INTRODUCCIÓN

La histología es el estudio de la células y tejidos del cuerpo, su estudio se realiza con la ayuda
de un microscopio. En este capítulo se hablará de cada uno de estos instrumentos y se hablará
del procedimiento en células, además se explicará una d las metodologías más utilizadas para
investigar la función y el metabolismo.

PREPARACION DE MUESTRAS PARA EL EXAMENE MICRIOSCOPICO

Las investigaciones en química, fisiología, inmunología y patología son fundamentales para el

conocimiento adecuado de la biología de las células, los tejidos y los órganos.

los procedimientos más usados en el estudio de tejidos al microscopio óptico, consiste en la

preparación de cortes histológicos .la imagen se forma a partir de los rayos luminosos de un
haz de luz que atraviesa una estructura.

por ejemplo, el mesenterio, la cola de un renacuajo, la parte de una célula de la mejilla de un

hámster, se observan el en microscopio en forma directa. De este modo es posible estudiar las
estructuras esas estructuras durante largos periodos en diferentes condiciones fisiológicas o
experimentales.

La poder ser observados los tejidos y los órganos deben pasar por una serie de tratamientos
que son:

FIJACION:

El proceso de fijación tiene varias finalidades, una de ellas es evitar que digieran los
tejidos, otra finalidad seria endurecer los fragmentos; conservar una gran parte la
estructura y la composición molecular.

La fijación se hace por métodos químicos o por métodos físicos; en la fijación

química, se sumergen los tejidos en soluciones d sustancia desnaturalizadas o en
sustancias que estabilicen las moléculas al formar puentes con moléculas
adyacentes.

Dos de los fijadores mas usados para la microscopia óptica es una solución de
formaldehido al 4%, el otro fijador es el glutaraldehído. debido a su alto resolución
del microscopio electrónico, se requiere sumo cuidado al hacer la fijación para
conservar mejor los detalles de las estructuras de las células y la matriz.

Para una fijación doble; se utiliza una solución de glutaraldehído amortiguado, por
otro lado, también tenemos la fijación en tetróxido de osmio, que conserva y da
contraste a los lípidos y las proteínas.

En la fijación física, se basan bien en una congelación muy rápida del tejido o bien en
la aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando los fijadores químicos alteran las
estructuras que queremos observar, cuando necesitamos una fijación muy rápida, o
cuando el tipo de tejido y la técnica que usaremos lo requieran.
 INCLUSIÓN:

Las sustancias más utilizadas para ese fin son la parafina y ciertas resinas plásticas .la
parafina suele utilizarse para la microscopia óptica y las resinas, tanto para la óptica
como electrónica.

En este proceso, se extrae el agua que contiene los tejidos mediante el pasaje por
diversos baños de soluciones de concentración creciente de etanol (por lo común,
desde etanol al 70% en agua hasta etanol al 100%). tras la deshidratación, se
sustituye el etanol por una sustancia intermediaria (por lo general un solvente
orgánico).

Para la inclusión en parafina, las sustancias intermediarias más usadas son ele xileno
o el tolueno. cuando el solvente orgánico impregna los fragmentos de tejidos, estos
quedan transparente o traslucidos

Figura 1.1 El microtomo sirve para

cortar tejidos en parafina o resina, al
pasar por la cuchilla obtenemos una
rebanada de tejido.

FIJACION FISICA POR CONGELACIÓN:

es un buen método de preservación de las características moleculares, puesto que no se

verán alteradas por ninguna sustancia química. La congelación es conveniente que sea
rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo que nos
destrozarían la estructura del tejido.

Por ello es conveniente no usar piezas mayores a 2 mm para que no se retarde la

congelación de las zonas centrales de la pieza. Asimismo, cuando sea posible, es
conveniente embeber la muestra en anticongelantes, también llamados crio
protectores.

Una congelación rápida se consigue sumergiendo la pieza en isopentano (-170 ºC)

enfriado con nitrógeno líquido, o colocando la muestra sobre un metal, el cual se
sumerge parcialmente en nitrógeno líquido (-196 ºC), en mezclas de hielo seco y acetona
(-70 ºC) o incluso en helio líquido (-268 ºC). La crio protección es siempre recomendable,
aunque no siempre es posible.

Normalmente se emplean como agentes crio protectores al dimetilsulfóxido, el glicerol y

la sacarosa, bien solos o mezclados en diferentes concentraciones. Hay que tener en
cuenta, sin embargo, que una vez que el tejido se haya cortado se vuelve a descongelar y
hay que protegerlo de los procesos de degradación.
 Existen variantes a la técnica de congelación como son la criodesecación o liofilización y
la crio sustitución. La criodesecación parte de tejido previamente congelado al que
posteriormente se le sublima el hielo, es decir, el agua pasa de estado sólido a gaseoso
sin pasar por estado líquido.

Al eliminar el agua se impide que se den reacciones químicas, por lo que, además de la
fijación, este método preserva el tejido en el tiempo. La crio sustitución también parte
de tejido congelado, pero en este caso se produce una sustitución lenta del hielo por
una solución fijadora.

Con ello se posibilita una fijación química sobre un material que no ha sufrido deterioro
puesto que está congelado.

COLORACIÓN:

La molécula de un colorante tiene normalmente dos componentes importantes: uno que

aporta el color, denominado cromógeno, y otro que posibilita la unión a elementos del
tejido denominado auxocromo. El cromóforo es la organización molecular dentro del
cromógeno responsable de la absorción de un espectro determinado de longitudes de
onda.

El auxocromo que se une al cromógeno puede influir en su coloración y muchos

colorantes tienen más de un grupo auxocrómico. El auxocromo puede ser un grupo
ionizable, un grupo que reacciona covalentemente con iones metálicos (mordientes) o
puede reaccionar covalentemente con el sustrato, en este caso el tejido.

Los colorantes son normalmente hidrosolubles, aunque hay colorantes que carecen de
grupos ionizables y sirven para teñir sustancias grasas, como gotas de lípidos.

MICROSCOPIA ÓPTICA
Los preparados coloreados se examinan al microscopio
óptico (también denominado microscopio de luz) por su
iluminación que atraviesa a la muestra
El microscopio óptico esta formado por partes
mecánicas y ópticas. el componente óptico consiste en
tres sistemas de lentes: condensador, objetivos y
oculares. El condensador es un dispositivo con una
lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la
fuente sobre la sección de tejido. El objetivo recibe la
luz que atravesó la muestra y proyecta una imagen
aumentada de la muestra en dirección al ocular.

FIGURA 1.2 esquema del microscopio óptico, podemos apreciar sus componentes principales y el
trayecto de luz desde la fuente iluminosa.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Y DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE
INFERENCIA.
Algunos sistemas ópticos permiten observar células y cortes sin coloración. las muestras
biológicas sin colorear suelen ser transparentes y la observación de detalles es difícil, pues todas
las partes de la muestra tienen casi la misma densidad óptica. en cambio, el microscopio de
contraste de fase utilizada un sistema de lentes que producen imágenes visibles de objetos casi
perfectos
MICROSCOPIA CONFOCAL
Lamentablemente, la imagen que ofrecen los microscopios no
suele componerse de un plano único muy delgado del corte.
Para resolver este problema se creó el microscopio con focal,
que focaliza un plano muy delgado de la muestra.
Los fundamentales de este microscopio son:

 Un haz óptico muy estrecho ilumina la muestra

 La imagen obtenida de la muestra debe pasar por un
orificio muy pequeño Figura 1.5 esquema del funcionamiento
de un microscopio confocal
MICROSPOCIA DE FLUORESCENCIA
Es una fuente de luz de mercurio a alta presión ilumina los
cortes. filtros especiales permiten seleccionar la longitud de
onda de los rayos luminosos que llegan a la muestra y también
de los rayos que emite la muestra .de este modo, las sustancias
fluorescentes se observan como objetos brillantes y con color.

Figura 1.6 microfotografía de células del riñón de hámster

en cultivo con naranja de acridina (microscopio de
fluorescencia)

MICROSCOPIA ELECTRONICA
Los microscopios electrónicos de transmisión y de barrio se basan en la interacción entre
electrones y componentes de los tejidos.
MICROSCOPIO ELCTRONICO DE TRANSMISIÓN
Es un sistema de producción de imágenes que, desde el
punto de vista teórica, posibilita una resolución altísima
(0,1nm) pero en la práctica, la resolución obtenida por la
mayoría de los buenos instrumentos se sitúa en torno a 3 nm.
Es lamentable que este grado tan alto de ampliación solo se pueda utilizar para analizar
partículas o moléculas aisladas, pues cortes delgados de células y tejidos pueden observarse en
detalle en aumento de hasta cerca de 12 mil veces.

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIO Figura 1.8 dibujo

Figura 1.7 microscopio esquemático de un
La microscopia electrónica de barrio proporciona imágenes microscopio de
de transición
seudotridimencionales de las superficies de células, tejidos y transición
órganos. en este microscopio, un haz de electrones de diámetro
muy pequeño y localizado sobre la muestra recorre de forma
secuencial la superficie.
Figura 1.9 dibujo esquematizado de
un microscopio electrónico de barrio

AUTORRADIOGRFIA EN CORTES DE TEJIDOS

El estudio funcional d ellos meca ismos biológicos en cortes de tejidos mediante la
radioactividad, que aprovecha la capacidad de sensibilizar emulsiones fotográficas. cristales de
bromuro de plata colocados antes en la emulsión fotográfica funcionan como detectores
CULTIVO DE CELULAS Y TEJIDOS
Las células pueden mantense vivas y estudiarse fuera del cuerpo lo cual esto facilita para poder
investigarlas ya se una célula o algún tejido.
El cultivo celular permite también realizar análisis directo del comportamiento de las células
vivas en el microscopio.
Para preparar cultivos de un tejido o un órgano, primero hay que separar las células por medios
mecánicos o por tratamiento enzimático. una vez asiladas, se las cultiva en suspensión o se las
coloca en una capsula de Petri o sobre un porta objetos de vidrió, superficie sobre las que las
células se adhieren y crecen como una capa celular única.

FRACCIONAMIENTO CELULAR
Se trata de un proceso físico por el cual se usa la fuerza centrifuga para separar un orgánulos y
componentes celulares en función de sus coeficientes de sedimentación.
El coeficiente de sedimentación de una partícula depende de su tamaño y su forma, así como de
su densidad y la viscosidad del medio en el que está suspendida.

HISTOQUIMICA Y CITOQUIMICA
Se utilizan para indicar técnicas que identifican y localizan las sustancia en las células y la
matriz extracelular, en cortes histológicos o en células de cultivo.
Para obtener esta información se basa en reacciones químicas o en interacciones de alta afinidad
entre moléculas.
Figura 1.13 El fraccionamiento celular permite aislar los
Figura 1.14 micrografías electrónicas de tres
componentes de la célula por centrifugación diferencial
fracciones celulares aisladas por configuración en
gradiente de densidad

 IONES
 Varios iones como por ejemplo el calcio, hierro o fosfato, pueden detectarse en los
tejidos mediante mediante reacciones reacciones químicas que forman productos
insolubles oscuros o con color.

Figura 1.15 microfotografía de un

corte de un hueso tratado
mediante una técnica histoquímica
para detectar iones de calcio

 ACIDOS NUCLEICOS
El DNA puede identificarse y cuantificarse en los núcleos de las células por medio de la
reacción de fulgen, que produce color rojo en el DNA, asimismo observar el DNA y el
RNA por la tintacion de las células o los cortes de tejidos mediante colorantes básicos.

 PROTEINAS
Aunque hay métodos generales para detectar proteínas en células y cortes de tejidos, las
técnicas histoquímicas no suelen localizar proteínas específicas, lo que se hace por
inmunohistoquímica .no obstante hay varios métodos histoquímicos que revelan con
mayor o menor especificidad un grupo grande de proteínas en las enzimas.