UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR

División de Ciencias Biológicas

Coordinación de Biología

Aislamiento y Caracterización de Bacterias Ácido Acéticas presentes en la Fermentación de

Cacao variedad Carenero

Por:

Luis Eduardo Marcano Anaya

PROYECTO DE GRADO
Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar
como requisito parcial para optar al título de
Licenciado en Biología
Sartenejas, Julio de 2016
 UNIVERSIDAD SIMON BOLIVAR
División de Ciencias Biológicas
Coordinación de Biología

Aislamiento y Caracterización de Bacterias Ácido Acéticas presentes en la Fermentación de

Cacao variedad Carenero

Por:

Luis Eduardo Marcano Anaya

Realizado con la asesoría de:

Prof. Elisabetta Lucci
Prof. Margarita Rodríguez

PROYECTO DE GRADO
Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar
como requisito parcial para optar al título de
Licenciado en Biología
Sartenejas, Julio de 2016
 RESUMEN

Las Bacterias ácido acéticas (BAA) cumplen un papel importante durante la fermentación de la semilla
del cacao, debido a su habilidad de oxidar etanol en ácido acético y distintos azucares en ácidos orgánicos
lo que inicia una serie de reacciones bioquímicas dentro y fuera del cotiledón, que conllevan a la
liberación de compuestos precursores del flavor del chocolate. Se planteó como objetivo el aislamiento y
caracterización bioquímica y molecular de BAA presentes en la fermentación de cacao variedad Carenero.
Se tomaron muestras durante los 6 días de fermentación en diferentes puntos de la masa y se realizaron
diluciones seriadas sembrando por extensión en superficie en medios de cultivo selectivo y diferencial.
Los aislados se caracterizaron por morfología celular, motilidad, capacidad de crecer en 30% D-glucosa,
oxidación de acetato, producción de pigmentos marrones solubles en agua y crecimiento en 10% de
etanol. La caracterización molecular se llevó a cabo mediante comparación de fragmentos de restricción
obtenidos con AluI y TaqI del ADNr 16S amplificado por PCR. Se seleccionaron 11 aislados que
mostraron crecimiento en ambos medios de cultivo, con halo de aclaramiento en el medio carbonato -
extracto de levadura - glucosa (CYG) y cambio de color de amarillo a purpura en el medio dextrosa –
manitol – sorbitol modificado (DMS-m), todos fueron bacilos Gram negativos motiles, oxidasa negativo y
catalasa positivo. Ese grupo se dividió en 3 fenotipos de acuerdo a la morfología de la colonia. El
crecimiento en 30% D-glucosa y en 10% etanol, logró diferenciar 3 aislados los cuales fueron
seleccionados para la caracterización molecular. El cambio de color a violeta del medio DMS-m en
conjunto con la habilidad de oxidar el acetato sugiere que todos los aislados pertenecen al género
Acetobacter. La caracterización molecular mediante el análisis de restricción del 16S ADN-r con la
enzima AluI no fue concluyente, sin embargo la digestión con la enzima TaqI mostró 2 patrones diferentes
los cuales permitieron ubicar a los aislados entre distintas especies posibles. Al correlacionar estos
patrones con la caracterización fisiológica y bioquímica se concluyó que se encontraban en este proceso 3
especies distintas de BAA la primera con características de Acetobacter cibinongensis, la segunda con
características de Acetobacter cerevisiae y la tercera con características de Acetobacter estunensis.

Palabras clave: Fermentación de Cacao, Bacterias ácido acéticas, Acetobacter cibinongensis,

Acetobacter cerevisiae, Acetobacter estunensis..

5
 AGRADECIMIENTOS

A mis padres y a mi familia, por apoyarme en todo momento, con todo su esfuerzo para darme
la oportunidad de estudiar en una gran universidad. Gracias por ser un ejemplo siempre para mí.

A mis tutoras, Elisabetta Lucci y Margarita Rodriguez, por su esfuerzo, apoyo, paciencia y
dedicación. Por brindarme la oportunidad de realizar mi trabajo de grado en los Laboratorios de
Microbiología. Les agradezco por haberme brindado su conocimiento y ser un ejemplo a seguir.

A la profesora María Angélica Santana por haberme dado la oportunidad de trabajar en el

Laboratorio de Biotecnología de plantas. Le agradezco por todo el apoyo, herramientas y
conocimiento que compartió conmigo durante este proyecto.

A mis compañeros de laboratorio Gabriela, Cristian y Alejandro por estar siempre dispuestos a
colaborar, por su amistad y por los ratos amenos.

A mi querido Orfeón universitario Simón Bolívar por ser más que un coro, una familia en la
que aprendí muchísimo.

A mis compañeros del grupo de teatro Contratexto USB por todos los buenos momentos, las
risas, los ratos de diversión y el trabajo duro. No hay palabras para expresar el cariño que les
tengo.

A la profesora Aurora Olivieri por todo el cariño y apoyo incondicional, su amistad y ser
siempre un ejemplo a seguir.

A Guillermo por haber sido un apoyo siempre, en las buenas y en las malas. Mi agradecimiento
es infinito.

A mis amigos por ser parte fundamental de mi vida, por motivarme a seguir adelante. A Karla,
Ara, Maggi, Anita, Gabbi, Reinaldo, Grecia, Ari, Mariangel, Vero, Chomón, Mario, Frodo,
Carlos, Santiago, Alberto, Elias, Lucia, Renzo, Rolando, Mariana, Sandra… Gracias por creer en
mí, y siempre animarme a seguir adelante.

6
 INDICE GENERAL

Página

ÍNDICE DE TABLAS .. vi

ÍNDICE DE FIGURAS vii

ABREVIATURAS viii

INTRODUCCIÓN 1

CAPÍTULO1. MARCO TEÓRICO 3

1.1 Bacterias Ácido Acéticas 3

1.2 Metabolismo de las BAA 4

1.3 Theobroma cacao 9

1.4 Fermentación cacao para la producción de chocolate 10

1.5 BAA en la fermentación de cacao 11

1.6 Aislamiento e Identificación morfológica bioquímica y fisiológica de las BAA 12

1.7 Técnicas de identificación molecular aplicadas a las BAA 15

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS 19

2.1 Muestreo de cacao durante el proceso de fermentación 19

2.1.2 Recolección de muestras 19

2.2 Aislamiento de BAA provenientes de la muestra de cacao fermentado 20

2.2.1 Tratamiento de la muestra 20

2.3 Caracterización bioquímica y fisiológica de los aislados 20

7
2.4 Caracterización molecular de los aislados 21

2.4.1 Amplificación del ADNr 16S por PCR 22

2.4.2 Digestión con enzimas de restricción del amplificado del ADNr 16S 23

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24

3.1 Recolección de muestras de cacao durante el proceso de fermentación 24

3.2 Aislamiento de BAA provenientes de la muestra de cacao fermentado 25

3.3 Caracterización fisiológica y bioquímica de las cepas 26

3.4 Caracterización molecular de las cepas 29

CONCLUSIONES Y RECOMENTACIONES 36

REFERENCIAS 37

APÉNDICES 41

Apéndice A 41

8
 ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1.1 Especies de los 13 géneros de BAA 4

Tabla 1.2 Características diferenciales de los 13 géneros de BAA 8

Tabla 1.3 Incidencia de distintas especies de BAA en la fermentación de cacao 13

Tabla 1.4 Características diferenciales de las especies de BAA más comunes en cacao 14

Tabla 1.5 Clasificación de las BAA encontradas en cacao de acuerdo al análisis 17

electroforético de la PCR-RFLP del ADNr 16S

Tabla 1.6 Tamaños de los fragmentos de restricción del ADNr 16S usados para clasificar 18
las BAA

Tabla 3.1 Morfología de las colonias aisladas sembradas en los medios de cultivo 27
DMS-m y CYG

Tabla 3.2 Pruebas fisiológicas y bioquímicas de las BAA aisladas 28

Tabla 3.3 Características fisiológicas y bioquímicas de distintas especies del género 33

Acetobacter
Tabla 3.4 Pruebas adicionales requeridas para la identificación de los aislados 34

Tabla 3.5 Clasificación de algunas BAA de acuerdo con el análisis electroforético de la 35

PCR-RFLP del ADNr 16S usando la enzima TaqI

9
 ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1.1 Tinción Gram de una bacteria del género Acetobacter 3

Figura 1.2 Oxidación del etanol en ácido acético en BAA 5

Figura1.3 Tres variedades de cacao. Criollo, Forastero y Trinitario 9

Figura 1.4 Dinámica bacteriana durante el proceso de fermentación de cacao 11

Figura 3.1 pH y temperatura de la masa durante los 6 días de fermentación 24

Figura 3.2 Prueba de motilidad de la cepa D3.1 28

Figura 3.3 Corrida electroforética de la amplificación del ADNr 16S por PCR 30

Figura 3.4 Digestión del ADNr 16S con la enzima AluI 31

Figura 3.5 Digestión del ADNr 16S con la enzima TaqI 32

10
 LISTA DE ABREVIATURAS

ADH Alcohol Deshidrogenasa

ALDH Aldehído Deshidrogenasa

BAA Bacterias ácido acéticas

BAL Bacterias ácido lácticas

CYG Carbonato de calcio-extracto de levadura-glucosa

DMS-m Dextrosa-Manitol-Sorbitol, modificado

HS Hestrin-Schramm

MEP Manitol-extracto de levadura-peptona

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

RFLP Restriction fragment length polymorphism, Polimorfismo de longitud de

fragmentos de restricción

YG Extracto de levadura-glucosa.

YP Extracto de levadura-peptona

11
 12

INTRODUCCIÓN

El uso de bacterias ácido acéticas (BAA) en la industria de los alimentos data de hace cientos de
años en la producción de vinagre, cuyo descubrimiento posiblemente está ligado al comienzo de
la elaboración de bebidas alcohólicas. Estas bacterias realizan una fermentación oxidativa
mediante la cual pueden oxidar el etanol en ácido acético, habilidad que les da su nombre, sin
embargo también son capaces de oxidar una gran variedad de azucares como glucosa, arabinosa y
galactosa en distintos ácidos orgánicos. En un principio las BAA eran clasificadas en 2 grandes
géneros, Acetobacter y Gluconobacter, sin embargo hoy en día se reconocen 13 géneros de estas
bacterias agrupados en la familia Acetobacteraceae (Sengun y Karabiyikli, 2010).

En la industria del chocolate también tienen un rol muy importante ya que forman parte del
consorcio microbiano involucrado en la fermentación de la semilla del cacao. En este proceso
participan en conjunto con levaduras y bacterias ácido lácticas (BAL) para iniciar una serie de
reacciones bioquímicas fuera y dentro del cotiledón que conllevan a la liberación de compuestos
precursores del flavor del chocolate.

Conocer la microbiota que forma parte del consorcio microbiano que lleva a cabo la
fermentación del cacao ha sido de interés para distintos investigadores en los últimos años. Uno
de los primeros estudios fue realizado por Rombouts (1952) quien analizó la microbiota presente
en la fermentación espontanea de cacao en varias regiones de Trinidad, encontrando que la pulpa
resultó ser un medio selectivo debido a la alta concentración de azucares y bajo pH inicial que
presenta, favoreciendo el crecimiento de levaduras y BAL, posteriormente a medida que se
aireaba la masa proliferaban las BAA, concluyendo que estos tres grupos microbianos dominaban
en el proceso. Estudios similares fueron realizados más recientemente en países como, México
(Romero et al., 2012), Ecuador (Papalexandratou et al., 2011), Ghana (Camu et al., 2008),
Malasia (Papalexandratou et al., 2013), Brasil (Papalexandratou et al., 2011), República
Dominicana (Lagunes et al., 2007) y Nigeria (Kostinek et al., 2008), donde se ha estudiado la
microbiota involucrada en la fermentación del cacao con miras a determinar las especies
predominantes de bacterias y levaduras presentes. Esto es de especial importancia para el control
del proceso, el cual se realiza de forma espontánea lo que conlleva a alta variabilidad en el
 13

producto final. Adicionalmente permitiría la selección de especies para el diseño de cultivos

iniciadores con el fin de homogeneizar el proceso para obtener chocolate de calidad consistente.
Cabe destacar que en Venezuela no se han publicado estudios acerca de la microbiota asociada a
la fermentación del cacao por lo que en este trabajo se plantearon los siguientes objetivos:

General

 Aislar y caracterizar las bacterias acido acéticas presentes en la fermentación

del cacao Carenero, cultivado en la localidad de Tacarigua de Mamporal Edo.
Miranda, Venezuela.

Específicos

 Aislar las bacterias acido acéticas presentes durante un proceso de

fermentación de cacao variedad carenero, utilizando medios de cultivo
selectivos y diferenciales y condiciones de incubación selectivas reportadas
para este grupo microbiano.
 Realizar la caracterización morfológica, bioquímica y fisiológica de las
bacterias aisladas
 Realizar la caracterización morfológica de los aislados mediante la
amplificación por PCR del ADNr 16S y el corte del amplificado con enzimas
de restricción comparando con patrones reportados para BAA.
 14

CAPÍTULO 1

MARCO TEÓRICO

1.1 Bacterias Ácido Acéticas

Las bacterias acido acéticas (BAA) son bacterias Gram negativas o Gram variables
pertenecientes a la familia Acetobacteraceae, aeróbicas estrictas, no formadoras de esporas, con
forma elipsoidal o de bacilo que pueden presentarse aisladas, en pares o en cadenas. Son motiles
por la presencia de flagelos ya sean polares o a lo largo de la célula. Su tamaño varía entre 0,4 – 1
µm de ancho y 0,8 – 4 µm de largo, son catalasa positivas, a excepción de Acetobacter
peroxydans, la cual es catalasa negativa. Su pH óptimo de crecimiento es entre 5 y 6,5 pero
algunas especies pueden crecer en valores más bajos (entre 3 y 4). Pueden producir pigmentos en
medio sólido y producir también distintos tipos de polisacáridos (Holt et al., 1994). En la Figura
1.1 se muestra la morfología de una bacteria perteneciente al género Acetobacter.

Figura 1.1 Tinción Gram de una bacteria del género Acetobacter. Phillips David, (2011)

La familia Acetobacteraceae está compuesta actualmente por 13 géneros los cuales se muestran
en la Tabla 1.1 (Brenner et al., 2005; Yamada et al., 2013). Las técnicas de identificación
 15

molecular han permitido la descripción de nuevos géneros como es el caso de

Komagataeibacter, un género que derivo del género Gluconacetobacter en el año 2013.

Tabla 1.1 Especies de los 13 géneros de BAA. Brenner et al. (2005); Yamada et al. (2013)

Género Especie Género Especie Género Especie

A. aceti Ga. azotocaptans Acidomonas Ac. Methanolica

Ga.
A. cerevisiae As. Bogorensis
diazotrophicus
A. cibinongensis Ga. entanii As. Krungthrpensis
Gluconacetobacter
A. estunensis Ga. sacchari Asaia As. Lannensis
A. indonesiensis Ga. liquefaciens As. Siamensis
A. lovaniensis Ga. johannae As. Spathodeae
A. malorum Ko. intermedius Ameyamaea Am. Chiangmaiensis
G.
A. nitrogenifigens Ko. hansenii
Acetobacter albidus
A. oeni Ko. nataicola G. cerinus
A. orientalis Ko. oboediens G. frateurii
A. orleanensis Komagataeibacter Ko. rhaeticus G. japonicus
A. pasteurianus Ko. europaeus G. kondonii
Gluconobacter
Ko.
A. peroxydans G. oxydans
saccharivorans
A. pomorum Ko. swingsii G. roseus
A. syzygii Ko. xylinus G. sphaericus
A. tropicalis Granulibacter Gr. bethesdensis G. thailandicus
Kozakia K. baliensis Neoasaia N. chiangmaiensis G. wancherniae
Saccharibacter S. floricola Swaminathania Sw. salitolerans Tanticharoenia T. sakaeratensis

1.2 Metabolismo de las BAA

El potencial metabólico de las BAA en los ambientes que ocupan es expresado por la oxidación
parcial de carbohidratos y alcoholes, liberando los productos correspondientes (aldehídos,
cetonas y ácidos orgánicos) en el medio que las rodea. A través de procesos llamados oxidaciones
fermentativas las BAA realizan reacciones específicas de oxidación canalizando los electrones
liberados en oxigeno molecular (Mamlouk y Gullo, 2013)
 16

Las BAA oxidan parcialmente el etanol mediante 2 reacciones catalíticas sucesivas de 2

enzimas de membrana, una alcohol deshidrogenasa (ADH) y una aldehído deshidrogenasa
(ALDH) que están adheridas a la superficie externa de la membrana citoplasmática. Los
complejos ADH y ALDH están fuertemente conectados con la cadena respiratoria que transmite
electrones vía ubiquinona y una ubiquinona oxidasa terminal al oxigeno como aceptor final. La
oxidación completa del etanol ocurre a nivel citoplasmático, el ácido acético producido puede ser
utilizado posteriormente por una Acetil CoA sintetasa integrándose en el ciclo de Krebs
(Mamlouk y Gullo, 2013). En la Figura 1.2 se muestra el proceso de oxidación del etanol en las
BAA. Los complejos ADH y ALDH que se encuentran en la membrana citoplasmática son
independientes de NAD(P)+ y tienen un pH óptimo de entre 4 y 5 sin embargo se ha detectado la
presencia de una ADH citoplasmática dependiente de NAD(P)+ que tiene un pH optimo entre 6
y 8 pero que es mucho menos especifica que su contraparte de membrana. La actividad de la
ADH en Acetobacter es más estable en presencia de ácido acético que la de Gluconobacter lo que
permite a Acetobacter una mayor producción de este ácido (Raspor y Goranovic, 2008).

Figura 1.2 Oxidación del etanol en ácido acético en BAA. Mamlouk y Gullo (2013).
 17

Las BAA pertenecientes a los géneros Acetobacter y Gluconacetobacter pueden oxidar el

ácido acético por la vía del ciclo de Krebs, otros ácidos como el ácido latico, pirúvico, málico,
succinico, cítrico y fumárico son metabolizados de manera similar (Mamlouk y Gullo, 2013).
Esta ruta es inhibida por la presencia de etanol por lo que solo ocurre en caso de que el etanol del
medio se acabe, pareciera ser un cambio irreversible en su metabolismo después del cual no son
capaces de oxidar etanol nuevamente. En el caso de Gluconobacter esta ruta no ocurre debido a
que no posee un ciclo de Krebs funcional, faltándole 2 enzimas clave como son la alfa-
cetoglutarato deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa (Raspor y Goranovic, 2008).

Las BAA son conocidas por su gran capacidad de oxidar azucares, especialmente glucosa pero
también arabinosa, fructosa, galactosa, manosa, ribosa, sorbosa y xilosa. Pueden catalizar
azucares mediante la ruta de las hexosas monofosfato y la ruta de Entner-Doudoroff, esta última
se encuentra solo en cepas de Acetobacter o Gluconacetobacter que son productoras de celulosa,
y en estas parece ser más activa que la ruta de las hexosas monofosfato (Mamlouk y Gullo,
2013).

Gluconobacter oxidans es la BAA más eficiente para oxidar de forma incompleta una gran
variedad de carbohidratos, alcoholes y otros compuestos relacionados, liberando al medio casi un
100% de los productos correspondientes. Estas reacciones ocurren fuera de la célula ya que esta
bacteria posee una gran cantidad de deshidrogenasas en la membrana cuyo sitio activo está
orientado hacia el periplasma (Raspor y Goranovic, 2008). Se ha reportado que la ruta oxidativa
pentosa fosfato es la más importante para la ruptura fosforilativa de azucares y polioles dando
como producto final CO2. Es por esto que se cree que G. oxidans tiene la capacidad de usar
muchos polioles, azucares y derivados de azucares e incorporarlos en el ciclo de las pentosas
fosfato. Los polioles son primero oxidados por deshidrogenasas solubles, estos productos junto
con otras cetosas y aldosas son modificados por varias isomerasas y epimerasas para finalmente
ser fosforilados por quinasas específicas o no específicas formando intermediarios de la ruta
oxidativa de las pentosas fosfato (Mamlouk y Gullo, 2013).

Acetobacter puede usar azucares por la ruta de las hexosas monofosfato y estas pueden ser
metabolizadas en H2O y CO2 en el ciclo de Krebs el cual está ausente en Gluconobacter. Los
 18

azucares son preferidos por Gluconobacter como fuente de carbono más que en el caso de
Acetobacter ya que las bacterias del genero Gluconobacter pueden metabolizarlas muy
eficientemente mediante la ruta pentosa fosfato. La reacción más característica es la oxidación
directa de glucosa en glucono-δ-Lactona la cual se oxida en ácido glucónico. Esta reacción ocurre
particularmente en especies de Gluconobacter creciendo a altas concentraciones de azúcares
(Mamlouk y Gullo, 2013).

Las BAA pueden oxidar varios azucares alcohólicos, pueden oxidar el glicerol a ácido
docosahexaenóico (DHA), D-manitol a D-fructosa, D-sorbitol a L-sorbosa, D-arabitol a D-
xilulosa, y meso-eritritol a L-eritrulosa. En G. oxidans se reportó que la oxidación de glicerol es
catalizada por una glicerol/sorbitol deshidrogenasa de membrana. Esta quinoproteína es
considerada la principal poliol-deshidrogenasa de esta especie y muestra una amplia variedad de
sustratos (Mamlouk y Gullo, 2013).

La ruta metabólica del glicerol en Acetobacter pasteurianus, mostró que la utilización de

glicerol viene acompañada de la formación de DHA, celulosa, CO2 y pequeñas cantidades de
acetato. En esta especie hay 2 rutas para la formación de DHA, una catalizada por una glicerol
deshidrogenasa y otra vía glicerol 3-fosfato por una glicerol quinasa. El DHA fosfato puede luego
ser transformado en gliceraldehido-3-fosfato y entrar así en la ruta de la gluconeogénesis
(Mamlouk y Gullo, 2013).

Durante la producción tradicional de vinagre, las bacterias que se encuentran en la superficie

producen una biopelícula al estar en contacto con oxígeno. Esta biopelícula las protege de las
altas concentraciones de etanol y ácido acético a las que se encuentran expuestas y está
compuesta en gran parte por celulosa bacteriana. Esto ocurre en varios de los géneros de BAA
como Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter, y Komagataeibacter. Este último género,
específicamente K. xylinus es considerado un microorganismo modelo en la producción de
celulosa bacteriana (Valera et al., 2014).

Los estudios de producción de celulosa en BAA se han enfocado en la composición de las

biopelículas de exopolisacaridos (EPS) producidos por cepas de K. xylinus, técnicas de
 19

microscopía han mostrado que este secreta una sustancia mucosa en la que se forman las fibras de
celulosa. Estos estudios se enfocan principalmente en cómo aumentar la formación de celulosa
cambiando la composición de los medios de cultivo o usando distintas cepas (Valera et al., 2014).

En la Tabla 1.2 se muestran las principales características morfológicas y bioquímicas de los

distintos géneros de BAA.

Tabla 1.2 Características diferenciales de los 12 géneros de BAA. Sengun y Karabiyikli, (2010); Yamada
et al. (2013).

Características A Ac As Ga G K S Sa N Gr T Am Ko

Flagelación pe/n n pe/n pe/n po/n n pe n n n n Po n

Oxidación de etanol a ácido acético + + -/w + + + + v + v + + +
Oxidación de ácido acético a CO2 y H2O + + + + - d d - - d - + +
Oxidación de lactato a CO2 y H2O + d + +/- - d d W - + - D +/-
Crecimiento en 0.35% de ácido acético + + - + + + + - + Nd + + +
Crecimiento en metanol -/d + - - - - - - - + - D -
Crecimiento en D-Manitol +/- d +/- +/- + + Nd Nd Nd Nd Nd Nd +/-
Crecimiento en presencia de 30% de D-glucosa - - + +/- -/+ - Nd + + Nd + - +/-
Producción de celulosa +/- - - +/- - + Nd - Nd Nd Nd Nd +/-
Producción de sustancia mucosa a partir de Sucrosa -/+ - - -/+ - + Nd - - Nd - - +/-

Fijación de nitrógeno molecular - - - -/+ - - Nd Nd Nd Nd Nd Nd +/-

Ketogénesis a partir de glicerol +/- d -/d +/- + + + - d - + D +/-
Producción de ácido a partir de
D-manitol -/+ - +/- +/- + - - + d - - - +/-
Glicerol -/+ - + + + + + - + +/- + D +
Raffinosa - Nd - - + Nd - + Nd Nd Nd -
Tipo de ácido graso celular C18:1 C18:1 C18:1 C18:1 C18:1 C18:1 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd
Q- Q- Q- Q- Q- Q- Q-
Tipo de ubiquinona Q-9 Q-10 Q-10 Q-10 Q-10 Q-10 10 10 10 10 10 10 10

57- 52- 55-

Composición de ADN (%mol G+C) 52-60 63-66 59-61 55-66 55/63 56-57 60 53 63.1 59 66.0 65.6 66

Símbolos: A. Acetobacter; Ac. Acidomonas, As. Asaia, Ga. Gluconacetobacter, G. Gluconobacter, K.

Kozakia, S. Swaminathania, Sa. Saccharibacter, N. Neoasaia, Gr. Granulibacter, T. Tanticharoenia, Am.
Ameyamaea, Ko. Komagataeibacter; pe, peritrico; n, no motil; po, polar; +, 90 % o más de las cepas
positivas; -, 90% o más de las cepas negativas; +/- variable; d, reacción positiva débil; Nd, no
determinado;
 20

1.3. Theobroma cacao

Theobroma cacao es el nombre que recibe el árbol del cacao, una planta de hoja perenne de la
familia Malvaceae. Se cultiva en el trópico húmedo y es una importante fuente de ingresos para
varios países, especialmente del oeste de África. Su fruto contiene las semillas que son luego
procesadas por la industria del chocolate (Motamayor et al., 2008). Basado en características
morfológicas y de distribución geográfica, Theobroma cacao como especie ha sido subdividida
en 3 grupos principales, Forastero, Criollo y Trinitario.

Figura 1.3 Tres variedades principales de cacao: Criollo, Forastero y Trinitario. Tamorlan, (2010)

El cacao forastero se originó en la región amazónica de Suramérica y posee frutos verdes con
semillas predominantemente purpura. El cacao criollo fue la primera variedad no salvaje en
aparecer y se originaron en Centroamérica y el norte de Suramérica, posee unas semillas largas
blancas o rosadas que dan un chocolate altamente deseable aunque tienen un valor agronómico
pobre. El cacao trinitario es una mezcla entre el cacao criollo y el forastero (N’goran et al., 1994).

En Venezuela se cultivan las 3 variedades principales de cacao y sus cruces varietales. En la

región nororiental se cultiva el cacao denominado Río Caribe que son híbridos de cacaos
forasteros con influencia de viejos cacaos criollos y trinitarios, en la región norcentral-costera se
cultiva el Carenero superior y el Caracas natural, que son cacaos trinitarios mezclados con
 21

criollos locales que crecen en la zona de Barlovento, también en esta región se cultiva el cacao
Chuao que proviene de un mosaico de cacaos forasteros, trinitarios y criollos. Por ultimo en la
región suroccidental se cultiva el cacao de tipo Sur del Lago, cuyos granos son procedentes de
cacaos criollos y trinitarios mezclados con híbridos de criollo porcelana, Mérida y Guasare
(Cartay, 1998).

1.4 Fermentación de cacao para la producción de chocolate

El fruto cosechado del árbol Theobroma cacao debe ser procesado y curado antes de poder ser
transformado en chocolate, el proceso de curado incluye la fermentación, el secado y el tostado
de la semilla del cacao. La pulpa del cacao es un medio rico para el crecimiento microbiano, está
compuesta por un 82 – 85 % de agua, 10-15% azucares, 2-3% pentosas, 1-3% ácido cítrico y 1-
1,5% pectinas. Las semillas dentro del fruto son microbiológicamente estériles pero se
contaminan con una gran variedad de microorganismos al ser abiertas, algunos de los cuales
contribuyen en el proceso de fermentación. Las principales fuentes de contaminación de la pulpa
son los cuchillos, las manos de los trabajadores y los restos de pulpa que quedan en las cajas de
las fermentaciones anteriores. El proceso puede durar hasta 7 días dependiendo de la variedad de
cacao y se suele hacer en lotes desde 25 hasta 2.000 Kg. con volteos regulares para airear la masa
(Schwan, 1998).

Durante el proceso de fermentación se producen grandes cantidades de etanol y ácidos

orgánicos así como también una gran cantidad de calor que puede aumentar la temperatura de la
masa hasta 50°C. La difusión de los metabolitos generados durante la fermentación activa
reacciones bioquímicas complejas que ocurren en el cotiledón y que causan finalmente la muerte
del embrión, liberando así compuestos que son precursores del aroma, color y sabor del
chocolate. Otra de las ventajas de la fermentación es que al degradarse la pulpa el proceso de
secado es mucho más rápido y fácil (Schwan y Wheals, 2004). El orden y tiempo de aparición de
los distintos microorganismos que intervienen en la fermentación del cacao se muestran en la
Figura 1.4.
 22

La acidez inicial de la pulpa (pH 3,6) y el bajo nivel de oxigeno hace que al comienzo del
proceso predominen las levaduras, las cuales son capaces de usar los carbohidratos de la pulpa
tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas produciendo grandes cantidades de etanol. Las
poblaciones de levaduras aumentan durante las primeras 12 horas del proceso para luego tener un
descenso drástico. Seguidamente las BAL alcanzan su mayor número a las 36 horas produciendo
grandes cantidades de ácido láctico, para luego disminuir a medida que se va aireando la masa y
aumentando la temperatura. En este punto comienzan a dominar las BAA, alcanzando su máximo
número a las 88 horas y consumiendo el etanol producido por las levaduras transformándolo en
ácido acético (Schwan y Wheals, 2004).

Figura 1.4 Dinámica bacteriana durante el proceso de fermentación de cacao. Schwan y Wheals (2004)

1.5 BAA en la fermentación del cacao

Las BAA cumplen un rol fundamental en la fermentación del cacao a pesar de no ser las únicas
bacterias involucradas en este proceso. La acidificación y el aumento de temperatura que
ocasionan en la masa causan la muerte del embrión y la difusión e hidrolisis de proteínas en el
cotiledón, lo cual se traduce posteriormente en la liberación de los precursores del sabor y olor en
el chocolate. Durante el proceso de la fermentación las levaduras producen altas cantidades de
etanol y las BAL grandes cantidades de lactato, ambos compuestos pueden ser utilizados como
sustrato por las BAA. La degradación de lactato por parte de las BAA es algo deseable durante la
 23

fermentación ya que el exceso de este compuesto puede contribuir al desarrollo de sabores y

olores no deseables al producto final. Las grandes cantidades de acetato que producen las BAA
difunden en la semilla y activan una compleja cadena de reacciones bioquímicas que termina en
la formación de las moléculas precursoras del flavor del cacao. En el caso de las bacterias del
género Acetobacter pueden completar la oxidación del acetato a CO2 incorporándolo en el ciclo
de Krebs contribuyendo así a que el pH de la masa no descienda demasiado lo cual de ocurrir
podría afectar de forma negativa el flavor del producto final (Adler et al, 2014).

En el Apéndice A se recopila la identificación de las BAA presentes en 16 trabajos realizados

sobre la fermentación de cacao en varios países productores como, Ghana, Malasia, Indonesia y
en el Continente Americano, República Dominicana, Trinidad y Tobago, México, Brasil y
Ecuador. El resultado de esa recopilación permitió determinar el porcentaje de incidencia de las
especies predominantes que se muestran en la Tabla 1.3, siendo las más comunes especies del
género Acetobacter, predominando A. pasteurianus, A. aceti y A. ghanensis, tanto a nivel
mundial como en América y en esta última destaca también A. malorum, seguida por A. fabarum,
A. orientalis, , A. peroxydans y A. senegalensis. En el género Gluconobacter, los aislados que
predominan se restringen a G. oxidans.

1.8 Aislamiento e Identificación morfológica bioquímica y fisiológica de las BAA

Para el aislamiento de este grupo se puede usar una amplia variedad de medios de cultivo,
(Romero et al., 2012; Cleenwerck et al. 2007; Nielsen et al. 2007), los cuales permiten
diferenciar las BAA debido a la producción de ácidos orgánicos característica de este grupo. El
carbonato de calcio es un ingrediente usado comúnmente en estos medios ya que las BAA
presentan en el mismo un halo de aclaramiento alrededor de la colonia, producto de la reacción
del carbonato de calcio con los ácidos orgánicos secretados por la bacteria. Las fuentes de
carbono más usadas son glucosa, manitol y sorbitol ya que son azucares comúnmente usados por
estos organismos. Otra característica común que comparten estos medios es que tienen como
ingrediente extracto de levadura, un producto rico en vitaminas, especialmente del complejo B,
aminoácidos y otros nutrientes. .
 24

Uno de los medios de cultivo más utilizado es el medio carbonato-extracto de levadura-glucosa,

CYG el cual permite la característica diferencial de aclaramiento y adicionalmente permite el
crecimiento de un amplio grupo de las BAA. Otro medio de cultivo que se utiliza frecuentemente
es el desoxicolato-manitol-sorbitol (DMS) que puede diferenciar entre los 2 géneros más
comúnmente reportados, sin embargo este medio no permite el crecimiento de todas las especies.
Debido a esto es común la utilización de más de un medio de cultivo para el aislamiento de este
grupo microbiano.

Tabla 1.3. Incidencia de distintas especies de BAA en la fermentación de cacao.

Especie Incidencia mundial Incidencia en América
Acetobacter
Acetobacter aceti 31.25% 22.22%
Acetobacter cibinongensis 6.25% 11.11%
Acetobacter fabarum 12.50% 22.22%
Acetobacter ghanensis 31.25% 22.22%
Acetobacter indonesiensis 6.25% 22.22%
Acetobacter lovaniensis 25% 11.11%
Acetobacter malorum 18.75% 33.33%
Acetobacter orientalis 12.50% 22.22%
Acetobacter pasteurianus 68.75% 44.44%
Acetobacter cerevisiae 12.50% 22.22%
Acetobacter peroxydans 12.50% 22.22%
Acetobacter roseus 6.25% 11.11%
Acetobacter senegalensis 18.75% 22.22%
Acetobacter syzygii 12.50% 11.11%
Acetobacter tropicalis 12.50% 11.11%
Gluconobacter
Gluconobacter entanii 6.25% 11.11%
Gluconobacter europaeus 6.25% 11.11%
Gluconobacter oxydans 31.25% 55.55%

Además de la selección preliminar en medios diferenciales también es necesaria hacer una

caracterización morfológica ya que los medios diferenciales antes mencionados no son altamente
selectivos y pudieran permitir el crecimiento de otros microorganismos productores de ácidos
 25

orgánicos. La Tabla 1.4 muestra las características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de

algunas especies de BAA. Se han propuesto distintas pruebas para realizar la identificación
bioquímica de este grupo entre las que destacan, el crecimiento en 30% D-glucosa, el crecimiento
en 10% etanol, el uso de maltosa, metanol y/o glicerol como fuente de carbono (Cleenwerck et al,.
2007), la producción de celulosa (Romero et al., 2012) y la reducción de nitratos entre otros (Lisdiyanti
et al., 2001).

La identificación bioquímica en la mayoría de los casos no es suficiente para diferenciar estas

bacterias a nivel de especie por lo que son necesarias técnicas moleculares que permitan una
mejor diferenciación entre las mismas (Holt et al., 1994).

Tabla 1.4. Características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de algunas especies de BAA. Brenner
et al. (2005); Cleenwerck et al. (2007); Lisdiyanti et al. (2001); Romero et al. (2012)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Aclaramiento en medio CYG + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Color del medio DMS-m V V V V V V V V V V V V V V V V V A
KOH + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Formación a partir de glucosa

de:
Ácido 5-Cetoglucónico - - - - - - - - - - - - - + - + ND ND
äcido 2-Cetoglucónico - - + + + V - - + + + + + + + - ND ND
Crecimiento en amonio con
etanól - - + - - - - + - - - + + D - - + ND
Crecimiento en fuentes de
carbono
Glycerol D + + + + V + - + + + V + + + + + ND
Maltosa - + - - - V - + V + + - V D - - + ND
Metanol + + - + - + + + + + + + + D + + + ND
crecimiento en 10% de etanól V - - ND ND + - - - - V - - - - + + ND
crecimiento en 30% D-
glucosa + - - - + V - - - - - - - + - - + ND
Catalasa + + + + + + + - + + + + + + + + + +
Oxidasa - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Reducción de nitratos ND - - ND ND + - - - - - - - - - ND ND ND
Oxidación de acetato + + + + + + + + + + + + + + + + + -
1, A. ghanensis sp. nov.; 2, A. syzygii; 3, A. lovaniensis; 4. A. cerevisiae; 5, A. malorum; 6, A. pasteurianus; 7, A. pomorum; 8, A. peroxydans; 9,
A. orleanensis; 10, A. indonesiensis; 11, A. tropicalis; 12, A. estunensis; 13, A. aceti; 14, A. cibinongensis; 15, A. orientalis; 16, A. oeni; 17, A.
nitrogenifigen; 18, G. oxydans. Símbolos: +, Positivo; - , Negativo; +/- , Variable; ND, No Determinado; V, Violeta; A, Amarilla; D, Débil.
 26

1.8 Técnicas de Identificación Molecular aplicadas a las BAA

Para la identificación molecular de las BAA se han empleado diversas técnicas moleculares
entre las que destacan la hibridación ADN-ADN y la secuenciación del ADNr 16S. La
hibridación ADN-ADN es una técnica usada para estudios filogenéticos que mide el grado de
similitud entre 2 secuencias de ADN. Se mezclan una secuencia conocida con la del organismo
que se quiere identificar para ser comparadas, se incuban a 65oC para permitir que el ADN se
disocie y se formen cadenas hibridas de ambas secuencias. La similitud entre las secuencias es
determinada por la energía que se requiere para disociar de nuevo el ADN ya que secuencias con
mayor homología requerirán de mayor cantidad de energía (Sokransky et al., 2004). Esta prueba
ha sido de gran utilidad para la identificación de nuevas especies, como es el caso de A.
ghanensis cuya similitud con A. syzygii y A. lovaniensis hace difícil su identificación por otros
métodos (Cleenwerck et al., 2007).

El ARN ribosómico (ARNr) 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios

de filogenia y taxonomía bacterianas, es un polirribonucleótido de aproximadamente 1.500 pb
codificado por el gen RRS, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S). Son varias
las razones por las que el ADNr 16S es utilizado en estudios de filogenia y taxonomía, destacan
las siguientes: es una molécula muy antigua presente en todas las bacterias actuales lo que la hace
una diana universal para su identificación. Su estructura y función han permanecido constantes
durante tiempos prolongados, por lo que las alteraciones de secuencia reflejan probablemente
cambios aleatorios. Codifica el ARNr 16S que tiene un papel estructural actuando como un
andamio definiendo la posición del mensajero al ribosoma, además interacciona con el ARNr 23S
ayudando a la unión de las subunidades ribosómicas. Los cambios ocurren de manera
suficientemente lenta como para aportar información acerca de todos los procariotas pero al
mismo tiempo la molécula presenta suficiente variabilidad como para diferenciar no solo entre
los organismos más alejados en la cadena evolutiva sino también los más cercanos. El tamaño
relativamente largo del ADNr 16S (1,500 pb) minimiza las fluctuaciones estadísticas, dado que
resulta relativamente fácil secuenciarlo existiendo de él amplias bases de datos y en constante
crecimiento (Rodicio y Mendoza, 2004).
 27

La secuenciación del ADNr 16S es uno de los métodos más comunes usados para la
identificación de BAA en la fermentación de cacao, sin embargo otros métodos han sido
propuestos, como el análisis de la variación de longitud de fragmentos de restricción (RFLP por
sus siglas en inglés) del ADNr 16S. Gonzales et al. (2006) propusieron ese método para la
identificación de rutina de BAA y determinaron que 3 especies pueden ser identificadas con el
uso de una enzima, 13 con la combinación de 2 enzimas, 2 con la combinación de 3 enzimas y 2
con la combinación de 4 enzimas. La enzima que mostró mayor capacidad de diferenciación fue
AluI la cual generó 11 patrones distintos y permitió la identificación directa de 3 especies,
Kozakia baliensis, Acidomonas methanolica y Asaia borgorensis.

Entre las especies más comunes encontradas en la fermentación de cacao Acetobacter tropicalis
necesitó de 4 enzimas de restricción (AluI, CfoI, Tru9I y TaqI) para su completa identificación,
Acetobacter aceti requirió de 3 enzimas (AluI, CfoI y HinfI), Acetobacter pasteurianus logro
identificarse con el uso de 2 enzimas (TaqI y AluI) y Gluconobacter oxidans se identificó con 2
enzimas (TaqI y CfoI). Este método tiene como limitación la dificultad de diferenciar entre
algunas especies específicas como A. pasteurianus y A. pomorum, pero resulta un método fácil y
rápido para la identificación de rutina de estas bacterias. La Tabla 1.5 muestra los distintos
patrones que se observan al digerir con enzimas de restricción el ADNr 16S de las BAA más
comunes encontradas en la fermentación de cacao y en la Tabla 1.6 se muestran la longitud de los
fragmentos en los diferentes patrones.
 28

Tabla 1.5 Clasificación de las BAA de acuerdo con el análisis electroforético de la PCR-RFLP
del ADNr 16S. González et al. (2006)

AluI CfoI Tru9I HinfI TaqI HaeIII RsaI

A. tropicalis A1 C1 Tr1 T1
A. indonesiensis A1 C1 Tr1 T3
A. cerevisiae A1 C1 Tr2
A. orleanensis A1 C1 Tr2
A. malorum A1 C1 Tr2
A. estunensis A1 C2 Hi1
A. aceti A1 C2 Hi2
A. orientalis A2 T1
A.cibinongensis A2 T3
A. syzgii A3 T4
A. lovaniensis A3 T5
A. pasteurianus A3 T2
A. pomorum A3 T2
K. baliensis A4
G. frateurii A5 C1
G. cerinus A5 C3
G. oxydans A5 C4
Ga. intermedius A6 H1
Ga. xylinus A6 H4
Ga. europeaus A6 H4
Ga. johannae A7 R2
Ga. azotocaptans A7 R1
Ga. sacchari A8 H3
Ga.
diazotrophicus A8 H2 R1
Ga. oboediens A9 Hi2 H2 R2
Ga. hansenii A9 Hi3
Ac. methanolica A10
As. bogorensis A11
 29

Tabla 1.6. Tamaños de los fragmentos de restricción del ADNr 16S usados para clasificar las
BAA. González et al. (2006)

AluI CfoI
A1 330-280-250-210-200-120-50 C1 500-350-210-150-150
A2 450-320-290-200-120-50 C2 500-420-210-150-150
A3 450-320-290-200-110-50 C3 400-350-180-150-140-110-100
A4 550-290-210-190-190 C4 430-340-180-175-130-110-90
A5 550-290-200-180-120-70-50
A6 790-490-120-50 HinfI
A7 750-290-210-180-90 Hi1 950-275-200
A8 750-290-210-120-70 Hi2 950-210-150-80
A9 740-470-120-70-50 Hi3 980-200-180-120
A10 550-275-225-210-190
A11 550-250-225-225-175 RsaI
R1 500-400-250-150-110
Tru9I R2 500-400-400-150
Tr1 530-350-350-150-110
Tr2 530-350-340-150-110 HaeIII
H1 550-290-190-80-70-100
TaqI H2 550-280-210-180-170
T1 650-375-210-180 H3 550-290-280-180-170
T2 500-375-370-210 H4 550-220-200-180-170-100
T3 850-375-210
T4 500-375-210-175-160
T5 500-375-200-190-150
 30

CAPITULO 2

MATERIALES Y METODOS

2.1. Muestreo de cacao durante el proceso de fermentación

Se analizaron muestras de Theobroma cacao de la variedad denominada “Carenero”

provenientes de la localidad de Tacarigua de Mamporal, Municipio Brión, Edo Miranda. Las
muestras fueron cosechadas y procesadas en noviembre del 2014. Se abrió el fruto de forma
manual, se extrajeron las semillas y se colocaron en una cesta de plástico de 60x45x60cm con
aberturas inferiores y laterales que permitían el drenado de los líquidos y se cubrió con un
plástico durante todo el proceso de fermentación. Este se llevó a cabo de forma natural por 6 días
realizando volteos para airear la masa cada 2 días.

2.1.2 Recolección de muestras

Se recolectó alrededor de 1 Kg de pulpa cada día desde el momento en el que inició el

proceso (tiempo 0) y cada 24 horas hasta el día 6. Se tomó la temperatura de la masa en el
momento de la recolección de cada muestra. La toma de muestra se realizó utilizando una
espátula estéril, tomando porciones en la superficie y a 25 cm de profundidad de la masa de
fermentación en 5 puntos del cajón. Las muestras se colocaron en bolsas de polietileno con cierre
hermético y se transportaron en refrigeración hasta el laboratorio para el análisis microbiológico.
Una vez en el laboratorio se midió el pH de las muestras.
 31

2.2 Aislamiento de bacterias ácido acéticas provenientes de la muestra de cacao fermentado.

2.2.1 Tratamiento de la muestra

Se pesaron asépticamente 300g de pulpa y se lavaron en 300ml de agua peptonada al 0.1%

buferizada, masajeando suavemente por un minuto, se tomaron 20 ml de la fase liquida y se le
agregaron 80 ml de agua peptonada al 0.1% buferizada para obtener una dilución 1/10 que se uso

para realizar diluciones seriadas sembrando alícuotas de 0.1 ml por extensión en agar
glucosa-extracto de levadura-carbonato de calcio, denominado medio CYG ( 5% glucosa, 1%
extracto de levadura, 3% carbonato de calcio y 2% agar a pH 5.6), suplementado con 100mg/L de
cicloheximide y Agar Desoxicolato-manitol-sorbitol modificado, denominado DMSm (1%
peptona, 3% extracto de levadura, 0,63% ácido láctico, 0,5% etanol, 0,3% ácido acético, 0,1%
glucosa, 0,1% sorbitol, 0,1% manitol, 0,1% potasio hidrógeno fosfato, 0,01% desoxicolato de
sodio, 0,002% sulfato de magnesio heptahidratado, 0,003% purpura de bromocresol y 1.8% agar
a pH 4.5). Las placas fueron incubadas por 7 días según protocolos de Ardhana y Fleet (2003) y
Romero et al. (2012).

Las colonias que presentaron aclaramiento en el agar CYG y que crecieron en el agar DMSm
fueron reaisladas en esos mismos medios hasta obtener cultivos puros, luego se les realizó una
prueba de KOH y se seleccionaron aquellas que fueron Gram negativas. Las cepas seleccionadas
fueron conservadas en cuñas de agar MEP (D-Manitol 2,5%, extracto de levadura 0,5%, peptona
0,3%, agar 1,5% a pH 6).

2.3 Caracterización bioquímica y morfológica de las cepas

La caracterización de los aislados se realizó mediante morfología de la colonia, reacción

catalasa y oxidasa, motilidad, producción de celulosa, oxidación de acetato, crecimiento en 30%
de D-glucosa, crecimiento en 10 % de etanol, crecimiento a distintos pH, producción de
pigmentos marrones solubles en agua y utilización de urea. Para la prueba de motilidad: se
inoculó cada cepa por punción en tubos de agar MEP con 0.5% de agar y se incubaron a 30°C por
4 días observándose la motilidad de las bacterias en el agar.
 32

Producción de celulosa: se realizó en caldo Hestrin-Schramm, HS (2% D-glucosa, 0,5%

peptona, 0,5% extracto de levadura, 0,27% Na2HPO4, 0,115% ácido cítrico pH 6). Primero se
preparó un caldo madre inoculando cada cepa en 10ml de caldo HS e incubando este a 30°C por
una semana. Se preparó la prueba agregando 1% de caldo madre a caldo HS fresco e incubando
nuevamente por una semana a 30°C. La formación de celulosa se observa como una capa blanca
en la superficie del tubo, sin embargo para comprobar que la biopelícula observada es de celulosa
se procedió a hacer un lavado, se centrifugó por 10 min a 4000g, luego se lavó 3 veces con agua
destilada y el pellet se sometió a ebullición con 0,5 M NaOH por 15 min. Se consideraron
positivas para producción de celulosa las cepas cuyo pellet persistió luego de ese tratamiento
(Aydin y Deveci, 2009).

Oxidación de acetato: se inoculó cada cepa en tubos con 4 ml de caldo YP (0,3% extracto de
levadura, 0.2% peptona, 0.002% azul de bromotimol. pH 6.8) suplementado con 0.2 % de acetato
de sodio y se incubaron a 30°C por 7 días, se consideraron positivos aquellos aislados que
mostraron un cambio de color en el caldo a color azul (Aydin y Deveci, 2009).

Crecimiento en 30% D-glucosa: se inoculó cada cepa en tubos con 4 ml de caldo (0,5% extracto
de levadura, 30% D-glucosa pH 6.4), se incubaron por 7 días a 30°C y se observó el crecimiento
por un aumento de la turbidez en el tubo.

Crecimiento en 10% de etanol: se inoculó cada cepa en tubos con medio base (0,5% extracto de
levadura, 0,5% D-glucosa pH 6) suplementado con 10 % de etanol y se incubaron a 30°C por 7
días. Se observó el crecimiento por un aumento de la turbidez del tubo.

Crecimiento en distintos pH: Se inoculó cada cepa en tubos con caldo MEP al cual se le ajusto el
pH a distintos niveles (3, 3,5, 4, 5, y 6,8) y se observó el crecimiento por un aumento en la
turbidez de los tubos.

2.4 Caracterización molecular de los aislados

Para la extracción de ADN se utilizó el protocolo de Wilson (1987) con las modificaciones de
Cleenwerck (2002). Se inoculó 5 ml de caldo Yeast Extract-Glucose YG (5% D-glucosa, 1%
extracto de levadura a pH 6.5) con cada cepa aislada y se incubó a 30°C por 3 días. Se centrifugó
 33

1.5 ml de cultivo en una micro centrifuga Ependorf MiniSpin® por 5 min a 8.000 rpm y se
descartó el sobrenadante. Las células se lavaron con 1 ml de buffer RS (0.15 M NaCl, 10mM
EDTA, pH 8) mezclando cuidadosamente por inversión y se centrifugó nuevamente 5 min a
8.000 rpm descartando luego el sobrenadante. El pellet fue resuspendido en 600 µl de buffer
Tris/EDTA ( 10mM tris/HCl, 200 mM EDTA, pH 8) que contenía RNasa A (200 µg/ml) SDS
(2% p/v) y proteinasa K (200 µg/ml) y luego se incubó a 37°C por 1 hora. Posteriormente se
agregó 120 µl de NaCl 5M (para una concentración final de 1 M) y 80 µl de solución
CTAB/NaCl (10% p/v Bromuro de hexadeciltrimetilamonio en 0,7 M NaCl) y se incubó a 65°C
por 10 min para que actuara la proteinasa K. Se Agregó un volumen igual (800 µl) de
cloroformo/isoamyl alcohol, se mezcló por inversión varias veces y se centrifugó 5 min en la
micro centrífuga a 5.433 g. Cuidadosamente se removió la fase superior y se transfirió a tubos
nuevos descartando la fase inferior, repitiendo el proceso una segunda vez. Se agregó 1 volumen
de isopropanol para precipitar los ácidos nucleicos mezclando por inversión 50 veces, luego se
centrifugaron las muestras a 12.000 rpm por 20 min para precipitar el ADN. Se lavó el
precipitado con etanol frio al 70% y se centrifugó 5 min a temperatura ambiente descartando el
sobrenadante y se dejó secar al aire. El ADN se resuspendió en buffer Tris/EDTA (Tris HCl
10mM, EDTA 1mM, pH 8) y se congeló a -20°C para ser utilizado posteriormente.

2.4.1 Amplificación del ADNr 16S por PCR

Los cebadores utilizados para la amplificación del ADNr 16S por PCR fueron 16Sd:
5´GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3´ y 16Sr: 5´-GGAGGTGATCCAGCCGCAGGT-3´
diseñados por Ruiz et al. (2000). Se prepararon reacciones de 25 µl con 2.5 µl de ADN y el resto
de la mezcla de amplificación (15 pmol de cada cebador, 200µM de cada dNTP, 5µl de buffer de
amplificación 10X, 3mM MgCl2 y 2.5 U de taq polimerasa). Se incubaron las muestras por 5 min
a 94 °C y luego se realizaron 35 ciclos de 94 °C por 1 min, 62°C por 2 min y 72°C por 2 min, y
finalmente una extensión de 72°C por 10 min. Los productos de la amplificación se corrieron en
un gel de agarosa 1% (p/v) por 20 minutos a 100v en una cámara de electroforesis MiniRun Ge-
100 con 0,5x Buffer TAE (40mM Tris-acetato, EDTA 1 mM, pH 8,2 a 25 oC) conteniendo
bromuro de etidio y se visualizaron en un sistema de digitalización de imagen FOTODYNE.
Posteriormente se purificó el producto de amplificación usando un kit para ADN Wizard–
 34

Promega siguiendo las instrucciones del fabricante y se procedió a su visualización como se

describió anteriormente.

2.4.2 Digestión con enzimas de restricción del amplificado del ADNr 16 S

La digestión del ADN se realizó con 3 enzimas de restricción, AluI, TaqI y HinfI, usando los
buffers correspondientes a cada enzima y las condiciones adecuadas para cada una, digiriendo 5
µl de cada amplificado en reacciones de 20 µl. Luego se realizó una corrida electroforética en un
gel de agarosa 2.5% (p/v) por 20 min a 100v en una cámara de electroforesis MiniRun Ge-100
con buffer TAE 0,5X (40mM Tris-acetato, 1mM EDTA a. pH 8,3) conteniendo bromuro de
etidio para la visualización de las digestiones y el análisis de los fragmentos. Los geles fueron
fotografiados usando un sistema de digitalización de imagen FOTODYNE y el peso molecular de
los fragmentos se calculó usando el programa DNAfrag.
 35

CAPITULO 3

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Recolección de muestras de cacao durante el proceso de fermentación

Se recolectaron las muestras durante los 6 días de fermentación y se midieron parámetros

fisicoquímicos temperatura y el pH de la masa. Estos datos se encuentran en la figura 3.1.

pH (oC)

pH
Temperatura

Días

Figura 3.1 pH y temperatura de la masa durante los 6 días de la fermentación

Se puede observar que el pH de la masa va aumentando gradualmente, lo cual coincide con datos
reportados y se presume que se debe al consumo del ácido cítrico por parte de las levaduras. Este
aumento en el pH es una de las condiciones que permite el crecimiento de la BAL en la masa.
Según lo reportado por Schwan y Wheals (2004) las BAA se encuentran presentes en la masa
desde el día 1 sin embargo, no es hasta que la masa se airea lo suficiente y llega a temperaturas de
 36

37 oC o más que la población de BAL disminuye y las BAA pasen a ser el grupo dominante en el
proceso. Al predominar las BAA el pH de la masa sigue aumentando ya que aunado a la
producción de ácido acético, algunas especies pueden lograr la oxidación de este en CO2 y H2O.
Las BAA pertenecientes al género Acetobacter también son capaces de metabolizar el ácido
láctico aumentando aún más el pH de la masa.

Se puede observar también un incremento gradual de la temperatura hasta llegar a 40oC en el

día 4, se ha reportado que esto se debe a que las reacciones metabólicas son altamente
exotérmicas en las levaduras y bacterias durante la fermentación. En los lotes de fermentación se
pueden alcanzar temperaturas de hasta 50oC según lo reportado por Schwan y Wheals (2004), el
descenso de la temperatura que se observa en el día 5 pudo originarse por una lluvia prolongada
que ocurrió durante la noche anterior.

3.2 Aislamiento de BAA provenientes de la muestra de cacao fermentado

El aislamiento de las BAA se realizó a partir de las muestras de cacao recolectadas durante
los 6 días de fermentación utilizando los agares CYG y DMS-m. Se obtuvieron 11 colonias
provenientes de los días 1, 2, 3, 4 y 6 que mostraban características típicas de las BAA en los 2
agares, presentando halos de aclaramiento en el agar CYG y cambio de color de amarillo a
purpura en el agar DMS-m. A cada aislado se le realizó una prueba de KOH y una tinción Gram
resultando ser bacilos Gram negativos. El crecimiento de las colonias fue lento en ambos medios,
por lo que se tuvo que esperar hasta 7 días para poder observar la morfología de la colonia.

En la Tabla 3.2 se muestran los resultados del crecimiento de los aislados en los dos medios
utilizados, mediante la morfología de las colonias en los diferentes agares se pudo distinguir 3
fenotipos distintos. El primer fenotipo (fenotipo A) se obtuvo durante los 6 días, siendo colonias
blancas con borde recular con un diámetro de alrededor de 3 mm en el medio CYG igual al
fenotipo mostrado en el medio DMSm.

El segundo fenotipo (fenotipo B) se observó únicamente en el día 1, las colonias crecidas en el

medio CYG eran marrones de borde regular de 2 mm de diámetro y en DMS-m presentaban color
blanco con el centro violeta. El tercer fenotipo (fenotipo C) se aisló en los días 2, 3 y 6. Las
 37

colonias en el medio CYG fueron de color beige con borde regular con un tamaño pequeño de 2
mm y en el medio DMS-m las colonias fueron similares pero de color violeta. Aunque no se tiene
ningún aislado del día 5 de la fermentación se presume que las BAA siguen presentes ya que
luego pudieron aislarse en la muestra del día 6. En el caso del fenotipo C también se cree que
estuvo presente durante el día 4 aunque no pudo ser aislado reapareciendo nuevamente en el día
6.

De estos 11 aislados solo 7 pudieron recuperase posteriormente para realizar la caracterización

fisiológica y bioquímica, esto debe alertarnos sobre la dificultad de mantener las condiciones
naturales de crecimiento al hacer el muestreo general ya que los medios comerciales empleados
parecen no mantener la viabilidad de todos los aislados. Los aislados que no se pudieron
recuperar incluyen los 2 pertenecientes al fenotipo C, por lo que este fenotipo no pudo ser
considerado para el resto de la caracterización.

Caracterización fisiológica y bioquímica de las cepas

En la Tabla 3.3 se muestra las pruebas fisiológicas y bioquímicas que se le realizaron a los
aislados, resultando todos motiles, catalasa positiva, oxidasa negativo, tuvieron capacidad de
oxidar acetato y fueron capaces de producir celulosa. La prueba de oxidación de acetato puede
ayudar a diferenciar entre los géneros Acetobacter y Gluconobacter ya que el acetato se integra
en el ciclo de Krebs. Gluconobacter no tiene un ciclo de Krebs funcional por lo que es incapaz de
oxidar este compuesto. Todos los aislados dieron un resultado positivo para la oxidación de
acetato lo cual en conjunto con el color violeta observado en el medio DMS-m posterior al
crecimiento de las colonias descarta la presencia del género Gluconobacter entre los aislados.
 38

Tabla 3.1. Morfología de la colonia aisladas sembradas en los medios de cultivo DMS-m y CYG

Cepa CYG DMS-m Cepa CYG DMS-m

y y
Fenotipo Fenotipo
D1.1 D3.2
Fenotipo Fenotipo
A A

D1.2 D4.1
Fenotipo Fenotipo A
A

D1.3 D6.1
Fenotipo Fenotipo
B A

D1.4 D6.2
Fenotipo Fenotipo
B C

D2.1 D6.3
Fenotipo Fenotipo
C A

D3.1
Fenotipo
C
 39

Tabla 3.2. Pruebas fisiológicas y bioquímicas de las BAA aisladas.

Pruebas bioquímicas D6.1 D6.2 D1.1 D6.3 D1.2 D3.1 D3.2

Motilidad + + + + + + +
Producción de pigmentos marrones - - - - - + -
Catalasa + + + + + + +
Color de la colonia en DMS V V V V V V V
Oxidación de acetato + + + + + + +
Crecimiento en 30% D-glucosa - - - - + - -
Producción de celulosa + + + + + + +
Crecimiento en pH 3 - - - - + - -
Crecimiento en 10% etanol - - - - - + -
+, Positivo; - , Negativo; V, Violeta.

La figura 3.2 muestra un ejemplo de la motilidad observada en los aislados. La mayoría de las
bacterias pertenecientes al género Acetobacter son motiles con la excepción de Acetobacter
pomorum la cual no ha sido reportada en fermentación de cacao en ningún estudio hasta el
momento.

La producción de catalasa es positiva para la gran mayoría de las especies de Acetobacter

excepto para A. peroxydans (Cleenwerck et al. 2007).Todos los aislados fueron catalasa positivo
por lo que se descartó la presencia de A. peroxydans entre los aislados.

Figura 3.2 Prueba de la motilidad de la cepa D3.1

 40

El crecimiento en 30% de D-glucosa es una característica de pocas especies de Acetobacter

específicamente solo A. ghanensis, A. malorum, A. cibinongensis y A. nitrogenifigens mientras
que A. pasteurianus tiene un resultado variable entre distintas cepas (Cleenwerck et al. 2007).
Solo el aislado D1.2 fue capaz de crecer en ese medio lo que sugiere que pertenece a alguna de
las especies previamente mencionadas.

La prueba de producción de celulosa mostró que todos los aislados eran capaces de producir
celulosa usando D-glucosa como fuente de carbono. La producción de celulosa es una
característica variable en el género Acetobacter, que cambia en cepas de la misma especie y
además depende de la fuente de carbono suministrada (Valera et al. 2014), el hecho de que todos
los aislados tuvieran un resultado positivo no permite concluir la especie a la que pertenecen.

Se evaluó el crecimiento de los aislados a diferentes pH 3,5., 4., 4,5, 5, 5,5, 6 y 6,5) creciendo
todos en esos rangos, solo el aislado D1.2 logró crecer a pH 3. El pH inicial de la masa registró
un valor de 3.8 para luego aumentar gradualmente, sugiriendo que todos los aislados son capaces
de soportar las condiciones de pH iniciales de la masa.

El crecimiento en 10% de etanol es una característica diferencial entre algunas de las especies
del genero Acetobacter, el aislado D3.1 fue el único que mostro esta capacidad. A. ghanensis, A.
oeni, A. nitrogenifigens y A. pasteurianus son las especies que toleran tales condiciones
(Cleenwerck et al. 2007).

3.3 Caracterización molecular de las cepas

Se realizó la extracción de ADN y se procedió a verificar su pureza y concentración midiendo

la absorbancia a 260 nm y 280 nm. La relación A260/A280 dio valores entre 1.8 y 2 para todas las
muestras lo cual indica que eran de una pureza apta para realizar las amplificaciones de PCR.

Se realizó la amplificación de PCR del ADNr 16S de los 11 aislados, sin embargo solo se
realizó la purificación y se trabajó con aquellos aislados que mostraron diferencias entre sí en la
 41

caracterización bioquímica y fisiológica. Para comprobar el tamaño de los amplificados se realizó

una corrida electroforética en un gel de agarosa 1% p/v (figura 3.3), donde se muestra la
amplificación de aproximadamente 1.450 pb, lo cual concuerda con lo esperado.

Figura 3.3 Corrida electroforética de la amplificación del ADNr 16S por PCR de los aislados. Carril 1,
marcador de peso molecular Lambda x HindIII (23.130-9.416-6.557-4.361-2.322-2.027-564-125 pb);
Carril 2, aislado D6.1; Carril 3, aislado D1.2; Carril 4, aislado D3.1.

Para la digestión de los amplificados se utilizaron las enzimas de restricción AluI y TaqI. La
Figura 3.4 muestra la digestión de los amplificados con AluI que corresponde a una prueba
preliminar realizada para comprobar su actividad, sin embargo luego de ese experimento ocurrió
la inactivación de la enzima y no se pudo realizar la digestión para hacer una corrida
conjuntamente con el marcador de pesos moleculares. A pesar de ese inconveniente, en la
imagen se puede observar que los aislados D6.1 y D3.1 parecieran tener el mismo patrón de corte
y en el caso de aislado D1.2 no se observó digestión debido a un error experimental.
 42

Figura 3.4. Digestión del ADNr 16S con la enzima AluI Carril 1, aislado D6.1 sin digerir; Carril 2, aislado
D6.1 x AluI; Carril 3 y 4 aislado D1.2 sin digerir; Carril 5, aislado D3.1 sin digerir;
Carril 6, aislado D3.1 x AluI.

La figura 3.5 muestra la digestión de los amplificados con la enzima TaqI, donde puede
observarse que el aislado D1.2 tiene el mismo patrón del aislado D3.1. con fragmentos de peso
molecular de aproximadamente 931- 380 pb y el aislado D6.1 mostró un patrón de bandas de
aproximadamente 677 y 380 pb. Al comparar estos resultados con los reportados por Gonzales et
al. (2006), para los fragmentos de TaqI se podría inferir que los aislados D1.2 y D3.1
corresponden al patrón T3 (850-375-210 pb) y el aislado D6.2 corresponde al patrón T1 (650-
375-210-180 pb). En esta corrida no se observaron los fragmentos inferiores a 250,
probablemente debido a que se salieron del gel al tiempo en que se detuvo la corrida. De acuerdo
a los patrones de digestión reportados por González et al. (2006) el patrón T1 correspondería a
las especies del genero Acetobacter, A. tropicalis y A. orientalis mientras que el patrón T3
 43

correspondería a A. indonesiensis y A. cibinongensis pero habría que incluir a A. cerevisiae, A.

orleanensis, A. malorum, A. estunensis y A. aceti que no fueron reportados los patrones para TaqI
en ese trabajo ya que se clasificaron en base a digestiones con otras enzimas. Las especies de
Acetobacter con patrones TaqI denominados T2, T4 y T5 quedan excluidas porque las bandas de
estos patrones no se observaron.

Figura 3.5. Digestión del ADNr 16S con la enzima Taq I. Carril 1 y 8, Marcador de peso molecular 50 pb-
Biolabs (1.350-916-766-700-650-600-550-500-450-400-350-300-250-200-150-100-50); Carril 2,aislado
D1.2; Carril 3, aislado D1.2 x TaqI; Carril 4, aislado D6.1; Carril 5, aislado D6.1 x TaqI; Carril 6, aislado
D3.1; Carril 7, aislado D3.1 x TaqI.

La Tabla 3.3 muestra las características fisiológicas y bioquímicas que permiten diferenciar
entre las posibles especies que corresponderían a los aislados. Al hacer la correlación de la
caracterización molecular con las características bioquímicas y fisiológicas de las cepas se logran
descartar algunas especies.

En el caso del aislado D1.2 que tiene el patrón T3 y puede crecer en 30% D-glucosa este
podría pertenecer a las especies A. malorum o A. cibinongensis descartando A. cerevisiae, A.
 44

orleanensis, A. indonesiensis, A. estunensis y A. aceti ya que estas no son capaces de crecer en

30% D-glucosa. Para la discriminación entre estas 2 especies se requeriría como prueba adicional
determinar su crecimiento con metanol como fuente de carbono y conocer la digestión con la
enzima AluI. El aislado D3.1 también presenta el patrón T3 y fue el único de los aislados capaz
de crecer en 10% de etanol. Esta característica descarta la posibilidad de las especies A.
orleanensis, A. indonesiensis, A. estunensis, A. aceti, y A. cibinongensis y el crecimiento en 30%
D-glucosa a A. malorum. El crecimiento en 10% etanol no se encontró reportado en la literatura
consultada para A. cerevisiae por lo que esta especie pudiera ser considerada dentro de las
posibilidades para este aislado.

El aislado D6.1 presentó características tanto bioquímicas como de patrón de corte con la
enzima TaqI que son compartidas por las especies A. cerevisiae, A. tropicalis, A. estunensis, A.
aceti y A. orleanensis. Para la discriminación entre las 4 primeras especies se requeriría de las
pruebas adicionales crecimiento en maltosa como fuente de carbono, reducción de nitratos y
digestión con las enzimas Tru9I, CfoI y HinfI. Para la discriminación con la especie A.
orleanensis sería necesario realizar la digestión con la enzima AluI de la región intergénica ADNr
16S-23S.

Tabla 3.3. Características fisiológicas y bioquímicas diferenciales entre distintas especies del
género Acetobacter. Brenner et al. (2005); Cleenwerck et al. (2007); Lisdiyanti et al. 2001;
Romero et al. 2012)

Características 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Crecimiento en 10% de etanol ND ND - - V - - - -
Crecimiento en 30% D-glucosa - + - - - - - + -
Crecimiento en fuentes de carbono
Glicerol + + + + + V + + +
Maltosa - - V + + - V - D
Metanol - + - - - - - - D
Reducción de nitratos ND ND V V + + - - -

1, A. cerevisiae; 2. A. malorum; 3. A. orleanensis; 4 A. indonesiensis; 5 A. tropicalis; 6 A estunensis 7. A. aceti; 8 A.

cibinongensis; 9 A. orientalis; ND, no determinado; +, positivo; -, negativo; V, variable; D, débil.
 45

Con el fin de poder determinar a qué especies pertenecen los aislados D6.1 y D1.2 se realizaron
las pruebas de reducción de nitratos y crecimiento en metanol y maltosa como fuente de carbono,
los resultados se muestran en la Tabla 3.4.

Ninguno de los 3 aislados seleccionados muestra la capacidad de usar metanol o maltosa como
fuentes de carbono y tampoco de reducir nitratos. Estos resultados eran los esperados para el
aislado D3.1 y confirman que el aislado es A. cerevisiae. En el caso del aislado D6.1 tampoco fue
capaz de usar estas fuentes de carbono ni de reducir nitratos, lo cual descarta que se trate de A.
tropicalis ya que esta especie es capaz de utilizar maltosa como fuente de carbono. En el caso del
aislado D1.2 estos resultados descartan a A. malorum ya que esta es capaz de utilizar la maltosa
como fuente de carbono, dejando como única posibilidad a A. cibinongensis.

Tabla 3.4. Pruebas adicionales requeridas para la identificación de los aislados

Pruebas bioquímicas D6.1 D1.2 D3.1

Crecimiento en fuentes de carbono
Maltosa - - -
Metanol - - -
Reducción de nitratos - - -

- , Negativo

González et al. (2006) no reportaron el patrón de digestión con la enzima TaqI del ADNr 16S
para las especies A. cerevisiae, A. estunensis, A. aceti y A. orleanensis dado que ellos lograron la
discriminación entre esas especies usando otras enzimas, en este estudio se recurrió a la base de
datos del GenBank usando el programa NEBcutter V2.0 de New England Biolabs para
determinar la longitud de los fragmentos al digerir la secuencia usando la enzima TaqI sobre el
ADNr 16S. Los patrones de corte obtenidos y el peso molecular de los fragmentos fueron
determinados con la data obtenida del GenBank que se muestran en la tabla 3.5.
 46

Tabla 3.5 Clasificación de algunas BAA de acuerdo con el análisis electroforético de la PCR-
RFLP del ADNr 16S usando la enzima TaqI

Especie Fragmentos Patrón de corte con la enzima TaqI

Acetobacter cerevisiae 848- 373 - 208 T3
Acetobacter estunensis 657 – 382 – 217 - 187 T1
Acetobacter aceti 851 – 376 - 211 T3
Acetobacter orleanensis 851 – 373 - 208 T3

A. cerevisiae tiene el patrón T3 el cual coincide con el patrón obtenido para el aislado D3.1. El
aislado D6.2 que tiene un patrón T1 indicando que podría ser A. estunensis descartando A.
cerevisiae, A. aceti y A. orleanensis ya que estas tienen el patrón T3.

De los 3 aislados encontrados en este trabajo, las especies Acetobacter cerevisiae y Acetobacter
cibinongensis sólo han sido reportadas en fermentaciones estudiadas en Sur América,
específicamente en Ecuador y Brasil, con una frecuencia 22,22% y en Ecuador con una
frecuencia de 11,11% respectivamente (Papalexandratou et al., 2011). En cuanto a la especie
Acetobacter estunensis no se encontró información de su aislamiento en la fermentación de cacao
en la revisión bibliográfica realizada en este trabajo, lo que pudiera sugerir que se trata de una
especie característica de esta región.

Estos resultados sugieren una posible relación entre la región geográfica y las especies
asociadas al proceso de fermentación ya que los 3 aislados encontrados en este estudio parecieran
estar presentes únicamente en las fermentaciones reportadas en Suramérica.
 47

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIÓNES

- Se obtuvieron 11 aislados a lo largo de todo el proceso de fermentación en medios

selectivos que sugieren que los aislados pertenecen a la familia Acetobacteraceae, género
Acetobacter. Agrupados en 3 fenotipos distintos por la morfología de la colonia.

- La correlación entre la caracterización molecular y bioquímica realizadas sugiere que el

aislado D1.2 podría pertenecer a la especie Acetobacter cibinongensis, D3.1 podría ser
Acetobacter cerevisiae y D6.1 podría pertenecer a la especie Acetobacter estunensis.
Se recomienda realizar la secuenciación del ADNr 16S para corroborar los resultados

- Se recomienda la secuenciación del ADNr 16S para corroborar estos resultados.

 48

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APENDICE A