combinado de US y AN.

Té Tiempo
Nisina Natamicina US
TRATAMIENTO verde de US
(UI/mL) (UI/mL) (%)
(%) (min)
Control 0 0 0 0 0
US 0 0 0 70 4
US+Ni250 250 0 0 70 4
US+Té(0,2%) 0 0,2 0 70 4
US+Na100 0 0 100 70 4
3.6.3. Almacenamiento y muestreo
Una vez tratadas las muestras, se almacenaron a 5ºC y periódicamente (día 0, 7, 14, 21 y 28)
se tomaron muestras para evaluar el efecto sobre los indicadores de calidad que se detallan en las
siguientes secciones.
a. Indicadores fisicoquímicos (pH, SST, Apariencia visual)
Las determinaciones de pH y SST fueron realizadas de acuerdo a la sección 3.5.1.d.i.
Apariencia visual y Registro de imágenes: Se realizó una inspección visual de los tratamientos
para detectar diferencias visibles de color, textura, separación de fases y a su vez, se registraron
las imágenes tomando fotos con el cuidado de mantener las mismas condiciones de luz y color de
fondo para obtener un registro comparable.
b. Contenido de polifenoles totales y capacidad antioxidante
Las determinaciones de CPT, DPPH y FRAP se hicieron de acuerdo a la sección 3.5.1.d.iii.
c. Contenido de betalaínas
El contenido de betalaínas fue determinado según la sección 3.5.1.d.iv.
d. Calidad microbiológica

3.3.5.a.
62
3.6.5. Efecto de la combinación de US y AN frente a L. innocua y E. coli
a. Preparación de los inóculos
Se preparó un cultivo mixto con tres cepas de microorganismos inoculados en sus

correspondientes caldos, de acuerdo a como se detalla en la sección 3.4.1.a.i. y 3.6.5.a.ii. Para
ello, se mezcló 10 mL de cada pre-cultivo (1.108 UFC/mL) obteniéndose 20 mL finales con
concentración de 5.107 UFC/mL de cada uno.
i. L. innocua
La preparación del inóculo de L. innocua se llevó a cabo como se especificó en la sección
3.4.1.a.i.
ii. E coli
Para la preparación del inóculo se utilizó una cepa subrogante de E. coli O157:H7, Escherichia
coli ATCC 8739 (EC), como microorganismo no patógeno indicador, dado que tiene
comportamiento y resistencia similar ante diversos tratamientos (Jørgensen y col., 2010). Se
sembró una muestra de la cepa EC en caldo TSYE y se incubó durante 16 a 18 h a 28°C. Luego,
se transfirió una alícuota del pre-cultivo a un nuevo caldo TSYE fresco y estéril y se lo incubó a
28°C durante 16 h, hasta llegar a los 8 log UFC/mL, determinado por densidad óptica cuando se
logró una absorbancia de 0,14 a 630 nm.
Las muestras fueron preparadas como se especificó en la sección 3.6.1. En este caso, se realizó
la inoculación del cultivo mixto de Listeria innocua junto con E. coli, obtenidos de acuerdo a la
sección 3.6.5.a., simulando una contaminación de 1.106 UFC/mL aproximadamente en cada uno
de los vasos de precipitados próximos a tratar con US. Adicionalmente, previo al tratamiento, se
separó una muestra control de batido inoculado, por duplicado, que fue almacenada en frascos
PET de 33mL bajo refrigeración a 5°C.
c. Tratamientos de US y agregado de AN
El tratamiento fue llevado a cabo del mismo modo que en la sección 3.6.2.
d. Almacenamiento y muestreo
A continuación, una vez tratadas las muestras, fueron almacenadas a 5ºC y luego se evaluó el
efecto del tratamiento (a día 0) sobre la calidad microbiológica de manera de evaluar las
reducciones iniciales obtenidas, ya que por la acidez del batido y en base a la experiencia previa
con esta matriz se sabe que, los recuentos de Listeria y E. coli no aumentan con el tiempo
(Fernandez y col., 2020) con lo cual esta reducción inicial es determinante en la evaluación de la
efectividad del tratamiento en el control de estos MO.
63
e. Recuentos microbiológicos
Se realizaron los homogenatos para los correspondientes análisis microbiológicos según las
especificaciones de la sección 3.3.5.a. La siembra fue realizada en gota.
i. L. innocua
El recuento de L. innocua fue realizada como se especificó en la sección 3.4.1.d.
ii. E. coli
Se determinó el recuento de enterobacterias en agar Mac Conkey (Biokar Dignostics, Francia)
adicionado con el suplemento 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido "MUG" (Biokar
Dignostics, Francia) incubado a 37°C durante 24 hs. Para la determinación de las colonias de E.
coli el recuento se realizó bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm), considerándose positivas
aquellas colonias fluorescentes.
3.6.6. Análisis estadísticos
64
Resultados
4. RESULTADOS
4.1. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y TÉ VERDE PARA LA

Con el objetivo de evaluar el efecto del tratamiento de irradiación gamma (IG) y su interacción
con el extracto de té verde (ETV) sobre los distintos atributos de calidad del batido de frutas y
verduras (F&V), se analizaron algunos indicadores de interés obteniéndose los resultados que se
detallan a continuación.
a. Calidad microbiológica
Con respecto a la calidad microbiológica, es importante destacar que las frutas y verduras
naturalmente poseen una microflora nativa y esa carga inicial solo se reduce marginalmente con
los procesos de lavado y desinfección (Grumezescu y Holban, 2019). A su vez, debido a que el
procesamiento (pelado, cortado y licuado) de las frutas y verduras constituye una operación que
aumenta el riesgo de contaminación si no se cuidan las condiciones higiénicas, en esta Tesis se
tomaron las debidas precauciones durante el saneamiento y procesamiento de las mismas
(Alvarez, 2008). En la Tabla 4.1 se muestran los recuentos de bacterias aerobias mesófilas
(BAM), enterobacterias (EB) y mohos y levaduras (M&L) obtenidos:
Tabla 4.1 - Recuento de BAM, EB y M&L en muestras control y muestras tratadas con
IG, ETV y combinación de ambos, durante el almacenamiento bajo refrigeración (5°C), a
día 2 y día 15.
Bacterias
Mohos y
TRATAMIENTO DÍA aerobias Enterobacterias*
levaduras*
mesófilas*
2 3,8±0,3a,A 3,9±0,6a,A 3,1±0,1a,A
Control
15 4,9±0,2a,B 3,6±0,4a,A 3,9±0,4a,A
2 3,9±0,3a,A 3,5±0,3a,A < 2,0b,A
Control + Té(0,5%)
15 4,8±0,1a,B 4,2±0,2a,A 3,3±0,4a,B
2 < 2,0b,A < 2,0b,A < 2,0b,A
1,5 kGy
15 3,3±0.1a,b,B < 2,0b,A < 2,0b,A
2 < 2.0b,A < 2,0b,A < 2,0b,A
1,5 kGy + Té(0,5%)
15 2,4±0.1b,B < 2,0b,A < 2,0b,A
2 < 2.0b,A < 2,0b,A < 2,0b,A
3,0 kGy
15 2,5±0.8b,B < 2,0b,A < 2,0b,A
2 < 2,0b,A < 2,0b,A < 2,0b,A
3,0 kGy + Té(0,5%)
15 2,3±0,4b,B < 2,0b,A < 2,0b,A
*Letras minúsculas diferentes indican diferencias entre tratamientos, letras mayúsculas diferentes
indican diferencias entre día 2 y día 15. Datos expresados como medias ± desviación estándar.
65
Resultados
Como se puede observar en los resultados, las muestras control presentaron recuentos bajos,
del orden observado en elaboraciones previas (Fernandez y col., 2018), en todos los grupos
microbianos analizados. Inicialmente, a día 2, no se observaron diferencias significativas entre
las muestras sin irradiar con y sin té (Control+Té y Control) (p>0,05), excepto para el recuento
de M&L (p<0,05), lo que indicaría la poca efectividad del extracto de té verde (ETV) para
controlar la microflora del batido por sí solo. La diferente susceptibilidad de las diversas cepas
bacterianas frente al ETV puede estar relacionada con diferencias en las membranas celulares
(Ikigai y col., 1993). En cuanto a los principales compuestos responsables de la actividad
antimicrobiana del té verde, la epigalocatequina (EGCG) y epicatequina (ECG) son las catequinas
más potentes para exhibir actividad antimicrobiana debido al resto galoilo presente en sus
estructuras (Perumalla y col., 2011). Si bien, los polifenoles provenientes del extracto de té verde
han mostrado efectos inhibidores sobre bacterias tanto Gram positivas (G+) como Gram negativas
(G-) (Gadang y col., 2008), han sido reportadas diferentes concentraciones inhibitorias. En este
sentido, Yoda y col. (2004) encontraron que se requerían de 50 a 100 μg/mL para inhibir el
crecimiento de Staphylococcus y concentraciones superiores a 800 μg/mL para inhibir algunos
bacilos G- estudiados. Sakanka y col. (1989) reportaron que se necesitó una concentración
inhibitoria mínima de 250 μg/mL para las bacterias que causan la caries dental Streptococcus
mutans. Los extractos de té verde chino (C. sinensis L.) a 500 μg/ml mostraron un fuerte efecto
inhibidor (44 a 100%) sobre los principales patógenos transmitidos por los alimentos (especies
de Listeria, Salmonella, Staphylococcus y Bacillus) (Si y col., 2006). Over y col. (2009)
demostraron que el ETV solo (20 o 40 mg/mL) o en combinación con ácido tartárico (37,5 mM)
redujo Salmonella, Listeria y E. coli en al menos 3,5 log UFC/ mL en estudios de cultivo en caldo.
Además, Almajano y col. (2008) estudiaron la actividad antifúngica de diferentes tipos de té y
observaron que el crecimiento de Candida albicans era inhibido principalmente por extractos de
té verde y blanco. Se podría decir, entonces, que los hallazgos encontrados han sido muy
interesantes porque revela a este compuesto como un antimicrobiano de amplio espectro siendo
efectivo no solo para bacterias sino también para mohos y levaduras. Con respecto al
almacenamiento, el té no ha podido controlar el crecimiento de la microflora nativa del batido,
presentándose aumentos significativos, a día 15, para BAM y M&L (p<0,05), y no significativos
para EB (p>0,05). Por lo tanto, el uso de ETV como único método de preservación utilizado en
concentración de 0,5% podría ser considerado insuficiente para lograr inhibiciones de manera
comparativa, de acuerdo a los resultados encontrados en esta Tesis. Una alternativa para mejorar
la actividad antimicrobiana sería aumentar la concentración del ETV en el batido. Sin embargo,
es bien sabido que el ETV tiene sabor y color muy fuerte, siendo este un limitante de gran
importancia para su aplicación en alimentos. Es por ello que la tecnología de barreras toma gran
relevancia a la hora de mejorar las inhibiciones logradas, siendo preferente en este caso su
combinación con otras tecnologías antes que el aumento de las concentraciones a utilizar.
De acuerdo con los resultados, la irradiación aplicada de manera individual fue muy efectiva,
todas las muestras irradiadas presentaron a día 2 recuentos por debajo del límite de detección (<
2,0 log). Éstos concuerdan con otros estudios sobre matrices vegetales similares como las
estudiadas por Song y col. (2006 y 2007) donde muestras de jugos de zanahoria y col rizada
irradiadas con 2 y 3kGy lograron recuentos por debajo del límite de detección (1 log UFC/mL)
para E.coli y Salmonella, habiendo inoculado 7 log UFC/mL, respectivamente. También
reportaron la eliminación de todas las bacterias aeróbicas y coliformes (6 a 7 log UFC/mL) del
jugo de zanahoria mediante irradiación a una dosis de 3 kGy, y que aproximadamente 2 log
UFC/mL de las bacterias sobrevivieron en el jugo de col rizada irradiado hasta 5 kGy; sin
embargo, estas células que sobrevivieron a la irradiación en el jugo de col rizada no crecieron,
66
Resultados
mientras que las de las muestras no irradiadas alcanzaron 9 log UFC/mL después de 3 días de
almacenamiento a 10°C. De esta forma, los resultados hallados en este ensayo de Tesis fueron
muy prometedores tanto al inicio como durante el almacenamiento, y podría estar relacionado a
la acidez particular del batido (pH entre 3,8 y 4,3). Según estudios citados en el trabajo de Ross y
col. (2003), la irradiación combinada con la reducción del pH (con diferentes acidulantes) puede
resultar conveniente por sus efectos sobre la vida útil de un producto. Se demostró que las
bacterias de la familia enterobacteria fueron destruidas y/o dañadas por la irradiación, y las células
dañadas no pudieron crecer al pH ácido incluso en productos sometidos a abusos de temperatura.
En el estudio de Niemira, (2001), quienes irradiaron (0,25-1,25) cinco formulaciones comerciales
de jugo de naranja de pH muy ácidos, estadísticamente diferentes (p<0,05) (pH de 3,87 a 4,13),
lograron inactivar el 90% de una cepa de Salmonella Enteritidis sin diferencias significativas
entre los valores de reducción decimal (D10) hallados. Además, también han demostrado que el
efecto letal de las radiaciones ionizantes no mejora mucho con una acidificación suave (valores
de pH entre 5 y 6). Por lo tanto, en general, cuando se combinan con ciertos procesos no térmicos,
las condiciones ácidas pueden resultar en una mayor inactivación de bacterias y esporas
vegetativas que a pH neutro (Ross y col., 2003). Al igual que se puede ver también en esta Tesis,
al final del almacenamiento, a día 15, las muestras irradiadas (1,5 y 3,0 kGy), las cuales a su vez
tienen valores de pH ácidos similares a estudios mencionados (Niemira, 2001), obtuvieron
recuentos por debajo del límite de detección (<2 UFC/mL) para EB y M&L, y aumentos ≤1,3 log
en BAM, que igualmente la diferencia entre ambos a día 15 fue menor que 1 log UFC/mL
(p>0,05). Resultados muy similares se han encontrado en los tratamientos irradiados conteniendo
té (1,5+Té y 3+Té), de manera que inicialmente, a día 2, los recuentos estuvieron por debajo del
límite de detección para ambos tratamientos. Y al final del almacenamiento, solo se pudieron
observar aumentos ≤0,4 log en BAM, sin diferencias significativas entre tratamientos (p>0,05).
An y col. (2004) reportaron que la irradiación de polifenoles del té verde podría mejorar sus
propiedades antimicrobianas contra ciertas bacterias (S. aureus, S. epidermidis, E. coli y S.
mutans) pudiendo lograr una mayor lisis celular. Es posible que el polifenol irradiado no cambie
su estructura química, pero podría esperarse algún cambio en la actividad de grupos funcionales
como –OH o –COOH, dando como resultado una mayor actividad antimicrobiana. De hecho, en
el trabajo previamente mencionado (An y col., 2004) se requirió la mitad de concentración
mínima inhibitoria de té para S. aureus y S. mutans. De acuerdo con los resultados obtenidos en
este ensayo de Tesis, observando el comportamiento durante el almacenamiento del tratamiento
con menor dosis de irradiación, 1,5 kGy, se vio que este tuvo un recuento de 3,3 log UFC/mL a
día 15, mientras que el tratamiento de 1,5+Té presentó un recuento de 2,4 log UFC/mL; por lo
tanto, podría ser que la irradiación haya tenido cierta influencia sobre la actividad del té
explicando de esta manera la mejora en los resultados.
b. Capacidad antioxidante (DPPH y FRAP)
Los resultados obtenidos respecto de la capacidad antioxidante de las muestras estudiadas se

presentan en la Tabla 4.2.
En primer lugar, el tratamiento solo con té (Control+Té) inicialmente, a día 2, presentó una
mayor actividad antioxidante, tanto por metodología DPPH como FRAP, siendo
significativamente mayor que la muestra control (p<0,05). A su vez, el tratamiento Control+Té
mostró una menor reducción durante el almacenamiento, en particular para DPPH. En relación
con esto, Perumalla y col. (2011) afirman que el té verde ha atraído más atención en los últimos
67
Resultados
años debido a sus beneficios para la salud como sus propiedades antioxidantes además de las
antimicrobianas, anticancerígenas y antiinflamatorias. Estos beneficios se han asociado a los
compuestos polifenólicos, principalmente flavonoides, presentes en el extracto de té verde cuyas
propiedades antioxidantes potenciales se deberían a su potencial redox que les permite actuar en
diversas formas, como donantes de hidrógeno, agentes reductores, extintores de oxígeno nacientes
e iones metálicos quelantes en numerosas aplicaciones alimentarias (Gramza y col., 2006). Los
grupos hidroxilo activos presentes en la estructura molecular de los polifenoles son los
componentes activos del extracto de té verde que pueden interactuar con los radicales libres
(Perumalla y col., 2011). Entre estos, el galato de epigalocatequina (EGCG) tiene la mayor
actividad depuradora de radicales libres seguida de galato de epicatequina (ECG), epicatequina
(EC) y epigalocatequina (EGC), ya que las funciones antioxidantes de las catequinas del té
dependen de la estructura, posición y número de grupos hidroxilo (Hu y col., 2001). Además, la
concentración, la solubilidad, la accesibilidad de los grupos activos al oxidante y la estabilidad
del producto también juegan un papel importante en las propiedades antioxidantes del extracto de
té verde (Perumalla y col., 2011).
En cuanto a las muestras que solo fueron irradiadas, en general, presentaron valores mayores
de capacidad antioxidante que las no irradiadas (control), aunque las diferencias entre los distintos
tratamientos no fueron significativas, y tampoco las diferencias de los tratamientos con el control
(p>0,05). Inicialmente, a día 2, las muestras irradiadas con 1,5 kGy mostraron un mayor valor en
DPPH que las irradiadas con 3,0 kGy. Sin embargo, si bien durante el almacenamiento estos
valores fueron disminuyendo, se vio que el tratamiento con 3,0 kGy tuvo una menor reducción;
de modo que a día 15, las retenciones en actividad antirradicalaria (DPPH) fueron del 20, 23 y
37% en las muestras control, 1,5 y 3,0 kGy, respectivamente. En el caso de los valores observados
para el potencial de reducción férrica (FRAP), se vio que a mayor dosis de irradiación mayor fue
la actividad antioxidante inicialmente lograda, y a su vez también mayor estabilidad durante el
almacenamiento, de modo que a día 15, las retenciones fueron de 73, 77 y 80% en las muestras
control, 1,5 y 3,0 kGy respectivamente. Según Song y col. (2006), tanto el valor inicial de DPPH
como de FRAP medido en un jugo de zanahoria irradiado (3 y 5 kGy) fue más alto que el del
control (no irradiado), mostrando además una mayor estabilidad de los componentes
antioxidantes al cabo de 3 días a 10°C, en comparación con la muestra control. Estos resultados
podrían estar relacionados con otros estudios previos (Beaulieu y col., 2002; Breitfellner y col.,
2002; Fan y col., 2003; Moussaid y col., 2000) que informaron que la radiación, a una solución
acuosa, de compuestos fenólicos (ácido gálico, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido cinámico, ácido
p-cumárico, ácido cafeico, entre otros que pueden estar presentes de manera natural en los jugos
y batidos de F&V) condujo a una eficiente y notable hidroxilación, logrando aumentar la
capacidad antioxidante. Además, de acuerdo a lo reportado por Song y col. (2006), también el
nivel de fenoles totales en el jugo de zanahoria irradiado fue más alto que el control a los 3 días
(a 10°C) (p<0,05), mientras que el del jugo no irradiado disminuyó su contenido (p<0,05); se
supone que una de las razones de esto puede deberse a la captación de radicales por el b-caroteno
(EI-Agamey y col., 2004), un desactivador eficaz de moléculas que participan en la generación
de radicales y oxígeno. Además, vieron que hubo una alta correlación entre el contenido fenólico
estimado y los valores de FRAP (p<0,01) para el jugo de zanahoria. Por lo tanto, atribuyeron un
efecto de protección sinérgica por parte de la combinación de b-caroteno y otros antioxidantes,
contra la oxidación de fenoles (Marta y col., 2003; Yun-Zhong y col., 2002) resultando en un
mayor contenido de estos componentes y en consecuencia, una mayor capacidad antioxidante.
Por otro lado, en cuanto a un almacenamiento más prolongado, Mesquita y col. (2019) reportaron
que la pérdida de actividad antioxidante durante el almacenamiento por 120 días a 21±3°C de un
68
Resultados
jugo de mezclas de uvas irradiado (1, 1,5 y 2 kGy) pudo haber sido a causa de la oxidación de los
polifenoles y a la degradación de la vitamina C, así como a las reacciones de polimerización de
compuestos con poder antioxidante como las antocianinas, en ese caso. Según Almeida y col.
(2018) y Khoo y col. (2017) la formación de radicales libres durante la irradiación de las muestras
interfiere con el antioxidante, reduciendo así la eficacia de los mecanismos de captación de
radicales libres. También se demostró en la fruta de litchi que la irradiación gamma producía
radicales libres y disminuía la capacidad antioxidante total debido a una disminución en la
cantidad de compuestos fenólicos y ácido ascórbico (Mishra y col., 2012). Otros autores (Latorre
y col., 2010; Naresh y col., 2015; Ashtari y col., 2019) sostienen que puede ser del aumento de la
cantidad de H2O2 y especies reactivas del oxígeno (ERO) reactivos en la célula, provocando que
los compuestos antioxidantes se consuman para la eliminación de los mismos (H2O2 y ERO) y
por lo tanto se reduzca su cantidad.
En el caso de las muestras irradiadas conteniendo té, en cuanto a DPPH, inicialmente no se

obtuvieron diferencias significativas (p>0,05) respecto de aquellas sin irradiar conteniendo té, en
cambio, a día 15, los tratamientos 1,5+Té y 3+Té presentaron retenciones alrededor del 98%. Por
otro lado, para FRAP, a día 2, se pudo destacar el tratamiento 3+Té presentando un aumento
significativo, comparando con los demás tratamientos y el control (p<0,05). A su vez, el mismo,
logró retenciones de casi el 100% durante el almacenamiento, siendo este resultado realmente
remarcable, ya que se logró un valor elevado y sostenido de antioxidantes en el batido, mientras
que el tratamiento 1,5+Té no tuvo aumentos iniciales significativos (p>0,05) ni tampoco
retenciones importantes durante el almacenamiento, siendo las mismas alrededor del 50%.
Tabla 4.2 - Capacidad antioxidante en muestras control y muestras tratadas con IG,
ETV y combinación de ambos, durante el almacenamiento a 5°C, a día 2 y día 15.
DPPH* FRAP*
TRATAMIENTO DÍA (μM Trolox/100g de (μM Trolox/100g
batido) de batido)
2 258,3±28,8a,A 489,7±57,1a,A
Control
15 51,3±17,3a,B 355,5±52,7a,A
2 718,0±2,5b,A 22313,7±685,1b,A
Control + Té(0,5%)
15 707,0±0,1c,B 11533,7±25,4b,B
2 296,7±31,8a,A 582,9±56,1a,A
1,5 kGy
15 67,5±20,3a,B 451,1±11,2a,A
2 724,7±2,3b,A 21557,4±417,7b,A
1,5 kGy + Té(0,5%)
15 716,0±1,5c,B 10808,5±358,1b,B
2 284,0±50,3a,A 642,5±11,7a,A
3,0 kGy
15 104,2±13,6b,B 518,7±15,1a,B
2 729,3±4,8b,A 24218,9±63,4c,A
3,0 kGy + Té(0,5%)
15 712,6±1,8c,B 24174,1±806,1c,A
En síntesis, si bien en los tratamientos llevados a cabo en este ensayo no se vieron aumentos
en la capacidad antioxidante durante el almacenamiento, es importante destacar la implicancia de
ciertas reacciones iniciales relacionadas con los efectos de la irradiación y los compuestos
antioxidantes, ya sean propios del batido o del té agregado; y además, relacionarlas con la mayor
estabilidad lograda durante el almacenamiento, destacando particularmente el tratamiento 3+Té
por su elevado valor antioxidante y la retención del mismo. A su vez, es sabido que habitualmente
69
Resultados
se han utilizado diferentes métodos para evaluar la actividad antioxidante de las frutas y sus
derivados, ya que la misma está dada por la presencia y actividad de muchos compuestos
fitoquímicos, tales como flavonoides, ácidos fenólicos, aminoácidos, ácido ascórbico, tocoferoles
y pigmentos, entre otros. Como están involucrados varios mecanismos de reacción, no todos estos
compuestos aportan de manera similar a la capacidad antioxidante de un sistema complejo como
lo es este batido, razón a la que pueden deberse las diferencias observadas en los valores y
comportamiento de los indicadores DPPH y FRAP (Tabla 4.2). Por tanto, el uso de dos o más
métodos puede proporcionar información más representativa del perfil completo de actividad
antioxidante (Mesquita y col., 2019).
c. Actividad enzimática
El pardeamiento enzimático de frutas y verduras y sus productos es un factor importante que

influye en su calidad. Debido al creciente interés de los consumidores en el consumo de batidos
de F&V no pasteurizados, existe la necesidad de buscar otras tecnologías no térmicas y/o agentes
anti-pardeamiento naturales que puedan usarse como técnicas para prevenir cambios
organolépticos indeseables de estos productos.
Con respecto a la actividad enzimática de las muestras evaluadas, se consideró la actividad de

polifenoloxidasa (PPO) y peroxidasa (POD) dado que suelen ser las principales enzimas
responsables del deterioro en este tipo de producto (Cao y col., 2011; Cao y col., 2012). A
continuación, en la Tabla 4.3 se muestran los resultados de las muestras sin té.
Tabla 4.3 - Actividad enzimática en muestras control y muestras tratadas con IG,
durante el almacenamiento a 5°C, a día 2 y día 15.
TRATAMIENTO DÍA PPO* POD*
2 10,7±1,1a,A 12,3±0,3a,A
Control
15 6,85±1,5a,B 20,35±0,8a,B
2 7,5±1,1b,A 11,35±0,1a,A
1,5 kGy
15 7,0±0,4a,A 17,3±0,3a,B
2 7,95±0,2b,A 10,85±1,8a,A
3,0 kGy
15 7,35±0,6a,A 17,8±2,3a,B
Las muestras irradiadas en este ensayo (1,5 y 3 kGy) mostraron reducciones iniciales
significativas de la actividad de enzimas PPO (p<0,05) y reducciones iniciales no significativas
de POD (p>0,05), comparando con las muestras control. Los valores de actividad residual, a día
2, fueron de 70% y 74% para PPO, y de 92% y 88% para POD, para las muestras irradiadas a 1,5
y 3,0 kGy, respectivamente. De manera similar, Ashtari y col. (2019) vieron que la actividad de
la enzima PPO en muestras de arilos de granada (cv. ‘Malas Savehʼ) irradiadas con tres dosis de
1, 3 y 5 kGy fue significativamente menor que en las muestras no irradiadas. Por otro lado, en
otro estudio sobre un jugo de col rizada (Kim y col., 2007), la irradiación gamma no afectó la
actividad PPO, obteniéndose en éste una actividad residual inicial de PPO de 96% y 98% para
dosis de 3 y 5 kGy, respectivamente, pero luego de 3 días a 10°C se vio una disminución gradual
sin diferencias significativas entre las muestras irradiadas y no irradiadas. Para el caso de las POD,
70
Resultados
Barros y col. (2018) demostraron un elevado poder oxidativo en este tipo de enzimas, los autores,
quienes irradiaron (1, 3, 6 y 9 kGy) un batido mezcla de uvas y leche de soja, notaron que a mayor
dosis de irradiación, mayor era la actividad de la POD (µmol H2O2.mg proteina-1), concluyendo
en la gran resistencia de esta enzima frente a esta tecnología. También Mesquita y col. (2019)
reportaron que una reducción tan significativa en el contenido de vitamina C de un jugo de uvas
irradiado (2 kGy) podía haber sido causada por la acción directa de la enzima ácido ascórbico
oxidasa (ascorbinasa) o por enzimas oxidantes como la peroxidasa, ya que la radiación gamma
podría haber aumentado la actividad enzimática de algunas enzimas (Jenjob y col., 2017).
Adicionalmente, tanto Barros y col. (2018) como Mesquita y col. (2019) reportaron que al
aumentar la dosis de irradiación, se obtenía un mayor incremento inmediato (inicial) de la
capacidad antioxidante, lo cual podía contrarrestar el efecto oxidativo de las enzimas en cuestión,
lo que se podría relacionar con lo mostrado en la sección 4.1.1.b. donde también se puede ver
cierto aumento en la actividad antioxidante del batido frente a una mayor dosis de irradiación.
En cuanto al tiempo de almacenamiento, la actividad de la PPO tuvo una tendencia a la

disminución, sin diferencias significativas (p>0,05) (excepto para el control), mientras que la
actividad de POD aumentó significativamente tanto en la muestra control como las irradiadas. En
el caso de PPO, se observó que la reducción de la actividad enzimática fue de 36%, 7% y 8% para
las muestras control, 1,5 y 3,0 kGy, respectivamente, y en POD se observó que el aumento de la
actividad fue de 65%, 52% y 64%, respectivamente. Estos descensos y aumentos en las
actividades enzimáticas se suelen observar durante el almacenamiento y tienen diversas
explicaciones. En el caso del descenso, algunos autores sugieren que podría deberse a la influencia
del ambiente ácido, que dificultaría la regeneración de las enzimas. Mientras que en el caso de la
reactivación (como observamos en este estudio para POD) puede asociarse al despliegue y
replegamiento de enzimas a las estructuras iniciales u otras estructuras activas como consecuencia
del tratamiento (aunque en este caso también se observó activación en el control) (Ross y col.,
2003; Oey y col., 2008; Cao y col., 2011). Ashtari y col. (2019) vieron que a día 14, la actividad
de PPO en muestras irradiadas con 5 kGy fue menor que en muestras con dosis de 3 kGy, y a su
vez ambas menor a las muestras con dosis de 1 kGy y control.
De acuerdo con los resultados (Tabla 4.3) la efectividad en la reducción de PPO, ya sea al
inicio o durante el almacenamiento, pudo haber sido debido a cualquier cambio inducido por la
irradiación en la estructura de las enzimas, ya que la actividad de éstas depende de su estructura
y podría quedar impedida (Ashtari y col., 2019). Se ha demostrado que las ondas UV-C pueden
reducir directa e indirectamente la actividad de la enzima PPO. De forma directa, estas ondas son
absorbidas por la estructura de la enzima y así se producen la fotooxidación. De forma indirecta,
estas ondas oxidan las proteínas y alteran la estructura de las enzimas al producir radicales libres.
No obstante, a pesar de que se necesita más información sobre los efectos de las ondas en la
estructura y función de las enzimas en los alimentos (Maghoumi y col., 2013), la irradiación
gamma posiblemente basada en un mecanismo similar afecta directamente la estructura de la
enzima o, al aumentar los radicales libres dentro de las células, puede alterar la estructura de las
enzimas y disminuir su actividad.
Con respecto a otros productos vegetales, se ha informado una inactivación parcial de PPO
por radiación gamma en hongos frescos (Dean y Professor, 1989) y frutos de mango (Frylinck y
col., 1987). Sin embargo, en general se acepta que las enzimas de las materias primas alimentarias,
cuando no hay tratamiento térmico, son estables frente a dosis bajas de irradiación (Kim y col.,
2007). Se podría decir que los resultados de este estudio lo confirmaron, mostrando valores
71
Resultados
similares en PPO tanto para el control (6,85) como para los tratamientos 1,5 y 3 (7,0 y 7,35,
respectivamente) a los 15 días de almacenamiento.
Finalmente, es importante mencionar que en los tratamientos con agregado de té no se pudo

determinar la actividad enzimática, ya que al momento de agregar el guaiacol para esta
determinación se opacó inmediatamente la mezcla y no se pudo realizar la lectura en
espectrofotómetro. De esta forma, se concluye que esto pudo deberse a algún tipo de reacción
entre compuestos del té verde y los reactivos utilizados aquí para la determinación de actividad
enzimática; lo que se observaba era que la mezcla se ponía turbia. También, podría ser por el
propio color que imparte el té verde a la solución e interfiera en la lectura.
De esta forma, en el caso de utilización de té verde, será necesario probar otras metodologías
para estas determinaciones.
d. Calidad sensorial
Los resultados de la evaluación sensorial realizada sobre muestras control y muestras tratadas
con IG, ETV y combinación de ambos, durante el almacenamiento a 5°C, a día 2 y día 15, se
presentan en la Tabla 4.4.
En relación al color, si tenemos en cuenta el límite de aceptabilidad (generalmente se adopta

un puntaje de 5), las muestras irradiadas con una dosis de 3,0 kGy presentaron un puntaje
inaceptable al día 2. Adicionalmente, se podría decir que este fue uno de los atributos más
afectados al cabo de 15 días de almacenamiento a 5ºC, obteniéndose puntajes promedio de
4,2±1,8, 3,8±1,5 y 4,0±1,6 para las muestras control, 1,5 y 3,0 kGy, respectivamente, pudiendo
concluir que la dosis aplicada de irradiación no ha logrado la estabilidad de este atributo en este
producto. A diferencia con estos resultados obtenidos, algunos autores (Song y col., 2007)
aseguran que el color de los jugos de zanahoria y de col rizada irradiados a 3 y 5 kGy se pudo
mantener durante el almacenamiento a 10°C por 3 días, mientras que las muestras control (no
irradiadas) se pusieron oscuras y amarronadas. Estos autores reportaron que puede deberse a la
eliminación de la PPO a causa de la irradiación la cual, como se mencionó previamente, es la
enzima principalmente responsable de la oxidación de los polifenoles presentes en las frutas y
verduras. En el caso de las muestras conteniendo té presentaron puntajes promedio más altos de
color, que las muestras irradiadas sin té. El extracto de té verde que se utilizó para este ensayo
presenta un color rojo intenso, que puede haber actuado como resaltador del color del batido,
pudiendo mantenerse la aceptabilidad del mismo a lo largo de los 15 días de estudio (puntaje
promedio de 5,7 para muestras con té). Además, Klimczak y Świgło (2017) reportaron que la
adición de extracto de té verde, independientemente de la concentración, dio como resultado la
prevención de cambios significativos del color de un jugo de manzana durante el almacenamiento,
en refrigeración, durante 24 horas. Los autores vieron que la diferencia de color después de 48
horas aumentó en las muestras con té, pero estos valores no fueron superiores a los valores de
referencia que mostrarían gran diferencia, ni para la concentración de té más baja utilizada (1g.L-
1
). Los autores observaron cambios mínimos en el color para el jugo de manzana con 3 g.L-1 de
té, se calculó que los extractos de 1, 2 y 3 g.L-1 inhibieron el pardeamiento del jugo en un 56%,
67% y 88%, respectivamente, en comparación con el jugo de manzana sin té. Y se atribuyeron
los resultados a las catequinas del té verde, que constituían aproximadamente el 90% de su
contenido fenólico total, como principales inhibidoras de la oxidación de pigmentos y las enzimas
involucradas en pardeamientos (Klimczak y Świgło 2017). Por otro lado, según Lavelli y col.
72
Resultados
(2010) compuestos de color marrón podrían originarse a partir de la oxidación y polimerización

de compuestos flavonoides (flavan 3-oles) presentes en el té, lo cual también podría ser
considerado como característica del color final apreciado en el producto. Puede ser entonces que
los colores apreciados, luego de los tratamientos con té, podrían deberse por un lado a la
estabilidad del color rojizo aportado por el té, y/o a la eficiencia del té para controlar los cambios
de color durante el almacenamiento analizado en este ensayo.
Respecto del sabor y nivel de agrado general, ambos parámetros presentaron un

comportamiento similar. En el caso de las muestras irradiadas se pudieron ver valores alrededor
de 6 (aceptable), sin diferencias significativas, tanto al inicio como al final del almacenamiento.
En cambio, estos parámetros se vieron significativamente reducidos en el caso de las muestras
irradiadas conteniendo té, tanto a día 2 como a día 15, las cuales presentaron menos astringencia
pero más amargor que las muestras tratadas solo con té, presentando puntajes por debajo del límite
de aceptabilidad (5). Los resultados sensoriales de las muestras adicionadas con té obtuvieron
observaciones similares a otros trabajos donde se ha aplicado té verde a distintos productos (Wang
y col., 2000; Auger y col., 2004; Kajiya y col., 2004). El té imparte un sabor amargo y astringente
muy característico, con lo cual es importante en el caso de optar por su agregado, mantenerlo en
concentraciones que no resulten inaceptables para los consumidores.
Se puede destacar que para 3,0 kGy los puntajes de sabor y aceptabilidad general iniciales
fueron más bajos que para 1,5 kGy, lo cual puede estar relacionado a que para cada tipo de
producto existe una dosis máxima de irradiación que afecta negativamente a las propiedades
organolépticas. Sin embargo, también se vio que para una mayor dosis de irradiación, mayor fue
la estabilidad de estos parámetros durante el tiempo de almacenamiento, es decir que se podría
obtener una disminución más gradual de estas variables características del producto en el caso de
las muestras irradiadas con 3,0 kGy. Song y col. (2007), quienes analizaron ciertos parámetros
sensoriales (color, sabor, olor y nivel de agrado general), durante 3 días de almacenamiento a
10°C, en jugos de zanahoria y col rizada irradiados (3 y 5 kGy), encontraron que inmediatamente
después de la irradiación, las puntuaciones sensoriales generales de las muestras irradiadas y no
irradiadas no eran significativamente diferentes. Sin embargo, la calidad sensorial del jugo de
zanahoria y col rizada no irradiados disminuyó con el tiempo de almacenamiento, no pudiendo
realizar pruebas de sabor a partir del día 2 (inclusive) por deterioro. Al igual que en el estudio de
Song y col. (2007), en el ensayo realizado en esta Tesis, solo las muestras que fueron irradiadas
pudieron ser evaluadas durante el tiempo de almacenamiento, ya que las muestras Control, o
Control+Té no fueron consideradas para evaluación de sabor al final del almacenamiento debido
a que estas muestras presentaron altos recuentos microbianos.
Finalmente, en cuanto a la textura los resultados mostraron que inicialmente este parámetro
de calidad no fue afectado por la irradiación, sin embargo, luego se presentó una tendencia a la
disminución de este indicador cuanto mayor fue la dosis de irradiación. Esto podría deberse a una
posible disrupción celular generada por el tratamiento afectando este parámetro, o una pérdida de
consistencia o viscosidad. Por otro lado, en el aroma no se vieron puntuaciones ni cambios
relevantes frente a los tratamientos, además, al día 15 de almacenamiento, como era de esperarse,
se observaron puntajes menores en todos los atributos de calidad respecto del día 2 para todos los
tratamientos evaluados, excepto para el aroma. De forma similar, Song y col. (2010) encontraron
que la irradiación redujo la viscosidad en un jugo de batata fresco. Los autores reportaron que las
pruebas de evaluación sensorial no revelaron diferencias significativas entre las muestras control
y las irradiadas con 1 kGy, excepto en la textura y el color, pero las puntuaciones sensoriales
disminuyeron cuando se empleó una irradiación de 3 kGy o más (excepto en las pruebas de sabor).
73
Resultados
Tabla 4.4 - Análisis sensorial en muestras control y muestras tratadas con IG, ETV y
combinación de ambos, durante el almacenamiento a 5°C, a día 2 y día 15.
NIVEL
TRATAMIENTO DÍA COLOR TEXTURA SABOR AGRADO AROMA
GENERAL
2 5,7±1,2a,A 6,7±1,0a,A 7,0±0,6a 6,8±0,8a,A 7,0±1,0a,A
Control
15 4,2±1,8a,A 6,3±0,6a,A - - 7,0±1,2a,A
2 5,8±1,3a,A 6,5±1,0a,A 3,8±1,5b 4,0±0,6b,A 6,7±1,5a,A
Control + Té(0,5%)
15 5,8±1,3a,A 6,0±0,0a,A - - 6,2±1,6a,A
2 5,3±0,8a,A 6,7±0,8a,A 6,8±0,8a,A 6,7±0,8a,A 5,7±2,1a,A
1,5 kGy
15 3,8±1,5a,A 5,4±1,1a,A 5,5±0,7a,A 4,8±1,1a,A 6,8±1,3a,A
2 5,7±0,5a,A 6,3±1,0a,A 3,8±1,5b,A 3,7±1,0b,A 6,0±2,0a,A
1,5 kGy + Té(0,5%)
15 5,8±1,3a,A 5,4±1,1a,A 3,0±0,0b,A 4,8±1,6a,A 6,2±1,8a,A
2 4,3±1,4a,A 6,7±0,8a,A 5,7±0,8a,b,A 5,5±0,8a,b,A 6,0±1,0a,A
3,0 kGy
15 4,0±1,6a,A 5,0±1,6a,A 6,0±0,0a,A 4,8±1,1a,A 6,2±1,8a,A
2 4,5±1,4a,A 6,3±1,0a,A 3,3±0,8b,A 3,8±1,2b,A 6,3±0,6a,A
3,0 kGy + Té(0,5%)
15 5,6±1,1a,A 4,8±1,8a,A 2,5±0,7b,A 4,2±1,6a,A 5,2±1,1a,A
De acuerdo con los resultados aquí demostrados, y a los de las secciones anteriores (4.1.1.a.,
4.1.1.b. y 4.1.1.c.), cabe destacar que el agregado de té verde proporciona un aporte nutricional
importante. Por lo cual, haciendo un balance entre su aporte nutricional, sus efectos sensoriales y
los efectos microbiológicos observados (que fueron prácticamente desestimables) decidimos
avanzar probando otras combinaciones. Como la irradiación resultó muy efectiva frente a
bacterias Gram negativas y mohos y levaduras (se habían observado recuentos por debajo del
límite de detección) pero no logró mantener el control en el tiempo de los recuentos de BAM, y
el té, aun siendo un antimicrobiano de amplio espectro, no pudo complementar eficazmente (en
la concentración utilizada) al tratamiento de irradiación, se decidió en los siguientes ensayos
utilizar antimicrobianos naturales que tengan como target específico las bacterias Gram positivas
para lograr un mejor complemento entre las barreras seleccionadas. No descartando, sin embargo,
la posibilidad de utilizar concentraciones menores de té verde como complemento de otra
metodología, como el US, y así aprovechar sus excepcionales aportes nutricionales.
4.2. COMBINACIÓN DE IRRADIACIÓN Y NISINA PARA LA

4.2.1. Radioresistencia de Listeria innocua y Listeria monocytogenes
Como se mencionó anteriormente en la sección 3 de Materiales y Métodos, la bacteria Listeria

innocua es una cepa que ha sido ampliamente utilizada como subrogante de L. monocytogenes,
ya que ha mostrado tener un comportamiento y resistencia similar frente a tratamientos físicos,
químicos y biológicos (Dion y col., 1994; Cabeza y col., 2007; Cabeza y col., 2009).
74
Resultados
En esta Tesis se propuso llevar a cabo un estudio microbiológico de radioresistencia de Listeria

innocua (CIP 80.11) y L. monocytogenes (colección de cultivos microbianos argentinos Nº29
código CCMA-29-Lm-1271) inoculadas en el batido estudiado.
Los resultados se muestran en la Figura 4.1 y la Figura 4.2. En primer lugar, si bien se
inocularon aproximadamente 8 log UFC/mL en ambos casos, las muestras con L. monocytogenes
presentaron recuentos iniciales de 4,5 log UFC/mL, mientras que en las muestras con L. innocua
fue de 7,5 log UFC/mL; lo que podría deberse al efecto del bajo pH del sistema y frente al cual,
la cepa L. monocytogenes resulte más sensible que L. innocua. Como era de esperar, la respuesta
de Listeria innocua al tratamiento de irradiación se ajusta a la cinética de inactivación de primer
orden (R2 =0,95) donde se halló un valor de D10 =0,79 siendo esta la dosis de irradiación requerida
para reducir un 90% de la población de bacterias, es decir un ciclo logarítmico. En cambio, para
L. monocytogenes el ajuste no fue muy bueno obteniéndose un R2 =0,83, si bien en el caso de L.
monocytogenes la cinética de primer orden tuvo un ajuste menos significativo, sí puede observarse
que la sensibilidad de esta cepa fue menor que en el caso de L. innocua, observándose recuentos
siempre menores a iguales dosis de irradiación aplicadas a los batidos inoculados. De hecho, por
ejemplo, a 1,2 kGy, los recuentos de L. monocytogenes estuvieron por debajo del límite de
detección. Esto puede deberse al efecto combinado de la acidez y la irradiación sobre la cepa de
L. monocytogenes. De este modo se halló un valor de D10=0,41 viendo que esta última fue mucho
menos radioresistente que la cepa inocua. A su vez, el resultado de radioresistencia obtenido en
esta matriz alimenticia, tiene coincidencia con lo reportado en bibliografía para otros tipos de
productos. Por ejemplo, Cabeza y col. (2007) demostraron que algunas cepas de Listeria
monocytogenes tienen un valor de D10 bastante inferior, en general, que otras cepas del género
Listeria. Como valores habituales, el rango informado por varios autores en una variedad de
condiciones, están entre valores de D10 de 0,41-0,65 kGy para células de la cepa Scott A en estado
de crecimiento y estacionario estando suspendidas en solución salina fisiológica, D10 de 0,16-0,38
kGy para varias cepas de L. monocytogenes y D10 de 0,49 kGy para L. innocua en productos
cárnicos.
Como ha sido demostrado en los resultados obtenidos, el efecto de la irradiación varía en

función de las cepas, el estado fisiológico de la cepa utilizada, la matriz, la temperatura, entre
otras variables. A partir de los ensayos de radioresistencia realizados en esta Tesis, y adoptando
un criterio conservador, se seleccionó a Listeria innocua como microorganismo de diseño para
futuros ensayos.
75
Resultados
8.00
Log Nº sobrevivientes 7.50
7.00
6.50
6.00
5.50
5.00
0 0.3 0.6 0.9 1.2
Dosis (kGy)
y = -1.2671x + 7.5483
L. innocua Linear (L. innocua) R² = 0.9527
Figura 4.1 - Recuento de Listeria innocua luego de tratamientos de irradiación

de batidos inoculados con 108 log UFC/g.
5.00
4.50
Log Nº sobrevivientes
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
0 0.3 0.6 0.9 1.2
Dosis (kGy)
y = -2.4562x + 4.7287
L. monocytogenes Linear (L. monocytogenes) R² = 0.8311
Figura 4.2 - Recuento de Listeria monocytogenes luego de tratamientos de

irradiación de batidos inoculados con 108 log UFC/g.
4.2.2. Efecto de la combinación de irradiación y nisina sobre la calidad

microbiológica del batido
Con el objetivo de mejorar la preservación de los batidos por el método de irradiación gamma
(IG), muy efectivo para las bacterias Gram negativas (G-) y mohos y levaduras pero insuficiente
para inactivar completamente a las bacterias aerobias mesófilas (BAM)(visto en sección 4.1.1.a.),
76
Resultados
se decidió combinar con nisina (Ni), un antimicrobiano que no aporta aroma, sabor ni olor y es
altamente efectivo frente a bacterias Gram positivas (G+), lo que podría complementar
perfectamente la acción antimicrobiana de la irradiación sin impartir efectos sensoriales
indeseables. Asimismo, se ha demostrado que la nisina (y otras bacteriocinas) actúan sobre varias
especies de bacterias Gram negativas, siempre que se alteren primero algunas de las barreras de
obstáculo de la membrana externa (Ross y col., 2003).
Es sabido que los batidos de frutas y verduras (F&V) sin tratar tienen una vida útil corta, y
muchas veces es a causa del deterioro microbiano, lo que también puede traer aparejados peligros
microbiológicos en los alimentos. Aunque estos productos suelen ser muy ácidos (pH inferior a
4) y esta característica inhibe el crecimiento de la mayoría de las esporas bacterianas, algunos
microorganismos (MO) tolerantes al ácido como las levaduras, bacterias del ácido láctico
(Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococcus), Alicyclobacillus acideoterrestris,
algunas especies de Salmonella, algunas cepas de E. coli y algunas especies de Listeria, entre
otras, podrían sobrevivir y crecer en este medio (Gram y col., 2002; Jayachandran y col., 2015).
Así mismo, se han relacionado brotes de listeriosis con jugo de fruta contaminado y se ha
recuperado L. monocytogenes de la mezcla de jugo de manzana no pasteurizado (pH 3,78) (Sado
y col., 1998) y jugo de manzana y frambuesa (pH 3,75) después de 1 día de almacenamiento a
5°C. También se ha informado que este patógeno sobrevive en presencia de posibles compuestos
inhibidores en alimentos ácidos, como jugos de manzana y naranja (pH 3,5), sidra de manzana
(pH 3,4) y productos de tomate, incluso si no prolifera durante el período normal de
almacenamiento refrigerado (Beuchat y col., 1991; Buchanan y col., 1998; Baumann y col.,
2005). Parish y Higgins (1989) encontraron que este microorganismo sobrevivió durante 21 días
a 4°C y durante 5 días a 30°C en jugo de naranja con pH ajustado a 3,6. Aunque los jugos de
frutas ácidos parecen ser fuentes poco probables de este microorganismo, este patógeno
sobrevivió mucho más allá de la vida útil normal de los jugos de naranja no estériles, lo que
sugiere que este tipo de producto puede ser un vehículo de la listeriosis humana (Rayser y col.,
1991).
De esta forma, en este ensayo fueron evaluados los recuentos de Listeria y de BAM luego de
la aplicación de los tratamientos mencionados en la Tabla 4.5.
77
Resultados
Tabla 4.5 - Recuento de Listeria innocua y BAM en muestras control y muestras

tratadas con IG, Ni y combinación de ambos, durante el almacenamiento bajo
refrigeración (5°C), a día 2 y día 21.
Bacterias
Listeria
TRATAMIENTO DÍA aerobias
innocua*
mesófilas*
2 6,70±0,04a,A 6,69±0,25a,A
Control
21 5,20±0,63a,B 7,08±0,18a,A
2 5,65±0,72b,A 5,42±0,52b,A
Ni100
21 ≤ 2.70b,B 6,53±0,53a,B
2 4,19±0,51c,A 3,88±0,17c,A
Ni300
21 ≤ 2,70b,B 6,57±0,42a,B
2 5,11±0,25b,A 5,02±0,06b,A
1 kGy
21 ≤ 2,70b,B 2,89±0,39b,B
2 3,57±0,62c,e,A 3,85±0,31c,A
2 kGy
21 ≤ 2,70b,B ≤ 2,70b,B
2 ≤ 2,70e,A ≤ 2,70d,A
1 kGy + Ni100
21 ≤ 2,70b,A ≤ 2,70b,A
2 ≤ 2,70e,A ≤ 2,70d,A
1 kGy + Ni300
21 ≤ 2,70b,A ≤ 2,70b,A
2 ≤ 2,70e,A ≤ 2,70d,A
2 kGy + Ni100
21 ≤ 2,70b,A ≤ 2,70b,A
2 ≤ 2,70e,A ≤ 2,70d,A
2 kGy + Ni300
21 ≤ 2,70b,A ≤ 2,70b,A
En primer lugar, se destaca que los resultados obtenidos mostraron inicialmente, a día 2,
disminuciones con diferencias significativas en todos los tratamientos evaluados comparando con
las muestras control (p<0,05), tanto para el caso de Listeria como para BAM.
En cuanto a las muestras que no fueron tratadas (control), las mismas mostraron una reducción
en los recuentos de Listeria y un aumento de las BAM a los 21 días. Este comportamiento de
Listeria ha sido observado previamente sobre el mismo sistema, como fue reportado por
Fernández y col. (2019) quienes vieron una disminución de L. innocua en las muestras control
del mismo batido a base de frutas y vegetales, hasta alcanzar valores indetectables al final de 28
días de almacenamiento en refrigeración, probablemente debido al bajo pH (pH=3,7) del batido
el cual estuvo por debajo del mínimo reportado necesario para su crecimiento (pH=4,5). Además,
observaron que dado que la temperatura de almacenamiento fue superior a la temperatura mínima
de crecimiento (-1°C) (Adams y Moss, 2008), se evidencia un efecto de pH más fuerte.
Para los tratamientos con solo nisina (Ni100 y Ni300), se puede observar en la Tabla 4.5 que,
a mayor concentración de nisina utilizada, se obtuvieron mayores reducciones iniciales (día 2)
tanto para Listeria como para BAM, mostrando diferencias significativas entre tratamientos
(p<0,05). Otros autores también vieron reducciones iniciales en ambos tipos de MO solo con
nisina como tratamiento (McNamee y col., 2010; Fernández y col., 2018). La nisina se une
electrostáticamente a los fosfolípidos cargados negativamente y aumenta la permeabilidad de la
membrana mediante la formación de poros, lo que resulta en una rápida salida de pequeñas
moléculas intracelulares esenciales (Breukink y col., 1997). También interfiere con la biosíntesis
de la pared celular. Estos fenómenos están mediados por la capacidad de la nisina para unirse al
78
Resultados
lípido II, un peptidoglicano precursor de la pared celular bacteriana (Bauer y Dicks, 2005). Con
respecto a los comportamientos durante el almacenamiento, en el caso de Listeria los recuentos
siguieron disminuyendo durante el almacenamiento resultando en valores por debajo el límite de
detección (2,7 log UFC/mL) a día 21; como no se realizaron muestreos intermedios, no se pudo
detectar si hay diferencias en el tiempo en el que se alcanza estos valores indetectables (2,7 log
UFC/mL), por lo cual es probable que a mayor concentración de nisina se logre una inactivación
más rápida. Es sabido que la nisina es efectiva contra un amplio rango de bacterias G+, incluyendo
a Listeria (Jagus y col., 2016); además, debido a que la membrana citoplasmática de Listeria es
dañada por las bajas temperaturas facilita la acción de la nisina para formar poros en la membrana
y destruir las células, de esta forma logra aumentar su tasa de muerte a temperaturas de
refrigeración (Martins y col., 2010), lo cual además probablemente se vio incrementado por el ya
mencionado efecto combinado con la acidez. Por otro lado, resulta notorio el aumento de recuento
de BAM que se ha obtenido durante el almacenamiento, llegando a valores muy cercanos al
control a día 21, independientemente de la concentración de nisina utilizada. Estos
comportamientos pueden deberse a varias explicaciones, como que la actividad de las
bacteriocinas puede inhibirse en las matrices alimentarias debido a cambios en la solubilidad,
carga de las bacteriocinas, la unión de las bacteriocinas a los componentes alimentarios y la
inactivación de las bacteriocinas por las proteasas (Ross y col., 2003); sin embargo, como la nisina
ha resultado efectiva frente a Listeria, se considera que podrían haber bacterias G+ o G- (presentes
como BAM) menos sensibles a esta bacteriocina. Resultados similares se pueden mencionar en
el trabajo de Fernandez y col. (2014) donde se evaluó el desarrollo in vitro de la microflora nativa
obtenida de hojas de remolacha, la cual fue inoculada en caldo fresco estéril (inóculo inicial:
aproximadamente 105 UFC/ml). Entre los tratamientos realizados, se encontraban los de Ni
250UI/mL (Ni250), Ni 500UI/mL (Ni500). Las muestras se almacenaron a 15ºC durante 144
horas, y se evaluaron recuentos de bacterias aerobias mesófilas, mohos y levaduras y
enterobacterias. Encontrándose que el control llegó a valores de 9 log UFC/mL de BAM a las 24
horas de almacenamiento y los tratamientos Ni250 y Ni500 presentaron comportamientos
similares a éste, no teniendo un efecto eficaz. Otro estudio, donde se han hecho análisis in vivo
en jugos de frutas como el de Walker y col. (2008), reportan una significativa disminución en las
células vegetativas de Alicyclobacillus acidoterrestris (3,15 log UFC/mL) o esporas (3,59 log
UFC/mL) en un jugo de manzana que fue almacenado durante 29 días a 30°C, utilizando una
concentración de nisina de 10 UI/mL, en comparación con los controles. Por otro lado, los mismos
autores vieron que la nisina sola en concentraciones de hasta 1000 UI/mL no fue eficaz para
inhibir la multiplicación de Propionibacterium cyclohexanicum (mesófilas, G+) en un jugo de
naranja almacenado durante 29 días a 30°C lo que sugiere que este organismo puede ser resistente
a la nisina. Por lo tanto, se puede comprobar que la nisina como único método de preservación no
ha sido capaz de inhibir la amplia variedad que implica el grupo de las aerobias mesófilas.
En cuanto a los tratamientos de irradiación, 1 y 2 kGy, ambos presentaron inicialmente, a día

2, reducciones significativas de 1,6 y 3,1 log para Listeria, respectivamente, y 1,7 y 2,8 para
BAM, respectivamente, comparando con el control (p<0,05). Además, la menor dosis de
irradiación (1 kGy) fue suficiente para obtener un recuento de Listeria por debajo del límite de
detección al final del almacenamiento. El comportamiento de esta última está de acuerdo con los
resultados mencionados anteriormente (sección 4.1.1.a.) donde se citaron estudios que
demuestran que la irradiación aplicada a un sistema de bajo pH puede resultar conveniente por
sus efectos de extensión de la vida útil en este tipo de producto y para lograr mayores inhibiciones
frente a una variedad de MO incluido Listeria (Ross y col., 2003). A su vez, la irradiación también
ha resultado muy positiva para el caso de las BAM, a diferencia de los tratamientos con solo
79
Resultados
nisina, durante el almacenamiento los recuentos de BAM bajaron. Si bien las dosis aplicadas no
fueron suficientes para eliminar completamente la carga inicial de BAM, posiblemente los
tratamientos generaron un daño físico en las células remanentes que les imposibilitó su desarrollo
en el medio ácido y en refrigeración durante el almacenamiento. En este sentido, Finten y col.
(2017) reportaron que los recuentos de BAM en muestras de hojas de espinaca irradiadas (1,5 y
3,0 kGy) mantuvieron sus valores bajos (alrededor de 3 log UFC/mL) alcanzados luego de la
irradiación (a día 1) durante varios días y si bien se vieron aumentos, permanecieron por debajo
del criterio de aceptabilidad durante el tiempo de almacenamiento (15 días a 6°C).
Comportamientos similares también fueron informados por Gupta y col. (2012), Prakash y col.
(2000a; 2000b), quienes estudiaron el efecto de la irradiación sobre la microbiota nativa de otras
verduras.
Adicionalmente, se pudo destacar que inicialmente, a día 2, no hubo diferencias significativas

(p>0,05) entre los tratamientos Ni100 y 1 kGy, y entre los tratamientos Ni300 y 2 kGy, para
Listeria ni BAM, mostrando reducciones muy similares (tratamientos equivalentes) respecto a las
muestras control. Por otro lado, de manera muy satisfactoria, los cuatro tratamientos combinados
(1+Ni100; 1+Ni300; 2+Ni100 y 2+Ni300) obtuvieron recuentos iniciales, a día 2, por debajo del
límite de detección tanto de Listeria como de BAM, manteniendo dicho valor hasta el día 21. Es
sabido que esta bacteriocina, como otras, también se pueden aplicar en combinación con
tecnologías no térmicas de procesamiento de alimentos con el fin de aumentar la eficacia de los
tratamientos y protección contra la proliferación de supervivientes durante el almacenamiento
(Bevilacqua y col., 2018). Calderon y col. (1999) observaron que al aumentar la concentración de
nisina o simplemente su incorporación como método combinado junto a otra tecnología de
preservación, el efecto pasaba de ser aditivo a sinérgico. McNamee y col. (2010) incorporaron
nisina y natamicina en jugo de naranja procesado por tecnología PEF para inactivar
microorganismos de deterioro (P. fermentans) y patógenos (E. coli y Listeria spp.). Las
combinaciones de nisina y PEF mostraron el mayor efecto sinérgico sobre los niveles de
microorganismos estudiados. Sokołowska y col. (2012) utilizaron HHP con nisina para inactivar
esporas de Alicyclobacillus acidoterrestris (más de 6 log) en jugo de manzana. Zhao y col. (2013)
trataron el jugo de pepino por HHP con nisina, obteniendo así una vida útil más larga en
condiciones refrigeradas en comparación con otras muestras. Li y col. (2012) evaluaron la
combinación DPCD (dióxido de carbono en fase densa) + nisina en jugo de lichi (o lechias, fruta
tropical proveniente de un árbol originario del sur de China) y como resultado lograron la
inactivación completa de bacterias aerobias, sin embargo, no se observó ningún efecto
significativo de la nisina frente a la inactivación de levaduras y mohos. En otro estudio, Bi y col.,
(2014) combinaron DPCD y nisina para inactivar E. coli en jugo de zanahoria. El DPCD mejoró
la sensibilización de E. coli, bacterias Gram negativas, frente a la acción de la nisina, y además,
el tiempo de inactivación completa se redujo en 2,5 a 5 min. Por lo tanto, la aplicación de nisina,
un antimicrobiano con acción disruptiva de la pared celular de los MO (Jagus y col., 2016), en
combinación con el método de irradiación que involucra un mecanismo de inactivación
microbiana por daño directo (roturas de una o dos hebras de ácidos nucleicos) o indirecto
(radicales de hidroxilo que se originan a partir de la radiólisis del agua) al ADN (Sommer y col.,
2001) y posiblemente algo de inactivación de proteínas (Lado y col., 2002), ha logrado resultados
muy prometedores.
Finalmente, es importante destacar que los resultados obtenidos en este estudio son de gran
relevancia ya que aunque L. innocua no pudo desarrollarse en las muestras control probablemente
porque la propia acidez de la bebida limitó su crecimiento, es sabido que alimentos con un número
80
Resultados
entre 10 y 1000 células bacterianas de L. monocytogenes, representan un alto riesgo ya que son
suficientes para desarrollar la enfermedad de listeriosis humana (McLaughlin y col, 2004; Tomás-
Callejas y col., 2011; FDA, 2012). En este sentido, se encontraron resultados altamente
prometedores a partir de la combinación de irradiación gamma y nisina que lograron reducir los
recuentos de Listeria a valores por debajo del límite de detección desde el inicio de la evaluación
(día 2), sin observarse recrecimientos. En función de estas observaciones (sumado los ensayos
previos realizados en la sección 4.1.1.a.), se propuso la realización de nuevos ensayos utilizando
dosis menores en los tratamientos combinados. Dado que en este trabajo las combinaciones con
las dosis estudiadas fueron muy efectivas, es posible que se puedan reducir mucho más las
intensidades y conseguir resultados similares. Sumado a esto, es necesario realizar estudios
relacionados con el impacto de los tratamientos sobre atributos de calidad sensorial y nutricional.
Sin embargo, pese que, hasta el momento no se ha podido avanzar con esta línea de la
investigación por el cierre de los laboratorios de CNEA debido a la pandemia COVID-19, los
próximos ensayos están programados para realizarse ni bien se apruebe su apertura.
4.3. TRATAMIENTOS DE ULTRASONIDO PARA LA

4.3.1. Efecto de tratamientos de ultrasonido sobre la calidad del batido
En primer lugar, los ensayos de ultrasonido (US) comenzaron llevando a cabo pruebas para
definir los parámetros de proceso y condiciones operativas adecuadas para su procesamiento, con
el objetivo de desarrollar un método de preservación y conservación que resulte eficiente para el
tratamiento de jugos y batidos.
El US ha sido ampliamente utilizado en tratamientos de jugos, analizando e interactuando

múltiples variables como son la potencia (W), amplitud (%), frecuencia (kHz), tiempo (t),
temperatura (T), etc. Por ejemplo, en jugos de bayas rojas y azuladas (200W; 70% y
100%; 20kHz; 10 y 15 min; 25°C) (Farhadi Chitgar y col., 2017), jugo de arándanos (500W; 40%
a 100%; 20kHz; 25°C) (Mohideen y col., 2015), jugo de calabaza (500W; 70%;20 a 50kHz; 30
min; 25°C) (Bhat y Sharma, 2016), jugo de moras negras (650W; 20kHz; 30 min; 20°C) (Jiang y
col., 2015), jugo de zanahorias (100W; 50%; 20kHz; 15 min; 30°C) (Khandpur y col., 2015),
entre otros (Bevilacqua y col., 2018). Sin embargo, se encuentran pocos trabajos relacionados con
su aplicación en matrices más complejas como son los batidos, por ejemplo, un batido de
manzana, plátano, naranja y fresa (1500W; 40% a 100%; 20kHz; 3 y 10 min) (Keenan y col.,
2012b), debido a que su consumo se ha extendido recientemente como parte de las tendencias
hacia el consumo de alimentos más nutritivos y naturales. Su complejidad radica no solo en el
hecho de estar compuesto por una mezcla de varias frutas y verduras (F&V), sino que además al
no tener en su proceso una etapa de filtrado, mantiene las fibras naturales de las F&V, un mayor
contenido de sólidos y por ende una textura más consistente. Al tratarse el ultrasonido de un
método que ha obtenido resultados tan prometedores en jugos de F&V, se consideró de interés el
estudio y optimización de los parámetros de proceso para su aplicación en batidos.
En este primer ensayo se tuvo en cuenta el impacto de algunas variables cruciales como la
temperatura y la potencia aplicadas a través de la variación de la amplitud de las ondas
81
Resultados
ultrasónicas. Como fue mencionado anteriormente, el efecto de los tratamientos, además, va a

depender de la composición del batido y particularidades de la matriz, y serán evaluados sobre
los atributos de calidad y en la inactivación de la microflora nativa (mesófilos, enterobacterias y
mohos y levaduras).
a. Perfil térmico
El incremento de la temperatura en el medio líquido causado por el ultrasonido es atribuido a

la cavitación producto de la formación y colapso de microburbujas que liberan grandes cantidades
de energía (Raviyan y col., 2005; Sulaiman y col., 2015). Algunos autores han demostrado que
estas cavitaciones y colapsos generan puntos calientes localizados con temperaturas alrededor de
5000K y presiones alrededor de 500 atm junto con turbulencias líquidas y efectos de alto
cizallamiento (Piyasena y col., 2003). En sistemas similares, otros reportan que las altas
temperaturas locales instantáneas son > 5000°C y presiones >1000 atm (Kanthale y col., 2003).
Se muestran en la Figura 4.3 los distintos perfiles térmicos que han resultado de los diferentes
tratamientos evaluados con diferentes amplitudes y con o sin baño de hielo (30%, 50%, 100%,
30%+H, 50%+H y 100%+H). En principio, se puede destacar que, durante todo el tiempo de
tratamiento, en las muestras tratadas con las potencias más bajas y con baño de hielo (30%+H y
50%+H) se mantuvieron temperaturas menores a 25ºC, lo que asegura que no se está incorporando
un efecto térmico en el tratamiento. Esto demuestra que el control de temperatura (atemperado a
través de baño de hielo) ha resultado satisfactorio logrando mantener la temperatura por debajo
de los 40°C, siendo entre 40 y 50°C el rango de temperatura crítica para la pérdida de nutrientes
(Salleh Mack y col., 2007); exceptuando de este caso al tratamiento 100%+H, que se mantuvo en
temperaturas menores a 25ºC durante los primeros 4 min, y luego se disparó sobrepasando los
40°C en unos pocos minutos (aun notándose el hielo sin derretir en el baño). En estudios similares
realizados en jugos de frutas como naranja y lima, o vegetales como zanahoria y espinaca
(Khandpur y col., 2015), también debieron mantener la temperatura por debajo de 30°C utilizando
un baño de hielo alrededor del contenedor (vaso de 250 mL) del jugo, ya que, de no hacerlo, ésta
sobrepasaba los 50°C. Los autores trabajaron con variables ultrasónicas de procesamiento de
100W, 20 kHz y ciclo de trabajo del 50%, con tiempo de tratamiento de 15 minutos. De esta
forma, este atemperado aseguró que la desactivación microbiana resultante en el sistema de
ultrasonido se debiera solo a los fenómenos de cavitación y no a efectos térmicos (Khandpur y
col., 2015). Cao y col. (2018) reportaron que la temperatura final de un jugo de arándano después
de 2-10 minutos de tratamiento con ultrasonido usando una intensidad de 90-452 W/cm2 fue
indefectiblemente más alta que la de los jugos tratados por ultrasonido con control de temperatura
bajo las mismas condiciones. El tratamiento con atemperado a 452 W/cm2 durante 10 min dio
como resultado una temperatura final de 61℃ en el jugo de arándano, mientras que el mismo
experimento sin enfriamiento resultó en una temperatura final de 75,2℃, con lo cual se vio que
usando un baño de hielo se logran temperaturas menores durante tratamiento de sonicación.
También Golmohamadi y col. (2013) informaron que la temperatura del puré de frambuesa roja
tratado por ultrasonido y ultrasonido con enfriamiento, durante 30 minutos, aumentó a 83,3℃ y
55,4℃, respectivamente.
Con respecto a los sistemas sin control de temperatura solo aquel sometido a la potencia de
tratamiento más baja (amplitud 30%) logró mantenerse en temperaturas que permitirían
asegurarnos la independencia de los efectos térmicos. Por otro lado, los batidos correspondientes
82
Resultados
a los tratamientos de 100% y 50% alcanzaron temperaturas mayores a 40ºC, desde los 2 y 5
minutos, respectivamente, previéndose un menor valor en la calidad nutricional junto con una
mejor performance en la inactivación de enzimas y microorganismos debido a las temperaturas
alcanzadas, al igual que para el sistema 100%+H. Cabe mencionar que en el caso del tratamiento
100% se decidió cortar el mismo antes de tiempo (a los 9 min) porque la temperatura estaba muy
cercana a la de ebullición, incluso empezándose a observar la formación de burbujas en el mismo,
viraje del color a tonalidades amarronadas y liberación de aromas a cocido.
Perfil térmico
100
90
Temperatura del batido (°C)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (min)
100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Figura 4.3 - Perfil térmico en muestras del batido tratadas con US a

diferentes porcentajes de amplitud (%), sin control de temperatura (100%, 50%
y 30%) y con control de temperatura (100%+H, 50%+H y 30%+H), a día 0.
b. Indicadores de calidad
i. pH
Los tratamientos evaluados no afectaron significativamente el valor de pH inicial de las

muestras, a día 0, resultando en un valor promedio de 3,89±0,02. Estos valores obtenidos son
semejantes a los encontrados en otros batidos de frutas y/o verduras, por ejemplo, jugo de
manzana (pH 3,78) y jugo de manzana y frambuesa (pH 3,75) (Sado y col., 1998), jugos de
manzana y naranja (pH 3,5) (Ferrante y col., 2007), jugo de piña (pH 3,65) (Bevilacqua y col.,
2015), que son considerados productos de una acidez elevada (pH < 4), o ya sea del mismo batido
tratado en esta Tesis que ha presentado una variación en el valor de pH que va desde 3,76 a 3,81
en los ensayos de Fernández y col. (2018) o de 3,89 (sección 4.2.2.) a 4,21 (sección 4.4.2.a.). La
variación en el pH hallada en este trabajo de Tesis puede deberse a la variabilidad de la materia
prima utilizada, origen, estación del año, madurez, frescura, entre otros parámetros de calidad. A
su vez, no se notaron mayores diferencias en los valores de pH durante el tiempo de
almacenamiento, observándose a día 15, para todos los casos, un valor promedio de 3,92±0,03.
83
Resultados
De manera similar, según Bhat y Sharma (2016) distintos tratamientos variando amplitud y
frecuencia (500 W; 50% a 90%;50 kHz; 10 a 30 min y 500 W; 70%; 20 a 50 kHz; 30 min; 25 °C)
no mostraron una disminución significativa del pH en un jugo de calabaza. Zhang y col. (2016)
tampoco han hallado diferencias significativas en el pH de muestras de vino tinto sometidas a
intensos tratamientos de ultrasonido, las cuales fueron tratadas a frecuencias de 45, 80 y 100 kHz,
bajo distintos niveles de potencia (120, 150, 180, 210, 240, 270 y 300W) y además, con el fin de
investigar los efectos del tiempo de exposición al ultrasonido en el vino, se ensayaron diferentes
tiempos de tratamiento incluyendo 20, 40, 60, 80 y 100 minutos. Los resultados ilustraron la
existencia de cambios significativos en características cromáticas, conductividad eléctrica y
compuestos fenólicos totales, mientras que el pH y la acidez prácticamente no cambiaron excepto
en las muestras tratadas con altas temperaturas (60°C) (Zhang y col., 2016).
ii. Sólidos Solubles Totales (SST)
Los tratamientos evaluados no afectaron significativamente el valor de sólidos solubles totales

(SST) inicial de las muestras, a día 0, presentando todas las muestras un valor promedio de
11,10±0,32 °Brix. Estos resultados condicen con otros estudios donde se han tratado diferentes
matrices vegetales con ultrasonido con y sin control de temperatura. Por ejemplo, teniendo en
cuenta las temperaturas empleadas, la termosonicación (1500W; 20Hz; 80%; 15 y 25 min, <60°C)
empleada sobre un jugo de pera espinosa morada mostró mínimas diferencias en SST (Cruz y
col., 2015); Farhadi Chitgar y col. (2017) no obtuvieron diferencias significativas entre los jugos
de bayas rojas sonicados (200W; 70% y 100%; 20kHz; 10 y 15 min; 25°C) y los tratados con
procesos térmicos a 90°C por 1 min; tampoco se reportaron diferencias significativas en SST en
jugos de pomelo (70%; 28Hz; 0-90 min; 20°C) (Aadil y col., 2015a), jugos de arándanos
(500W; 40% a 100%; 20kHz; 25°C) (Mohideen y col., 2015), jugo de banana (40 kHz; 50W; 0-
30 min) (Bora y col., 2017), jugo de fresa (25 kHz; 0, 15 y 30 min a 20 ℃) (Bhat y Goh, 2017) y
jugo de zanahoria y uva (20 kHz; 525 W; 70%) (Nadeem y col., 2018), independientemente de la
intensidad (% de amplitud) ultrasónica, el tiempo de procesamiento y temperaturas alcanzadas
(25-60°C) (Cheng y col., 2007; Tiwari y col., 2008; 2009; 2010). Los valores en °Brix obtenidos
en este ensayo de Tesis, también coincide con resultados de estudios previos sobre el mismo
batido (jugo de naranja, manzana, zanahoria, hojas y tallo de remolacha) tratado con procesos de
altas presiones (HPP, High Pressure Processing), hasta 900 MPa a temperatura ambiente (21-
24°C) por Fernández y col. (2018). En cuanto al tiempo de almacenamiento, los valores de °Brix
no mostraron mayores diferencias, siendo a día 15 el valor promedio de todos los tratamientos
11,00±0,12 °Brix. De acuerdo con esto, Cruz y col. (2015) reportaron que los jugos sonicados a
80% durante 25 minutos no presentaron diferencias significativas en °Brix a los 28 días de
almacenamiento. Rivas y col. (2006), quienes trabajaron con tecnología no térmica de campos
eléctricos pulsantes (PEF) sobre un jugo de naranja y jugo de zanahoria, informaron cambios no
significativos en los sólidos solubles totales, durante el almacenamiento a 2°C por 10 semanas (o
almacenamiento a 12°C por 8 semanas). En general, se puede decir que el procesamiento con
ultrasonido permite mantener mejor el perfil de SST (o carbohidratos en general) en comparación
con los habituales tratamientos térmicos de pasteurización (Rivas y col., 2006). Numerosas
investigaciones confirman que el método convencional de procesamiento térmico puede resultar
en pérdidas significativas de sólidos solubles, principalmente azúcares. Como ejemplo de ello,
durante el escaldado de zanahorias por 5 minutos, se ha informado alrededor del 62,5% de pérdida
de azúcar (Machewad y col., 2003), o durante 7 minutos mostró una pérdida del 24 y 38% de
84
Resultados
sólidos solubles y carbohidratos, respectivamente (Nyman y col., 2005). Por otro lado, algunos
autores también reportaron que un aumento en el tiempo de procesamiento (lo que conlleva a un
posible aumento consecuente de temperatura (Cao y col., 2018)) y un largo tiempo de
almacenamiento, las matrices vegetales podrían sufrir una disminución significativa en el
contenido de azúcares, lo que puede atribuirse a la utilización de éstos como fuentes de energía y
sustratos en los procesos metabólicos de la microbiota (Rocha y col., 2003; Khandpur y col.,
2015).
iii. Actividad enzimática
En cuanto al estudio de la actividad enzimática, los resultados se muestran en la Figura 4.4

donde se puede evidenciar la actividad de las enzimas presentes en las muestras. Los tratamientos
100%, 50% y 100%+H fueron los que lograron las reducciones más destacables, en las actividades
de todas las enzimas evaluadas. Éstas fueron de 99,9%, 98,5% y 87,3% con 100% de amplitud,
de 53,0%, 21,2%, 0,0% con 50% y de 31,4%, 17,2% y 11,9% para el tratamiento 100%+H en
peroxidasa (POD), polifenoloxidasa (PPO) y pectinmetilesterasa (PME), respectivamente. En
base a esto, posiblemente las reducciones se encuentran condicionadas por las temperaturas
alcanzadas, ya que como se mostró en la Figura 4.3 el tratamiento de 100% presentó un aumento
constante de temperatura hasta 85°C (116W) hasta los 9 minutos de estudio, el tratamiento de
50% llegó a los 69°C (44W) y el de 100%+H hasta 52°C (162W), ambos a los 15 minutos.
Cao y col. (2018), quienes trabajaron sonicando un jugo de arándanos, reportaron que la
actividad de PPO se redujo presentando valores del 53,23% y 12,84%, de la actividad inicial, a
90 y 181 W/cm2 durante 10 minutos sin control de temperatura, respectivamente. Estos autores
vieron que con el aumento de la intensidad o el tiempo de ultrasonido, la tasa de inactivación de
la PPO aumentó drásticamente. De esta forma, reportaron que la actividad residual de PPO fue de
solo 4,22% y 0,08% cuando se trató a una mayor intensidad (271 y 362 W/cm2) durante 8 minutos.
Además, la PPO se inactivó completamente a 452 W/cm2. Por otro lado, luego de los 10 minutos
de tratamiento, a 452 W/cm2, pero con control de temperatura la PPO se inactivó de manera
relativamente más lenta en comparación a lo mencionado anteriormente, mostrándose una
actividad residual de 3,28%. Por lo cual, los autores también atribuyeron las diferentes tasas de
inactivación de PPO a las temperaturas alcanzadas en el jugo de arándano sonicado.
Adicionalmente, el efecto sinérgico del calor y la energía ultrasónica sobre la inactivación
enzimática ya fue informado en estudios anteriores. Sulaiman y col. (2015) encontraron que los
valores residuales de PPO luego del tratamiento con US (32°C) fueron 58%, 59% y 25% para
frutas como pera, manzana y fresa, respectivamente, mientras que al aumentar la temperatura de
tratamiento a 52 y 72 ℃, la actividad de PPO disminuyó rápidamente. Cheng y col. (2013)
también observaron que el ultrasonido usado en combinación con calor suave podría mejorar la
inactivación de PPO en el extracto crudo de hongos donde las constantes de velocidad aumentaron
de 0,040 min-1 a 55 ℃ a 2,617 min-1 a 75 ℃. Los resultados sugirieron que el aumento de la
temperatura fue un factor que contribuyó de manera importante en la desnaturalización de la
enzima durante el tratamiento con ultrasonido.
85
Resultados
a) PPO
30
Actividad enzimática (1/min)

25
20
15
10
0
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
b) POD
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
c) PME
35
30
25
20
15
10
0
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
Figura 4.4 - Actividad de las enzimas a)PPO, b)POD y c)PME en muestras

control y muestras tratadas con US a diferentes porcentajes de amplitud (%),
sin control de temperatura (100%, 50% y 30%) y con control de temperatura
(100%+H, 50%+H y 30%+H), a día 0.
86
Resultados
Continuando con la revisión de los resultados, de acuerdo con la bibliografía sobre diferentes
aplicaciones de ultrasonidos en alimentos (López y col., 1994; Costa y col., 2006; Lemoine y col.,
2007; Jang y col., 2009; Cao y col., 2018), es sabido que es necesario optimizar los diferentes
parámetros, como la potencia aplicada, el tiempo de tratamiento, la temperatura, entre otros;
teniendo en cuenta los objetivos de cada ensayo. Por ejemplo, se podría dar el caso contrario a la
desactivación enzimática, éste corresponde a la intensificación de reacciones enzimáticas. Según
Cao y col. (2018) se requiere una aplicación de ultrasonido controlada que actuaría como estímulo
para activar la enzima en lugar de desactivarla. En los tratamientos llevados a cabo en esta Tesis
se pudo identificar que aquellos más suaves, con control de temperatura (<25°C), obtuvieron una
actividad residual enzimática de 98%, 115,7% y 101,9% con 50%+H y de 97,5%, 137,9%, 110%
con 30%+H en POD, PPO y PME, respectivamente. Engmann y col. (2014), quienes trataron un
jugo de moras con ultrasonido notaron que en general, la inactivación de PPO se redujo a medida
que aumentaron la frecuencia ultrasónica (22, 24 y 26 kHz) y el tiempo de tratamiento (10, 20 y
30 min), lo que indicaría una relación inversa. De esta forma, Engmann y col. (2014) observaron
que la inactivación más alta se registró a 22 kHz durante 10 minutos, mientras que la más baja se
obtuvo para el tratamiento a 26 kHz durante 30 minutos. La razón que reportan los autores en
cuanto al aumento de la actividad de PPO a los 30 minutos comparando los 10 minutos para cada
nivel de frecuencia es que puede deberse a la activación de isoenzimas de PPO latentes por el
proceso de ultrasonido.
En cuanto a la actividad de POD, Cao y col. (2018) reportaron que la inactivación registrada
para esta enzima, teniendo en cuenta los aumentos de potencia y temperaturas, fue similar al caso
de la PPO; sin embargo, notándose en POD una mayor actividad residual. De forma similar,
Engmann y col. (2014) constataron que con los niveles de frecuencia y tiempo elegidos en su
trabajo, la actividad de POD no se redujo significativamente en un grado apreciable. Además,
Mason y col. (1996) demostraron cierta resistencia de POD a la inactivación, de modo que en sus
ensayos, recién luego de 3 horas de ultrasonido lograron una reducción de la actividad de POD
en un 90%. Por otro lado, Cruz y col. (2006) observaron un aumento en la actividad de POD de
los berros (Nasturtium officinale) sometidos a ultrasonidos (20kHz, 50% de la potencia máxima
y 40°C), según los autores el aumento de la actividad enzimática con ultrasonidos, a bajas
temperaturas, podría estar relacionado con el cambio de conformación de la enzima a una mayor
interacción enzima-sustrato, y consecuentemente a una etapa óptima de consumo del sustrato.
En el caso de la actividad de la enzima PME, como fue mencionado al comienzo de esta

sección, fue la que obtuvo mayor actividad residual frente a los tratamientos evaluados,
comparando con los valores obtenidos para la muestra control. Por un lado, comparando los
tratamientos 100% y 100%+H se pudo ver que habiendo empleado la misma amplitud hubo cierta
influencia de la temperatura, ya que se ha obtenido una mayor reducción con la temperatura
alcanzada de 85°C (con 100%) que a 52°C (con 100%+H). Sin embargo, el tratamiento 50% que
también ha alcanzado temperaturas elevadas, llegando a 69°C al final del procesamiento, no logró
mayores reducciones; con lo cual se podría pensar que si bien la temperatura ayudó en la
desactivación enzimática de la PME, también fue necesario el empleo de la máxima amplitud. En
otros trabajos similares, como el de Koshani y col. (2014) quienes trabajaron con ultrasonido (60-
100W) sobre un jugo de naranja, evidenciaron que el efecto de la temperatura fue más
significativo que otras variables sobre la actividad residual de la enzima PME. Observaron efectos
sinérgicos sobre la inactivación de esta enzima en el tratamiento combinado de calor y
ultrasonido. En el rango de temperatura entre 60-70°C, la combinación de sonicación y calor
mostró un efecto sinérgico mucho mayor en el proceso de inactivación de la enzima en
comparación con el rango de temperatura más bajo (40-60°C) y la inactivación térmica sola. Los
87
Resultados
autores también encontraron que las condiciones óptimas para la inactivación de PME con el
proceso de termosonicación fueron de 80W durante 9,8 min a 63°C, de forma que sus resultados
indicaron que la termosonicación del jugo de naranja podría inactivar por completo esta enzima.
La PME es una de las enzimas más predominantes y resistentes al tratamiento térmico (Miller y
Silva, 2012), ésta hidroliza los enlaces metiléster del polímero de pectina produciendo la
liberación de grupos carboxílicos, que reaccionan con los iones Ca+2 desestabilizando el sistema,
con la subsiguiente pérdida de turbidez (clarificación con formación de dos fases) en el jugo
natural y gelificación en jugo concentrado (Ferrario y col., 2016). La inhibición de las enzimas,
especialmente de PME, estabiliza la pulpa en suspensión, manteniendo la turbidez de los jugos,
factor de calidad importante para la aceptación por parte del consumidor. Sin embargo, las altas
temperaturas necesarias para la inactivación de enzimas, donde la práctica comercial
recomendada considera un tratamiento a 90ºC durante 60 segundos, tienen un impacto negativo
sobre otras características sensoriales y nutricionales, respecto del jugo fresco (Famworth y col.,
2000). El daño en las propiedades sensoriales y nutricionales de los jugos procesados debido a la
acción de tratamientos térmicos tradicionales ha centrado el interés en nuevos métodos de
preservación sin el uso de calor o al menos sin la intensidad de los tratamientos convencionales.
Sin embargo, el ultrasonido, por sí solo, a temperaturas suaves (T<50°C) no es efectivo contra
varias enzimas alimentarias (Tiwari y col. 2008, 2009; Koshani y col., 2014). Con respecto a los
resultados encontrados en esta Tesis para PME, apoyan esta hipótesis encontrándose una mayor
eficiencia en la inactivación de la enzima cuando no se utilizaron baños de hielo para controlar el
ascenso de la temperatura.
iv. Contenido de polifenoles totales (CPT) y capacidad antioxidante (DPPH y FRAP)
CPT. Se muestran en la Figura 4.5 los resultados obtenidos de CPT según los distintos
tratamientos aplicados. El valor de CPT en el batido sin tratar fue de 58,90±0,24 mg AG/100mL
de batido, observándose, en general, un incremento de este valor luego del tratamiento con US,
presentándose el mayor aumento (del 22%) para el tratamiento de 50%+H comparando con la
muestra control. El aumento de fenoles totales por ultrasonido puede ser causado por la rotura
mecánica de la pared celular, lo que lleva a una mayor extractabilidad de estos compuestos, como
antocianinas, aminoácidos y proteínas con grupo hidroxilo fenólico después del tratamiento, ya
que el molibdeno (Mo6+) y wolframio (W6+) se reducen a Mo2＋ o W2＋ por estas sustancias
oxidantes en el método Folin Ciocalteau (Cao y col., 2012). Resultados similares fueron
reportados por Cao y col. (2018) donde el tratamiento con ultrasonido dio como resultado una
tendencia al aumento de los fenoles totales en el jugo de arándano y esta tasa de aumento dependió
de la potencia y el tiempo del tratamiento. Los autores demuestran que se detectó un aumento del
3,55 al 9,57% de los fenoles totales en el jugo sonicado a más de 181 W/cm 2 por 10 minutos, y
que a niveles de amplitud y tiempo de tratamiento más bajos, los cambios no fueron significativos.
Estas observaciones, como las halladas en esta Tesis, fueron similares también a varios estudios.
Entre ellos, Golmohamadi y col. (2013) no observaron cambios significativos en los fenoles
totales del puré de frambuesa roja a bajas frecuencias de ultrasonido, excepto en la sonicación a
986 kHz durante 30 minutos, donde hubo un aumento del 10,9%. Jabbar y col. (2014) observaron
un aumento del 3,15% de los fenoles totales en el jugo de zanahoria tratado mediante sonicación
a 24 kHz, 120 µm de amplitud y 10 minutos. A su vez, en el estudio de Cao y col. (2018) se pudo
encontrar que los fenoles totales en el jugo de arándano tratado con US controlando la temperatura
era más alto que el de las muestras tratadas sin control de temperatura cuando se trataba con la
88
Resultados
misma potencia y tiempo de sonicación, lo que indicó que el enfriamiento durante el tratamiento
con ultrasonido era beneficioso para mantener los compuestos fenólicos en el medio líquido.
También, Tiwari y col. (2009) observaron una retención significativa del contenido de fenoles
(>94%) bajo las condiciones máximas de tratamiento a un jugo de moras empleando un porcentaje
de amplitud de 100% durante 10 minutos y T=25°C, de modo que demostraron una elevada
estabilidad de estos compuestos fenólicos (propios del jugo) durante la sonicación.
Por el contrario, en el estudio de Khandpur y col. (2015) se observó que un tratamiento

prolongado con potencia ultrasónica de más de 100W y un tiempo de tratamiento superior a los
15 min, redujo el contenido de ácido ascórbico y compuestos fenólicos con una ligera disminución
en los atributos sensoriales. Rawson y col. (2010) informaron que la temperatura de sonicación
jugó un papel importante en la preservación de compuestos bioactivos, ellos observaron una
disminución en el contenido fenólico del jugo de sandía sonicado cuando la temperatura se
incrementó de 25 a 45°C. El efecto de la temperatura fue más pronunciado en tiempos de
procesamiento más prolongados (por ejemplo, 10 min). En esta Tesis, resulta interesante destacar
que ninguno de los tratamientos analizados (Figura 4.5) generó reducciones en el contenido de
CPT.
CPT
90.00
80.00
mg AG/100 mL batido
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
Figura 4.5 - Contenido de polifenoles totales en muestras control y

muestras tratadas con US a diferentes porcentajes de amplitud (%), sin
control de temperatura (100%, 50% y 30%) y con control de temperatura
(100%+H, 50%+H y 30%+H), a día 0.
Finalmente, Fernandez y col. (2018) trabajando sobre el mismo batido determinaron el

contenido total de fenoles de las muestras tratadas con altas presiones hidrostáticas y mostraron
que los valores oscilaban entre 62,07±0,91 y 68,33±1,35 mg AG/100mL de batido, presentándose
un aumento alrededor de un 10% después del tratamiento. Según Chen y col. (2013), para los
tratamientos con alta presión, el aumento de CPT podría estar relacionado con el hecho de que
durante la etapa de compresión, el volumen del sistema tiende a reducirse, el solvente extractor
ingresa a las células para interactuar con los componentes bioactivos y las células presurizadas
muestran una mayor permeabilidad, por lo tanto, un aumento extracción de algunos componentes.
De forma similar, como lo informan algunos, entre tantos, autores (Bevilacqua y col., 2018; Das
y Eun, 2018) las técnicas de US generan altas presiones localizadas y podría afectar directamente
a los componentes celulares vegetales liberando ciertos compuestos de interés.
89
Resultados
DPPH. Se muestran en la Figura 4.6 los resultados obtenidos de actividad antioxidante

mediante la técnica de DPPH. De acuerdo con los valores obtenidos, si bien estos fueron similares
para todos los tratamientos, se puede destacar que el tratamiento de 100% ha dado los mejores
resultados en cuanto a la actividad antioxidante de los componentes del batido. De esta forma, se
puede mencionar que la capacidad antioxidante no se vio afectada por el aumento de temperatura
(final de 85°C) que se registró en esta muestra. Los tratamientos 100% y 50%+H fueron los únicos
que presentaron aumentos en DPPH de 13% y 5%, respectivamente en comparación con la
muestra control. Esto podría atribuirse a la adición de radicales hidroxilo (-OH) generados
sonoquímicamente al anillo aromático de los compuestos fenólicos que se ha informado que
mejoran el poder antioxidante (Ashokkumar y col., 2008; Bhat y col., 2011), o bien al
desencadenamiento de reacciones poliméricas que sufren los fenoles resultando en el aumento de
capacidad antioxidante (Jiang y col., 2014). Por otro lado, en cuanto al efecto de la temperatura,
los polifenoles y otros compuestos bioactivos se degradan enzimáticamente en presencia de la
enzima polifenoloxidasa. Esta enzima puede inactivarse mediante calentamiento suave y, por lo
tanto, algunos autores han informado que la inclusión de un paso de calentamiento
(aproximadamente a T de 50°C) puede tener un efecto positivo sobre la retención de compuestos
fenólicos. Por ejemplo, Skrede y col. (2000) demostraron que la adición de un extracto de pulpa
de arándano tratado con temperatura al jugo de arándano no producía degradación de las
antocianinas, mientras que la adición de un extracto sin tratamiento provocaba una pérdida del
50% de antocianinas, lo que sugiere un papel enzimático en la degradación de las antocianinas,
compuestos que podrían ser responsables de la actividad antioxidante.
En cuanto a los demás tratamientos (50%, 30%, 100%+H y 30%+H), todos ellos presentaron
leves disminuciones en la capacidad de captación de radicales libres. Es interesante destacar que
pese a que dichos tratamientos obtuvieron aumentos en CPT, esto no se vio reflejado en un
aumento para DPPH. De acuerdo con algunos autores (Jiang y col., 2014; Khandpur y col., 2015),
esto puede ser causa de posible degradación de otros nutrientes o compuestos bioactivos como
las antocianinas o ácido ascórbico, entre otros nutrientes que se encuentran principalmente en
frutas y verduras (Khandpur y col., 2015). Estos resultados también concuerdan con los de otros
investigadores (Amakura y col., 2000; Piljac Zegarac y col., 2009; Jiang y col., 2014) que no
observaron una correlación significativa entre el contenido fenólico total y la actividad de
captación de radicales de DPPH, en grosellas (del género Ribes), granadas, cerezas, algunas
especies de bayas y jugo de moras negras, con lo cual también se puede deber a la implicancia de
otros compuestos como se mencionó anteriormente. De esta forma, para explicar las reducciones
en capacidad antioxidante producidas por sonicación, se podrían proponer dos mecanismos
principales de reacción química para la degradación de compuestos bioactivos. El primer
mecanismo es la pirólisis dentro de las burbujas o núcleos de cavitación, estas son burbujas muy
pequeñas que flotan libremente en las bolsas de líquido o gas atrapadas en las grietas de los límites
sólidos en el medio líquido; probablemente sea la ruta de reacción principal para la degradación
de compuestos bioactivos polares. Y el segundo mecanismo, es la degradación de compuestos por
la formación de radicales libres durante la sonicación (Portenlänger & Heusinger, 1992). Se
encuentra que la formación de radicales hidroxilos aumenta con la desgasificación. Las cavidades
de sonicación se pueden llenar con vapor de agua y gases disueltos en el alimento líquido, como
O2 y N2 (Korn y col., 2002). Las interacciones entre los radicales libres y compuestos con poder
antioxidante, como el ácido ascórbico, pueden ocurrir en las interfaces gas-líquido. En resumen,
la degradación del ácido ascórbico puede seguir una o ambas de las siguientes vías: (1) Ácido
ascórbico → termólisis (burbujas internas) y activación de Reacción de Maillard. (2) La
90
Resultados
generación de radicales -OH (H2O → OH + -H) posteriormente oxida los compuestos orgánicos
polares (ácido ascórbico, fenoles totales) (Rawson y col., 2011a).
Sin embargo, teniendo en cuenta otros estudios, se informa que el tratamiento con ultrasonidos
de los jugos de frutas tiene un efecto mínimo sobre el contenido de ácido ascórbico durante el
procesamiento y da como resultado una estabilidad mejorada durante el almacenamiento en
comparación con el tratamiento térmico (Rawson y col., 2011a; 2011b). Se supone que este efecto
positivo del ultrasonido en comparación con el calentamiento se debe a la eliminación efectiva
del oxígeno ocluido del jugo (Knorr y col., 2004) ya que este es un parámetro crítico que influye
en la retención de ácido ascórbico. Futuros estudios podrían orientarse al estudio específico del
efecto de los tratamientos aquí evaluados sobre el ácido ascórbico. Con respecto a las frutas
exóticas, Cheng y col. (2007) informaron un aumento significativo en el contenido de ácido
ascórbico del jugo de guayaba durante la sonicación de 110±0,5 (fresco) a 119±0,8 (sonicación)
y a 125±1,1 (sonicación y carbonatación combinadas) mg AG/100mL que podrían deberse a los
efectos de las cavitaciones causadas por la carbonatación y la sonicación, respectivamente. Los
autores también observaron que durante la carbonatación, la temperatura de la muestra disminuyó
sustancialmente, lo que podría haber desfavorecido la degradación del ácido ascórbico. Rawson
y col. (2010) investigaron el efecto de la termosonicación sobre los compuestos bioactivos del
jugo de sandía recién hecho, observando una mayor retención de ácido ascórbico y licopeno a
bajo nivel de amplitud y temperatura. También observaron un ligero aumento de licopeno a bajo
nivel de amplitud. Se informa que el procesamiento por ultrasonido mejora el rendimiento de
extracción de compuestos bioactivos en aproximadamente un 6 y un 35% (Vilkhu y col., 2008),
aunque depende de las condiciones de procesamiento.
DPPH
300
µM TROLOX/100 g batido
250
200
150
100
50
0
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
Figura 4.6 - Capacidad antioxidante, medida en DPPH, en muestras

control y muestras tratadas con US a diferentes porcentajes de amplitud
(%), sin control de temperatura (100%, 50% y 30%) y con control de
temperatura (100%+H, 50%+H y 30%+H), a día 0.
FRAP. Para el caso de la determinación de actividad antioxidante por el método de FRAP

(Figura 4.7), los aumentos en FRAP que se pueden destacar, fueron de 24%, 8% y 5% para los
tratamientos de 100%, 30% y 100%+H, respectivamente. De igual manera, se puede mencionar
que el efecto de la temperatura en el tratamiento de 100% no ha causado una afección negativa
91
Resultados
en el batido, de lo contrario, fue donde se obtuvo el mayor aumento de capacidad antioxidante,

tanto por FRAP como por DPPH.
Adicionalmente, teniendo en cuenta trabajos previos donde fueron sonicados productos

similares al batido tratado en esta Tesis, se obtuvieron resultados muy parecidos en cuanto al
aumento de capacidad antioxidante medida por ambos métodos (FRAP y DPPH). Por ejemplo,
en jugo de bayas rojas y azuladas (“barberry” en inglés) (200W; 70% y 100%; 20kHz; 10 y 15
min; 25°C) se obtuvo un incremento significativo en el contenido de polifenoles totales y
actividad antioxidante (Farhadi Chitgar y col., 2017), en jugo de moras negras (650W; 20kHz; 30
min; 20°C) donde se destacó una alta retención de compuestos fenólicos, antocianinas y actividad
antioxidante (Jiang y col., 2015), en un jugo de zanahorias los análisis nutricionales mostraron
que luego del tratamiento con US (100W; 50%; 20kHz; 15 min; 30°C) las muestras presentaban
valores similares al del producto fresco (Khandpur y col., 2015).
Finalmente, si bien los aumentos obtenidos no fueron significativos, tampoco se obtuvieron

grandes pérdidas en capacidad antioxidante mediante la aplicación del US. La capacidad
antioxidante de las muestras tratadas depende de una gran variedad de componentes nutricionales
propios de las matrices vegetales que se ven afectados de diferentes maneras frente a los distintos
parámetros de procesamiento con US.
FRAP
350
300
µM TROLOX/100 g batido
250
200
150
100
50
0
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
Figura 4.7 - Capacidad antioxidante, medida en FRAP, en muestras

control y muestras tratadas con US a diferentes porcentajes de amplitud
(%), sin control de temperatura (100%, 50% y 30%) y con control de
temperatura (100%+H, 50%+H y 30%+H), a día 0.
v. Contenido de betalaínas
Los resultados obtenidos se muestran en las Figura 4.8 donde se puede ver que tanto a día 0
como a día 15, el contenido de Betacianinas (Bc) y Betaxantinas (Bx) fue mayor en las muestras
tratadas, comparando con la muestra control. En primer lugar, a día 0, se destacaron las muestras
tratadas con 100% de amplitud que obtuvieron aumentos de 54% y 112%, y las muestras tratadas
con 100%+H con aumentos de 75% y 153% para Bc y Bx comparando con las muestras control,
92
Resultados
respectivamente. Estos resultados mostraron un mayor aumento de extracción a temperaturas

intermedias, de forma que el tratamiento a una temperatura alrededor de 50°C (100%+H) resultó
más eficiente que temperaturas alrededor de 85°C (100%). Algunos autores (Tang y Norziah,
2007) reportaron la alta sensibilidad de la Bc a temperaturas elevadas, notando que casi el 90%
de este pigmento se redujo con el aumento de la temperatura de 25°C a 75°C. Las betalaínas son
moléculas termolábiles y su velocidad de descomposición aumenta con la temperatura (>50°C),
lo que provoca una hidrólisis que produce ácido betalámico y ciclo-dopa-5-O-glucósido (Cruz y
col., 2015). Maran y col. (2013) estudiando el proceso de extracción de betalaínas de la pera
espinosa roja (género Opuntia), mostraron claramente que estos compuestos (y el rendimiento del
color) aumentaban con el aumento de temperatura en el rango de 30-50°C. Otros estudios (Ramli
y col., 2014), donde se realizaron extracciones de compuestos betalaínicos y otros antioxidantes
de la pitahaya roja (fruta del dragón), lograron mejores resultados en una extracción de manera
convencional a 50°C en comparación con la extracción a temperatura ambiente (25°C) con un
tratamiento por ultrasonido a 50kHz durante 30 minutos. Los resultados pueden explicarse por el
hecho de que un aumento en la temperatura de extracción provocaría el ablandamiento del tejido
vegetal, liberaría los compuestos bioactivos de los constituyentes de la matriz de manera más
eficaz sumado al aumento de la permeabilidad de las membranas celulares de las células. Además,
el aumento de temperatura podría permitir la mayor tasa de extracción al mejorar la solubilidad
del pigmento y así aumentar el coeficiente de difusión (Maran y col., 2013). De esta forma, las
temperaturas moderadas mencionadas pueden romper parcialmente el enlace del ácido betalámico
para que pueda volver a asociarse con aminoácidos precursores como la prolina, lo que lleva a
una regeneración parcial de este pigmento en el jugo (Cruz y col., 2015).
En cuanto al porcentaje de amplitud de los procesos ultrasónicos, Laqui-Vilca y col. (2018)

vieron que en el caso de la cáscara de quinua tratada con ultrasonido (100W; 20-100%; 30 kHz;
0-50 min; 20°C), el contenido total de betalaínas se incrementó con la amplitud y el tiempo de
extracción (hasta los 10 min). Es bien sabido que la intensidad ultrasónica se correlaciona
directamente con la amplitud del transductor y, en consecuencia, con la amplitud de presión de la
onda sonora. Por lo tanto, un aumento en la amplitud generalmente resulta en un aumento de los
efectos sonoquímicos y el rendimiento de extracción (Chemat y col., 2017; Maran y Priya, 2015).
Del mismo modo, un aumento en el tiempo de extracción se asocia con el aporte de energía y
mejora la extracción por ultrasonido (Chemat y col., 2017). Sin embargo, el tiempo de extracción
podría tener un efecto negativo en el contenido total de betalaínas, lo que podría estar relacionado
con una degradación de éstas por especies reactivas de oxígeno generadas por un mayor tiempo
de cavitación acústica (Laqui-Vilca y col., 2018).
A su vez, la metodología de US manteniendo una temperatura controlada, generalmente de

ambiente (25°C), también ha sido ampliamente estudiada para la extracción de pigmentos. Por
ejemplo, Farhadi Chitgar y col. (2017) vieron que al emplear una amplitud del 70% en un proceso
de sonicación (200W; 20kHz; 10 y 15 min; 25°C) de un jugo de bayas rojas y azuladas
(“barberry” en inglés) mostró menos efecto negativo sobre la antocianina total y el color del jugo,
en comparación con el tratamiento máximo al 100%. Bhat y Sharma (2016) reportaron que el
aumento de amplitud (70% durante 20 minutos) condujo a un aumento significativo de
carotenoides en un jugo de calabaza sonicado (500W; 20 a 50kHz; 30 min; 25°C).
93
Resultados
a) Bc
20.000
mg Bc/L batido 15.000
10.000
5.000
0.000
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
0 15
b) Bx
20.000
15.000
mg Bx/L batido
10.000
5.000
0.000
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
0 15
Figura 4.8 - Contenido de a) Bc y b) Bx en muestras control y muestras

tratadas con US a diferentes porcentajes de amplitud (%), sin control de
temperatura (100%, 50% y 30%) y con control de temperatura (100%+H,
50%+H y 30%+H), a día 0.
Durante el almacenamiento a 5°C por 15 días, las muestras control fueron las que mostraron
una menor retención del contenido betalaínicos tanto para Bc como para Bx, con disminuciones
del 64% y 38%, respectivamente. El tratamiento con 100% de amplitud obtuvo una disminución
menor al 1% en Bc y del 9% en Bx. Por otro lado, cabe destacar que si bien el tratamiento de
50%+H no ha logrado los mayores aumentos inicialmente (a día 0, del 38% y 63% para Bc y Bx,
respectivamente) sí ha tenido un buen poder de retención durante el tiempo de almacenamiento
estudiado, con disminuciones del 37% y 2% para Bc y Bx, respectivamente; mostrándose estos
valores porcentuales bastante menores frente a los demás tratamientos evaluados. Estudios han
asociado diferentes comportamientos de estos pigmentos betalaínicos con las condiciones de
almacenamiento, por ejemplo, en el trabajo de Fernández y col. (2017) se muestran resultados
obtenidos para estos pigmentos de muestras (hojas de remolacha) expuestas a distintas
94
Resultados
condiciones (A: 25 ± 1°C 60-62% HR y B: 5 ± 1°C 97-99 %HR), que dieron lugar a una rápida
disminución de las concentraciones de betacianinas y betaxantinas, alcanzando pérdidas en torno
al 50% al final del almacenamiento bajo condición A. Por el contrario, cuando las muestras fueron
expuestas a la condición "B", no se observaron cambios significativos para ambos pigmentos,
mostrando retenciones alrededor del 90% a los 28 días. En el caso de esta Tesis, se decidió
almacenar los batidos en refrigeración (5°C) esperando obtener mayor retención de pigmentos
betalaínicos.
Si bien los resultados en este ensayo muestran un comportamiento bastante similar entre las
Bc y Bx frente a los diferentes tratamientos aplicados, se pueden ver en la Figura 4.8.a y Figura
4.8.b algunas diferencias entre estos compuestos. En este sentido, Celli y Brooks (2016) revisaron
el efecto de diferentes condiciones de procesamiento y tecnologías sobre la estabilidad de las
betalaínas y asociaron las diferencias entre el comportamiento de las betacianinas y betaxantinas
a la estructura molecular de los pigmentos. En esta línea, diferencias entre el comportamiento de
las betalaínas podrían estar asociadas a la estructura molecular de estos compuestos que se
diferencian por los residuos adheridos a la estructura principal: las betacianinas exhiben una
estructura cerrada de ciclo-DOPA (ciclo-3,4-dihidroxi-fenilalanina) y pueden ser sustituidos con
azúcares y grupos acilo, mientras que las betaxantinas están conjugadas con aminas y
aminoácidos (Polturak y Aharoni, 2017).
En base a los estudios citados y los resultados obtenidos en esta sección, un tratamiento con
US aplicando amplitudes entre 40-100%, temperatura óptima de procesamiento posiblemente un
poco mayor a la de ambiente (25°C) y tiempos controlados de forma que no se generen
degradaciones de los pigmentos, parecerían ser los parámetros recomendables para obtener los
mejores resultados en los contenidos de betalaínas.
vi. Calidad microbiológica
Los recuentos microbiológicos a día 0 y día 15 de almacenamiento a 5ºC se muestran en la

Figura 4.9.a y Figura 4.9.b, respectivamente. A día 0, las muestras control mostraron recuentos
alrededor de 5 log UFC/mL para las bacterias aerobias mesófilas (BAM) y alrededor de 4 log
UFC/mL para enterobacterias (EB) y mohos y levaduras (M&L). Estos valores están en el orden
de los observados en estudios previos del grupo con este batido (Fernandez y col., 2018;
Fernandez y col., 2019).
Los recuentos de BAM presentaron reducciones mínimas y máximas de 0,5 y 1,6 ciclos log
para los tratamientos de 30%+H y 100%, respectivamente; y los demás tratamientos tuvieron
reducciones intermedias, viéndose una mayor disminución de los recuentos frente a la aplicación
de una mayor amplitud y temperaturas más altas (>50°C). Según D'amico y col. (2006), el
tratamiento de sonicación utilizando 20 kHz al 100% de amplitud combinado con calor suave
(57°C) durante 18 minutos mostró una reducción de 5 log en las bacterias aeróbicas totales
presentes en leche cruda y una reducción de 6 log en E. coli O157: H7 en la sidra de manzana.
Otros autores también señalaron que el efecto del ultrasonido es más pronunciado cuando se
combina con el calor (Cheng y col., 2007; McClements, 1995; Piyasena y col., 2003). Una posible
explicación podría ser que la sonicación hace que los microorganismos sean más susceptibles a
la inactivación por otros mecanismos inhibidores (temperatura, presión, pH, entre otros). He y
col. (2021) vieron que el nivel de daño morfológico dependía en gran medida de la intensidad del
tratamiento con US y el tiempo de duración del mismo. Se ha demostrado que el ultrasonido eleva
95
Resultados
la permeabilidad de la membrana a través de la sonoporación, es decir, el fenómeno de la

formación transitoria de poros en la membrana celular resultante de la cavitación acústica. Esto
puede deberse al hecho de que se genera un gran número de burbujas de cavitación cuando se
aplica un tratamiento con ultrasonidos a un medio líquido. Estas burbujas pueden expandirse y
colapsar en períodos de tiempo muy cortos, y cuando esto sucede, se liberan ondas de choque.
Como se comentó previamente, también pueden desarrollarse áreas de presión y temperatura
extremas en el medio líquido. Estos efectos son lo suficientemente fuertes como para lograr una
gran perturbación la estructura de la membrana celular, lo que permite una permeabilización
celular temporal (He y col., 2021). La literatura informa sobre un comportamiento diferente de
los distintos microorganismos frente al tratamiento de ultrasonido, las bacterias Gram positivas
son generalmente más resistentes que las Gram negativas (Drakapoulou y col., 2009) y los cocos
son más resistentes que los bacilos (Chemat y col., 2011). Además, si bien las esporas presentan
una mayor resistencia frente a los tratamientos con US, la combinación de éste con calor y presión
(mano-termo-sonicación) ha resultado más eficiente para este tipo de microorganismo (Butz y
Tauscher, 2002; Chemat y col., 2011). Además, las células más grandes son más sensibles que
las pequeñas, probablemente debido a sus áreas de superficie más grandes (Bevilacqua y col.,
2012). Adicionalmente, algunos autores aseguran que el uso de condiciones ácidas o de pH bajo
aumenta la eficacia antimicrobiana de la sonicación posiblemente atribuida a la producción
mejorada de radicales hidroxilo. Por lo tanto, los jugos con niveles de pH más bajos son más
susceptibles al tratamiento con ultrasonidos (Ross y col., 2003; Khandpur y col., 2015). Se
observó durante los estudios llevados a cabo por Khandpur y col. (2015) que en el caso del
tratamiento por ultrasonido de jugos de cítricos con valores de pH de 3,85 y 2,83 para naranja y
lima dulce respectivamente, se lograron niveles más altos de inactivación microbiana en
comparación con la inactivación microbiana de jugos de vegetales con valores de pH de 5,43 y
5,23 para el jugo de zanahoria y espinaca, respectivamente. En relación con este parámetro, el
batido tratado en esta Tesis presentó valores de pH entre 3,89 y 3,92, valores que podrían actuar
en sinergia con los tratamientos aplicados.
En cuanto a M&L, en líneas generales, se observó que los tratamientos con control de
temperatura (100%+H, 50%+H y 30%+H) obtuvieron reducciones menores a 1 log, mientras que
en aquellos donde no hubo control de temperatura (100%, 50% y 30%) las reducciones fueron
máximas mostrando recuentos por debajo del límite de detección (2,7 log UFC/mL), esto podría
indicar un aporte de la temperatura a la inactivación de M&L. Adekunte y col. (2010), quienes
estudiaron el efecto de la sonicación en el hongo P. fermentans en jugo de tomate, si bien
encontraron que tanto el nivel de amplitud como el tiempo de tratamiento resultaron ser
significativos en cuanto a la reducción de los recuentos del microorganismo, también sostuvieron
que los efectos físicos de la sonicación pueden no dar como resultado una inactivación eficaz en
levaduras debido al hecho de que estas células son relativamente rígidas y difícilmente afectadas
por la acción de la microcorriente aportada por el ultrasonido. Por otro lado, se sugirió que las
células de levadura podrían contener núcleos internos de cavitación y la sonicación podría causar
una cavitación interna, así como microcorriente interna, modificando la estructura celular. Y
además, que esta alteración de las partículas subcelulares durante la sonicación es a menudo más
rápida que la alteración de las paredes celulares y que el ultrasonido alteraba rápidamente las
mitocondrias con una fina fragmentación de la membrana (Lida y col., 2008). Adicionalmente,
de acuerdo con lo que también se vio en esta Tesis, Adekunte y col. (2010) sostuvieron que el
efecto térmico contribuía a una mayor sensibilidad de las levaduras.
96
Resultados
a) Recuentos microbianos "día 0"

9.00
8.00
log UFC/mL batido 7.00
6.00
5.00
4.00
LD
3.00
2.00
1.00
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
BAM EB M&L
b) Recuentos microbianos "día 15"

9.00
8.00
7.00
log UFC/mL batido
6.00
5.00
4.00
LD
3.00
2.00
1.00
C 100% 50% 30% 100% + H 50% + H 30% + H
Tratamientos
BAM EB M&L
Figura 4.9 - Recuento de BAM, EB y M&L en muestras control y

muestras tratadas con US a diferentes porcentajes de amplitud (%),
durante el almacenamiento a 5°C, a a) día 0 y b) día 15.
En el recuento de EB solo los tratamientos 100%, 50% (con mayor amplitud sin control de
temperatura) y 100%+H (con mayor amplitud con control de temperatura) permitieron lograr
reducciones hasta recuentos por debajo del límite de detección; mientras que los tratamientos más
suaves resultaron menos efectivos, presentando reducciones menores a 1 log. De manera similar,
en el estudio de Khandpur y col. (2015), quienes trabajaron sonicando (manteniendo T<30°C)
jugos de diferentes cítricos y vegetales, reportaron que la aplicación de bajos niveles de amplitud
y potencia no lograban las reducciones necesarias de patógenos causantes de enfermedades
transmitidas por alimentos. Por el contrario, mediante ensayos para potencias de 100 W o más,
observaron que con esta elevada potencia ultrasónica (100 W) y un tiempo de tratamiento de 15
minutos, se logró una reducción de 4 log en un volumen de muestra de jugo de 250mL.
Adicionalmente, mostraron que niveles de potencia por debajo de 100 W, lograba una reducción
97
Resultados
máxima de 3 a 3,5 ciclos log de la flora nativa de estos jugos aumentando el tiempo de tratamiento
de 15 a 30 minutos y también disminuyendo el volumen donde fue tratada la muestra a
aproximadamente 100 a 150 mL (inicialmente de 250mL). Sin embargo, en nuestro sistema y con
el método de control de temperatura utilizado, vimos que no es posible la aplicación de la potencia
máxima por más de 5 min sin sobrepasar los 40ºC, temperatura a partir de la cual se considera
que puede haber efectos térmicos asociados.
Luego de 15 días de almacenamiento bajo refrigeración (5°C), las muestras control y las
tratadas con 30% y 30%+H muestran un crecimiento considerable de todos los microorganismos
evaluados (BAM, EB y M&L). En cambio, se puede ver que en los tratamientos donde se aplicó
mayor amplitud (100% y 100%+H) todos los recuentos estuvieron por debajo del límite de
detección al final del almacenamiento. De acuerdo con esto, la reducción microbiana observaba
podría deberse a la combinación de los efectos químicos y físicos inducidos por el ultrasonido
debilitando a los microorganismos, junto con el ambiente ácido del pH y la condición de
refrigeración. Gao y col. (2012) sostienen que el crecimiento de microorganismos podría inhibirse
y disminuirse en jugos frutales de pH bajo (<4,6), de modo que una mayor acidez la vida útil se
prolonga considerablemente.
4.3.2. Optimización de tratamientos de ultrasonido
A partir de los resultados del ensayo anterior tuvimos un primer panorama sobre los efectos
del ultrasonido (US) en el sistema de estudio, y verificamos la importancia del control de la
temperatura durante el proceso. Destacando que, si bien hubo muchos parámetros que dieron los
mejores resultados con el tratamiento 100%, valores similares se lograron con tratamientos con
control de temperatura (100%+H o 50%+H, según el caso). Si bien en esta instancia no se hizo
un análisis sensorial formal se registraron, como se mencionó al inicio de la sección, viraje de
color al naranja/amarronado y presencia de aroma a cocido en las muestras expuestas a altas
temperaturas, muy notable en el caso de 100%. En esta Tesis se planteó como objetivo la
combinación de tecnologías no térmicas con antimicrobianos naturales, y para poder evaluar los
efectos e interacciones de estos tratamientos independientemente de los efectos térmicos se
decidió continuar con el control de temperatura con baño de hielo durante el procesamiento con
US. Asimismo, teniendo en cuenta que el tiempo también es un factor determinante del
tratamiento, se decidió trabajar con tiempos más cortos para evitar efectos de activación
enzimática y evitar el rápido desgaste de las puntas de US, otra limitación práctica que se observó
durante el trabajo en el laboratorio y que tiene fuertes implicancias económicas. De este modo,
en este ensayo se propuso la optimización a través de un diseño factorial considerando tres niveles
para el tiempo y dos niveles para la amplitud. Las respuestas evaluadas fueron aquellas en las que
el tratamiento con US demostró tener mayor impacto. El objetivo principal durante los estudios
de optimización relacionados con los parámetros operativos fue mantener los niveles de seguridad
microbiana utilizando una intensidad minimizada de manera que se retengan los nutrientes y los
atributos sensoriales y estéticos de los jugos.
98
Resultados
a. Indicadores de calidad
i. Indicadores fisicoquímicos (pH, Sólidos Solubles Totales (SST))
Los resultados obtenidos de pH y SST (°Brix) se exponen en la Tabla 4.6.
Tabla 4.6 - Valores de pH y °Brix en muestras control y muestras tratadas con

ultrasonido a diferentes amplitudes (%) y tiempos.
TRATAMIENTO pH* °Brix*
Control 4,09±0,00 11,90±0,14
30%-2 min 4,17±0,04 11,90±0,00
30%-4 min 4,12±0,01 11,60±0,57
30%-8 min 4,15±0,04 12,00±0,00
70%-2 min 4,15±0,02 11,95±0,07
70%-4 min 4,12±0,01 11,95±0,07
70%-8 min 4,11±0,01 11,95±0,07
*Datos expresados como medias ± desviación estándar.
pH. Se pudo ver que, al igual que se había observado en el ensayo anterior, el tratamiento con
US no afectó el pH del sistema, independientemente del tiempo o amplitud utilizada (p>0,05).
SST. El contenido de SST no presentó diferencias significativas entre tratamientos, ni de estos

con el control (p>0,05), además se asemeja bastante al obtenido en la sección 4.3.1.b.ii. (valor
promedio inicial de SST en tratamientos fue de 11,22±0,08 °Brix y a los 15 días fue de 11,00±0,13
°Brix), mostrando diferencias mínimas que podrían deberse a la variabilidad de la materia prima
utilizada.
Los resultados son los mostrados en la Tabla 4.7. Las muestras que presentaron una diferencia
significativa en cuanto a la actividad enzimática de la polifenoloxidasa (PPO) fueron 30%-2 min
y 30%-4 min respecto de las muestras control (p<0,05), las reducciones obtenidas fueron de 30%
y 29%, respectivamente. Con lo cual se puede decir que bajo un tratamiento de 30% de amplitud
tanto por 2 minutos o 4 minutos se puede reducir notablemente la actividad de estas enzimas. En
el caso de la peroxidasa (POD), todos los tratamientos evaluados presentaron reducciones
significativas en la actividad de esta enzima, comparando con las muestras control (p<0,05), la
mínima reducción obtenida fue de 43% para el tratamiento 30%-2 min y la máxima fue de 70%
para el tratamiento 70%-4 min.
Resulta curioso mencionar que los valores iniciales, en las muestras control, de actividad
enzimática tanto de PPO como de POD fueron diferentes a los obtenidos en los ensayos previos
de esta Tesis, lo que podría indicar que esta matriz alimentaria presenta fluctuaciones
dependiendo del estado de la materia prima que se utiliza. Aquí pueden influenciar parámetros
ambientales y/o el manipuleo de las mismas. A diferencia con los ensayos previos, en éste se
observaron reducciones para todos los tratamientos aplicados, lo que confirma la posibilidad de
que las tendencias al aumento de ésta (activación) observadas en el ensayo anterior, se hayan
99
Resultados
debido al empleo de tiempos prolongados de procesamiento y/o intensidades de ultrasonido

mayores, junto con temperaturas bajas (Cruz y col., 2006; Engmann y col., 2014; Cao y col.,
2018), como fue mencionado previamente. Si bien, los autores en general han obtenido resultados
prometedores en sus trabajos, no hay dudas de que existen algunas divergencias y que la
optimización de los parámetros en cuanto al uso del US resulta muy dependiente de cada matriz
alimenticia, así como también de los objetivos buscados. Sin ir más lejos, en base a los resultados
de este ensayo, se recomendaría el uso del tratamiento 70%-4 min para lograr una mayor
reducción en POD. Pero por otro lado las mayores reducciones de PPO se encontraron para los
tratamientos más suaves 30%-2 min y 30%-4 min, por lo que en todo caso la elección del
tratamiento óptimo resultará como una solución de compromiso que buscará minimizar factores
de deterioro y maximizar atributos de calidad.
Tabla 4.7 - Actividad enzimática en muestras control y muestras tratadas con

TRATAMIENTO PPO* POD*
Control 66,15±2,90a 18,50±0,71a
30%-2 min 46,50±2,12b 10,50±3,54b
30%-4 min 46,75±1,77b 8,50±3,54b
30%-8 min 59,95±5,30b,a 6,50±0,71b
70%-2 min 62,05±5,73a 6,50±0,71b
70%-4 min 64,05±2,05a 5,50±0,71b
70%-8 min 61,90±1,98a 7,50±0,71b
* Letras minúsculas diferentes indican diferencias entre tratamientos. Datos expresados como medias
± desviación estándar.
iii. Contenido de betalaínas
El contenido de betalaínas obtenido, a partir del batido, con los diferentes tratamientos se
presentan en la Figura 4.10. Como era de esperarse, según los resultados del ensayo anterior,
todos los tratamientos presentaron aumentos significativos de sus pigmentos betalaínicos en
comparación con las muestras control (p<0,05). Se destacaron aumentos del 70% y 110% en
Betacianinas (Bc) y Betaxantinas (Bx) para el tratamiento 70%-4 min, respectivamente, y
aumentos del 76% y 136% en Bc y Bx para el tratamiento 70%-8 min, respectivamente.
En este ensayo, además se pudo evidenciar que tanto para los tratamientos con 30% como para
los de 70% de amplitud, un mayor tiempo de tratamiento con US dio como resultado una mayor
efectividad de extracción de estos pigmentos, siendo el tiempo una variable muy importante en
cuanto al desprendimiento y retención de los pigmentos medidos.
100
Resultados
Betalaínas
12.00
10.00
mg/L batido
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
C 30%-2 min 30%-4 min 30%-8 min 70%-2 min 70%-4 min 70%-8 min
Tratamientos Bc Bx
Figura 4.10 - Contenido de betalaínas en muestras control y tratadas con

Por otro lado, un aspecto muy interesante que se pudo ver comparando los resultados de la
sección 4.3.1.v. y este ensayo fue que el mayor contenido de pigmentos apreciado en el batido se
logró con los tratamientos más severos (100% y 100%+H; 70%-2 min, 70%-4 min y 70%-8 min),
por lo cual, la amplitud de sonicación utilizada también juega un papel muy importante en la
extracción, además de los parámetros mencionados anteriormente, como la temperatura y el
tiempo (Tang y Norziah 2007; Sivakumar y col., 2009; Ramli y col., 2014). De manera similar,
otros estudios llevaron a cabo ensayos bajo la metodología de superficie de respuesta, se ejecutó
el diseño experimental de Box-Behnken (BBD) con cuatro factores de tres niveles para evaluar y
optimizar la influencia de las variables del proceso como la temperatura de extracción (40-60°C),
la potencia ultrasónica (60-120W), tiempo de extracción (15-45 min) y relación sólido-líquido
(10-30g/mL) y así determinar el rendimiento máximo de extracción de betalaínas de tallos de
remolacha roja (Maran y Priya, 2016) y de hojas de espinaca de Malabar (Maran y Priya, 2015).
Los autores constataron que las condiciones óptimas fueron: para los tallos de remolacha, 53°C,
89W, 1:19 (g/mL) relación de muestra/solvente, durante 35 minutos (Maran y Priya, 2016);
mientras que para la espinaca de Malabar, 54°C, 94W, 1:17 (g/mL) relación muestra/solvente,
durante 32 minutos (Maran y Priya, 2015).
iv. Calidad microbiológica
Los resultados de los análisis microbiológicos se muestran en la Figura 4.11. Es aceptado que
la eficiencia de los tratamientos de preservación dependerá de la carga inicial de MO, perdiendo
eficacia en la medida que los recuentos iniciales sean muy elevados (>7 log UFC/mL, BOE, 2001
o > 6 log UFC/mL, Varela-Santos y col., 2012). En este ensayo, se registraron recuentos iniciales
de 5,14, 5,00 y 3,84 log UFC/mL para BAM, EB y M&L, respectivamente, en las muestras sin
tratar; valores que estuvieron dentro de los rangos observados previamente (sección 4.3.1.b.vi.).
En líneas generales, para los tratamientos con menor amplitud (30%) se encontraron menores
reducciones en comparación con las muestras tratadas a mayor amplitud (70%) siguiendo una
101
Resultados
tendencia de mayor reducción a mayor duración del tratamiento. Asimismo, es importante

destacar que en todos los casos se obtuvieron reducciones bajas, menores a 1 log UFC/mL.
Para el caso de las BAM, el tratamiento más intenso de 70%-8 min mostró diferencias
significativas con los tratamientos de menor amplitud, como 30%-8 min, y tratamientos de menor
duración como el de 70%-2 min, además de con el control (p<0,05). En cuanto a las EB, solo se
vieron diferencias significativas entre el tratamiento 70%-8 min y las muestras control (p<0,05),
resultando los demás tratamientos con recuentos similares entre ellos. En cambio, en el recuento
de M&L no se han presentado diferencias significativas entre los distintos tratamientos, tampoco
entre éstos y las muestras sin tratar (p>0,05). Abdullah y Chin (2014) informan que el efecto letal
de los ultrasonidos depende del tipo de microorganismo que se trate. En general, la cavitación es
más eficaz en bacterias Gram positivas, esporas, células redondas pequeñas y de forma esférica.
Por lo tanto, recientemente, se ha utilizado con éxito la combinación de tecnologías no térmicas
con otros modos de conservación, como los agentes antimicrobianos, para mantener la seguridad
alimentaria, poder abarcar un espectro más amplio de microorganismos y asegurar la calidad de
los jugos de frutas y verduras. La combinación de US con antimicrobianos se ha estudiado en
diversos jugos de fruta, encontrando resultados prometedores (Bevilacqua y col., 2013; 2014;
2015; 2018; Khandpur y col., 2016). Según Ross y col. (2003), las ondas ultrasónicas podrían
mejorar la letalidad de los AN aumentando la permeabilidad de las células, aumentando la
velocidad de reacción entre éstos y los componentes de la célula y dispersando los agregados de
las células para aumentar el área de superficie de contacto. En base tanto a esta bibliografía citada,
como a resultados obtenidos por el grupo del laboratorio donde se ha desarrollado esta Tesis o
inclusive a los propios mencionados en esta sección y la anterior (sección 4.3.1.) se concluye que
los ensayos de US evaluados podrían lograr mejores resultados si se lo combina con
antimicrobianos naturales.
Recuentos microbianos
6.00
5.00
log UFC/mL batido
4.00
3.00 LD
2.00
1.00
0.00
C 30%-2 min 30%-4 min 30%-8 min 70%-2 min 70%-4 min 70%-8 min
Tratamientos BAM EB M&L
Figura 4.11 - Recuentos de BAM, EB y M&L en muestras control y muestras tratadas

con ultrasonido a diferentes amplitudes (%) y tiempos.
102
Resultados
Finalmente, entre los tratamientos evaluados en este ensayo aquel de máxima amplitud y
tiempos intermedios demostró lograr los mejores resultados en inhibición de actividad de POD
(70% de reducción) junto con mayores extracciones de Bc y Bx. Mientras que los tratamientos
más suaves que lograron las mejores reducciones de PPO (30% de reducción), presentaron los
resultados más pobres respecto de los contenidos de Bc y Bc. Por otro lado, no se vieron
diferencias significativas para los parámetros fisicoquímicos y microbiológicos de los batidos
expuestos a los distintos tratamientos, sin embargo, las tendencias indican que con tratamientos
más intensos se logran mayores inhibiciones que con los más suaves. Es por ello que se seleccionó
el tratamiento 70%-4 min para la próxima etapa de la investigación, la combinación de US con
antimicrobianos naturales.
4.4. COMBINACIÓN DE ULTRASONIDO Y ANTIMICROBIANOS

NATURALES PARA LA PRESERVACIÓN DEL BATIDO
4.4.1. Tratamientos de ultrasonido y agregado de antimicrobianos naturales
Considerando que el tratamiento con ultrasonido (US) aplicado de manera individual no logró
reducciones significativas de ninguno de los microorganismos evaluados, en este ensayo se
decidió estudiar su combinación con antimicrobianos naturales (AN) de distinto modo de acción
de manera de verificar con cuál se logran las mejores respuestas. Se estudió entonces la
combinación de US con extracto de té verde (ETV), nisina (Ni) o natamicina (Na). En cuanto al
ETV, estudios más recientes del grupo del laboratorio donde se desarrolló esta Tesis probaron
que en una dosis baja (0,2%) resultó ser aceptable sensorialmente, aportando mejoras en la calidad
nutricional y quedando planteada la posibilidad de lograr mejoras en la calidad microbiológica
del producto si se lo combina con otras tecnologías. La Ni normalmente solo es efectiva contra
los organismos Gram positivos, ya que el componente lipopolisacárido externo de la membrana
de las bacterias Gram negativas evita que dichos compuestos antimicrobianos accedan a la
membrana citoplasmática o a la capa de peptidoglicano. Sin embargo, se ha demostrado que ha
podido actuar sobre varias especies de bacterias Gram negativas, siempre que las propiedades de
barrera de la membrana externa se alteren primero (Ross y col., 2003). Finalmente, la Na, es una
bacteriocina cuyo modo de inhibición principal implica una interacción entre ésta y el ergosterol,
un componente esencial de las membranas de levaduras y mohos. Se ha demostrado que la acción
de la natamicina no aumenta la permeabilidad del citoplasma, si no que más probablemente
previene el crecimiento celular, la germinación de esporas e inhibe la actividad enzimática
asociada a la membrana (Te Welscher y col., 2008; van Leeuwen y col., 2009; Delves y col.,
2011). Además, ha sido estudiado su efecto inhibidor sobre grupos bacterianos provenientes de
distintos suelos (rizósfera, epoisses, dardilly y auvillard) demostrando que algunas bacterias de la
microflora del suelo no son resistentes (Mohamed y col., 2005). Adicionalmente recientemente,
Yikmis y col. (2019) evaluaron los efectos de la natamicina en combinación con ultrasonido
contra la microbiota natural de jugos vegetales obteniendo resultados interesantes.
103
Resultados
a. Indicadores fisicoquímicos (pH, Sólidos Solubles Totales (SST), Apariencia visual)
pH. Los resultados obtenidos para muestras control y tratadas se presentan en la Tabla 4.8. Se
pudo observar que inicialmente, a día 0, todas las muestras tratadas presentaron diferencias
significativas con el control (p<0,05) pero no entre sí. Por lo cual, la ligera disminución observada
en el pH podría atribuirse al proceso de sonicación, posiblemente causada por la liberación de
ácidos orgánicos debido a la ruptura de las partículas disueltas (Bhat y col., 2016). Sin embargo,
cabe destacar que, si bien matemática y/o estadísticamente se presentaron algunas diferencias
significativas, éstas son muy pequeñas como para implicar efectos relevantes a nivel
microbiológico y/o sensorial. En cuanto al almacenamiento, se vio que tanto el control como los
tratamientos tuvieron tendencia a la reducción del pH durante el tiempo de evaluación. Sin
embargo, cabe destacar que esta disminución fue similar para todas las muestras (no tratadas y
tratadas), de forma que no presentaron diferencias significativas a día 28 (p>0,05). De este modo,
las reducciones obtenidas al final del almacenamiento, a día 28, fueron de 5,7%, 3,7%, 5,4%,
5,2% y 5,0% para el control, US, US+Ni3250, US+Té(0,2%) y US+Na100, respectivamente. Esta
reducción durante el almacenamiento puede estar relacionada con los procesos naturales de
deterioro, como fue mencionado anteriormente en otras secciones
SST. Se puede ver en la Tabla 4.8 que inicialmente, a día 0, solo la muestra tratada con US+Té
presentó diferencias significativas en SST (en °Brix) comparando con el control (p<0,05), de
modo que los demás tratamientos no tuvieron diferencias significativas entre ellos (p>0,05),
demostrando ser equivalentes inicialmente. Este aumento inicial en las muestras tratadas
conteniendo té podría estar relacionado con el hecho de que los componentes principales del ETV
son compuestos solubles en agua (Perumalla y Hettiarachchy 2011). Adicionalmente, cabe
señalar que el ETV contiene galato de epigalocatequina (EGCG), que es un inhibidor natural de
PME, ya que interactúa acoplándose en su hendidura catalítica (Lewis y col., 2008), por lo que es
probable que las muestras que contienen ETV presenten mayor cantidad de pectina, también un
compuesto soluble en agua. En este sentido, la actividad de la enzima PME genera la reticulación
de grupos carboxílicos libres pertenecientes a cadenas de pectina dando macropolímeros
insolubles que atrapan otros componentes de la nube, incluyendo sólidos solubles y otros
compuestos relacionados con el sabor, textura y color de los jugos, que terminan decantando,
observándose una separación de fases (Carbonell y col., 2006). La nube de los jugos, que está
compuesta de partículas finamente divididas de pectina, celulosa, hemicelulosa, proteínas y
lípidos en suspensión (Irwe y Olsson, 1994; Klavons y col., 1994), se considera una característica
deseable que se busca mantener, ya que se relaciona con la turbidez, sabor y color característico
de estos productos. Durante el almacenamiento, si bien se muestra una tendencia de disminución
de SST, ningún tratamiento, incluyendo al control, presentó diferencias significativas a lo largo
del tiempo de evaluación (p>0,05). Los tratamientos no térmicos generalmente no tienen un efecto
significativo sobre los valores de °Brix, pH o la acidez de titulación (Yismik y col., 2019) de los
productos. Resultados similares fueron mencionados anteriormente en la sección 4.3.1.b.ii (Cruz
y col., 2015; Bora y col., 2017; Bhat y Goh, 2017; Nadeem y col., 2018; Yismik y col., 2019).
104
Resultados
Tabla 4.8 - Valores de pH y °Brix en muestras control y muestras tratadas con

ultrasonido en combinación con antimicrobianos naturales, tomando mediciones a día 0, 7,
14, 21 y 28 durante el almacenamiento a 5°C.
TRATAMIENTO DÍA pH* °Brix*
0 4,21±0,01a,A 10,60±0,14a,A
7 4,21±0,03a,A 10,65±0,07a,A
Control 14 3,95±0,04a,B 10,60±0,00a,A
21 4,03±0,04a,B.C 10,70±0,00a,A
28 3,97±0,01a,B,C 10,60±0,10a,A
0 4,14±0,01b,A 10,80±0,00a,b,A
7 4,20±0,01a,A 10,70±0,00a,A
US 14 3,95±0,01a,B 10,50±0,28a,A
21 3,97±0,03a.b,B 10,75±0,07a,A
28 3,98±0,06a,B 10,60±0,10a,A
0 4,14±0,01b,A 10,80±0,00a,b,A
7 4,17±0,01a,A 10,75±0,07a,A
US+Ni250 14 3,93±0,00a,B 10,70±0,00a,A
21 3,93±0,00b,B 10,70±0,00a,A
28 3,92±0,02a,B 10,65±0,07a,A
0 4,15±0,01b,A 10,95±0,07b,A
7 4,19±0,01a,B 11,05±0,07b,A
US+Té(0,2%) 14 3,94±0,01a,C 10,95±0,07a,A
21 3,94±0,00a.b,C 11,05±0,07a,A
28 3,93±0,00a,C 10,80±0,00a,A
0 4,14±0,01b,A 10,80±0,00a,b,A
7 4,19±0,01a,A 10,70±0,00a,A
US+Na100 14 3,94±0,01a,B 10,85±0,07a,A
21 3,95±0,02a.b,B 10,50±0,42a,A
28 3,94±0,01a,B 10,60±0,14a,A
indican diferencias entre día 0,7,14,21 y 28. Datos expresados como medias ± desviación estándar.
Apariencia visual. Se realizó un análisis cualitativo de la apariencia visual y registro de

imágenes evaluando el color, estabilidad de nube, separación de fases y presencia de burbujas por
fermentación, entre otras características que podrían aparecer durante el almacenamiento. De este
modo, se tomaron fotos durante los distintos tiempos de evaluación, mostrándose los
correspondientes resultados en la Figura 4.12.
Inicialmente, el batido sin tratar presentó un color rojo oscuro intenso, y como se puede ver en
la Figura 4.12.a, no hubo diferencias distinguibles a simple vista entre tratamientos. De manera
similar, Cao y col. (2018) reportaron que aunque los tratamientos con ultrasonido indujeron
cambios en todos los valores de la evaluación del color del jugo de arándano, estos cambios fueron
considerados muy bajos e indicaron que no serían fácilmente detectados a simple vista. El color
es uno de los atributos de calidad organoléptica más importante de los jugos porque estos
productos son apreciados por su valor estético intrínseco y también porque es un parámetro
asociado a la calidad nutricional de los alimentos. La permanencia de los pigmentos
característicos de algunas frutas, como las antocianinas en las fresas (Tiwari y col., 2009) o los
carotenoides en las naranjas (Tiwari y col., 2008a), están relacionados con la maduración de la
fruta, la presencia de impurezas, los tratamientos tecnológicos, las condiciones de
almacenamiento, alteraciones por microorganismos y reacciones de pardeamiento.
105
Resultados
Por otro lado, hubo estudios donde los cambios en el color de las muestras tratadas con
ultrasonidos fueron notables (Tiwari y col., 2008b; Mohideen y col., 2014; Farhadi Chirgar y col.,
2017). La degradación del color puede deberse a fenómenos físicos extremos (temperatura hasta
1000 K y presión hasta 500 MPa a microescala) que tienen lugar cuando las burbujas colapsan
(Suslick, 1989), además, podrían estar invoculadros en la degradación de varios pigmentos los
radicales hidroxilo (-OH) o el peróxido de hidrógeno (H2O2) producidos por cavitación, mediante
la apertura de anillos y formación de chalcona (cetona aromática y un enona que forma el núcleo
central para una variedad de compuestos biológicos importantes) (Tiwari y col., 2010).
Durante el almacenamiento, se pudo identificar que la muestra control (muestra 1) se fue

poniendo más oscura a lo largo del tiempo de evaluación, este resultado se pude notar en la Figura
4.12.d1, en la cual se ve que la muestra 1, en esa instancia (día 21), presenta un color más oscuro
amarronado en comparación con las muestras que fueron tratadas (muestra 2,3,4 y 5). De acuerdo
con esto, algunos autores (Knorr y col., 2004; Chen y col., 2007; Zafra Rojas y col., 2013)
sostienen que la sonicación causa una reducción del oxígeno disuelto presente en los jugos, un
parámetro crítico que influye en la estabilidad de los pigmentos durante el almacenamiento.
Además, la degradación de los pigmentos betalaínicos suele estar relacionada con las actividades
de las glicosidasas, polifenoloxidasas (PPO) y peroxidasas (POD) (Strack y col. 2003) que, como
se vio en la sección 4.3.2.a.ii. presentan actividad reducida en el batido a causa del ultrasonido.
En cuanto al agregado de los AN, el ETV en concentración de 0,2%, a pesar de que presenta
un color rojo intenso, no aportó inicialmente cambios significativos al color, al igual que fue
mencionado anteriormente en la sección 4.1.1.d.; sin embargo, durante el almacenamiento las
muestras tratadas US+Té (muestra 4) presentaron un color rojizo más vibrante por su poder
antioxidante de pigmentos como fue mencionado en la sección 4.1.1.d. En el caso de las muestras
con nisina o natamicina (muestras 3 y 5), se observó un menor oscurecimiento a lo largo del
almacenamiento respecto de lo observado en el control. Estos antimicrobianos, que son incoloros
y no modifican el color del alimento al cual son agregados, posiblemente por su acción contra los
microorganismos podrían haber ayudado a mantener el color de batido fresco más similar al de
los primeros días.
Como se mencionó previamente, la estabilidad de la nube es un parámetro crítico de la calidad

de jugos y batidos, le confiere un sabor, color y sensación en la boca característico (Tiwari y col.,
2008). Inicialmente y hasta el día 7, tanto el control como los tratamientos presentaron una buena
estabilidad de nube (evaluada de manera visual), no mostrando separación de fases en el batido
(Figura 4.12.a y Figura 4.12.b). Luego, desde la medición del día 14 hasta el día 28, como se
puede ver en las Figura 4.12.c1, Figura 4.12.d1 y Figura 4.12.e1, las muestras comenzaron a
tener una separación de fases cada vez más marcada, de modo que, las Figura 4.12.c2, Figura
4.12.d2 y Figura 4.12.e2, son luego de una leve agitación manual. Sin embargo, es de destacar
que al final del almacenamiento, a día 28, las muestras tratadas con US+Té (muestra 4) mostraron
una mayor estabilidad en comparación con los demás tratamientos y el control. Esto podría
deberse a que el té posee la catequina EGCG con poder de inactivación de la PME, enzima
responsable de la separación de fases en jugos y batidos de frutas, como fue mencionado
anteriormente (sección 4.3.1.b.iii.). Adicionalmente, si bien en otros estudios (Knorr y col., 2004)
se ha informado que el ultrasonido, por sí solo, logró una reducción de la actividad PME en el
jugo de limón resultando en una mejor estabilidad de la nube debido solo al daño mecánico de la
estructura de la proteína PME, en los estudios anteriores mencionados en la sección 4.3.1.b.iii se
encontró que no hubo efecto del US en la actividad de PME.
106
Resultados
Figura 4.12 - Evaluación de la apariencia visual sobre color y separación de fases en muestras del
batido. 1:Control, 2:US (70%- 4 min), 3:US+Ni250; 4:US+Té(0,2%) y 5:US+Na100. Registro de
imágenes tomando mediciones a día a) 0, b) 7, c) 14, d) 21 y e) 28 durante el almacenamiento a 5°C.
107
Resultados
c. Contenido de polifenoles totales (CPT) y capacidad antioxidante (DPPH y FRAP)
CPT. Los resultados mostraron que inicialmente, a día 0, todas las muestras tratadas lograron
aumentos en el CPT (Tabla 4.9). Sin embargo, el tratamiento de US+Té fue el único que presentó
aumentos iniciales significativos en comparación con todos los demás tratamientos y el control
(p<0,05). De modo que, a día 0, obtuvo un valor de CPT 11 veces mayor al presentado por las
muestras control. Este resultado se atribuye al alto contenido de compuestos fenólicos del ETV
(Perumalla y Hettiarachchy 2011; Dan y Eun, 2018). Los demás tratamientos, US, US+Ni y
US+Na, presentaron aumentos no significativos del 11,5%, 3,0% y 15,9%, respectivamente
(p>0,05). De esta forma, otros estudios (Vilkhu y col., 2008; Tomadoni y col., 2016) han
demostrado que el incremento del contenido fenólico podría deberse a la aplicación de
ultrasonidos, ya que este tratamiento mejora el rendimiento de extracción de compuestos
bioactivos y moléculas antioxidantes en varios productos alimenticios. De acuerdo con Farhadi
Chirgar y col. (2017), el ultrasonido produjo un aumento significativo en el CPT de todos los
jugos tratados con esta tecnología, en comparación con el control, de modo que obtuvieron el
mayor contenido fenólico sonicando a 100% de amplitud durante 15 minutos. Mohideen y col.
(2014) encontraron que al aumentar el porcentaje de amplitud (500W; 40% a
100%; 20kHz; 25°C) en un jugo de arándanos, también aumentaba el contenido de polifenoles
totales. En esta línea, como los compuestos fenólicos están presentes en las vacuolas de las
paredes celulares vegetales en forma soluble o unidos a compuestos como pectinas, celulosas,
hemicelulosas y trazas de lignina, es posible que el uso de ultrasonidos mejore la ruptura de las
paredes celulares biológicas y facilite la liberación de su contenido a través del colapso
cavitacional en el entorno de las partículas coloidales (Patras y col., 2009; Bhat y col., 2011; Zafra
Rojas y col., 2013), o también a la adición de un grupo hidroxilo producido por sonicación al
anillo aromático de compuestos fenólicos (Ashokkumar y col., 2008).
Durante el almacenamiento, tanto el control como todos los tratamientos mostraron una
tendencia de disminución gradual en el CPT hasta el día 28. Nuevamente, se destaca el tratamiento
de US+Té, que si bien redujo su valor durante el almacenamiento, de todas formas, a día 28 se
presentó un CTP 7 veces mayor respecto del control, resultando ser la única muestra con
diferencias significativas al final del almacenamiento (p<0,05), quedando los demás tratamientos
con contenido de polifenoles significativamente menor al obtenido con el agregado de ETV. De
manera similar, otros autores como Nadeem y col. (2018), reportaron una disminución gradual en
el contenido de fenoles y flavonoides, durante el almacenamiento (100 días) de una mezcla de
jugo de zanahoria y uva previamente tratado con ultrasonido (525W; 20kHz; 70%; 2, 4 y 6 min;
15°C). También Saeeduddin y col. (2017) que trabajaron con jugo de pera sonicado (750W;
30kHz; 70%; 10 min; 25, 45 y 65°C) informaron una disminución notable en compuestos
fenólicos durante 21 días de almacenamiento a 4ºC. Khandpur y Gogate (2015) encontraron en
jugos de naranja y lima dulce tratados con ultrasonido (100W; 20kHz; 50%; 15 min; <30°C) una
caída significativa en el contenido fenólico después del almacenamiento de 10 semanas a 4°C.
Algunos autores sostienen que la reducción de compuestos fenólicos durante el almacenamiento
de jugos sonicados podría asociarse a los radicales hidroxilos generados sonoquímicamente.
Además, Bursać Kovačević y col. (2019) trabajando con jugo de manzana postularon que las
burbujas de cavitación nucleadas que crecen y colapsan durante el tratamiento ultrasónico pueden
llenarse con vapor de agua u otros gases que se disuelven en el jugo, promoviendo la degradación
oxidativa de compuestos fenólicos (Dubrović, Herceg y col., 2011).
108
Resultados
DPPH. En el caso de la actividad antiradicalaria, al contrario de lo visto anteriormente para

CPT, no todos los tratamientos produjeron incrementos iniciales de este parámetro en las muestras
(Tabla 4.9), con lo cual resulta evidente que otros compuestos que hacen un aporte a la actividad
antioxidante del producto pueden haberse visto afectados por los tratamientos, no existiendo una
correlación relevante entre el CPT y DPPH. De acuerdo a lo primero mencionado, solamente los
tratamientos conteniendo té (US+Te) y natamicina (US+Na100) presentaron aumentos similares
a los vistos anteriormente para CPT, probablemente por el gran aporte de antioxidantes por parte
del ETV y por sus particulares características mencionadas en la sección 4.1.1.b. (Perumalla y
Hettiarachchy 2011; Klimczak y Gliszczynska-Swigło, 2017; Dan y Eun, 2018). Es de destacar
que el tratamiento de US+Té fue el único que presentó aumentos iniciales significativos en
comparación con todos los demás tratamientos y el control (p<0,05), de modo que, a día 0, se
obtuvo un valor de DPPH 14 veces mayor al presentado por las muestras control. Para el caso del
tratamiento conteniendo natamicina, Yismik y col. (2019) informaron posibles efectos
protectores, por parte de este antimicrobiano, que ayudaron a impedir la degradación de
compuestos fenólicos y flavonoides en jugos sonicados. Y de acuerdo a lo segundo mencionado,
hay estudios que demuestran que podría no haber una correlación entre CPT y la capacidad
antioxidante. Por ejemplo, Jiang y col. (2014) informaron que no hubo una correlación
significativa entre el contenido fenólico total y la actividad antioxidante en el jugo de moras
sonicado (R2=0,279). Tampoco Amakura y col. (2000), Song y col. (2006) y Piljac Zegarac y col.
(2009) encontraron correlación significativa entre estos dos indicadores en grosellas, granadas,
cerezas y algunas especies de bayas. Por otro lado, otros estudios como el de Nadeem y col.
(2018), reportaron que todos los tratamientos con ultrasonido (525W; 20kHz; 70%; 2, 4 y 6 min;
15°C), realizados sobre un jugo mezcla de zanahoria y uva, mostraron mayor actividad
antioxidante en comparación con las muestras sin tratar. Estos autores sostienen que el aumento
de antioxidantes podría atribuirse a que el tratamiento ultrasónico aumentó el contenido de
fenólicos y el de ácido ascórbico, además de la posible inactivación de enzimas responsables de
pardeamientos (Nadeem y col., 2018). De esta forma, si bien los polifenoles tuvieron aumentos
iniciales inmediatamente después de todos los tratamientos en esta Tesis, posiblemente algunos
tratamientos produjeron reducción de otros compuestos que aportan a la capacidad antioxidante
y esto resultó redundante en los valores de DPPH encontrados.
En cuanto al tiempo de almacenamiento, tanto el control como todos los tratamientos

mostraron una reducción significativa en sus valores de DPPH a día 28 (p<0,05). Este
comportamiento también fue informado por otros autores, por ejemplo, Nadeem y col. (2018)
reportaron que la actividad antioxidante total de todas las muestras de jugo mezcla de zanahoria
y uva tratadas disminuyó significativamente del día 1 al día 90. Asimismo, Bursać Kovačević y
col. (2019) observaron que después de 7 días de almacenamiento en frío, la capacidad
antioxidante de todas las muestras de jugo de manzana sonicadas se redujo significativamente, en
comparación con el primer día de medición. Jiang y col. (2014) vieron este comportamiento de
reducción significativa en muestras de jugo de mora negra sonicadas (650W, 20kHz, 30 min,
20°C) y almacenadas (8 días, a 15 y 25°C), y finalmente, Saeeduddin y col. (2017) demostraron
que las muestras de jugo de pera sonicadas (750W, 30 kHz, 70%, 25, 45 y 65°C, 10 min) tuvieron
una disminución notable en capacidad antioxidante total durante 21 días de almacenamiento a
4°C. La posible razón de esta reducción en capacidad antioxidante observada podría explicarse
con una fuerte tendencia polifenólica a la polimerización. En particular, cuando la etapa de
polimerización alcanza un valor crítico, el aumento de la complejidad molecular reduce la
disponibilidad del grupo hidroxilo para los radicales DPPH, lo que en consecuencia conduce a
una disminución de la capacidad antioxidante (Pinelo y col., 2004). Si bien, como fue
109
Resultados
mencionado, tanto el control como todos los tratamientos presentaron una tendencia de
disminución de la capacidad antioxidante durante el almacenamiento; sin embargo, cabe destacar
que el tratamiento conteniendo té (US+Té) ha mostrado una mayor estabilidad de componentes
obteniendo, a día 28, una actividad antioxidante 21 veces mayor respecto del control, mientras
que los demás tratamientos (US, US+Ni y US+Na) presentaron valores menores al mismo
(control), aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas al final del
almacenamiento, a día 28 (p>0,05).
Tabla 4.9 – Valores de CPT, DPPH y FRAP en muestras control y muestras tratadas
con ultrasonido en combinación con antimicrobianos naturales, tomando mediciones a día
0, 7, 14, 21 y 28 durante el almacenamiento a 5°C.
CPT* DPPH* FRAP*
TRATAMIENTO DÍA (mg AG/100g de (µM Trolox/100g (µM Trolox/100g de
batido) de batido) batido)
0 59,68±0,57a,A 248,25±4,82a,A 319,42±2,60a,A
7 54,05±3,85a,A,B 132,34±14,65a,B 280,66±59,71a,A,B
Control 14 47,14±0,99a,B,C 121,16±16,08a,B,C 175,62±11,54a,B,C
21 43,74±2,37a,B,C 79,66±0,52a,C 234,77±15,58a,A,C
28 41,95±4,24a,C 99,58±7,05a,B,C 157,68±2,31a,C
0 66,53±3,10a,A 250,61±0,37a,A 321,05±7,79a,A
7 51,88±3,43a,A,B 125,47±1,87a.B 225,59±17,60a,B
US 14 51,29±4,39a,A,B 119,92±3,00a,B 170,12±6,06a,C,D
21 46,88±7,49a,B 62,80±3,13a,C 203,36±6,35a,b,B,C
28 40,76±0,33a,B 65,25±5,93a,C 140,75±2,60a,D
0 61,49±2,89a,A 242,09±11,68a,A 296,17±51,63a,A
7 53,56±0,03a,B 138,36±9,20a,B 218,46±16,15a,A,B
US+Ni250 14 47,97±1,38a,B,C 142,28±5,65a,B 181,74±13,85a,B
21 49,86±0,09a,B 61,94±4,00a.C 172,77±5,19b,B
28 42,36±1,80a,C 65,59±5,77a,C 146,25±4,04a,B
0 650,54±10,73b,A 3414,86±5,56b,A 3871,33±72,11b,A
7 575,56±3,91b,A 2020,99±226,62b,B 3269,64±40,38b,B
US+Té(0,2%) 14 307,72±15,93b,B 3251,77±45,94b.A 2741,38±106,75b,C
21 481,18±74,25b,A,C 1947,49±66,15b,B 2502,74±11,54c,C
28 306,02±56,82b,C 2056,26±3,20b,B 2782,17±181,72b,C
0 69,16±3,76a,A 275,40±36,53a,A 326,96±20,77a,A
7 52,31±4,51a,B 128,72±5,79a,B 225,80±7,50a,B
US+Na100 14 47,78±1,41a,B 145,15±9,72a,B 155,43±0,87a,C
21 53,39±2,01a,B 59,23±0,52a,C 223,96±18,75a,B
28 42,63±1,41a,B 51,76±0,32a,C 183,37±11,54a,B,C
indican diferencias entre día 0,7,14,21 y 28. Datos expresados como medias ± desviación estándar.
FRAP. En el caso de este indicador de capacidad antioxidante por reducción férrica, se

presentó una tendencia similar a lo encontrado para DPPH, de modo que podrían ser válidas las
mismas hipótesis mencionadas anteriormente. Por su parte, el tratamiento de US+Té fue el único
que presentó diferencias significativas en comparación con todos los demás tratamientos y el
control (p<0,05). Inicialmente, a día 0, se obtuvo un valor de FRAP 12 veces mayor al presentado
por las muestras control. Si bien, tanto el control como todos los tratamientos presentaron una
tendencia de disminución de la capacidad antioxidante durante el almacenamiento, cabe destacar
que el tratamiento conteniendo té (US+Té) ha mostrado una mayor estabilidad obteniendo, a día
28, una actividad de reducción férrica 18 veces mayor respecto del control, mientras que los
110
Resultados
demás tratamientos (US, US+Ni y US+Na) no presentaron valores con diferencias significativas
respecto del control al final del almacenamiento (p>0,05).
d. Contenido de betalaínas
Tanto en Betacianinas (Bc) como en Betaxantinas (Bx), se vieron aumentos iniciales

significativos de casi todos los tratamientos comparando con el control (C) (p<0,05), exceptuando
al tratamiento conteniendo té, que si bien obtuvo un aumento importante, no fue considerado
estadísticamente significativo (p>0,05). De esta forma, a día 0, se pueden destacar los
tratamientos US y US+Ni250, los cuales presentaron aumentos del 55% y 61% para Bc
respectivamente, y aumentos del 78% y 83% para Bx respectivamente, comparando con las
muestras control. Estos resultados pueden atribuirse, en parte, a una mayor liberación de estos
pigmentos de los compartimentos celulares a causa del ultrasonido. Este fenómeno se ha
informado en trabajos previos como el de Rojas y col. (2016) que trabajando con jugo de durazno
procesado por la tecnología de ultrasonido (1000W, 20kHz, 22±3ºC, durante 3, 6, 10 y 15 min)
encontraron cambios en su estructura, evidenciados por microscopía óptica y distribución del
tamaño de partícula, que involucraron daños celulares, liberación de contenido intracelular,
reducción del tamaño de partícula, disrupción de las células completas, reducción del tamaño de
polisacáridos y dispersión de constituyentes. Debido a estos efectos, la tecnología de ultrasonido
es estudiada ya que facilita la liberación de componentes celulares y diferentes operaciones de la
unidad de transferencia de masa, como la extracción de antocianinas observada en orujo de uva
(Barba y col., 2015), mejorando la calidad (aumento del contenido de azúcares, compuestos
fenólicos y actividad antioxidante) y afectando ligeramente las concentraciones de licopeno y su
bioaccesibilidad in vitro en pulpa de tomate (Anese y col., 2015).
Durante el almacenamiento, los 4 tratamientos evaluados presentaron tendencias muy

diferentes en el contenido tanto de Bc como de Bx. En primer lugar, particularmente para el caso
de las Bx se puede destacar que los tratamientos con antimicrobianos (US+Ni250, US+Té y
US+Na100) presentaron una tendencia de aumento de este compuesto durante el tiempo de
almacenamiento. Por lo cual, lleva a pensar en un efecto positivo por parte de los AN junto con
la posible disminución de reacciones deteriorativas que supone la técnica de ultrasonido
eliminando el oxígeno ocluido de los jugos (Knorr y col., 2004). Es sabido que los agentes
antimicrobianos actúan como agentes protectores en la prevención de procesos oxidativos que
conducen al deterioro de compuestos como las betalaínas. Por su parte, el tratamiento de US+Té
presentó una tendencia similar tanto para Bc como para Bx, si bien el contenido inicial de
betalaínas, al día 0, fue el más bajo comparando con los demás tratamientos, éste ha sido el único
que ha logrado aumentos significativos durante el almacenamiento, especialmente hasta día 21
(p<0,05), obteniéndose a día 28 un valor mayor al inicial, en ambos compuestos betalaínicos
(Figura 4.13). Es necesario tener en cuenta que la degradación de las betalaínas suele estar
relacionada con las actividades de las glicosidasas, polifenoloxidasas (PPO) y peroxidasas (POD)
(Strack y col. 2003), todas reacciones dependientes del oxígeno. Se ha visto en la sección 4.1.1.b.
los efectos de los polisacáricos de los ETV contra diversas formas de deterioro (Gramza y col.,
2006), también han mostrado efectos inhibidores sobre las glicosidasas (Chen y col., 2009) y en
estudios más recientes, se demostró la capacidad del ETV para inactivar la PPO (Klimczak y
Gliszczynska-Swigło 2017), además al ser un antioxidante tiene un “efecto protector” que
explicaría la estabilidad durante el almacenamiento. Por otro lado, las muestras expuestas
111
Resultados
solamente al tratamiento con US disminuyeron su contenido de Bc y Bx hasta llegar a valores

similares a los del control a día 28.
a) Bc
10.00
8.00
mg AG/L batido
6.00 0
7
4.00 14
21
2.00
28
0.00
C US US+Ni250 US+Té(0,2%) US+Na100
Tratamientos
b) Bx
12.00
10.00
mg AG/L batido
8.00
0
6.00 7
14
4.00
21
2.00 28
0.00
Tratamientos
Figura 4.13 - Contenido de a) Bc y b) Bx en muestras control y muestras

tratadas con ultrasonido en combinación con antimicrobianos naturales,
tomando mediciones a día 0, 7, 14, 21 y 28 durante el almacenamiento a 5°C.
e. Calidad microbiológica
En el caso de las bacterias aerobias mesófilas (BAM) (Figura 4.14), el tratamiento de

US+Ni250 fue el único que logró una reducción inicial significativa comparando con la muestra
control y con la muestra conteniendo té (p<0,05), ya que estas últimas presentaron recuentos
similares. Este resultado inicial positivo del tratamiento de ultrasonido con nisina, podría haber
sido debido al uso de ambos métodos combinados que al tener una acción antibacteriana con
efecto sobre las paredes celulares, a través de un enfoque de obstáculos múltiples, podría producir
efectos sinérgicos. Por un lado, se encuentra la acción antimicrobiana de la nisina, la cual se une
electrostáticamente a los fosfolípidos cargados negativamente (Jagus y col., 2016), aumenta la
112
Resultados
permeabilidad de la membrana mediante la formación de poros y resulta en una rápida salida de

pequeñas moléculas intracelulares esenciales interfiriendo con la biosíntesis de la pared celular.
A esto, pudo haberse agregado un efecto bactericida adicional por parte del procesamiento por
ultrasonido, para el cual se reportan las cavitaciones acústicas intracelulares que causan un
aumento en la permeabilidad de las membranas, pérdida de selectividad, adelgazamiento de las
membranas celulares, calentamiento localizado y producción de radicales libres (Farhadi Chitgar
y col., 2017).
Durante el almacenamiento, el mejor resultado fue obtenido por el tratamiento de US+Na100

logrando una reducción significativa de 1,2 log UFC/mL al final del almacenamiento, a día 28
(p<0,05) (Figura 4.14). Este resultado no era esperable ya que es conocido que la natamicina
bloquea el crecimiento de hongos al unirse específicamente al ergosterol, presente casi
exclusivamente en las membranas plasmáticas de éstos (Te Welscher y col., 2010). De hecho, por
ejemplo, Fernandez y col. (2018) reportaron que al tratar las hojas de remolacha con natamicina
(200ppm) como único tratamiento no produjo ningún efecto inhibidor sobre los recuentos de
BAM, de forma que presentó un comportamiento similar al control. Sin embargo, es considerable
tener en cuenta un previo efecto antimicrobiano promovido por el US, al igual que fue
mencionado anteriormente para nisina, lo cual posiblemente produjo vías alternativas para el
ataque de la natamicina a través de las membranas plasmáticas de las células. De acuerdo con
esto, investigaciones recientes (Yikmis y col., 2019) han reportado el sinergismo que ocurrió
cuando se combinó la metodología de US (80W; 26 kHz; 60%; 5 min) con Na (12,5ppm) para el
estudio de la microflora nativa de un jugo de granada. Los autores reportaron que tanto al inicio
como al final del almacenamiento (30 días a 4°C) los recuentos se encontraron por debajo del
límite de detección para el tratamiento combinado de US+Na; mientras que la natamicina, como
único método, logró mantener un efecto bacteriostático presentando recuentos al inicio y al final
del almacenamiento alrededor de 4 log UFC/mL (vs controlinicio≈5 log UFC/mL - controlfinal≈7
log UFC/mL) para BAM y EB; y solamente se vio completa efectividad con recuentos por debajo
del límite de detección para M&L, tanto a día 1 como a día 30. En el caso de los tratamientos de
US y US+Ni250, se pudo ver en ambos casos un efecto bacteriostático durante el almacenamiento
hasta día 21 inclusive, manteniendo recuentos por debajo de 4,0 y 3,7 log UFC/mL,
respectivamente. Y un aumento al final de éste (día 28) que, de todos modos, para el caso de la
muestra conteniendo nisina, fue significativamente menor al alcanzado por el control (p<0,05).
Fernandez y col. (2018) reportaron, de manera similar, que la nisina (250ppm) empleada sobre
hojas de remolacha presentó la típica reducción inicial característica de la actividad de este AN
(Fernandez y col. 2014) y luego, dentro de las primeras 6 horas el recuento de BAM aumentó
alcanzando valores similares a los de las muestras de control. Entonces, en el ensayo de esta Tesis,
se puede ver que al combinar Ni con US se logró controlar mejor el crecimiento durante todo el
almacenamiento. Y por último, el tratamiento de US+Té tuvo una tendencia al aumento de sus
recuentos iniciales obteniendo valores similares al control al final del almacenamiento. Si bien,
el galato de epigalocatequina (EGCG), que es la principal catequina presente en el té verde, puede
unirse directamente a los peptidoglicanos e incitar su precipitación (Bansal y col., 2013),
induciendo daño en la pared celular e interfiriendo con su biosíntesis, su eficiencia depende, entre
otras variables, de la concentración utilizada (Fernandez y col. 2018). Si bien se podría pensar
que aún aplicado en una menor concentración, en base a lo que fue demostrado anteriormente en
la sección 4.1.1.a. donde una concentración de 0,5% del té no resultó efectiva contra los mismos
microorganismos, podría haber tenido efecto sinérgico al combinarse con ultrasonido, esto no fue
lo sucedido en este ensayo.
113
Resultados
BAM
7
6
log UFC/mL batido
5
0
4 7
14
3 LD
21
28
2
1
Tratamientos
Figura 4.14 - Recuento de BAM en muestras control y muestras tratadas con

ultrasonido en combinación con antimicrobianos naturales, tomando mediciones a
día 0, 7, 14, 21 y 28 durante el almacenamiento a 5°C.
En el caso de enterobacterias (EB) (Figura 4.15), los tratamientos con té (US+Té) y con
natamicina (US+Na100) fueron los que obtuvieron reducciones iniciales significativas
comparando con el control (p>0,05), mientras que los tratamientos de US y US+Ni250 resultaron
con recuentos muy similares al control, de modo que no mostraron diferencias significativas
(p>0,05). Para el caso del tratamiento US+Ni250 fue el único que no afectó inicialmente, a día 0,
al recuento de EB, este resultado está de acuerdo con otros autores (Helander y Mattila-
Sandholm, 2000; Delves y col., 2011) quienes reportan la insensibilidad de las bacterias Gram
negativas frente a la nisina. También, en el estudio de Fernandez y col. (2018), mencionado
anteriormente, se encontró que las muestras tratadas con nisina (500 ppm) (o natamicina 200 ppm)
presentaron un comportamiento similar al control, en sus recuentos de EB.
Por otra parte, al final del almacenamiento, tanto el control como todos los tratamientos
evaluados resultaron con recuentos por debajo del límite de detección (<2 log UFC/mL) a día 28.
Esto se debe probablemente al bajo pH del batido y que posiblemente la microflora Gram negativa
imperante sea sensible a la acidez. Sin embargo, cabe destacar que a día 21 mientras el control
seguía con un recuento de 2,85 log UFC/mL, las muestras tratadas ya se encontraban en recuentos
cercanos, y por debajo, del límite de detección (2 log UFC/mL). De modo que, considerando
nuevamente los efectos antimicrobianos del US (Farhadi Chitgar y col., 2017), pudo haberse
favorecido el acceso y acción de otros antimicrobianos, como la nisina, que generalmente es
incapaz de penetrar en la membrana externa de bacterias Gram negativas debido a su gran tamaño
(1,8-4,6 kDa) (Helander y Mattila-Sandholm, 2000). Además, el pH bajo del alimento
mencionado anteriormente también podría jugar un rol determinante en el comportamiento de las
EB, que a menudo es un obstáculo adicional que inhibe el crecimiento bacteriano (Delves y col.,
2011). De esta forma, cuando se combinan con ciertos procesos no térmicos, las condiciones
ácidas pueden resultar en una mayor inactivación de bacterias vegetativas y esporas que a pH
neutro. La mayor inactivación de las células vegetativas se debe presumiblemente a cambios
estresantes en el pH citoplásmico combinado con la pérdida de la funcionalidad de la membrana
114
Resultados
y otros daños celulares causados por los obstáculos del procesamiento no térmico (Ross y col.,
2003). Adicionalmente, se vio previamente en la sección 4.4.2.d. que tanto la muestra control
como la tratada con ultrasonido han logrado valores similares de compuestos betalaínicos al final
del almacenamiento. De modo que también se podría considerar una contribución adicional por
parte de la actividad antimicrobiana de las betalaínas, estas suponen efectos adversos sobre la
estructura, función y permeabilidad de la membrana celular de los microorganismos, lo que
eventualmente conduce a la muerte celular. Aunque se encontró que las betalaínas inhiben un
amplio espectro antimicrobiano, se informa muy poco en la literatura sobre su mecanismo de
inhibición microbiana (Gengatharan y col., 2015).
EB
4.5
4
log UFC/mL batido
3.5
3 0
7
2.5
14
LD
2 21
28
1.5
1
Tratamientos
Figura 4.15 - Recuento de EB en muestras control y muestras tratadas con

ultrasonido en combinación con antimicrobianos naturales, tomando
mediciones a día 0, 7, 14, 21 y 28 durante el almacenamiento a 5°C.
En cuanto a mohos y levaduras (M&L) (Figura 4.16), todos los tratamientos conteniendo
antimicrobianos lograron reducciones iniciales significativas comparando con la muestra control
(p<0,05), y a su vez, no presentaron diferencias significativas entre ellos (p>0,05). Además, es
interesante destacar que, durante el almacenamiento, el tratamiento US+Na100 ha sido el único
capaz de mantener la reducción inicial lograda, mostrando a día 28 un recuento significativamente
menor comparando con el control y el resto de los tratamientos (p<0,05), los cuales tuvieron una
tendencia de aumento de los recuentos llegando a valores similares al control. Este resultado fue
esperado, ya que como fue mencionado anteriormente, es sabido que la natamicina bloquea el
crecimiento de hongos al unirse específicamente al ergosterol (responsable del transporte de
nutrientes intracelular), presente casi exclusivamente en las membranas plasmáticas de éstos (Te
Welscher y col., 2010). La natamicina forma un complejo con el ergosterol de la célula fúngica,
complejo polienosterol, esta compleja estructura conduce a una rápida fuga de iones esenciales y
pequeños péptidos al alterar la permeabilidad de la membrana, lo que probablemente explica el
mecanismo de la natamicina para inactivar mohos y levaduras (Te Welscher y col., 2008). De
forma similar, Ollé Resa y col. (2014) vieron que la inactivación de levaduras, en un estudio in
vitro sobre un sistema alimenticio líquido, aumentó utilizando mayor concentración de natamicina
como único método. De modo que una dosis de 20 ppm de natamicina mostró que el número de
115
Resultados
células de S. cerevisiae se redujo a 1,25 log UFC/mL después de 96 horas y tuvo un efecto
fungistático durante los 4 días adicionales evaluados (a 28°C), mientras que el tratamiento con 50
ppm de natamicina sobre la misma población inicial, produjo una mayor reducción de este
microorganismo, y después de 96 horas resultó en menos de 1 log UFC/mL. Gallo y Jagus (2006)
también estudiaron la inactivación de S. cerevisiae en suero de queso líquido tratado con
diferentes niveles de natamicina (12,5 mg/L a 100 mg/L) y con diferentes tamaños de inóculo,
mostrando que la inactivación de S. cerevisiae aumentó con tiempo de almacenamiento y
concentración de natamicina. Investigaciones recientes (Karaman y col., 2020) demostraron el
potencial de la natamicina para inhibir Zygosaccharomyces bailii y Z. rouxii, las levaduras
osmotolerantes que causan graves deterioros en las matrices alimentarias que contienen azúcar
como el jugo de manzana. De esta forma, los autores determinaron que el jugo de manzana podría
conservarse en buen estado hasta los 41 días de almacenamiento bajo refrigeración, con la adición
de natamicina que también demostró tener una capacidad antioxidante para mejorar las
propiedades bioactivas durante el almacenamiento. Además, (Yikmis y col., 2020) reportaron que
el tratamiento combinado de ultrasonido (80W; 26 kHz; 60%; 5 min) y natamicina (12,5 ppm) a
un jugo de uva roja produjo una reducción de 2,4 log UFC/mL del hongo Botrytis cinerea (hongo
patógeno de muchas especies vegetales y animales, generalmente llamado moho gris) luego de
un mes de almacenamiento bajo refrigeración (4°C).
Es importante destacar que en trabajos previos realizados por el grupo de trabajo se mostró
M&L
7
6
log UFC/mL batido
5
0
4 7
14
3 LD
21
28
2
1
Tratamientos
Figura 4.16 - Recuento de M&L en muestras control y muestras tratadas

con ultrasonido en combinación con antimicrobianos naturales, tomando
mediciones a día 0, 7, 14, 21 y 28 durante el almacenamiento a 5°C.
que los tratamientos individuales con Ni (500UI/mL), Té (1,0%) y Na (200ppm) en este mismo
batido, no resultaron efectivos para el control de la microflora nativa evaluados durante un
almacenamiento en refrigeración (hasta día 28) (Nieva y col., 2019; 2021). Por lo tanto, todos los
efectos significativos hallados en este ensayo, donde adicionalmente se probaron dosis menores
de los antimicrobianos, se deben a la combinación del tratamiento de US con los respectivos AN.
116
Resultados
Finalmente, es importante mencionar que si se considera el límite máximo usualmente

aceptado tanto para BAM como para M&L en bebidas a base de F&V (106 UFC/g), la muestra
control y el tratamiento US+Té fueron aceptables hasta el día 14, el tratamiento US fue aceptable
hasta el día 21, logrando extender la vida útil microbiológica del batido por lo menos 7 días, y los
tratamientos US+Ni250 y US+Na100 hasta el día 28, siendo estos dos últimos capaces de
extender la vida útil microbiológica por lo menos 14 días.
4.4.3. Efecto de la combinación de ultrasonido y antimicrobianos naturales frente

a Listeria innocua y Escherichia coli
Este ensayo se realizó debido a la importancia de diseñar tratamientos que no solo sean
efectivos para prolongar la vida útil de los productos alimenticios sino también para asegurar su
inocuidad en el caso de contaminaciones con patógenos. Tanto en el caso de Listeria spp. como
de Escherichia coli se verificó en estudios previos realizados con esta matriz, que debido al pH
del batido, estos microorganismos no logran desarrollarse, de hecho Listeria se inactiva. Esto
también ha sido notado en otros estudios donde se ha informado que tanto Listeria como E. coli
son bacterias que pueden sobrevivir sin proliferar en condiciones de bajo pH (3,5±0,2) y
temperaturas de refrigeración (Jordan y col., 2001; Ferrante y col., 2007). Por lo tanto, este ensayo
se hizo solo a tiempo cero, evaluando el efecto inmediato del tratamiento, de modo que esta
inactivación inicial será determinante de la efectividad del tratamiento.
Los resultados encontrados tanto para L. innocua como para E. coli se pueden ver en la Figura
4.17. Para el caso de L. innocua, los tratamientos de US y US+Na100 obtuvieron reducciones de
0,4 y 0,6 ciclo log con respecto al control, no observándose diferencias significativas (p>0,05).
Por su parte, el tratamiento de US+Té logró una reducción significativa de 1,5 log (p<0,05), y
finalmente el tratamiento de US+Ni250 fue el que logró un mayor efecto antilisterial,
encontrándose una reducción significativa de al menos 2,9 log, ya que para este último tratamiento
se obtuvo un recuento por debajo del límite de detección (< 2,7 log UFC/mL).
En cuanto a E. coli, los tratamientos de US y US+Ni250 obtuvieron reducciones no

significativas de 0,6 log, comparando con el control (p>0,05). En cambio, las muestras tratadas
con US+Té y US+Na100 fueron las que lograron las mayores reducciones, de 1,0 y 0,7 log,
respectivamente, diferenciándose estadísticamente de las muestras control (p<0,05). Si bien estas
reducciones son bajas, se consideran relevantes debido a la dificultad de encontrar tratamientos
que sean efectivos para inactivar bacterias Gram negativas.
117
Resultados
Recuento Microbiano
6.00
log UFC/mL batido
5.00 L. innocua
E. coli
4.00
3.00 LD
2.00
C US US+NI250 US+Té(0,2%) US+NA100
Tratamientos
Figura 4.17 - Recuento de Listeria innocua y E. coli en muestras control y muestras

tratadas con ultrasonido en combinación con antimicrobianos naturales, a día 0.
De acuerdo a los resultados obtenidos, en este ensayo, se pudo ver que el tratamiento de
sonicación de 70% de amplitud durante 4 minutos (US), por sí solo no ha logrado una reducción
significativa de los microorganismos aquí estudiados (L. innocua y E. coli). De manera similar,
Alighourchi y col. (2014) mostraron que los niveles de amplitud más bajos (50 y 75%) aplicados
a un jugo de granada, manteniendo una temperatura de 25°C, no inactivaron E. coli y S. cerevisiae
significativamente (reducción <1,5 log), mientras que a un nivel de amplitud del 100% durante
15 minutos, la población de ambos microorganismos tuvo una reducción de 3,2 log UFC/mL.
Estudios más recientes (Guo y col., 2020) demostraron que el tratamiento con ultrasonido solo,
independientemente de las diferentes intensidades utilizadas (127, 191 o 255 W/cm 2), no afectó
significativamente (p>0,05) la eficacia de inactivación contra las células de E. coli, en cambio, la
aplicación de ultrasonidos durante más tiempo dio como resultado una actividad antibacteriana
significativamente más fuerte (p<0,05). De todos modos, los autores reportaron que el ultrasonido
por sí solo no logró una reducción mayor a 1 log en las poblaciones de E. coli incluso cuando el
tratamiento se aplicó a la intensidad más alta (255 W/cm2) y el tiempo de tratamiento más largo
utilizado en ese estudio (9 minutos). A su vez, Ugarte-Romero y col. (2007) vieron, en un estudio
in vitro, que las células de L. monocytogenes (G+) eran más resistentes a la sonicación (1,43
W/mL; 20 min; T<35°C (subletal)) que algunas cepas de Shigella (G-), encontrando una
reducción de 2,7 log para Listeria, mientras que la reducción de Shigella bajo esa misma
condición fue de 5,5 log. Los autores indicaron que la pared celular más gruesa de los organismos
Gram positivos, los cuales presentan una comprimida capa de peptidoglicanos, probablemente
actuó como un mecanismo de protección para mitigar el daño causado por las fuerzas de
cizallamiento y otros factores inactivadores generados por la cavitación. Adicionalmente, al igual
que en esta Tesis, Lee y col. (2003) también observaron estas diferencias similares en la
resistencia al ultrasonido en sus pruebas de sonicación sobre E. coli (G-) y Listeria (G+).
La combinación de US y ETV (US+Té) ha logrado, para ambos microorganismos, reducciones

significativas respecto a las muestras control, de modo que se han obtenido recuentos similares
para L. innocua y E. coli luego del tratamiento. Sin embargo, múltiples estudios con
antimicrobianos provenientes de plantas han indicado que algunos son más efectivos contra
118
Resultados
bacterias Gram positivas (como Listeria) que contra bacterias Gram negativas (como E. coli)
(Delaquis y col., 2002; Burt y col., 2004). En primer lugar, Gilling y col. (2019) reportaron que
tanto el extracto de semilla de uva (ESU) como el ETV (5,0% y 6,0% peso/volumen,
respectivamente) tuvieron una eficacia limitada contra la E. coli (G-) en el estudio in vitro en
solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS; pH 7,4; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO),
requiriendo 24 horas para lograr una reducción significativa; de esta forma, los autores indican
que el ETV y el extracto de semilla de uva fueron bastante efectivos con tiempos de exposición
prolongados y que podrían usarse en situaciones en las que no se requiere una muerte rápida, o
en combinación con una técnica rápidamente eficaz para proporcionar un efecto residual adicional
de larga duración (Gilling y col., 2019). Por otra parte, Theivendrans y col. (2006) reportaron que
al evaluar el efecto inhibidor de estos compuestos naturales en un medio de solución tampón
fosfato (PBS, pH=7) que contenía aproximadamente 109 UFC/mL de L. monocytogenes, se
demostró que tanto el ESU (1%) como el ETV (1%) resultaron eficaces para inhibir L.
monocytogenes en ese medio. Por su parte, el tratamiento con ETV (1%) disminuyó 2 log la
población celular a las 12 horas de incubación en PSB a 37°C y a su vez el número de
supervivientes se mantuvo similar hasta las 48 horas de incubación. Además, también informaron
que cuando el ETV se combinó con nisina, el efecto aumentó significativamente (p<0,05) en
comparación del ETV solo. Se ha demostrado que los componentes fenólicos presentes en este
extracto natural (aproximadamente: epicatequina (1087,0 mg/100g), ácido cafeico (830,1
mg/100g), ácido benzoico (319,8 mg/100g) y ácido siríngico (75,91 mg/100g) (Rababah y otros
2004)) son individualmente eficaces contra patógenos bacterianos (Theivendrans y col., 2006).
De acuerdo con los resultados obtenidos en las muestras tratadas conteniendo bacteriocinas
(US+Ni250 y US+Na100), otros investigadores (McNamee y col., 2010) notaron que la
incorporación de nisina y natamicina en jugo de naranja procesado por tecnología PEF lograba
inactivar microorganismos de descomposición (P. fermentans) y patógenos (E. coli y Listeria
spp.). Las combinaciones de nisina y PEF mostraron un efecto sinérgico sobre los niveles de
microorganismos estudiados. Los cambios producidos por la nisina en la envoltura celular de L.
innocua pueden mejorar la sensibilidad celular al tratamiento con PEF. Por otro lado, los autores
informan que el daño estructural inducido por PEF en la pared celular de E. coli k12, o un daño
subletal pueden haber aumentado la sensibilidad de este microorganismo a la nisina. Las bacterias
Gram negativas son generalmente resistentes a la nisina (Thomas y col., 2000), y solo se encontró
que los esferoplastos de E. coli eran sensibles a ella (Schved y col., 1996) de forma que se ha
demostrado que la nisina es eficaz contra bacterias Gram negativas con membranas externas rotas
(Stevens y col., 1992). Por otra parte, en relación a esta Tesis, es sabido que la cavitación acústica
resultante del tratamiento con ultrasonidos de alta potencia a 20-100 kHz induce la inactivación
microbiana a través de la rotura de las membranas celulares y el daño de las biomoléculas
intracelulares (Huang y col., 2017). Por lo cual, se podría pensar que, al igual que lo mencionado
para PEF, la aplicación del ultrasonido en combinación con nisina o natamicina posiblemente
actúen de manera aditiva o sinérgica para mejorar la actividad antimicrobiana de ambos.
Otras investigaciones donde se combina ultrasonido con otros antimicrobianos también

obtuvieron resultados muy prometedores, por ejemplo, Park y col. (2019) informaron que cuando
sometieron un jugo de manzana, contaminado con E. coli O157:H7, S. Typhimurium o L.
monocytogenes, a un tratamiento por US durante 5 minutos, la carga de patógenos se redujo en
0,80, 0,87 o 1,05 log UFC/mL, respectivamente. Luego, probaron el efecto bactericida de ácido
fumárico (0,05, 0,1 y 0,15%) como AN en el jugo de manzana, obteniéndose distintas reducciones
para E. coli O157: H7 (1,23, 2,42 y 3,32 log UFC/mL) y para L. monocytogenes (1,10, 1,57 y
119
Resultados
1,85 log UFC/mL) después de 5 minutos de tratamiento solo con el ácido. Finalmente, cuando el
jugo de manzana contaminado se trató con una combinación de US y 0,1% de ácido durante 5
minutos, la carga media de E. coli O157: H7, S. Typhimurium y L. monocytogenes se redujo en
3,59, 5,88 y 2,22 log CFU/mL, respectivamente. Algunas combinaciones de US y ácido fueron
sinérgicas mientras que otras fueron aditivas o antagónicas, dependiendo de la concentración de
ácido. Por lo tanto, una vez más queda en evidencia la eficacia de la actividad antimicrobiana de
los ultrasonidos en combinación con otras tecnologías, resultando la llamada tecnología de
obstáculos (Sango y col., 2014).
Finalmente, se debe considerar que las contaminaciones reales suelen ser con concentraciones
mucho más bajas que la aquí simulada, el efecto de los tratamientos antimicrobianos suele ser
mayor en ese caso, por lo que probablemente se pueda esperar un mejor desempeño de los
tratamientos en un escenario de contaminación real. Los resultados obtenidos fueron
significativos y muy prometedores, especialmente si se tiene en cuenta que la contaminación se
simuló con un margen de seguridad muy grande. Adicionalmente, se sabe de estudios previos
sobre el mismo batido (Nieva y col., 2019; 2021) que la combinación de los tres AN (Té, Ni y
Na) lograron reducciones de alrededor de 6 log para BAM y EB, y recuentos por debajo de 3 log
UFC/mL para M&L durante el almacenamiento en refrigeración (5°C) por 28 días. De modo que,
lograron prolongar la vida útil de los batidos por al menos 14 días, si se consideran los límites
microbianos usualmente aceptados (6 log BAM) en este tipo de producto. Teniendo en cuenta
estos resultados para futuros ensayos se propone la combinación ternaria de US+Té+Na o bien
US+Té+Ni que podrían complementarse en su acción logrando efectos más importantes.
120
Conclusiones
5. CONCLUSIONES
El presente trabajo de investigación para mi Tesis de Grado permitió desarrollar nuevos

conocimientos en el área de preservación de matrices complejas, como lo son los batidos mixtos
de frutas y verduras (F&V), empleando como tecnologías de preservación: Irradiación Gamma
(IG), Ultrasonido (US), y su combinación con Antimicrobianos Naturales (AN). Se obtuvieron
resultados relacionados con el efecto inmediato de los tratamientos sobre las principales causas
de deterioro (actividad microbiana y enzimática) y sobre sus atributos de calidad fisicoquímica,
nutricional y sensorial. Adicionalmente, se exploró la estabilidad de los batidos durante el
almacenamiento bajo refrigeración (5°C) y la efectividad de los tratamientos para el control de
una contaminación con subrogantes de los principales microorganismos (MO) patógenos de
interés en estos productos (Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157:H7).
La formulación del batido seleccionado como sistema de estudio, conteniendo hojas y tallos
de remolacha (cv. Detroyt, Argentina), junto a los demás ingredientes (naranjas, manzanas y
zanahorias), tuvo el doble valor de, por una parte, aportar una estrategia de revalorización para
estas porciones de la planta de remolacha muy poco explotadas y/o muchas veces desechadas. Y,
por otra parte constituir el sistema complejo mezcla de frutas y verduras, que al no tener en su
proceso una etapa de filtrado, mantiene las fibras naturales de las F&V, un mayor contenido de
sólidos y por ende una textura más consistente, en el que se buscó probar las tecnologías para
cubrir un área de vacancia.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los diferentes ensayos realizados, se pudo
establecer particularmente que:
• La irradiación, aplicada de manera individual en dosis de 1,5 y 3,0 kGy, fue efectiva para
controlar los MO, al inicio y durante el almacenamiento, siendo las bacterias aerobias
mesófilas (BAM), entre los grupos microbianos evaluados, las más resistentes a los
tratamientos. No se vio tal efectividad para la inactivación de enzimas. Desde el punto de
vista sensorial, si bien no se observaron diferencias significativas respecto del control,
con la dosis más alta se observaron tendencias como pérdida de color rojizo y dulzor.
• Se determinó mayor radioresistencia por parte de la bacteria Listeria innocua,
presentando una reducción decimal de D10 =0,79, en comparación con el patógeno
Listeria monocytogenes que presentó un valor de D10=0,41. Teniendo en cuenta este
resultado, se seleccionó Listeria innocua como microorganismo de diseño del tratamiento
de irradiación para ensayos posteriores.
• El extracto de té verde (ETV) (0,5%), aplicado como método de preservación individual,
resultó insuficiente para reducir de la microflora nativa. A su vez, su uso en combinación
con IG no presentó mejoras respecto de la irradiación por sí sola. Asimismo, el té verde
impartió su típico sabor astringente que resultó inaceptable en las dosis utilizadas. Sin
embargo, se destacó el excepcional potencial de ETV para incrementar
significativamente la capacidad antioxidante del batido y mejorar su calidad nutricional.
• La nisina (Ni) empleada en concentraciones de 100 y 300 ppm resultó muy eficaz en la
reducción de Listeria innocua, al inicio y durante el almacenamiento, logrando recuentos
por debajo del límite de detección al final éste. En cambio, no fue tal la efectividad para
las BAM las cuales, al final del almacenamiento, llegaron a recuentos similares al control.
121
Conclusiones
• La irradiación sola (1,0 y 2,0 kGy), al igual que el tratamiento con Ni, logró reducciones
significativas de L. innocua, al inicio y durante el almacenamiento. Además, también fue
efectiva en la reducción de BAM, logrando recuentos cercanos y por debajo del límite de
detección al final del almacenamiento.
• Los tratamientos combinados de IG y Ni obtuvieron resultados muy prometedores,
logrando recuentos por debajo del límite de detección inmediatamente después de la
aplicación de éstos, manteniendo este efecto durante el tiempo de almacenamiento
evaluado, quedando abierta la posibilidad de trabajar con combinaciones de dosis más
bajas que podrían resultar igualmente efectivas.
• Los tratamientos de US, aplicados de manera individual, mostraron que mayor porcentaje
de amplitud (>50%), mayor tiempo de procesamiento (>4 min) y temperaturas elevadas
(>50°C) se obtienen las mayores reducciones iniciales de microflora nativa, logrando
además controlar su crecimiento durante el almacenamiento. A su vez, en general, se
identificó que los mohos y levaduras (M&L) fueron el grupo más sensible frente este
tratamiento, seguido de las enterobacterias (EB) y las BAM, mostrando estas últimas ser
las más resistentes.
• Las mayores reducciones de las actividades enzimáticas evaluadas (PPO, POD y PME)
se lograron con la combinación de temperaturas elevadas (>50°C) y porcentajes de
amplitud elevados (>50%). Además, se evidenció que en algunos casos el aumento del
tiempo de tratamiento de US, bajo temperatura controlada, puede producir una activación
enzimática.
• Los aumentos obtenidos en contenido de polifenoles totales y capacidad antioxidante
mediante el procesamiento de US, sin control de temperatura, no fueron significativos,
pero tampoco las pérdidas fueron relevantes.
• El contenido de betalaínas fue significativamente mayor en los tratamientos con mayor
porcentaje de amplitud (≥70%) y mayor tiempo de sonicación (≥4 min). A su vez,
posiblemente la extracción de estos compuestos es mejorada a una temperatura alrededor
de 50°C.
• Los tratamientos combinados de US con AN resultaron eficaces para reducir inicialmente
la microflora nativa y controlar su crecimiento durante el almacenamiento. Se destaca, en
primer lugar, el tratamiento con nisina US+Ni el cual obtuvo reducciones iniciales
significativas de BAM y M&L, y en segundo lugar, el tratamiento con natamicina (Na)
US+Na que pudo mantener y reducir el recuento de estos microorganismos durante el
almacenamiento. Además, ambos lograron prolongar la vida útil microbiológica por lo
menos 14 días.
• El ETV (0,2%), combinado con el tratamiento de US, aumenta significativamente el
contenido de polifenoles totales, betalaínas y la capacidad antioxidante en el batido.
• Mientras que el tratamiento de US, como único método de preservación, no logró
reducciones iniciales significativas de L. innocua o de E. coli, su combinación con Ni250
o ETV(0,2%) lograron reducir significativamente el recuento de L. innocua, y su
combinación con ETV(0,2%) o Na100 lograron reducir significativamente el recuento de
E. coli, demostrando el potencial de estos tratamientos para el control de los MO
patógenos comúnmente asociados a brotes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos
(ETAS) por consumo de este tipo de producto.
Por lo expuesto, se puede afirmar que los Objetivos planteados inicialmente fueron cumplidos.
Sin embargo, vale la pena mencionar que algunos nuevos interrogantes han surgido:
122
Conclusiones
• ¿Cuáles son las dosis óptimas para el tratamiento de irradiación en combinación con
nisina?. Y ¿cómo afecta este tratamiento a la estabilidad nutricional y sensorial del
producto?
• ¿Cuáles son los mecanismos específicos de acción que explican los efectos encontrados
al combinar US y Na sobre las bacterias Gram positivas y Gram negativas estudiadas en
este Tesis?
• ¿Cuáles son los efectos del tratamiento combinado de dos tecnologías de preservación no
térmicas, como la IG y el US? Su estudio y optimización frente a la calidad
microbiológica y a los diferentes indicadores de calidad analizados en esta Tesis,
evaluados inicialmente y durante el almacenamiento.
• ¿Cómo resultaría la combinación ternaria de US o IG con mezclas de los AN utilizados
en esta Tesis? Como ser: US(o IG)+Té+Ni, US(o IG)+Té+Na.
• ¿Qué posibilidades de inserción de estos productos hay en el mercado argentino?
Futuras investigaciones podrían orientarse a abordar estos aspectos que, algunos de ellos
estaban fuera del alcance de mi Tesis y otros, no se pudieron realizar por los recesos de
público conocimiento a causa del Aislamiento Social, Preventivo y Obligatorio y
el Distanciamiento Social, Preventivo y Obligatorio a partir de la pandemia de COVID-19.
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

APLICACIÓN DE IRRADIACIÓN GAMMA,

TESIS DE GRADO INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Tesista: Casco, María de los Ángeles

Directoras: Dra. Ing. Fernández, María Verónica

Dra. Ing. Agüero, María Victoria

BUENOS AIRES, 18 de junio de 2021

5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 121

A Tomás Ben y a todo el equipo de trabajo de BEGROUND, por brindarme mi primer

A la Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ingeniería, Facultad de Ciencias Exactas

Recientemente, la tendencia hacia la búsqueda de alimentos más nutritivos, saludables y

En el marco de esta Tesis se estudió y optimizó el proceso de conservación de un batido mixto

1.1. DIETA SALUDABLE Y CONSUMO DE FRUTAS Y VERDURAS

1.1.1. Algunos Problemas por el bajo consumo de frutas y verduras

A principios del 2002 se realizó la Consulta Mixta OMS/FAO de Expertos en Régimen

Se ha constatado que la carga de enfermedades crónicas ha aumentado rápidamente en todo el

En el análisis de las promociones del consumo saludable, se constata una importante

1.1.2. Demanda de alimentos saludables

Los incentivos para la comercialización y producción de alimentos más saludables deberían

En respuesta a la demanda de estos consumidores más informados, la industria alimentaria,

1.1.3. Bebidas naturales

Las bebidas a base de frutas y verduras se han posicionado en un sector de la industria

Generalmente, los jugos de frutas comercializados tienen un porcentaje mínimo de fruta

solo en el desarrollo de formulaciones nutritivas y atractivas, sino también en el estudio e

1.2. APROVECHAMIENTO DE RECURSOS PARA LA INDUSTRIA

En contraste, la utilización de estos subproductos que pueden resultar nutritivos y beneficiosos

Un ejemplo de esto puede apreciarse en México, donde se consumen altas cantidades de

En España, se realizó un estudio de caracterización y aprovechamiento de tubérculos andinos

En Argentina, se puede citar el caso de las hojas y tallos de remolacha, subproductos de la

antioxidante (70%RSC) (Fernandez y col., 2014). Asimismo, se demostró que su calidad

También, en Argentina, se han proporcionado diversos usos a la calabaza y sus subproductos;

1.3. CALIDAD E INOCUIDAD DE FRUTAS, VERDURAS Y

1.3.1. Calidad Microbiológica

deteriorativos menos frecuentes son mohos de los géneros Trichoderma, Aureobasidium

En esta misma línea de investigación, se ha constatado el vacío existente en algunos países

pasteurización1 y no se ven afectados. Muchos de los casos reportados fueron a causa de

Muchos incidentes como estos llevaron a que la Administración Federal de Drogas y

anualmente no muestran tendencias a disminuir, siendo evidente que la contaminación de

Escherichia coli O157:H7:

Por otro lado, Listeria innocua es un microorganismo no patógeno, pero en muchas

Tabla 1.1 - Especificaciones microbiológicas de hortalizas y frutas frescas.

En este contexto, los procesadores de alimentos y la comunidad científica que están

Tabla 1.2 – Especificaciones microbiológicas de alimentos preparados listos para el

Salmonella spp. N=5, c=0, Ausencia en 25g ISO 6579:2002

1.3.2. Calidad Fisicoquímica, Sensorial y Nutricional

Figura 1.1 – A: Estructura de resonancia de betalaínas; B: Estructura básica de

componentes de polifenoles vegetales conocidos como flavonoides, son responsables de los

Figura 1.2 - Estructura química de compuestos polifenólicos flavonoides. Los esqueletos

Figura 1.3 - Estructura química de compuestos polifenólicos no flavonoides.

A pesar de la gran cantidad de bebidas mixtas de F&V disponibles actualmente en el mercado,

1.4. TECNOLOGÍAS NO TÉRMICAS

El desarrollo y la optimización de las formulaciones de bebidas son pasos muy importantes

Actualmente, la pasteurización térmica es el tratamiento comúnmente aplicado para la

En esta Tesis se aplicaron ultrasonido e irradiación gamma como técnicas de preservación

1.4.1. Irradiación gamma

La irradiación gamma (IG) de productos alimenticios se ha utilizado en más de 60 países y su

Actualmente, la dosis de radiación recomendada por la Comisión FAO/OMS del Codex

Los microorganismos son inactivados por IG principalmente debido al daño en el ADN y

lo tanto, algunos microorganismos de deterioro y cepas de Salmonella, E. coli,y Campylobacter,