Informes de Bioquímica y Biología Molecular Vol.

5, N ° 1,
octubre de 2016

www.RBMB.net
Artículo de revisión

Diagnóstico de acidemia metilmalónica por

Métodos de laboratorio

Fatemeh Keyfi 1, 2, Saeed Talebi 3, Abdol-Reza Varasteh * 2, 4, 5

Abstracto

La acidemia metilmalónica (MMA) generalmente es causada por una deficiencia de la enzima metilmalonil-CoA mutasa (MCM), un
defecto en el transporte o síntesis de su cofactor, la adenosil-cobalamina (cblA, cblB, cblC, cblF, cblD y cblX) , o deficiencia de la
enzima metilmalonil-CoA epimerasa. Un enfoque de diagnóstico integral implica investigaciones de metabolitos con espectrometría de
masas en tándem, análisis de ácidos orgánicos con cromatografía de gases, estudios enzimáticos con cultivo de células de
fibroblastos y, finalmente, análisis de mutaciones. Con técnicas bioquímicas y ensayos enzimáticos se puede lograr la caracterización
confiable de pacientes con análisis de formulación aislada de MMA. La clasificación confiable de estos pacientes es esencial para los
estudios en curso y prospectivos sobre tratamientos, resultados y diagnósticos prenatales.

Palabras clave: Técnicas de diagnóstico, Ensayo enzimático, Acidemia metilmalónica, Análisis de mutaciones, Análisis de ácidos orgánicos,
Espectrometría de masas en tándem

Introducción como tipo 'cbl'. El tipo cblA es causado por mutaciones en el gen

La acidemia metilmalónica (MMA) suele ser causada por una MMAA en 4q31. El MMAA está involucrado en la síntesis de

deficiencia de la enzima metilmalonil-CoA mutasa (MCM, adenosilcobalamina (AdoCbl), una coenzima para MCM. El tipo

EC5.4.99.2), un defecto en el transporte o síntesis de su cblB está causado por mutaciones en el gen MMAB en 12q24.

cofactor, la adenosil-cobalamina (cblA, cblB, cblC, cblF, MMAB codifica cobalamina adenosil transferasa (ATR), que

cblDandcblX), o deficiencia de la enzima metilmalonil-CoA cataliza la transferencia de un grupo adenosilo de ATP a

epimerasa. MCM es una enzima mitocondrial que cataliza la cobalamina (I) para formar AdoCbl (2, 3).

isomerización de metilmalonil-CoA a succinil-CoA.

La combinación de MMA y homocistinuria es un trastorno

El MMA aislado se encuentra en pacientes con mutaciones en genéticamente heterogéneo del metabolismo de la cobalamina (cbl;

MUT, localizadas en el cromosoma6p21, que causan vitamina B12). El defecto provoca una disminución de los niveles de

(mut-) o completo (mut 0) deficiencia de enzimas (1). En general, las las coenzimas adenosilcobalamina (AdoCbl) y metilcobalamina

formas mut de MMA no responden a la terapia con vitamina B12. (MeCbl), que dan como resultado una disminución de la actividad de

MCMactivity requiere 5-primedeoxiadenosilcobalamina (AdoCbl), una las respectivas enzimas MCM y metiltetrahidrofolato homocisteína

forma de coenzima de la vitamina B12. Los pacientes con defectos en metil transferasa, también conocida como metionina sintasa (MTR).

la síntesis de AdoCbl generalmente responden al tratamiento con Se han clasificado diferentes formas del trastorno según grupos de

vitamina B12 y se clasifican complementación de células in vitro: cblC, cblD, cblX y cblF.
Miembros de

1: Laboratorio de Inmunobioquímica, Centro de Investigación de Inmunología, Escuela de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas de Mashhad, Mashhad, Irán. 2:
PardisClinicalandGeneticLaboratory, Mashhad, Irán
3: Departamento de Genética Médica, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán
4: Laboratorio de Inmunobioquímica, Centro de Investigación de Alergias, Universidad de Ciencias Médicas de Mashhad, Mashhad, Irán

5: Varastegan InstituteforMedicalCenter, Mashhad, Irán

* Autor para correspondencia: Abdol-RezaVarasteh; Tel: + 9851-38442016; Fax: + 9851-38452236; Correo electrónico: [email protected]

Recibido: 22 de noviembre de 2015; Aceptado: 20 de enero de 2016

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Complementation groupcblD todos contienen mutaciones mutaciones en el gen HCFC1.

homocigotas o heterocigotas compuestas en el gen MMADHC, También se encuentra deficiencia de la enzima
ubicado en el cromosoma 2q23. El tipo cblC de MMA y metilmalonilCoA epimerasa y succinil-CoA sintetasa
homocistinuria combinados es causado por mutaciones formadora de ADP (SCS-A, EC6.2.1.5) en pacientes con
homocigotas o heterocigotas compuestas en el gen MMACHC MMA. La deficiencia de la enzima metilmalonil-CoA
localizado en el cromosoma 1p34. La MMA y la homocistinuria, tipo epimerasa es causada por una mutación en el gen MCEE en
cblC, es el error innato más común del metabolismo de la el cromosoma 2p13.3 y la deficiencia del SCS es causada por
cobalamina, con alrededor de 250 casos conocidos (4). El tipo cblF una mutación en el gen SUCLA2 en el cromosoma 13q14.2.
está causado por mutaciones homocigóticas o heterocigotas SCS es una enzima de la matriz mitocondrial que cataliza la
compuestas en el gen LMBRD1 en el cromosoma 6q13 (5). El tipo síntesis reversible de succinilCoA a partir de succinato y CoA.
cblX es un trastorno metabólico recesivo ligado al cromosoma X, La Fig. 1 muestra los genes implicados en la ruta de
Xq28, causado por conversión de propionil-CoA a succinilCoA.

Figura 1. La vía de conversión de propionil-CoAtosuccinil-CoA

El inicio de las manifestaciones de AMM aislado va desde el con letargo, vómitos, hipotonía, hipotermia, respiratoria
período neonatal hasta la edad adulta. Todos los fenotipos angustia, grave cetoacidosis,
muestran períodos intermitentes de salud relativa y hiperamonemia, neutropenia, y
descompensación metabólica, generalmente asociados con trombocitopenia y puede provocar la muerte. En el fenotipo infantil /
infecciones y estrés intercurrentes. En el período neonatal la que no responde a B12, la forma más común, los bebés son
enfermedad puede presentarse normales al nacer pero desarrollan

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 Métodos de diagnóstico para la acidemia metilmalónica

letargo, vómitos, deshidratación, hepatomegalia, hipotonía, Diagnóstico de MMA

andencefalopatía. En ocasiones, se presenta un fenotipo intermedio La acidosis, cetosis, hiperamonemia, hipoglucemia, hiperglucemia y
de respuesta a B12 en los recién nacidos, pero generalmente se neutropenia son síntomas de acidemia metilmalónica y propiónica
presenta en los primeros meses o años de vida; los niños afectados (AP). Los hallazgos de laboratorio que sugieren MMA y PA incluyen
presentan anorexia, retraso del crecimiento, hipotonía y retraso en el niveles bajos de bicarbonato de menos de 22 mmol / l en bebés y
desarrollo y, a veces, tienen versión proteica y / o vómitos y letargo menos de 17 mmol / l en recién nacidos, cetonas en la orina, niveles
después de la ingesta de proteínas. de amoníaco en sangre superiores a 150 μg / dl en recién nacidos, 70
μg / dl en bebés y 35-50 μg / dl en niños mayores y adultos, niveles de
La MMA atípica y "benigna" / adulta se asocia con un aumento, glucosa en sangre inferiores a 40 mg / ml en lactantes y menores de
aunque leve, de la excreción urinaria de metilmalonato; sin 60 mg / ml en niños, y recuentos absolutos de neutrófilos inferiores a
embargo, no está claro si las personas con estas afecciones
desarrollarán síntomas. Las principales complicaciones
secundarias de la AMM incluyen 1.500 / mm 3 ( 6). Los niveles de acilcarnitina en pacientes con
de desarrollo retrasar (variable), cualquiera de los hallazgos de laboratorio enumerados deben
nefritis tubulointersticial con insuficiencia renal progresiva, "accidente determinarse mediante espectroscopía de masas en tándem (MS /
cerebrovascular metabólico" (afectación aguda y crónica de los MS). Los pacientes también deben ser evaluados para PA / MMA según
ganglios basales), trastorno del movimiento incapacitante con Cocientes C3 y C3: C2 Los pacientes con sospecha de trastornos del
coreoatetosis, distonía y para / cuadriparesia, pancreatitis, retraso del metabolismo de la cobalamina o del propionato tienen valores de C3
crecimiento, deterioro funcional inmune y atrofia del nervio óptico. mayor que 7 μmol / ly C3: C2 proporciones mayores que 0,2;
Esta revisión describe los métodos de genética molecular y bioquímica sin embargo, este examen no puede distinguir entre MMA y PA. La
utilizados para diagnosticar el MMA aislado. tabla 1 muestra los diagnósticos diferenciales
ofMMAandPA.

Tabla 1. Diagnóstico diferencial de MMA y PA.

Plasma Amino
Aminoácidos
Clínico Laboratorio de rutina Ácidos Orina Orgánica
ruta Enzima
Síntomas Investigación (Acilcarnitina Ácidos
afectado
perfil)
Acidosis, cetosis, Nivel bajo de bicarbonato,
Metilo Isoleucina, Ácido metilmalónico
Metilmalo hiperamonio cetonas positivas en la orina, Metilmalónico
malónico valina, en sangre, Acyl
nyl CoA a, hipoglucemia, amoníaco en sangre ácido y metilo
Acidemia metionina, carnitinas, aumentado
mutasa hiperglucemia, niveles, sangre baja citrato en orina
(MMA) treonina glicina en sangre
y neutropenia niveles de glucosa

Acidosis, cetosis, Nivel bajo de bicarbonato, Ácido propiónico, 3-

Isoleucina,
Propiónico Propionilo hiperamonemio cetonas positivas en la orina, Propionilcarnitina, OH propiónico
valina,
Acidemia CoA a, hipoglucemia, amoníaco en sangre aumento de glicina en ácido, metilo
metionina,
(PENSILVANIA) carboxilasa hiperglucemia, niveles, sangre baja sangre citrato, propionilo
treonina
y neutropenia niveles de glucosa glicina en la orina

Un diagnóstico definitivo del trastorno se basa en el análisis de con respecto al momento de la toma de muestras, el estado clínico y
ácidos orgánicos en orina mediante cromatografía de gases / la dieta del paciente, y si la muestra se toma cuando el paciente está
espectrometría de masas (GC / MS) (6, en ayunas o alimentado. El muestreo durante el ayuno o la
7). Los ácidos orgánicos se pueden medir con cualquier fluido descompensación metabólica a menudo se considera más valioso
corporal, pero la orina es la más eficaz para determinar el tipo de porque, en la mayoría de los casos, los metabolitos de interés se
trastorno. La determinación de ácidos orgánicos y conjugados de excretan de forma selectiva o en concentraciones más altas. Dos
glicina en orina es clave para el diagnóstico y seguimiento de MMA. factores pueden incrementar la excreción de ácidos orgánicos; En
La orina recolectada durante 24 h permite variaciones en el volumen primer lugar, un aumento en la excreción puede ser inespecífico
de excreción durante el día. Sin embargo, la impracticabilidad de la porque se informa que algunos metabolitos se excretan de forma
recolección de 24 h es tal que una muestra aleatoria, preferiblemente anormal en condiciones no atribuibles a la EIM, como la terapia con
la primera evacuación matutina, es una alternativa aceptable. Se medicamentos, la dieta, enfermedades no relacionadas con la EMI o
producirán variaciones intraindividuales afecciones fisiológicas. Un segundo común

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la mala interpretación puede deberse al metabolismo bacteriano. realizar y determinar si es necesario realizar pruebas prenatales
De posible origen endógeno, como en las infecciones intestinales, (8).
es la excreción anormal de d-lactato, b) Los pacientes con ácido metilmalónico en orina ligeramente
metilmalonato, pags- elevado, pero homocisteína normal, tienen mutaciones en al
hidroxifenilacetato, p-hidroxifenilactato, menos uno de los subtipos MCEE, SUCLA2 y MMA benigna. Los
glutarato, benzoato e hipurato. Un perfil de ácido orgánico urinario subtipos se diagnostican
es casi siempre anormal durante la fase aguda de la enfermedad, por análisis de ensayo enzimático y / o estudio molecular.
pero por lo general apenas se detecta antes o entre crisis; por lo c) Los pacientes con concentraciones anormalmente altas de ácido
tanto, es importante obtener una muestra de orina para realizar metilmalónico en orina y homocisteína en plasma tienen mutaciones
pruebas durante el pico de una crisis. Los niveles de ácido en al menos uno de los subtipos cblC, cblF o cblD (var 1). Los
orgánico en la orina de pacientes con MMA contienen subtipos se diagnostican mediante análisis de mutaciones de
concentraciones relativamente altas de ácido metilmalónico y MMACHC, MMADHC y LMBRD1. La figura 2 muestra un diagrama
citrato de metilo, mientras que la orina de pacientes con PA de flujo para diferentes etapas del diagnóstico de AMM.
mostrará concentraciones relativamente altas de metabolitos de
propionil CoA, incluidos ácido propiónico, ácido metil cítrico, ácido
3-OH propiónico y propionilo. glicina (6). La Tabla 2 muestra las 1. Análisis del perfil de acilcarnitina

concentraciones de ácido metilmalónico en orina para diferentes En un subconjunto de enfermedades del recién nacido con trastornos

subtipos de MMA. metabólicos graves, pueden producirse daños irreversibles con

consecuencias adversas de por vida. Para algunas de estas
enfermedades, un método de diagnóstico puede ayudar a prevenir
tales daños. Una técnica de detección crítica que se utiliza para
Tabla 2. Concentraciones de ácido metilmalónico en orina para diferentes
detectar muchos de estos trastornos metabólicos en los recién
subtipos de MMA.
nacidos es la espectrometría de masas en tándem (EM / EM). MS /
Concentración de ácido metilmalónico MS tiene el potencial de detectar y cuantificar simultáneamente
Subtipo muchos metabolitos
Sangre (µM)
Orina (mmol / mol de creatinina)
con similar fisicoquímico
propiedades. Esto constituye un avance espectacular con respecto a
mut-, mut 0 1000-10000 100-1000
los métodos clásicos utilizados para el cribado neonatal. MS / MS ha

cblB, cblA, cblD 10-100 5-100 mejorado la detección de errores innatos del metabolismo en los
recién nacidos al hacer que el análisis sea más sensible, específico y
Deficiencia de MCEE,
50-1500 7 confiable de lo que era posible anteriormente. Su capacidad inherente
SUCLA2
para detectar y cuantificar múltiples metabolitos en una sola muestra
Normal <4 <0,27
permite un amplio reconocimiento de los trastornos de aminoácidos,
ácidos grasos y ácidos orgánicos.
Los aminoácidos plasmáticos en MMA contienen carnitinas,
mientras que los de PA contienen propionilcarnitina. Ambos pueden
Muchos pacientes tienen síntomas menos graves si se
tener un alto contenido de glicina incluso cuando están bien
diagnostican y tratan a tiempo. Además, el diagnóstico temprano
controlados (6). Además, la homocisteína plasmática se puede medir
puede reducir los gastos médicos y permitir que se considere la
para identificar los tipos de genes implicados en MMA. Después del
planificación familiar antes de que nazcan otros hermanos afectados.
análisis de ácido orgánico en orina y la determinación de la
Por lo tanto, la EM / EM puede proporcionar considerables beneficios
concentración de homocisteína en plasma, los pacientes se
a los pacientes y sus familias si se integra en los programas de
diagnostican según uno de los siguientes criterios:
detección neonatal, siempre que se disponga de fondos suficientes
a) Los pacientes con concentraciones muy altas de ácido
para cubrir los costos de los medicamentos y alimentos adicionales.
metilmalónico en la orina, pero homocisteína normal, tienen
Uno de los trastornos que pueden diagnosticarse después de la EM /
mutaciones en al menos uno de los MUT (mut-, mut 0), subtipos cblB,
EM es MMA. El programa de detección identifica a los niños que
cblA y cblD (var 2). Los subtipos de MMA se diagnostican mediante
pueden considerarse en riesgo de padecer estos trastornos.
análisis de ensayo enzimático y / o estudios moleculares. Las técnicas
Detección de recién nacidos para PA / MMA basada en C3 y C3: C2
de genética molecular están disponibles para la prueba de portadores
de miembros de la familia para ayudar en la decisión reproductiva.

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 Métodos de diagnóstico para la acidemia metilmalónica

se inició en el estado de Nueva York en noviembre de 2004. Los (C4DC) se agregó al panel de detección de recién nacidos como
diagnósticos se realizan en centros de atención especializada en marcador secundario para PA / MMA. En algunos casos, se remitieron
función de los resultados de las pruebas y la evaluación de muestras para descartar trastornos del metabolismo del propionato
especialistas en metabolismo. En mayo de 2005, metilmalonil carnitina sobre la base de C4DC persistentemente elevada. Hasta 2008, se
utilizó un protocolo en el estado de Nueva York que derivaba a
pacientes con sospecha de trastornos del metabolismo de la
cobalamina o el propionato con concentraciones de C3 superiores a 7
μmol / ly relaciones C3: C2 superiores a 0,2 (9).

Figura 2. Diagrama de flujo para las diferentes etapas del diagnóstico de MMA

2. Análisis de ácidos orgánicos opción para separar e identificar más de 250 metabolitos ácidos
En las enfermedades hereditarias conocidas como acidemia normales y patológicos detectados en estas enfermedades
orgánica, un defecto enzimático o cofactor en una vía metabólica (11-13).
conduce a la acumulación y aumento de la excreción de uno o más En 1963, Cox y White demostraron un aumento en la excreción
de estos metabolitos ácidos en la orina. Por lo tanto, la orina humana urinaria de ácido metilmalónico en pacientes con deficiencias de
contiene numerosos ácidos orgánicos y compuestos termoquímicos vitamina B12 (14). Desde entonces se han descrito numerosos
en una variedad de concentraciones (10) y el análisis de ácidos métodos para la determinación de ácido metilmalónico urinario
orgánicos urinarios se ha convertido en una herramienta importante usando colorimetría o CG (15, 16). Algunos de estos métodos
para los laboratorios involucrados en el diagnóstico de estos utilizan la purificación previa del ácido metilmalónico mediante
trastornos metabólicos hereditarios. La cromatografía de gases (GC) cromatografía de capa fina o resinas de intercambio iónico junto con
es la técnica de procedimientos calorimétricos o GC.

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Eran lo suficientemente sensibles como para medir una cantidad sugirió que pequeñas cantidades de estos ácidos dicarboxílicos en la
mucho mayor de ácido metilmalónico, pero la determinación orina humana normal, el líquido amniótico y el suero pueden medirse
precisa de pequeñas cantidades de ácido metilmalónico en con precisión con este método (17).
muestras biológicas ha sido difícil (17).
Verhaeghe y col. (1988) desarrollaron un método que combina la
Millar et al (1974) describieron un método mejorado especificidad, la reproducibilidad y el alto rendimiento de extracción de
basado en cromatografía gas-líquido (GLC) la cromatografía de intercambio aniónico con la velocidad y
del butil éster del ácido metilmalónico, que se produjo haciendo simplicidad de la extracción con disolventes utilizando un detector de
reaccionar un extracto de éter dietílico de orina u orina liofilizada con ionización de llama por cromatografía AGAS (GC-FID) para medir los
una mezcla de trifluoruro de boro y butanol. Por lo tanto, el ácido ácidos orgánicos de la orina. Sugirieron que este conveniente
metilmalónico se extrajo directamente de la orina y se midió como su procedimiento es selectivo, reproducible y una alternativa adecuada a
éster butílico (18). Tanaka y col. (1980) describieron un método la más engorrosa extracción con dietilaminoetil-Sephadex.
práctico de cromatografía de gases de análisis de ácidos orgánicos
urinarios que fue diseñado para ser utilizado en programas de método (10).
detección de acidemia orgánica. Este método implica la extracción de Hoffman y col. (1989) describieron un procedimiento para
orina con acetato de etilo, deshidratación el análisis de ácidos orgánicos en varias muestras biológicas
que incorpora el O- (2,3,4,5,6pentafluorobencil)
de los extraído residuos, oxima-trimetilsililo (O-
trimetilsililación y uso de la lista de índices de retención para PFBOxime-TMS) ésteres de oxoácidos, aldehídos y
identificar los ácidos orgánicos (19). cetonas.
En 1981 Maties et al. modificó el método de Millar y lo adaptó los ésteres de O-PFEOxime-TMS tienen claras ventajas sobre los
para su uso con muestras de orina absorbidas en papel de filtro. La ésteres de O-etoximeTMS comúnmente utilizados; cada uno se
ventaja de este método fue que el ácido metilmalónico se cuantificó procesa de una manera idéntica a la de los estándares acuosos y
con una confianza aceptable a partir de la pequeña cantidad de no requiere desproteinización. Sugirieron que no hay limitaciones
orina presente en las muestras de papel de filtro que se en los volúmenes de muestra y es probable que las muestras de
recolectaron fácilmente y se enviaron por correo a un laboratorio de líquido cefalorraquídeo y tejido homogeneizado también puedan
pruebas central. Esta técnica también fue aplicable a la detección analizarse sin más modificaciones. En la columna de ácido silícico
de otros tipos de acidemias orgánicas (20). se retienen proteínas y péptidos, así como compuestos básicos y
polares de baja masa molecular, como aminoácidos, ácidos
inorgánicos, creatinina, purinas, aminas, azúcares y urea. Una
En 1983, Hyman et al. describió un método rápido para la ventaja adicional es que el orotato y el uracilo, compuestos valiosos
detección de MMA que utiliza papel de celulosa DEAE para la para distinguir algunos trastornos del ciclo de la urea, se extraen de
recolección de muestras y pnitroanilina diazotizada para el desarrollo manera eficiente (22).
del color. Usando papel de filtro de intercambio de aniones, los ácidos
orgánicos de la orina se adsorben selectivamente al papel. La
reacción de color con p-nitroanilina diazotizada, que tiene lugar in situ, Uno de los puntos más críticos en un esquema de perfiles
es más sensible que una reacción en solución, y las sustancias que metabólicos es el aislamiento de los compuestos de interés de la
producen colores que interfieren con el reactivo pueden enjuagarse matriz biológica. Estos deben extraerse con rendimientos altos,
del disco antes del ensayo, lo que hace que el ensayo sea más uniformes y reproducibles, acompañados de la menor cantidad
preciso (21 ). posible de compuestos de otras clases de productos. Debido a que
los ácidos orgánicos cubren un rango tan amplio de polaridad y
Nakamura y col. (1987) describió un método para el microanálisis tienen diferentes propiedades químicas relacionadas con los
de ácidos dicarboxílicos de cadena corta que incluye diversos grupos funcionales presentes, este requisito ha sido difícil
metilmalónico, succínico y de cumplir. Además, para que un procedimiento sea útil como
ácidos metilsuccínicos, que consiste en el prefraccionamiento método de diagnóstico de rutina, se deberían poder procesar varias
de la fracción de ácido dicarboxílico por cromatografía de muestras simultáneamente con precisión y velocidad razonables.
intercambio iónico, extracción del eluato con acetato de etilo y
análisis de ácidos dicarboxílicos como dimetilésteres por GC.
Ellos

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 Métodos de diagnóstico para la acidemia metilmalónica

Los métodos actualmente en uso consisten en aislar los compuestos. Con la detección por GC-FID, por otro lado, los
constituyentes ácidos de la orina antes de la derivatización y la compuestos que son de 100 a 1000 veces menos concentrados
CG. Estos incluyen cromatografía de intercambio aniónico que los componentes principales de la muestra aún pueden
basada en polímeros orgánicos o celulosa y extracción por cuantificarse (10). GC / MS requiere
solvente con acetato de etilo o éter dietílico. La principal ventaja costoso instrumentación, y
de la dietilaminoetil-Sephadexcolumn El mantenimiento, la operación y la interpretación de datos requieren
capacitación y conocimientos técnicos altamente especializados.
La cromatografía es su especificidad y recuperación de Además, una computadora es casi indispensable para el
extracción alta y reproducible de ácidos polares y procesamiento de datos. Por lo tanto, la acidemia orgánica se ha
apolares. Este método se recomienda encarecidamente examinado solo en unos pocos centros médicos importantes, donde
para el seguimiento cuantitativo y para reconocer se dispone de esos instrumentos y experiencia.
cambios sutiles en los perfiles de excreción. Las
desventajas de este método son que es un En conclusión, en la actualidad, se utiliza ampliamente la
procedimiento laborioso y complejo y el perfil puede extracción con disolvente con acetato de etilo, éter dietílico o
estar oscurecido por picos dominantes de algunos ambos. Este tipo de extracción líquida produce
ácidos polares y sulfato y fosfato inorgánicos, que recuperaciones analíticas deficientes de los compuestos más
pueden enmascarar algunos ácidos orgánicos polares y es inconveniente para su uso con un gran número
importantes en el cromatograma de gases. Estas de muestras. Además, la GC-MS se ha convertido en una
deficiencias impiden el diagnóstico de enfermedades tecnología bien establecida, fácilmente automatizada y
metabólicas, especialmente en casos en los que los confiable en el campo de investigación de la metabolómica
aumentos de metabolitos de ácidos orgánicos son (23). La orina humana contiene muchos metabolitos, y el
pequeños, como en las acidopatías orgánicas que análisis GC-MS de ácidos orgánicos urinarios es una técnica
responden a las vitaminas. Debido a estas dificultades importante para el diagnóstico de errores innatos del
prácticas, muchos grupos han encontrado que la metabolismo de lípidos, aminoácidos y carbohidratos (24).
extracción con solvente es un enfoque atractivo para los Mediante el pretratamiento con ureasa de muestras de orina
diagnósticos rutinarios de acidemias orgánicas. Sin y otras mejoras metodológicas, se ha aplicado GC-MS para
embargo, analizar simultáneamente los numerosos intermediarios
metabólicos de múltiples categorías en la orina,

La extracción por solvente tiene serias limitaciones

impuestas por la baja e irreproducible capacidad de
extracción de ácidos polares como el 3hidroxiisovalerato,
3-hidroxipropionato, metilo. 3. Ensayo de actividad enzimática

citrato y citrato (19). La MMA puede diagnosticarse midiendo la actividad de MCM,

Además, un perfil de ácidos orgánicos permite con o sin la adición de AdoCbl. Esto se puede utilizar para
a evaluar metabólico trastornos distinguir entre dos variantes de MMA (que responden a Cbl y
patobioquímicamente sobre la base de sus relaciones entre sí como que no responden a Cbl) y distinguir entre dos subtipos de
precursores o productos. Por lo tanto, la consideración cuidadosa de MUT (mutand mut 0). Por lo tanto, la medición in vitro de la
los pequeños cambios en las proporciones de ácidos orgánicos es actividad de MCM, con y sin AdoCbl, es útil para investigar la
esencial para un diagnóstico preciso y un manejo óptimo para el vía de Cbl, diagnosticar MMA, identificar mutaciones de MUT y
pronóstico después del tratamiento, además de la determinación cbl y obtener información sobre los cambios bioquímicos que
cuantitativa de ácidos orgánicos. La GC-MS es más específica, ya acompañan a las deficiencias de vitamina B12. Los métodos
que la cuantificación se basa en las intensidades relativas de los iones descritos y empleados para medir la actividad de MCM
de fragmentos característicos en un cromatograma de iones incluyen métodos radiométricos, en los que se produce [14C]
reconstruido. La cromatografía de masas suele ofrecer una precisión y succinilCoA y se separa del sustrato DL [CH3-14C]
una sensibilidad más bajas que la detección GC-FID, y la metilmalonil-CoA mediante papel
monitorización de iones únicos o múltiples se puede utilizar para
cuantificar solo unos pocos objetivos.
cromatografia (28, 29), Delgado capa

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cromatografía (30, 31), electroforesis (32), oxidación de las mutaciones dan como resultado una actividad MCM no detectable.
permanganato de potasio (33, 34), filtración de micropocillos Las mutaciones mutuas dan como resultado una actividad enzimática
(35), extracción en acetato de etilo residual baja. El gen MUT humano fue identificado por Ledley et al.,
(36), alto actuación líquido Quienes seleccionaron una biblioteca de expresión con anticuerpos
cromatografía (HPLC) (37) y GC (38). También hay ensayos mutasa para aislar el primer ADNc humano (48). Durante los últimos
no radiactivos basados en la separación de 27 años, varios estudios han descrito el espectro de mutaciones
metilmalonil-CoA y succinilCoA por HPLC de fase inversa observadas en el locus MUT en pacientes humanos (45, 49-57).
(39, 40), o en el ensayo espectrofotométrico directo de Hasta el momento, se han identificado 272 mutaciones diferentes,
succinil-CoA (41-43). Los primeros seis métodos tienen fama incluidas 187 mutaciones sin sentido / sin sentido, 24 mutaciones en
de ser laboriosos el sitio de empalme, 37 deleciones pequeñas, 20 inserciones
porque ellos exigir muchos pequeñas, tres indeles pequeños y una deleción macroscópica.
manipulaciones, y requieren mucho tiempo debido a las
numerosas incubaciones, y han sido criticadas por su falta de
sensibilidad. El método de oxidación del permanganato también
es criticado porque las condiciones óptimas para la oxidación cblC
varían según la concentración de permanganato y el MMA, la deficiencia de cobalamina tipo C (cblC) con
calentamiento. homocistinuria (gen MMACHC) es el defecto genético más
hora. La cromatográfica de gases común en el metabolismo de la cobalamina (4, 58). El gen
El método de ensayo radiométrico parece ser sensible, pero también MMACHC responsable del trastorno cblC se encuentra en el
requiere mucho tiempo. La falta de sensibilidad y reproducibilidad, y cromosoma 1p34.1 y codifica un polipéptido de 282
la inconveniencia del ensayo radiométrico para la actividad MCM aminoácidos. Los exones 1 a 4 son codificadores y el exón 5
hacen que la HPLC sea el método de elección. no codifica. La proteína MMACHC puede actuar como una
Por lo tanto, los chaperona de tráfico de cobalamina intracelular y se ha
El ensayo de HPLC no radiactivo parece ser satisfactorio para demostrado que actúa, en parte, catalizando la descianación
medir la conversión de pequeñas fracciones de metilmalonil-CoA reductora de la cianocobalamina, generando cob (II) alamina,
en succinil-CoA, y se dice que es simple, rápido, confiable y que es el sustrato para la asimilación en el cofactor activo
altamente reproducible. Este método es lo suficientemente sensible forma metilcobalamina.
para medir una baja actividad de MCM, como la actividad de
holoMCM en extractos de tejido, o la actividad total de MCM de las (MeCbl) y
células. Por lo tanto, creemos que este método es adecuado para adenosilcobalamina (AdoCbl) (59). Hasta la fecha, los análisis de

detectar apoenzima MCM anormal, ya sea para diagnosticar MMA mutaciones de MMACHC (60, 61) han mostrado 81 mutaciones

o detectar errores del metabolismo de la cobalamina (44). diferentes, que incluyen 43 mutaciones sin sentido / sin sentido, cinco
mutaciones en el sitio de empalme, 19 deleciones pequeñas, ocho
inserciones pequeñas, una indel pequeña, cuatro deleciones
macroscópicas y una gruesa. inserción.
4. Análisis de mutaciones
MUT
El MMA es un error innato del metabolismo debido a la cblA
isomerización alterada de L-metilmalonil-CoA a succinil-CoA. El tipo cblA es causado por mutaciones en el gen MMAA en
Esta reacción es catalizada por la mitocondria. 4q31. MMAA participa en la síntesis de adenosilcobalamina
proteína MCM, un (AdoCbl) (2). Se han identificado dos funciones enzimáticas
enzima dependiente de adenosilcobalamina (45). El gen MUT diferentes para el producto del gen MMAA: un papel en el
humano, ubicado en el cromosoma 6, está compuesto por 13 transporte de vitamina B12 hacia las mitocondrias, la
exones que abarcan más de 35 kb. El marco de lectura abierto reducción de cobalamina II a cobalamina I y la conservación o
consta de 2,7 kb, que codifican 750 aminoácidos (46). Dos clases reactivación de MCM. Se han identificado múltiples
de mutaciones en MUT se distinguen clásicamente por estudios de mutaciones en varias regiones del gen, lo que ayudará a
[14C] -propionato orientar los estudios futuros de estructura y función (62, 63).
metabolismo en primario Las mutaciones incluyen
fibroblastos de pacientes con MMA (47). Mut 0

8 Rep. Biochem. Mol. Biol, vol. 5, No. 1, octubre de 2016

 Métodos de diagnóstico para la acidemia metilmalónica

30 mutaciones sin sentido / sin sentido, cuatro mutaciones en el sitio Las mutaciones truncadas se asociaron con el fenotipo clásico de
de empalme, cinco deleciones pequeñas, cinco inserciones pequeñas cblD. Esto respalda las sugerencias de que el producto del gen
y una deleción macroscópica. MMADHC desempeña un papel en la dirección de la cobalamina
hacia las 2 enzimas dependientes de cobalamina de las células de
cblB mamíferos, metilmalonil coamutasa y metionina sintasa (68).
En el tipo cblB de MMA, el gen defectuoso es MMAB. El gen
MMAB, en el cromosoma 12q24.1, codifica la enzima El tipo cblF está causado por mutaciones homocigotas o
mitocondrial ATP: cobalamina adenosil transferasa (ATR), que heterocigotas compuestas en el gen LMBRD1, que se encuentra
cataliza la transferencia de un grupo adenosilo del ATP a la en el cromosoma 6q13. Este gen produce una proteína
cobalamina (I) para formar AdoCbl (3). El análisis de transportadora de cobalamina lisosomal que facilita la exportación
mutaciones del gen MMAB identificó 20 mutaciones sin sentido de cobalamina lisosomal (69). Hasta la fecha, no se han reportado
/ sin sentido, siete mutaciones en el sitio de empalme, dos mutaciones para este gen. El gen SUCLA2 codifica la subunidad
mutaciones reguladoras, cinco deleciones pequeñas, tres beta de la succinil-CoA sintetasa formadora de ADP (SCS-A; EC
inserciones pequeñas y un indel pequeño (63, 64). 6.2.1.5). SCS es una enzima de la matriz mitocondrial que
cataliza la síntesis reversible de succinil-CoA a partir de succinato
y CoA. La reacción inversa ocurre en el ciclo de Krebs, mientras
que la reacción directa puede producir succinil-CoA para la
MCEE activación de los cuerpos cetónicos y la síntesis de hemo. Hasta
La D-metilmalonil-CoA (D-MMCoA) se forma como un producto de la fecha, se han identificado diez mutaciones sin sentido / sin
la reacción de propionil-CoA carboxilasa. D-MMCoA requiere sentido, una mutación en el sitio de empalme, una inserción
racemización antes de convertirse en un sustrato para la reacción pequeña, una deleción macroscópica y una indel pequeña (70). El
de MCM, y una deficiencia de D-metilmalonil-CoA racemasa tipo cblX es un trastorno metabólico recesivo ligado al cromosoma
(MCR, EC 5.1.99.1) se ha postulado durante mucho tiempo como X (Xq28) que se caracteriza por un desarrollo psicomotor
una etiología potencial de MMA hereditario (65). El gen de la gravemente retrasado aparente en la infancia y está causado por
epimerasa (MCEE) en el cromosoma 2p13.3 fue el primer gen mutaciones en el gen HCFC1. La mutación en el gen HCFC1
relacionado con la cobalamina que se identificó sobre la base de inhibe su función en la activación transcripcional del gen
arreglos de genes procarióticos. MMACHC y demostró que el trastorno de la transcripción puede
causar un error innato del metabolismo (71). Hasta el momento,
(66). A fecha, Tres no se han informado mutaciones para este gen. Los subtipos de
Se han identificado mutaciones sin sentido / sin sentido.
genes y las mutaciones involucradas en MMA se muestran en la
Tabla
Otros subtipos
Al menos otras cuatro vías de entidades genéticas pueden asociarse
con MMA aislada. Los tipos de cblD son causados
por homocigoto o compuesto
mutaciones heterocigotas en el gen MMADHC, que se encuentran
3.
en el cromosoma 2q23; estos incluyen ocho mutaciones sin sentido
/ sin sentido, dos pequeñas deleciones y tres pequeñas inserciones
Expresiones de gratitud
(67). La función del producto de este gen sigue siendo desconocida;
Esta investigación fue apoyada y financiada por el Laboratorio de
muestra homología con el componente ATPasa putativo de un
Inmunobioquímica, el Centro de Investigación de Alergias, la Facultad
transportador ABC bacteriano. Se identificaron mutaciones en la
de Medicina, la Universidad de Ciencias Médicas de Mashhad,
región Cterminal en pacientes con variante 2 de cblD, se
Mashhad, Irán. Todos los autores declaran no tener ningún conflicto
identificaron mutaciones en la región N-terminal en pacientes con
de intereses.
variante 1 de cblD, y

Rep. Biochem. Mol. Biol, vol. 5, No. 1, octubre de 2016 9

 Keyfi F et al.

Tabla 3. Subtipos y mutaciones en genes implicados en MMA (base de datos HGMD)

Número de
Subtipo Gene Mutación Porcentaje
mutación

Sinsentido / sinsentido 187

Mutación del sitio de empalme 24

No responde a Pequeña eliminación 37

MUT 58,37
vitamina B12 20
Pequeña inserción

Pequeño indel 3

Eliminación bruta 1

Sinsentido / sinsentido 30

Mutación del sitio de empalme 4

cblA MMAA Pequeña eliminación 5 9,65

Pequeña inserción 5

Eliminación bruta 1

Sinsentido / sinsentido 20

Mutación del sitio de empalme 7

Regulador 2
cblB MMAB 8.15
Pequeña eliminación 5

Pequeña inserción 3

Pequeño indel 1

Sinsentido / sinsentido 43

Mutación del sitio de empalme 5

Pequeña eliminación 19

cblC MMACHC Pequeña inserción 8 17.39

Pequeño indel 1

Eliminación bruta 4

Inserción bruta 1

Sinsentido / sinsentido 8

cblD MMADHC Pequeña eliminación 2 2,79

Pequeña inserción 3

Sinsentido / sinsentido 10

Mutación del sitio de empalme 1

SUCLA2 SUCLA2 Eliminación bruta 1 3,01

Pequeño indel 1

Pequeña inserción 1

cblF LMBRD1 No reportado - 0

cblX HCFC1 No reportado - 0

MCEE MCEE Sinsentido / sinsentido 3 0,64

10 Rep. Biochem. Mol. Biol, vol. 5, No. 1, octubre de 2016

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