Preinforme 9
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5.4. ¿Cómo funcionan los reactivos de las soluciones Buffer para la electroforesis?
R/= Tampón Tris-HCl
Tampón Tris-Gly
Tampón TAE
El pH es alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estén ionizados por
completo y éste se mantenga cargado negativamente. La composición habitual es
Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA 1 mM, pH=7,5
En la electroforesis, permite mantener las moléculas de DNA con una carga
negativa uniforme y constante. Es, por ello, componente del gel y del tampón de
electroforesis, o tampón de cubeta.
Tampón de carga
Es una disolución que se mezcla con la muestra antes de aplicarla al gel. Sus
componentes cumplen varios propósitos:
6.2. ¿Qué son los colorantes? ¿En qué se basa su selectividad? Mencione 5
ejemplos y que partes tiñe cada uno de ellos.
R/= Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los
materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos
y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de
metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas
negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina,
la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias
liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos
de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o
depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.
En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas
o que la mayoría de moléculas de DNA (aquéllas superiores a 300 pb), es decir,
marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible,
permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína
o DNA no se hayan salido del gel.
Ambos tienen un color azul turquesa que permite detener la electroforesis con la
confianza de que las moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.
Bromuro de etidio: Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene
afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se
debe a su geometría plana y su estructura aromática, que interacciona
favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice. En menor medida,
interacciona también con DNA monocatenario.
Una cadena alifática larga que hace de conector entre ambos núcleos
intercalantes.
Por otra parte, su ligera carga positiva también facilita su unión al DNA
(recuérdese que éste es una molécula polianiónica).
En forma libre, los dos núcleos aromáticos interaccionan entre sí y por ello la
molécula apenas es fluorescente.