Espectrofotometría

Alcedo Bernardo, Johana Akira.

Aranda Maguiña, Yumila Neyda.

Barrera Oriundo, Ricardo Junior.

Cuadros Andrade, Eva Milena Meyling.

Calvo Morales, Tomas Romario.

Dextre Tapia, Leishner Junior.

Escuela de Ingeniería Ambiental, Universidad José Faustino Sánchez Carrión

C33 - Química Analítica - V ciclo

Ing. Natividad Huasupoma, Delicias.

02 de junio de 2021
 Índice
1 Introducción.............................................................................................................4

2 Objetivos..................................................................................................................5

3 Justificación.............................................................................................................6

4 Marco Teórico..........................................................................................................7

4.1 Espectrofotometría...........................................................................................7

4.1.1 Espectrofotometría de Absorción...............................................................7

4.1.2 Espectrofotometría de Emisión..................................................................7

4.2 Radiación Electromagnética.............................................................................7

4.3 Parámetros Ondulatorios de la Radiación Electromagnética...........................7

4.4 Espectro Electromagnético...............................................................................9

4.5 Interacciones de los Analitos con la Luz..........................................................9

4.5.1 ¿Qué sucede cuando un átomo absorbe energía lumínica?........................9

4.5.2 ¿Qué sucede cuando una molécula absorbe energía lumínica?................10

4.6 Espectrofotometría de Absorción Molecular Uv-Visible...............................11

4.6.1 ¿Qué significa que el analito absorbe luz?...............................................11

4.6.2 Absorbancia..............................................................................................11

4.6.3 Ecuación de Lambert y Beer....................................................................12

4.6.4 Componentes del Espectrofotómetro Uv-Vis...........................................14

 4.6.5 Aplicaciones de la Espectrofotometría de Absorción Molecular.............15

4.7 Espectrofotometría de Emisión Atómica: Fotometría de Llama....................15

4.7.1 Componentes del Fotómetro de Llama.....................................................16

4.7.2 Procesos que Ocurren en la Llama...........................................................17

4.7.3 Aplicaciones Agronómicas de la Fotometría de Llama...........................17

5 Conclusiones..........................................................................................................18

6 Bibliografía............................................................................................................19

7 Anexos...................................................................................................................20

7.1 Anexo 1..........................................................................................................20

7.2 Anexo 2..........................................................................................................20

 1 Introducción

Aproximadamente entre las décadas de 1950 y 1057, los espectrofotómetros fueron

herramientas fundamentales en los laboratorios clínicos y parte fundamental para los investigadores. En

la actualidad son aparatos cotidianos también en los laboratorios químicos[CITATION Rob18 \l 3082].

La contribución de la espectrofotometría a la química ha sido tan grande que según Bruce

Merrifield ganador del premio Novel de química en el año 1984, catalogo como probablemente como

uno de los instrumentos más importantes jamás desarrollado para el avance de la Biociencia.

Una de las finalidades es que hace años anteriores se han empleado el color como parte

fundamental para reconocer las sustancias químicas, lo cual se reemplazó el ojo humano por otros

doctores de radiación donde se puede estudiar la absorción de sustancias, la zona del espectro visible,

en ultravioleta y ultrarrojo[CITATION Iva17 \l 3082].

La Espectrofotometría UV - Visible es una de las técnicas empleadas en Química Analítica sea

cuantitativa o cualitativa que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se

encuentra basado en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas, cabe recalcar que

también nos permite determinar la cantidad de luz que absorbe, depende de forma lineal de la

concentración. Para poder realizar las medidas se emplea un espectrofotómetro donde podemos

seleccionar la longitud de onda de la luz que traspasa por una solución y medir la cantidad de la Luz

que absorbe. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía

interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y

bacterias[CITATION Nie16 \l 3082].

 2 Objetivos

 Profundizar en el ámbito del estudio utilizando la técnica analítica que nos permiten la

determinación cualitativa y cuantitativa.

 Reconocer el termino Luz que se aplica de forma visible de la radiación electromagnética.

 Conocer la Ley de Lambert-Beer.

 Aspectos de absorción.

 Determinaciones colorimétricas específicas de compuestos.

 3 Justificación

El planteamiento y desarrollo de la validación de esta técnica analítica espectrofotométrica se

enfoca directamente en tomar en cuenta la importancia de conocer los protocolos que se emplean al

momento de realizar una validación de cualquier técnica de análisis; logrando que para un profesional o

un estudiante en la práctica cotidiana, no sea dificultoso validar la técnica empleada conociendo y

aplicando las herramientas necesarias como el análisis cualitativo y cuantitativo, el análisis

instrumental.

Para el tratamiento de los datos obtenidos y como resultado la emisión de resultados verídicos y

confiables. Es importante en la validación de un método analítico, el no arrastrar o sumar errores, por lo

que la calibración o verificación del equipo y el material a utilizar debe ser desarrollado correctamente.

La decisión de la elección de una técnica por espectrofotometría de absorción, fue

principalmente a que un laboratorio de análisis; en la actualidad; como mínimo cuenta con un

Espectrofotómetro ultravioleta-visible para sus determinaciones, por su amplia accesibilidad,

aplicabilidad, por su sencilla emisión de datos y tratamiento de los mismos[CITATION Nei14 \l 3082].
 4 Marco Teórico

4.1 Espectrofotometría

En espectrofotometría, es la medición de la intensidad de la luz para determinar la

concentración del analito presente en una muestra. Podemos dividir los métodos espectrofotométricos

en dos grandes grupos.

4.1.1 Espectrofotometría de Absorción

Se mide la Absorbancia (A) del analito, es la luz absorbida por el analito, y esta magnitud se

relaciona con la concentración (C).

A xC

4.1.2 Espectrofotometría de Emisión

Se mide la luz emitida por un analito previamente excitado, esta señal emitida se relaciona con

la concentración de la especie que emite luz cuando vuelve desde un estado excitado (estado de mayor

energía al que llegó absorbiendo energía) a su estado basal (estado de menor energía posible tal como

se encuentra naturalmente).

Señal emisión x C

4.2 Radiación Electromagnética

La Física Clásica define a la luz como una radiación electromagnética y la describe como una

onda trasversal a la dirección de propagación.

4.3 Parámetros Ondulatorios de la Radiación Electromagnética

- Longitud de onda (λ): Distancia que existe entre dos máximos o dos mínimos de la onda, se mide en

unidades de longitud (cm, µm, nm, etc).

- Número de onda (ν): Corresponde a la recíproca (o la inversa) de la longitud de onda, se mide en

( unidades de longitud )−1 , cm−1 , nm −1.

- Frecuencia de la onda (ν): Representa cuantas veces pasa la onda completa por un punto fijo en la

unidad de tiempo, se mide en Hercios (1 Hz= 1Hertz) que significa la inversa del segundo siendo 1 Hz

= 1/s = s− 1.

- Amplitud de la onda (A): Se mide desde la línea de avance hasta el máximo de la onda. Estos

parámetros que caracterizan a una radiación electromagnética están relacionados entre sí de la siguiente

manera:

ν = c/λ

Cabe recordar que la unidad de medida que se usa para la longitud de onda (λ) depende de la región del

espectro electromagnético en la que se esté trabajando. Si estamos en la región visible y ultravioleta la

unidad de medida es nanómetros, corresponde a 10− 9 metros. La frecuencia (ν) se mide generalmente

en Hertz (1/s) y c es la velocidad de la luz en el vacío, es una constante cuyo valor es 3 x 108 m/s o 3 x

1010 cm/s.

La Física Cuántica, se agregó el concepto de “dualidad onda partícula” que es la luz como una

onda de “fotones” que se propagan. Dichos fotones representan paquetes de energía denominados

“cuantos”.

Dicho esto, se interpreta a la luz como una onda que propaga energía y la energía de la onda

(radiación electromagnética) queda definida como:

E=h x v

h: constante de Planck, su valor es 6,63 x 10− 34 J.s (J: Joules; J=kg·m 2/ s2).
 Recordando que, ν = c/λ, podemos reemplazar en la expresión de energía:

E=h x c / λ

En esta expresión podemos observar claramente que cuanto mayor es la frecuencia de la luz

mayor será su energía y que cuanto mayor sea la longitud de onda menor será la energía.

4.4 Espectro Electromagnético

Una fuente de luz, por ejemplo, el sol y las lámparas eléctricas, emiten un amplio espectro de

radiaciones electromagnéticas, es decir que emiten luz de diferentes longitudes de onda:

Aquellas longitudes de onda que corresponden al rango entre 400-700 nm pertenecen a lo que

se denomina región visible del espectro ya que estas longitudes de onda afectan nuestra retina y

provocan que observemos colores. Además de la región visible existen en el espectro electromagnético

longitudes de onda a las que nuestra retina no es sensible: por encima de la región visible se encuentra

la región Infrarroja (λ mayores a 700 nm) y por debajo de la región visible se encuentra la región

Ultravioleta (λ menores que 350 nm). Como ya hemos mencionado, la energía de una radiación

electromagnética es inversamente proporcional a su longitud de onda (E = h x c/λ), por lo tanto, los

rayos visibles tienen menor energía que los ultravioleta, pero mayor energía que los infrarrojos.
4.5 Interacciones de los Analitos con la Luz

4.5.1 ¿Qué sucede cuando un átomo absorbe energía lumínica?: Átomo excitado

Esto sucede cuando un átomo absorbe energía lumínica en una cantidad adecuada, estas

producen transiciones electrónicas, es decir que los electrones que están en su condición de menor

energía posible (estado fundamental) pasan a un estado de mayor energía (estado excitado) que resulta

inestable y rápidamente buscarán la manera de volver al estado fundamental, podemos comprender que

cuando los electrones dentro del átomo absorben una cantidad de energía adecuada pueden pasar de un
Representación esquemática de los niveles de
energía en un átomo. E0, E1 y E2 representan los
niveles electrónicos, E0 corresponde al nivel
fundamental y los otros niveles son de mayor
energía. Para simplificar el esquema no se dibujaron
los niveles energéticos de cada uno de los orbitales
(s, p, etc) dentro de cada nivel energético. La flecha
negra representa un salto electrónico entre el nivel
fundamental y el primer nivel excitado. La flecha
gris indica el regreso al estado fundamental. La
diferencia de energía entre los niveles son
cantidades discretas de energía (determinados
valores de hν).

nivel energético a otro de mayor energía.

4.5.2 ¿Qué sucede cuando una molécula absorbe energía lumínica?: Molécula excitada

Formada por la unión entre átomos, no son estáticas ya que permanentemente vibran y rotan.

Unidos por enlaces entre sus electrones externos. Por lo tanto, cuando hablamos de la energía interna

(E) de una molécula estamos hablando de tres componentes: E rotacional, E vibracional y E

electrónica.

Representación esquemática de los niveles de energía

en una molécula: electrónicos (E0, E1); vibracionales
(0, 1, 2, 3) y rotacionales (0, 1, 2). Para simplificar el
esquema los niveles rotacionales se dibujaron sólo en
el nivel electrónico E0, pero este esquema se repite en
todos los niveles energéticos. Los niveles de energía
rotacional están separados entre sí por baja energía,
los niveles de energía vibracional están separados
entre sí por energía media y niveles electrónicos están
separados entre sí por mayor energía. La excitación en
la molécula puede ser sólo rotacional (flecha gris
clara) vibracional (flecha gris más oscura) o
electrónica (flecha negra).

La separación entre los niveles de energía estará dada por cantidades discretas de energía, es

decir “cuantos” de energía (E = h x ν). Esto quiere decir que para que un electrón pase de un nivel

energético a otro dentro de la molécula debe absorber cantidades discretas de energía. La transición

electrónica será la que alcance según la energía absorbida, pero es un hecho que, si la energía fue

suficiente para hacer un salto electrónico, fue más que suficiente para hacer saltos vibracionales y

rotacionales ya que son de menor energía.

Nota: Al igual que los átomos, las moléculas excitadas inestables buscaran la manera de

regresar a su nivel de menor de energía, liberando calor o emitiendo luz en el proceso de relajación.
4.6 Espectrofotometría de Absorción Molecular Uv-Visible

El equipo que se utiliza se denomina espectrofotómetro Uv-Visible, es un instrumento que

mide la absorbancia de una solución. Por lo tanto, para medir la concentración de un analito por este

método es necesario que el analito tenga la propiedad de absorber radiación electromagnética (luz) en

la región del UV-visible.

4.6.1 ¿Qué significa que el analito absorbe luz?

Significa que cuando un haz de luz incide sobre la solución del analito, éste absorbe energía la

que utiliza para pasar de su estado basal de energía (el más bajo, estado fundamental) a un estado

excitado (de mayor energía).

4.6.2 Absorbancia

Cuando una luz monocromática, atraviesa una solución que contiene una especie absorbente, en

una determinada longitud de onda, la intensidad (o la potencia) de la radiación disminuye como

consecuencia de la absorción de energía por parte de las especies absorbentes presentes en la solución.

P0: Potencia de la luz

incidente.
P: Potencia luego de
atravesar la muestra.

Representación de un haz de luz Monocromática que Incide en una Solución que Absorbe dicha Muestra

Se define transmitancia de una solución a la fracción de luz que deja pasar dicha solución:

T = P/ P0

Se define la absorbancia de la solución a partir de la transmitancia de la solución como:

A = -log T
 De las expresiones matemáticas podemos deducir que cuanto mayor es la A menor será la T, es

decir que, si una solución absorbe mucho, transmitirá poco. Además, podemos observar que, de

acuerdo a la definición de T y A, ambas propiedades son adimensionales, ya que se definen a partir de

un cociente de la misma magnitud (P/ P0).

4.6.3 Ecuación de Lambert y Beer

Cuando un haz de luz monocromática (de determinada longitud de onda) atraviesa una solución,

la absorbancia es directamente proporcional a la distancia recorrida por la luz atravesando la solución

absorbente y a la concentración del analito en la solución. La distancia recorrida por la luz atravesando

la solución se denomina camino óptico y se mide generalmente en cm.

Representación de la Ley de Lambert y Beer.

A=εxbxc

A: Absorbancia, adimensional.

ε: Coeficiente de extinción molar o absortividad molar.

b: Es el camino óptico, en general se mide en cm.

c: Es la concentración del analito expresada en molaridad (M).

 Dado que la Absorbancia y la absortividad molar dependen de la longitud de onda de la luz

incidente, muchas veces se expresa la ecuación de Lambert y Beer como una función de la longitud de

onda:

A (λ) = ε (λ) x b x c

Con cierta frecuencia se utiliza como constante de proporcionalidad en la Ley de Lambert y

Beer la absortividad específica (a) en lugar de la absortividad molar. Las unidades de la absortividad

específica son (L/g x cm) y por lo tanto en este caso la concentración del analito se debe expresar en

g/L. Sin embargo, la ley de Lambert Beer es una ley límite, es decir que sólo se cumple en

determinadas condiciones: luz monocromática y soluciones diluidas.

A=axbxc

Representación de la Absorbancia, Medida a una Determinada Longitud

de Onda en Función de la Concentración de Analito.

Podemos observar que

la representación gráfica de la Ley de Lambert y Beer es una recta. En el eje de las ordenadas (eje Y) se

representan los valores de A y en el eje de las abscisas (eje X) se representan las concentraciones del

analito. La pendiente de la recta corresponde al producto ε x b.

4.6.4 Espectrofotómetro Uv-Vis

El espectrofotómetro es un instrumento usado en la química analítica, asa como en otras ramas,

que sirve para medir en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma

magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones. También es utilizado en los laboratorios

para la cuantificación de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede

ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa.

Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una

muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador

principalmente, dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra e indicar

indirectamente qué cantidad de la sustancia de interés está presente en la muestra.

4.6.5 Partes del Espectrofotómetro

Al igual que otros instrumentos de laboratorio, el espectrofotómetro consta de diferentes partes

que le permiten realizar la medición de la absorbancia en la muestra, y tener un correcto

funcionamiento, estas son las siguientes:

 Fuente de Luz: La fuente de Luz que ilumina la muestra debe cumplir condiciones como

estabilidad, direccionalidad, distribución de energía especial continua y larga vida.

 Las fuentes que se emplean: lámpara de wolframio, lámpara de arco de xenón, lámpara de

deuterio lámpara LED que se utilizan en los laboratorios.

 Colimador: Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda

hacia un prisma el cual separa todas las magnitudes de onda de ese haz.

 Monocromador: Aísla las radiaciones de longitudes de onda deseada que inciden o se reflejan

desde el conjunto. Se usa para obtener luz monocromática. Está constituido por las rendijas de

entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión.

 Celda: Son los recipientes donde se depositan las muestras liquidas a analizar, la interacciones con

la materia (debe producirse donde no haya absorción ni dispersión de las longitudes de onda).

 Detector: Es el encargado de captar la radiación y a su vez dejarla en evidencia para su estudio

posterior existen dos tipos: los cuales responden a fotones o al calor.

El material del cual están hechas las partes antes mencionadas del espectrofotómetro varía de

acuerdo a la región en que se esté trabajando: son de vidrio o plástico si se trabaja en la región visible,

de acuerdo si se trabaja en la ultravioleta y de NaCl si se trabaja la región de infrarrojo que se

caracterizan por tener dos paredes correspondientes a los lados ópticos por donde cruza en haz de luz.

4.6.6 Funciones del Espectrofotómetro

Fuente de Luz: Ilumina la muestra química o biológica.

Fuentes de luz que se emplean:

Lámpara de deuterio e hidrógeno: Produce un espectro continuo en la región UV.

,absorbe fuertemente a longitudes de onda menores que 350 nm, se requieren la utilización de

cubetas de cuarzo.
 Lámpara de filamento de tungsteno: Es la fuente más común de radiación visible e

infrarrojo cercano, se utiliza en la región de longitud de onda de 350 a 2500 nm.

Lámpara de arco de xenón: Emite luz producida por un arco eléctrico (también

llamado arco voltaico). El tipo de lámpara se nombra según el gas en este caso xenón. Pero

también puede ser: néon, argón, kriptón, sodio, haluro metálico y mercurio.

Monocromador: Son superiores en calidad a los filtros. El monocromador de un

espectrofotómetro aísla las radiaciones de longitud de onda deseada, logrando obtener luz

monocromática.

Colimador: Es un lente que lleva el haz de luz entrante con una determinada longitud de

onda hacia un prisma, el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz logrando que

se re direccione hacia la rendija de salida.

Celda: Cubeta de espectrofotómetro es un pequeño tubo de sección circular o cuadrada,

sellado en un extremo, diseñado para mantener las muestras durante los experimentos de

espectroscopia.

Selectores de longitud de onda : Es la parte más importante del equipo, determinando en

gran parte su calidad. Son dispositivos que filtran el espectro producido por la fuente,

dejando "pasar" sólo radiaciones en un rango de longitud de onda determinada.

Detector: Convierte la energía radiante en una señal eléctrica, se encarga de evidenciar una

radiación para que posteriormente sea estudiada y saber a qué tipo de respuesta se

enfrentarán (fotones o calor).

4.6.7 Aplicaciones de la Espectrofotometría de Absorción Molecular Uv-Visible.

 Determinación de hierro en harinas y panificados.

 Determinación de compuestos nitrogenados y cloro libre en agua potable y en aguas residuales.

 Seguimiento de la maduración de un fruto a través de la medida del contenido de pigmentos:

Cuantificación de clorofilas, carotenoides y antocianinas.

 Análisis de la calidad de granos para diversos usos: determinación del contenido de hidratos de

carbono y de proteínas.

 Análisis de la composición de nutrientes en alimentos para ganado.

4.7 Espectrofotometría de Emisión Atómica: Fotometría de Llama

La espectroscopia de emisión atómica es un método analítico basado en la medida de la luz

emitida por átomos o iones de un elemento que se encuentran en estado de vapor. La excitación de los

átomos en estado de vapor puede realizarse de diferentes maneras, en el caso particular de la técnica

fotometría de llama; es un método espectroscópico de emisión en el cual una llama es utilizada como

fuente de excitación. El tiempo de vida del átomo excitado es breve y rápidamente vuelve al estado

fundamental emitiendo luz de una longitud de onda característica, la señal de emisión se mide en el

fotómetro de llama es directamente proporcional a la concentración del átomo que emite.

Señal emisión= k x C

k: es la constante de proporcionalidad.

c: concentración del analito cuya emisión se mide en el Fotómetro de llama.

4.7.1 Componentes del Fotómetro de Llama

4
3

2
5

1. Nebulizador: sistema que toma la muestra a analizar y la coloca directamente como pequeñas

gotas sobre la llama a través de un capilar.

2. Entrada de aire y entrada de gas natural, ambas con regulador de presión: comburente y

combustible con el que se formará la llama.

3. Llama: lugar donde la muestra pasa por una serie de procesos que terminarán con la emisión de

luz por parte de los componentes de la muestra que logren excitarse.

4. Sistema óptico: es un filtro que permitirá seleccionar la longitud de onda que llegue al detector;

es decir seleccionará de todas las emisiones que se producen en la llama, aquella que

corresponde al analito que queremos cuantificar. Por ejemplo, el Fotómetro de llama que se

usará en el práctico tiene un filtro para medir Sodio, otro para medir Potasio y otro para medir

Litio.

5. Detector: fototubo.
 6. Procesador y lector de la señal.

4.7.2 Procesos que Ocurren en la Llama

 Introducción y pulverización de la muestra sobre la llama.

 Evaporación del solvente, quedando las sales secas.

 Fusión y evaporación de las sales.

 Formación de vapor atómico.

 Excitación de los átomos en estado de vapor (por absorción de energía térmica).

 Emisión de luz cuando los átomos excitados vuelven al estado basal (relajación).

4.7.3 Aplicaciones Agronómicas de la Fotometría de Llama

 Determinación de sodio en muestras de agua y suelos.

 Determinación de potasio en un análisis foliar.

 Determinación de dureza de agua.

 Determinación de litio.
 5 Conclusiones

 La transmisión nos ayuda a determinar la cantidad de energía que logro atravesar por la

solución por medio absorbente lo cual expresa la cantidad de energía que queda absorbida en

las moléculas.

 La ley de Lambert-Beer, nos explica que un rayo de luz monocromática pasa por un medio

absorbente, su intensidad de disminuir exponencialmente a medida que la longitud del medio

absorbente aumenta. Por otro lado, tenemos la ley de Beer que cuando el rayo aumenta en la luz

monocromática asa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente

a medida que la transición del medio absorbente aumenta.

 Se logro conocer el funcionamiento teórico del espectrofotómetro dentro de ello su

funcionamiento y su composición.