Cultivo de Caña Guia

Producción sustentable en caña de azúcar 1
BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO

VEGETAL ASOCIADAS A CAÑA DE AZÚCAR
Proyecto FPTA-275 Producción sustentable en caña de

azúcar: bacterias promotoras del crecimiento vegetal
y su aplicación agronómica a cultivos comerciales
Responsable del Proyecto: Federico Battistoni*
Institución Ejecutora: Instituto de Investigaciones Biológicas «Clemente Estable» (IIBCE)-MEC.
Equipo técnico de trabajo: Dra. Margarita Sicardi, Lic. Claudia Barlocco Facultad de Ciencias
MSc. Cecilia Taulé, Lic. Cintia Mareque BIOGEM-IIBCE-MEC
Ing. Agr. Fernando Hackembruch ALUR S.A
*
Dr. Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas (BIOGEM), IIBCE-MEC.
Universidad de la República.
2 Producción sustentable en caña de azúcar
Título: Bacterias promotoras del crecimiento vegetal asociadas a caña de azúcar
Responsable del Proyecto: Federico Battistoni
Institución Ejecutora: Instituto de Investigaciones Biológicas «Clemente Estable»

(IIBCE)-MEC.
Equipo técnico de trabajo: Margarita Sicardi, Claudia Barlocco

Cecilia Taulé, Cintia Mareque, Fernando Hackembruch
Serie: FPTA N° 54
© 2014, INIA
Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia de Tecnología del INIA
Andes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguay

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Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podrá
reproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.
Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria
Integración de la Junta Directiva
Ing. Agr., MSc., PhD. Álvaro Roel - Presidente
D.M.T. V., PhD. José Luis Repetto - Vicepresidente
D.M.V. Álvaro Bentancur
D.M.V., MSc. Pablo Zerbino
Ing. Agr. Joaquín Mangado
Ing. Agr. Pablo Gorriti

FONDO DE PROMOCIÓN DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA
El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) fue instituido por el

artículo 18º de la ley 16.065 (ley de creación del INIA), con el destino de financiar
proyectos especiales de investigación tecnológica relativos al sector agropecuario del
Uruguay, no previstos en los planes del Instituto.
El FPTA se integra con la afectación preceptiva del 10% de los recursos del INIA
provenientes del financiamiento básico (adicional del 4o/oo del Impuesto a la Enaje-
nación de Bienes Agropecuarios y contrapartida del Estado), con aportes voluntarios
que efectúen los productores u otras instituciones, y con los fondos provenientes de
financiamiento externo con tal fin.
EL FPTA es un instrumento para financiar la ejecución de proyectos de investiga-
ción en forma conjunta entre INIA y otras organizaciones nacionales o internacionales,
y una herramienta para coordinar las políticas tecnológicas nacionales para el agro.
Los proyectos a ser financiados por el FPTA pueden surgir de propuestas
presentadas por:
a) los productores agropecuarios, beneficiarios finales de la investigación, o por sus
instituciones.
b) por instituciones nacionales o internacionales ejecutoras de la investigación, de
acuerdo a temas definidos por sí o en acuerdo con INIA.
c) por consultoras privadas, organizaciones no gubernamentales o cualquier otro
organismo con capacidad para ejecutar la investigación propuesta.
En todos los casos, la Junta Directiva del INIA decide la aplicación de recursos del
FPTA para financiar proyectos, de acuerdo a su potencial contribución al desarrollo del
sector agropecuario nacional y del acervo científico y tecnológico relativo a la
investigación agropecuaria.
El INIA a través de su Junta Directiva y de sus técnicos especializados en las
diferentes áreas de investigación, asesora y facilita la presentación de proyectos a los
potenciales interesados. Las políticas y procedimientos para la presentación de
proyectos son fijados periódicamente y hechos públicos a través de una amplia gama
de medios de comunicación.
El FPTA es un instrumento para profundizar las vinculaciones tecnológicas con
instituciones públicas y privadas, a los efectos de llevar a cabo proyectos conjuntos.
De esta manera, se busca potenciar el uso de capacidades técnicas y de infraestruc-
tura instalada, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los recursos nacionales
para resolver problemas tecnológicos del sector agropecuario.
El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria contribuye de esta manera a
la consolidación de un sistema integrado de investigación agropecuaria para el
Uruguay.
A través del Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA), INIA ha
financiado numerosos proyectos de investigación agropecuaria a distintas institucio-
nes nacionales e internacionales. Muchos de estos proyectos han producido resulta-
dos que se integran a las recomendaciones tecnológicas que realiza la institución por
sus medios habituales.
En esta serie de publicaciones, se han seleccionado los proyectos cuyos resulta-
dos se considera contribuyen al desarrollo del sector agropecuario nacional. Su
relevancia, el potencial impacto de sus conclusiones y recomendaciones, y su aporte
al conocimiento científico y tecnológico nacional e internacional, hacen necesaria la
amplia difusión de estos resultados, objetivo al cual se pretende contribuir con esta
publicación.
CONTENIDO
Página
1. RESUMEN EJECUTIVO ........................................................................................... 9

2. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 10
El cultivo de caña de azúcar en el Uruguay ....................................................... 10
Bacterias promotoras del crecimiento vegetal ................................................... 11
Endófitos bacterianos ........................................................................................... 11
Endófitos promotores del crecimiento vegetal asociados a gramíneas .......... 12
Fijación biológica de nitrógeno en caña de azúcar ........................................... 12
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 13
Objetivo general ..................................................................................................... 13
Objetivo específico ................................................................................................. 13
Productos ............................................................................................................... 13
4. METODOLOGÍA ...................................................................................................... 14
Selección de las variedades de caña de azúcar utilizadas por los productores
de ALUR, con mayor capacidad de FBN (metodología de 15N) ............................ 14
Muestreos .......................................................................................................... 14
15
Abundancia natural del N ............................................................................... 14
15
Dilución isotópica del N .................................................................................. 14
Aislamiento de endófitos-diazótrofos asociados a las variedades de caña de
azúcar en condiciones naturales ......................................................................... 15
Determinación de la capacidad de fijar nitrógeno por los aislamientos bacterianos
utilizando ensayos bioquímicos y técnicas de biología molecular ...................... 16
Identificación de los aislamientos bacterianos por técnicas de biología
molecular ................................................................................................................ 16
Estudio de la capacidad de la colección de endófitos-diazótrofos de presentar
características promotoras del crecimiento vegetal: producción de ácido indo
acético (AIA), solubilización de fosfatos y producción de sideróforos ................. 17
Caracterización fisiológica de los aislamientos: capacidad de crecer en diferentes
fuentes de C, N y determinación de la resistencia intrínseca a antibióticos ....... 17
Crecimiento en diferentes fuentes de carbono y nitrógeno .......................... 17
Resistencia intrínseca a antibióticos .............................................................. 18
Evaluación del crecimiento vegetal en invernáculo en respuesta a la inoculación
con bacterias endófitas-diazótrofas ....................................................................... 18
En plantas micropropagadas ............................................................................ 18
En plantas crecidas de esquejes .................................................................... 19
Página
Ensayos de campo de promoción del crecimiento vegetal de la mejor

combinación bacteria-cultivar determinada en los ensayos de invernáculo ... 19
Estudio de la interacción entre Enterobacter sp.UYSO10 y plantas
micropropagadas de la variedad LCP 85-384 mediante microscopía óptica,
electrónica de transmisión y de barrido .............................................................. 20
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 21
Selección de las variedades de caña de azúcar utilizadas por los productores
de ALUR, con mayor capacidad de FBN (metodología de 15N) ........................ 21
15
Abundancia natural del N ............................................................................... 21
15
Dilución isotópica del N ................................................................................. 21
Aislamiento de endófitos-diazótrofos asociados a las variedades de caña de
azúcar en condiciones naturales ......................................................................... 22
Determinación de la capacidad de fijar nitrógeno por los aislamientos
bacterianos ............................................................................................................. 23
Identificación de los aislamientos bacterianos y análisis filogenético ............ 24
Estudio de la capacidad de la colección de endófitos-diazótrofos de
producir metabolitos con actividad promotora del crecimiento vegetal ........... 25
Caracterización fisiológica de los aislamientos: capacidad de crecer en
diferentes fuentes de C, N y determinación de la resistencia intrínseca a
antibióticos ............................................................................................................. 25
Crecimiento en diferentes fuentes de carbono y nitrógeno .......................... 30
Resistencia intrínseca a antibióticos .............................................................. 30
Evaluación del crecimiento vegetal en invernáculo en respuesta a la
inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas ................................................ 32
En plantas de cañas de azúcar micropropagadas de la variedad

LCP 85-384 ........................................................................................................ 32
En plantas de cañas de azúcar crecidas a partir de esquejes de la
variedad LCP 85-384 ......................................................................................... 34
Ensayos de campo de promoción del crecimiento vegetal de la mejor
combinación bacteria-variedad determinada en los ensayos de invernáculo ....... 35
Estudio de la interacción entre Enterobacter sp. UYSO10 y plantas
micropropagadas de la variedad LCP 85-384 a través de microscopía
óptica, electrónica de transmisión y de barrido ................................................. 36
Adhesión bacteriana a raíces y tallos ............................................................. 37
Infección y colonización de raíces y base del tallo ...................................... 38
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................................... 41
7. BIBLIOFRAFÍA ........................................................................................................ 41
Cecilia Taulé, Cintia Mareque 1 ,
Claudia Barlocco 2 , Fernando
Bacterias promotoras
Hackembruch3, Margarita Sicardi
y Federico Battistoni1
del crecimiento vegetal
asociadas a caña de
1
azúcar
BIOGEM-IIBCE-MEC; 2Facultad de
Ciencias; 3ALUR S.A
Proyecto FPTA 275

Período de Ejecución: Mar. 2009-Jun. 2012
1. RESUMEN EJECUTIVO Shinella, Achromobacter y Agrobacte-

rium. Este es el primer reporte donde se
El presente proyecto tuvo como obje- presenta aislamientos pertenecientes a
tivo general contribuir a mejorar la sus- los géneros Shinella, Rahnella y Achro-
tentabilidad económica y ambiental del mobacter, como probables endófito aso-
cultivo de caña de azúcar (Saccharum ciados a caña de azúcar. Características
officinarum) en la zona norte del país. En promotoras del crecimiento vegetal, fue-
particular, se plantea la posibilidad de ron estudiadas en los 35 aislamientos
disminuir el uso de fertilizantes químicos identificados. Los resultados mostraron
nitrogenados, mediante la selección de que 12 aislamientos tienen la capacidad
variedades comerciales con potencial de de fijar biológicamente el N (FBN), 21
fijar biológicamente el nitrógeno (FBN) y fueron capaces de solubilizar fosfatos,
el empleo de bacterias promotoras del así como 65 y 10 fueron productores de
crecimiento vegetal (PCV). Mediante téc- ácido indol acético (AIA) y sideróforos
nicas isotópicas de 15N se determinó que respectivamente. Una colección bacte-
las tres variedades estudiadas y de inte- riana que posea diferentes característi-
rés para ALUR S.A. (Tuc 77-42, LCP 85- cas PCV es de gran importancia biotec-
384 y CP 92-618) son capaces de adqui- nológica y estratégica con miras de de-
rir parte de su N de la fijación biológica sarrollar un bioinoculante para este culti-
del N2. Por otro lado, a partir de 7 varieda- vo. Teniendo en cuenta esa proyección a
des de cañas de azúcar cultivadas en futuro, al mencionado conjunto de aisla-
Uruguay se obtuvo una colección de casi mientos se les estudió su capacidad de
600 aislamientos bacterianos nativos crecer en diferentes fuentes de nitrógeno
definidos en primera instancia como «pro- y de carbono, incluyendo sacarosa y
bables endófitos» siendo la primera co- azúcar de caña no refinada, evaluándose
lección de estas características en Uru- también la resistencia intrínseca a anti-
guay. Los mismos fueron caracterizados bióticos. Posteriormente, se evaluó en
bioquímica, fisiológica y molecularmen- condiciones de invernáculo, el efecto de
te. Un conjunto de 35 aislamientos fueron la inoculación de aislamientos seleccio-
seleccionados teniendo en cuenta su mor- nados de acuerdo a sus características
fología, así como sus características mo- PCV, sobre el crecimiento de esquejes y
leculares y fisiológicas. Mediante la se- plantas de caña de azúcar micropropa-
cuenciación del gen 16S rDNA se pudo gadas de la variedad LCP 85-384. Los
identificar a los mismos como relaciona- resultados mostraron que varios de los
das a los géneros: Stenotrophomonas, aislamientos estudiados fueron PCV de
Pseudomonas, Pantoea, Enterobacter, plantas de caña de azúcar en las condi-
Rahnella, Acinetobacter, Xanthomonas, ciones ensayadas, destacándose la cepa
Enterobacter sp. UYSO10 en ambos tentabilidad del sistema productivo. Es
experimentos. Estos datos son muy va- así que ALUR S.A., a través del «Proyec-
liosos teniendo en cuenta la metodología to Sucro-Alcoholero», promueve su plan-
empleada: plantas micropropagadas y tación como un cultivo estratégico y de
esquejes, inoculados con bacterias nati- gran importancia económica y social para
vas. Asimismo se sembró un ensayo de nuestro país. Dicha iniciativa guberna-
campo en el cual se evaluó la respuesta mental, se propuso como meta el incre-
a la inoculación con los aislamientos mentar el cultivo de la caña en el norte del
Enterobacter sp. UYSO10 y Shinella sp. país de 3.400 hectáreas (2005), a 10.000
UYSO24 en la variedad LCP 85-384. Los hectáreas (2009). Asimismo, se plantea
resultados no mostraron diferencias sig- como objetivo que la producción de azú-
nificativas en las variables biométricas car pase de 18.000 a 50.000 toneladas
evaluadas a los 3,8 y 12 meses de plan- anuales, produciendo conjuntamente
tado. Por último, mediante microscopía 15.000 m 3 de alcohol carburante. El pro-
óptica y electrónica se profundizó en el yecto Sucro-Alcoholero tiene como fina-
estudio de la interacción entre Entero- lidad, el cumplir con la Ley Nº 18.195,
bacter sp. UYSO10 y plantas de caña de donde se encomienda a ANCAP el incor-
azúcar var. LCP 85-384, lográndose defi- porar biocombustibles producidos en el
nir al aislamiento Enterobacter UYSO10 país con materias primas nacionales, en
como un «endófito verdadero» de caña de una proporción mínima obligatoria de un
azúcar, siendo éste el primer reporte de 5% a partir del 1º de enero de 2012. Si
estas características. En su conjunto, bien no han alcanzado los objetivos plan-
los resultados obtenidos justifican conti- teados inicialmente en su totalidad, la
nuar tanto en la profundización de la superficie ha ido incrementándose signi-
parte aplicada de pruebas de inoculación ficativamente, cosechándose en la zafra
en invernáculo y campo, así como en la 2010/11 unas 6.648 hectáreas de caña
investigación básica de la interacción de azúcar (Azúcar. Cultivo de Caña y
planta-microorganismo en un cultivo es- Producción Industrial. Zafra 2010/11,
tratégico para el país. www.mgap.gub.uy), esperándose alcan-
zar las 10.000 hectáreas en la próxima
siembra (Hackembruch com. pers.). En
2. INTRODUCCIÓN Uruguay no se cuenta con un programa
de mejoramiento de variedades del culti-
vo de caña de azúcar. La estrategia utili-
El cultivo de caña de azúcar en zada por ALUR es estudiar la adaptabili-
el Uruguay dad de variedades plantadas en la provin-
cia de Tucumán (Argentina) la cual posee
La plantación del cultivo de caña de un clima muy similar al de Bella Unión.
azúcar en Uruguay se restringe a la re- En los últimos años se ha cultivado en un
gión más norte del país, en los alrededo- 80 % del área plantada la variedad TUC77-
res de la ciudad de Bella Unión, Artigas. 42 debido al buen rendimiento de cose-
La misma se realiza principalmente bajo cha obtenido, repartiéndose el 20 % del
coordinación de Alcoholes del Uruguay área restante entre otras variedades de
S.A. (ALUR-www.alur.com.uy), empresa menor importancia. Actualmente ALUR
cuyo principal accionista es ANCAP. El plantea cambios en las características
cultivo de caña de azúcar posee en nues- tradicionales de la plantación tendiendo
tro país dos objetivos principales: el tra- a áreas equivalentes para cinco varieda-
dicional con fines alimenticios mediante des: TUC 77-42, TUC 78-14, LCP 85-384,
la producción de azúcar, y su nuevo uso CP 92-618 y NA 73-2596. Esta transforma-
como materia prima en la producción de ción busca además de diversificar las varie-
biocombustibles mediante la generación dades cultivadas, alargar el periodo de
de alcohol etílico. En el proceso de la cosecha utilizando variedades de produc-
cadena productiva se generan también, ción temprana y tardía, contemplando tam-
diversos subproductos aprovechables, bién otras características como es la tole-
tales como energía y alimento animal. rancia a heladas. La cosecha se realiza
Debido a esta característica, es que al desde mayo a octubre, comenzando con la
mismo se lo considera como un cultivo quema controlada del tablón y posterior-
multipropósito, hecho que mejora la sus- mente el corte manual de los tallos.
Uno de los problemas que presenta el nismos que estimulan la germinación de
cultivo de caña de azúcar en nuestro semillas así como la emergencia y el
país, son los altos costos de producción establecimiento de las plántulas, a tra-
relacionados a la fertilización química vés de la producción y liberación de
nitrogenada necesaria para su óptimo sustancias fenólicas como las quinonas
desarrollo, alcanzando aproximadamen- (18). Como mecanismos de acción indi-
te U$S 215/hectárea (Hackembruch, com. rectos se describen la inducción por
pers.). A este hecho, se le suma que el bacterias PCV, de los mecanismos de
cultivo fertilizado utiliza solo un 50% de defensa sistémicos de la planta confi-
los nutrientes suministrados, perdiéndo- riendo de esta forma protección frente a
se el resto por escorrentía o lixiviación a potenciales patógenos (95) y el control
aguas superficiales y/o subterráneas o biológico. El control biológico de bacte-
por volatilización (desnitrificación). El rias y hongos patógenos por parte de las
nitrógeno solubilizado en agua y trans- BPCV es llevada a cabo por competencia
portado hacia cuerpos de agua causa (de espacio, nutrientes, agua, luz, oxíge-
gran contaminación por promover el au- no) o mediante interacciones amensalis-
mento del crecimiento de algas y bacte- tas como la producción de antibióticos o
rias, fenómeno denominado eutrofización toxinas específicas como las bacterioci-
(20, 26,58). Esta problemática enfatiza nas (10,11,76).
la necesidad del uso de nuevas tecnolo- Las bacterias PCV pueden encontrar-
gías para ser empleadas en la agricultura se en vida libre o en asociaciones con
con el fin de lograr sistemas de produc- plantas como bacterias epífitas (inclu-
ción más sustentables desde el punto de yendo las rizosféricas), endófitas o en
vista económico y ambiental. Una alter- simbiosis, como los rizobios en asocia-
nativa al uso de fertilizantes químicos es ción con plantas de la familia legumino-
el empleo de bacterias nativas promoto- sa, quienes forman estructuras especia-
ras del crecimiento vegetal. les llamadas nódulos (42,43). Esta clasi-
ficación de las bacterias muestra la exis-
Bacterias promotoras del tencia de diferentes grados de interac-
crecimiento vegetal ción entre bacterias y plantas, resultan-
do en relaciones más o menos laxas. A
Bacterias y plantas han co-evolucio- mayor intimidad en la interacción, se
nado desarrollando distintos tipos de in- presentarán características más com-
teracciones incluyendo interacciones plejas resultantes de un mayor grado de
comensalistas, mutualistas y perjudicia- co-evolución y traducido generalmente
les. Desde el punto de vista de la planta, en mejores beneficios para ambas con-
una interacción beneficiosa puede incre- trapartes. El fenotipo de la interacción es
mentar el crecimiento vegetal (aumento generalmente plástico, dependiendo de
del rendimiento), mientras que una inte- la especificidad de genotipo de ambas
racción perjudicial significa una disminu- partes, del estado nutricional y del desa-
ción en el crecimiento de la planta y un rrollo así como también de factores am-
posible desarrollo de enfermedad (18,74). bientales.
Con respecto a las interacciones mutua-
listas se conocen dos formas en que las Endófitos bacterianos
plantas responden a la presencia de las
llamadas bacterias promotoras del creci- La etimología de la palabra endófito
miento vegetal (BPCV): la directa o la viene de endo (dentro) y fito (planta),
indirecta. Los mecanismos de acción literalmente significa «en la planta». Wil-
conocidos como promotores del creci- son y colaboradores (1995) definieron el
miento vegetal directo incluyen: la pro- término endófito en referencia a hongos o
ducción de sustancias estimulantes del bacterias que durante parte o todo su
crecimiento como las fitohormonas (auxi- ciclo de vida invaden los tejidos de plan-
nas, giberelinas y citoquininas), la fija- tas vivas causando una infección no apa-
ción biológica del nitrógeno (FBN) y el rente y sin provocar síntomas de enfer-
incremento en la capacidad de absorción medad (93). En este caso el uso del
de minerales como fósforo o hierro término se aplica a un amplio espectro
(13,75,92). También se conocen meca- de huéspedes (bacterias y hongos) y
hospederos (plantas e insectos en plan- Endófitos promotores del
tas), así como a diferentes formas de vida crecimiento vegetal asociados a
considerando estrategias simbióticas,
gramíneas
saprobióticas facultativas y parásitos.
De esta forma se incluyen interacciones
Las bacterias endófitas han demos-
comensalistas, mutualistas y patogéni-
trado ser benéficas en la promoción del
cas en estado de latencia (16). Posterior-
crecimiento vegetal y la salud de varios
mente, el término endófito también ha
cultivos (11,26,48,74,3,71). La explota-
sido definido con fines prácticos en refe-
ción de dicha interacción puede jugar un
rencia a las limitaciones experimenta-
rol significativo en sistemas agrícolas
les. Es así que Quadt-Hallmann y cola-
sustentables tanto para cultivos alimen-
boradores definieron el término endófito
ticios como no alimenticios. Durante las
como aquellas bacterias que pueden ser
últimas décadas, se ha incrementado el
aisladas o extraídas de tejidos de plan-
interés en el estudio de BPCV asociadas
tas esterilizados superficialmente y que
a cultivos agronómicamente importantes
no causan un daño visible en la misma
como arroz, maíz, trigo, caña de azúcar
(23). Sin embargo, esta definición no
y sorgo, con especial interés en las
incluye aquellas bacterias no extraíbles
bacterias que fijan biológicamente el N
o no cultivables. Más aún, Reinhold-Hu-
(diazótrofas), buscando extender a las
rek y Hurek propusieron el criterio para
gramíneas los conocimientos y usos de
identificar endófitos «verdaderos» (60).
la fijación biológica del nitrógeno (FBN),
El mismo hace referencia a bacterias que
muy estudiada en cultivos de legumino-
no solamente fueron aisladas de tejidos
sas (4,14). Es así que se han reportado
superficialmente estériles sino que ade-
varias bacterias diazótrofas promisorias
más se tenga evidencia microscópica de
para su uso biotecnológico en la rizósfe-
su presencia dentro de los tejidos. A su
ra y en el interior de las plantas (91). Se
vez una bacteria endófita debe cumplir
postula que en comparación a la interac-
con el postulado de Koch y ser capaz de
ción bacteria diazótrofas rizosféricas-plan-
infectar nuevos hospederos. En términos
ta, en la interacción endófito diazótrofo-
evolutivos a las bacterias endófitas se las
planta, la eficiencia del intercambio del
considera intermediarios entre bacterias
nitrógeno fijado es mayor al ser liberado
saprófitas y patógenas, considerándolas
en el interior de la planta, quedando
como bacterias que potencialmente evo-
rápidamente disponible para sus necesi-
lucionarán a un estado de patógenos o
dades (33). Si bien, las bacterias endófi-
como bacterias más evolucionadas que
tas-diazótrofas parecen ser una menor
han sido conservadas por el beneficio
población dentro de la comunidad de
resultante (23). Para explicar la infección
endófitos (77), se postula que el aumento
asintomática por dichas bacterias, se ha
en número de dicha población aumenta-
postulado que un balance entre las reac-
ría el beneficio percibido por la planta a
ciones antagónicas causadas por endó-
partir de la FBN (65).
fitos virulentos y las respuestas de defen-
sa de la planta han resultado en una
colonización asintomática (69). Por otro Fijación biológica de nitrógeno
lado se ha observado que en general las en caña de azúcar
poblaciones de bacterias endófitas ocu-
rren en más bajas densidades que las de Dadas las políticas energéticas y el
patógenos y algunas no presentan res- balance energético positivo que posee la
puestas de hipersensibilidad por parte de producción de etanol a partir del cultivo
la planta (69). Los endófitos pueden cla- de caña de azúcar en Brasil, dicho país
sificarse como obligatorios o facultati- ha impulsado desde hace varios años el
vos, siendo los endófitos obligatorios estudio del efecto de microorganismos
bacterias que dependen del huésped para PCV, particularmente diazótrofos, endi-
su crecimiento, sobrevida y dispersión. cho cultivo. Diversos estudios muestran
Por su parte los endófitos facultativos, la importancia económica que posee la
pueden ser caracterizados como bifási- FBN en el cultivo de caña de azúcar (86).
cos alternando una fase dentro de la Se ha reportado que ciertas variedades
planta y otra en el ambiente, general- son capaces de obtener hasta un 60 %
mente el suelo (24). del N necesario para su desarrollo a
través de la asociación con bacterias co se tiene información sobre el poten-
endófitas diazótrofas (7), factor depen- cial de esos microorganismos en reducir
diente del genotipo de la planta, de las los costos del fertilizante nitrogenado por
bacterias asociadas y del ambiente. inoculación de las plantas con bacterias
Particularmente para el caso de Brasil se diazótrofas.
ha sugerido que, las cantidades bajas de
fertilización nitrogenada incorporada en
la producción de caña de azúcar por los 3. OBJETIVOS
últimos 100 años, han seleccionado va-
riedades con baja respuesta al nitrógeno Objetivo general
fertilizado y con una mayor habilidad Contribuir a mejorar la sustentabilidad
para el nitrógeno fijado (7). Estos resulta- económica y ambiental del cultivo de
dos han llevado a estudiar cuáles son las caña de azúcar en la zona norte del país.
bacterias responsables de la contribu- Objetivo específico
ción de N vía FBN en cultivos de caña de
azúcar (38). Mediante técnicas depen- Disminuir el uso de fertilizantes quími-
dientes e independientes de cultivo se cos nitrogenados en el cultivo de caña de
han aislado e identificado diferentes bac- azúcar mediante el empleo de bacterias
terias asociadas a este cultivo. Es así promotoras del crecimiento vegetal.
que diversas bacterias han sido descrip- Productos
tas como asociadas a caña de azúcar,
3.1. Seleccionar la variedad de caña
pero como endófitos verdaderos sola-
de azúcar utilizadas por los pro-
mente los géneros: Gluconacetobacter,
ductores de ALUR, con mayor ca-
Herbaspirillum y Burkholderia (91). En
pacidad de FBN (metodología de
Brasil se está realizando un gran esfuer-
N15).
zo para desarrollar la formulación de un
inoculante para este cultivo. Para esto se 3.2. Aislar endófitos-diazótrofos aso-
han evaluado diferentes inóculos bacte- ciados a las variedades de caña de
rianos en cultivares de caña de azúcar azúcar en condiciones naturales.
utilizando como estrategia un pool de 3.3. Determinar la capacidad de
bacterias diazótrofas, incluyendo bacte- fijar nitrógeno por los aislamientos
rias endófitas (51). Actualmente se ha bacterianos utilizando ensayos bio-
definido la formulación y se están reali- químicos y técnicas de biología
zando ensayos de validación del inocu- molecular.
lante a campo bajo diferentes condicio-
nes ambientales (suelos, variedad de 3.4. Identificar los aislamientos bac-
caña de azúcar, clima). Si bien hay resul- terianos de interés por técnicas de
tados prometedores, los mismos pre- biología molecular.
sentan una gran variabilidad y baja repro- 3.5.Estudiar la capacidad de la co-
ducibilidad. Estos resultados demues- lección de endófitos-diazótrofos de
tran que se requieren más estudios con producir metabolitos con actividad
respecto a la interacción entre las bacte- promotora del crecimiento vegetal.
rias diazótrofas asociadas y las plantas, 3.6. Evaluar el crecimiento vegetal
quien/es son los responsables y qué en invernáculo en respuesta a la
condiciones favorecen la actividad de di- inoculación con bacterias endófi-
cha población y por ende la FBN. tas-diazótrofas.
De las variedades de caña de azúcar 3.7. Realizar ensayos de campo de
que se cultivan en el país se desconoce promoción del crecimiento vegetal
el tipo, características y funciones de las de la mejor combinación bacteria
bacterias promotoras del crecimiento cultivar determinada en los ensayos
vegetal asociadas a las mismas. Tampo- de invernáculo.
4. METODOLOGÍA y 10 hojas jóvenes elegidas al azar.

Conjuntamente se extrajeron de cada
Selección de las variedades de tablón o de lugares adyacentes, espe-
cies de malezas para utilizarlas como
caña de azúcar utilizadas por los
referencia. Se eligieron plantas con porte
productores de ALUR, con y ciclo similar al de la caña, a las cuales
mayor capacidad de FBN se les extrajo una muestra de 10 hojas de
(metodología de 15N). cada una. Las muestras se acondiciona-
ron y transportaron al laboratorio para su
análisis. Las malezas fueron identifica-
Muestreos das por el departamento de Botánica,
Se realizaron dos giras en los meses Facultad de Agronomía, UDELAR. Las
de abril y setiembre del 2009, a predios muestras se secaron a 65 ºC hasta peso
de agricultores de caña de azúcar que constante, se molieron finamente y a una
están bajo la coordinación de técnicos de sub-muestra de 0,5 g, de cada una, se le
ALUR S.A. en Bella Unión (S determinó el N total aéreo (método de
30º20´56,5´´; W 57º37´19,1´). El recorri- Kjeldhal) y δ15N de la parte aérea (por
do por el área elegida reveló marcadas espectrometría de masas), en el Labora-
diferencias entre los predios en cuanto a torio CATNAS de la Facultad de Agrono-
las variedades utilizadas, año del culti- mía, UdelaR. El %Nda (porcentaje de N
vos (soca 1, 2, etc.) y fertilización nitro- derivado del aire) para cada muestra se
genada. Para la colecta del material ve- calculó por la fórmula:
getal, se puso especial énfasis en elegir %Nda =(δ15N ref. - δ15N caña x 100)/
aquellos sitios de muestreo que tuvieran (δ15N ref.–B)
información detallada sobre la fertiliza- donde: δ15N ref. y δ15N caña corresponden
ción nitrogenada utilizada por el agricul- a los valores de δ15N (%) para las plantas
tor. Teniendo en cuenta la alta incidencia de referencia y las plantas de caña de
de la fertilización en los cultivos de caña azúcar respectivamente(6). Se asume un
de azúcar, se decidió a los efectos com- valor B de 0,0 δ15N, para aquella planta de
parativos, elegir plantas de cultivos con caña de azúcar que crece con N2 atmosfé-
alta fertilización (150 kgN/ha), baja ferti- rico como única fuente de nitrógeno.
lización (50 kgN/ha) y sin fertilización
nitrogenada en los últimos 4-5 años. En
Dilución isotópica del 15N
cada sitio seleccionado de acuerdo a la
variedad y fertilización nitrogenada, se En este ensayo las variedades de
colectaron los tallos de 12 plantas elegi- caña ensayadas fueron: CP 92-618, Tuc
das al azar dentro de un tablón. El mate- 77-42 y LCP 85-384 las cuales son de
rial vegetal fue acondicionado y transpor- interés para ALUR. Como controles se
tado adecuadamente al laboratorio. Por emplearon los cultivos de maíz (Zea mays
último se colectaron muestras compues- L. NK940) y sorgo (Sorghum officinalis L.
tas de los suelos (0-20 cm de profundi- DK-71-T). La evaluación se realizó a 2
dad) de cada sitio para su análisis fisico- niveles de fertilización nitrogenada, em-
químico. pleando soluciones de sulfato de amonio
Con la finalidad de cuantificar el apor- marcado con 10% de átomos de 15N en
te de la fijación biológica del nitrógeno en exceso, equivalente a 10 y 50 kg de N/ha.
las diferentes variedades de caña de El ensayo se cosechó a los 4 meses
azúcar cultivadas en Uruguay, se em- después de la siembra, determinándose
plearon las técnicas de la abundancia la biomasa aérea y radical seca, el N-
natural del N15 y de la dilución isotópica total aéreo y el % de átomos en exceso
del N15. de 15N. Para la determinación del porcen-
taje de N derivado de la atmósfera (%Nda)
se utilizó la fórmula:
Abundancia natural del 15N
%Nda = [(1–% a.e.15N caña / %a.e.
Para esta, en todos los sitios de 15
N control)] x 100.
muestreo en que se obtuvieron plantas
para el aislamiento bacteriano, se colec- donde: el %a.e. 15N caña y del control son
taron las hojas +3 (la tercera en emerger) los enriquecimientos en átomos en exce-
so de 15N de las variedades de caña y de ratorio a partir de yemas colectadas en
los cultivos controles, maíz y sorgo res- los muestreos (Figura 1). Las variedades
pectivamente. Los análisis estadísticos de caña de azúcar utilizadas fueron CP
fueron realizados con el paquete estadís- 92-618, LCP 85-384, TUC 77-42, TUC 67-
tico Infostat usando ANAVA con un p< 27, TUC 78-12y FAM 81-77. Con el fin de
0.05. En caso de obtener diferencias optimizar el procedimiento, se pusieron
significativas, los tratamientos fueron a punto diferentes protocolos en los cua-
comparados usando el test de LSD 0,05 les el material biológico se esterilizó
(29). superficialmente extrayéndose el fluido
apoplástico o macerándose asépticamen-
te. A partir de la suspensión obtenida en
Aislamiento de endófitos-
ambos casos, se hicieron diluciones
diazótrofos asociados a las seriadas hasta 10-6 sembrándose 200 µl
variedades de caña de azúcar de cada una de las mismas, en viales
en condiciones naturales conteniendo los medios de cultivo semi-
sólidos LGI, LGI-P-caldo y JNFb
El material de partida utilizado para (55,62,84). Los viales fueron incubados a
este procedimiento, fueron tallos de plan- 30°C por siete días y aquellos que pre-
tas traídos directamente del campo así sentaron una película de crecimiento,
como tallos jóvenes crecidos en el labo- fueron repicados en un vial fresco para
a
d
Nodo
c f
Internodo
Esterilización Inoculación en
superficial e medio semi
sólido
Procesamiento
Material vegetal
de partida
i h g
Purificación de los aislamientos

Figura 1. Estrategia utilizada para el aislamiento de bacterias endófitas diazótrofas. a-b) Material vegetal
utilizado para el aislamiento de bacterias potencialmente endófitas: a) nodos e internodos de tallos
traídos de campo y b) plantas rebrotadas a partir de yemas. c-f: ilustración del procedimiento utilizado
para el aislamiento bacteriano: c) esterilización superficial, d) obtención del apoplasto, e) macerado
de los tallos mediante uso de licuadora y f) inoculación de los viales conteniendo medio semisólido
sin nitrógeno. g-i) Purificación de los aislamientos: g) visualización de la película de crecimiento
característica de bacterias diazótrofas, h) estriamiento de una película de crecimiento en medio
sólido sin nitrógeno, i) purificación de los aislamientos en medio rico de cultivo.
luego ser estriados en placas contenien- GGGGATTCAC-3') y ERIC2 (5'- AAGTA-
do el mismo medio con el fin de obtener AGTGACTGGGGTGAGCG-3') (27). En
colonias aisladas. Finalmente cada colo- todos los casos las reacciones de PCR
nia obtenida fue crecida en placas conte- se realizaron usando como molde un
niendo medio TY para su clasificación lisado bacteriano obtenido a partir de
morfológica. colonias aisladas en medio sólido. Los
productos de la reacción se visualizaron
bajo luz UV luego de una electroforesis
Determinación de la capacidad
en gel de agarosa 0,7% y tinción con
de fijar nitrógeno por los bromuro de etidio. Los ensayos se reali-
aislamientos bacterianos zaron por duplicados independientes. Los
utilizando ensayos bioquímicos geles fueron analizados visualmente y
y técnicas de biología molecular los aislamientos agrupados de acuerdo a
perfiles de bandas similares a un 80%.
Las bacterias endófitas-diazótrofas
tienen la característica de formar halo en Identificación de los
medios de cultivo semisólido sin nitróge-
aislamientos bacterianos por
no (91). Es así que teniendo en cuenta
esta característica todas las cepas de la técnicas de biología molecular
colección fueron crecidas en viales con-
teniendo medios de cultivo semisólido La amplificación y secuenciación del
LGI, LGI-P, y JNFb. Asimismo toda la gen 16S ARNr se realizó en un grupo de
colección fue sometida a la reacción de aislamientos que presentaron el gen nifH
PCR con el fin de amplificar uno de los así como diferente patrón de bandas en
genes estructurales de la nitrogenasa el ensayo de ERIC-PCR. Los cebadores
(nifH) usando los cebadores nifHFwd (5'- universales utilizados fueron Eub27f (5'-
ATYGTCGGYTGYGAYCCSAARGC-3') y AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')y
nifHRev (5'-ATGGTGTTGGCGGCRTA- Eub1525r (5'-AAGGAGGTGATCCAGC-
VAKSGCC-3') (54). CGCA-3') (37). Las reacciones de PCR
se realizaron usando como molde una
La actividad nitrogenasa de los aisla- suspensión bacteriana obtenida a partir
mientos nifH positivos fue determinada de colonias aisladas en medio sólido.
mediante el ensayo de reducción del Los productos de la reacción se visuali-
acetileno (ARA)(25). Como controles zaron bajo luz UV luego de una electrofo-
positivos se utilizaron las cepas Burkhol- resis en gel de agarosa 0,7% y tinción
deria tropica PP8, Gluconacetobacter con bromuro de etidio. Con la finalidad de
diazotrophicus Pal5 crecidas 5 días en obtener las secuencias correspondien-
viales conteniendo LGI-P; Azospirillum tes al gen 16S ARNr, los productos de
amazonensis CBAMC crecida 5 días en PCR obtenidos se enviaron a secuenciar
viales conteniendo LGI; Herbaspirillum a MACROGEN, Korea. Las secuencias
seropedicae Hrc-54, Herbaspirillum ru- forward y reverse obtenidas fueron en-
brisubalcans Hcc-103 crecidas 2 días en sambladas usando el programa DNA
viales conteniendo JNFb. Como control Baser Sequence Assembler v3.x (2012)
negativo se utilizó un vial el cual no fue (http://www.DnaBaser.com). Las identi-
inoculado. dad de las secuencias de nucleótidos
Con el objetivo de poder visualizar la obtenidas se compararon con las dispo-
diversidad genómica de los aislamientos nibles en la base de datos del National
que evidenciaron la presencia del gen Center for Biotechnology Information
nifH, así como un crecimiento en forma (NCBI) utilizando el algoritmo BLAST.
de halo en medio semisólido sin N, se Para los análisis filogenéticos, los ali-
realizaron amplificaciones de regiones neamientos nucleotídicos fueron obteni-
consensuales repetitivas intergénicas de dos con el programa Greengenes usando
los aislamientos, mediante la técnica de la herramienta NASTA (12). Los árboles
ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive filogenéticos fueron construidos con el
Intergenic Consensus PCR), usando los programa Mega4 (81) usando 1458 nu-
cebadores ERIC1R (5'-ATGTAAGCTCCT- cleótidos de la secuencia del gen 16S
ARNr en el caso de las Gamaproteobac- Caracterización fisiológica de
terias o con 1471 nucleótidos de secuen- los aislamientos: capacidad de
cia para el caso de las Alfa o Betaprote-
crecer en diferentes fuentes de
obacterias. El algoritmo de Neighbor-
joining (67) y el modelo de Kimura de
C, N y determinación de la
sustitución de 2 parámetros fueron usa- resistencia intrínseca a
dos para la construcción de los árboles antibióticos
filogenéticos, estimándose la robustez
de cada rama de los mismos con un Para esta caracterización, las cepas
repetición de un bootstrap de 1000 (73). Achromobacter sp. UYSO02, Acineto-
bacter sp. UYSO03, Enterobacter sp.
UYSO10, Panotea sp. UYSO13, Pseu-
Estudio de la capacidad de la domonas sp. UYSO21, Rhanella sp.
colección de endófitos- UYSO22, Shinella sp. UYSO24 y Steno-
diazótrofos de presentar trophomonas sp. UYSO27, fueron selec-
características promotoras del cionadas de acuerdo a sus característi-
crecimiento vegetal: producción cas PCV detectadas in vitro.
de ácido indo acético (AIA),
solubilización de fosfatos y Crecimiento en diferentes fuentes de
producción de sideróforos carbono y nitrógeno
En estos experimentos, una suspen-
La producción de AIA por los aisla- sión de cada cepa se sembró por triplica-
mientos se estudió a las 24, 48 y 72 do en medio sólido JNFb, LGI o LGI-P
horas de crecimiento mediante el ensayo (según su medio de aislamiento original),
colorimétrico de Sarkowski (68). Como sustituyendo la fuente de C por 5g/l de:
controles positivos se utilizaron las cepas sacarosa, ácido málico, glucosa, glice-
H. seropedicae H54 y G. diazotrophicus rol, manitol y azúcar de caña no refinada
Pal5, mientras que como control negati- (ACnr). En el caso del N, se utilizó sulfa-
vo se usó el medio de cultivo sin inocular. to de amonio (NH4) 2SO4, nitrato de pota-
Para el caso de los aislamientos solubi- sio (KNO3), cloruro de amonio (NH 4Cl), L-
lizadores de fosfatos, cada cepa a ser tirosina (L-Tyr), L-asparagina (L-Asn) y L-
analizada se sembró en placas de Petri ácido glutámico (L-Glu) en concentra-
con medio rico GL conteniendo sales de ción 5mM. Como control positivo se uti-
fosfato precipitadas (78). Las bacterias lizaron los medios originales y como
solubilizadoras de fosfato se detectaron control negativo los medios sin fuente de
por la presencia de un halo translúcido C y N inoculados, en ambos casos, con
alrededor de la colonia el cual se midió a las cepas en estudio. Teniendo en cuen-
las 72 horas de crecimiento. La cepa ta que la composición interna de la caña
Burkholderia tropica PP8 se utilizó como de azúcar es de un 8-15 % de sacarosa,
control positivo. Los aislamientos pro- se estudió también el comportamiento
ductores de sideróforos, fueron identifi- de las cepas a una concentración similar
cadas mediante el ensayo de cromoazurol y doblemente mayor de sacarosa y de
(CAS) en placas con agar (70). Las colo- ACnr (100 y 200 g/l). La ACnr utilizada
nias positivas fueron detectadas por la posee un contenido algo menor de saca-
presencia de un halo amarillo alrededor rosa (> 94%) que el azúcar blanco o
de la colonia luego de 5 días de creci- refinado conservando aún parte de la miel
miento. En este caso, las cepas Sinorhi- a partir de la cual fue fabricado. Luego de
zobium meliloti 1021 y Pseudomonas 10 días de haber sido inoculados los
fluorescente CFBP 2392 fueron emplea- medios, se realizó la evaluación visual
das como control positivo (19,40). En del crecimiento en las placas y se las
todos los casos, cada ensayo se realizó clasificó en: sin crecimiento (-); colonias
por triplicado para cada uno de los aisla- aisladas en la estría (+); crecimiento
mientos. continuo sin colonias aisladas en la es-
tría (++).
Resistencia intrínseca a antibióticos Shinella sp. UYSO24. Como cepa de
referencia se utilizó Gluconacetobacter
La resistencia a antibióticos fue deter-
diazotrophicus Pal5 y como control ne-
minada sembrando 5µl de una suspen-
gativo se utilizaron plantas sin inocular.
sión celular de cada cepa a ensayar, en
Asimismo, se incluyó un tratamiento
placas conteniendo medio rico DYG‘s
donde se inocularon los 6 aislamientos
con diferentes concentraciones de anti-
evaluados en este ensayo (MIX), a una
bióticos. Los antibióticos con las máximas
concentración final de 1x107 células/planta
concentraciones evaluadas fueron: Ampli-
(21). Para cada tratamiento se realizaron
cilina 1000 mg/l; Kanamicina 650 mg/l;
10 réplicas. El diseño experimental utiliza-
Streptomicina 450 mg/l y Spectinomicina
do fue completamente al azar. Diez días
800 mg/l. Las soluciones de antibióticos,
posteriores a la inoculación (pi), las plan-
esterilizadas por filtración (0,2 µm), se
tas fueron traspasadas a almacigueras
agregaron al medio de cultivo estéril y
con arena: vermiculita estéril (2:1) y rega-
termostatizado. Las placas se incubaron
das con medio MS modificado sin N.
a 30 ºC registrándose la presencia o
Como las gramíneas no pueden adquirir
ausencia de crecimiento a las 48 h. El
el total del N a partir de la FBN, se regó
ensayo se realizó por triplicado para cada
alternadamente con medio MS con N
tratamiento. Como control positivo se
para que las plantas no presenten déficit
inocularon las mismas cepas en medio
de éste elemento. Durante estas prime-
DYG‘s sin el agregado de antibióticos.
ras etapas las plantas fueron mantenidas
a 30 °C con un fotoperiodo de 12/12 horas
Evaluación del crecimiento luz/oscuridad. A los 25 días pi se tras-
vegetal en invernáculo en plantaron las plantas a macetas conte-
respuesta a la inoculación con niendo 1.5 kg de arena:vermiculita estéril
(2:1) trasladándose al invernáculo con un
bacterias endófitas-diazótrofas
fotoperiodo controlado de 8/16 horas luz/
oscuridad (Figura 2). A los 4 meses pi se
En plantas micropropagadas cosechó el ensayo midiéndose las varia-
bles biométricas: altura de la planta (des-
Frascos de vidrio de 250 ml fueron de la base del tallo hasta el collarín) y
preparados con 20 ml de medio MS mo- diámetro del tallo (medido en la base de
dificado (63). En los mismos se coloca- la planta). Asimismo se determinó el
ron asépticamente entre cuatro y cinco peso seco de la parte área y radicular.
plantas de caña de azúcar micropropaga- Para esto las plantas se seccionaron en
das de similar tamaño en etapa de enraiza- raíz y parte aérea, secándose a 60 °C
miento (53). A los 3 días, los frascos que no hasta alcanzar peso constante. Los aná-
presentaron contaminación, fueron inocu- lisis estadísticos fueron realizados con
lados con 1x107 células/planta (63) con el paquete estadístico Infostat usando
los siguientes aislamientos: Enterobac- ANAVA (p<0,05). En caso de obtener
ter sp. UYSO10, Pantoea sp. UYSO13, diferencias significativas, los tratamien-
Rahnella sp.UYSO22, Acinetobacter sp. tos fueron comparados usando el test de
UYSO03, Pseudomonas sp. UYSO14 y Tukey (29).
a b c
Figura 2. Etapas del ensayo de promoción del crecimiento de plantas de caña de azúcar
micropropagadas e inoculadas con aislamientos seleccionados. a- inoculación aséptica de
plantas enraizadas en frascos, b- aclimatación y c- en macetas en invernáculo.
En plantas crecidas de esquejes nó el peso seco de la parte área y radicu-
lar. Para esto las plantas se seccionaron
En este ensayo se utilizaron macetas
en raíz y parte aérea, secándose a 60°C
conteniendo 1,5 kg de sustrato arena-
hasta alcanzar peso constante. Poste-
suelo (1:1). El suelo (0-20 cm de profun-
riormente la parte aérea se molió fina-
didad) fue extraído de la zona experimen-
mente para análisis de N-total por el
tal de Bella Unión, secado y tamizado en
método de Kjeldhal en el Laboratorio de
el laboratorio antes de su uso, mientras
Nutrición animal de la Facultad de Agro-
que la arena fue lavada con agua corrien-
nomía, UdelaR. Los análisis estadísticos
te y esterilizada. El diseño del ensayo
fueron realizados con el paquete estadís-
fue completamente al azar con 8 repeti-
tico Infostat usando ANAVA con un
ciones por tratamiento. Los tratamientos
p<0,05. En caso de obtener diferencias
inoculados fueron: Achromobacter sp.
significativas, los tratamientos fueron
UYSO02, Acinetobacter sp. UYSO03,
comparados usando el test de LSD
Enterobacter sp. UYSO10, Pantoea sp.
Fisher (29).
UYSO13, Pseudomonas sp. UYSO21,
Rahnella sp. UYSO22, Shinella sp.
UYSO24, Stenotrophomona sp. UYSO27 y Ensayos de campo de
la mezcla de las 8 cepas (MIX). Como promoción del crecimiento
referencia se incluyó un tratamiento con la vegetal de la mejor combinación
cepa Gluconacetobacter diazotrophicus bacteria-cultivar determinada en
PAl5. Como control positivo se realizó un
tratamiento al cual se le agregó una solución
los ensayos de invernáculo
de urea equivalente a 100 kg N/ha, mientras
que como control negativo se emplearon El ensayo se realizó en el campo
plantas de cañas de azúcar sin inocular y experimental de ALUR, Bella Unión, de
sin fertilizar. En la siembra se utilizaron forma de tener una preparación del suelo
esquejes de la variedad LCP 85-384. Los similar a la de las siembras comerciales
mismos fueron lavados con agua corrien- de caña. El diseño fue de bloques com-
te, desinfectados superficialmente con pletos al azar con 4 repeticiones. Cada
etanol 70% y cortados en trozos, dejan- bloque (4 en total) midió 8 m de ancho por
do una yema por esqueje. Las macetas 20 m de largo separados por calles de 2 m
fueron regadas con agua destilada a capa- de ancho. Asimismo, cada bloque estaba
cidad de campo sembrándose a los 3 días, constituido por 4 parcelas (una por trata-
1 esquejes por maceta. Las macetas fue- miento) y dentro de cada parcela habían
ron colocadas en un cuarto de crecimiento 4 surcos separados por 0,60-0,80m (Fi-
de plantas controlado a 28 ºC y 60% de gura 3). Los surcos fueron abiertos por
humedad relativa (HR), para facilitar la sembradora convencional momentos an-
germinación de las yemas (5-7 días). tes de la siembra para evitar la pérdida de
Posteriormente se las creció con un foto- humedad del suelo. La elección de las
período de luz: oscuridad de 14:10 h con cepas a evaluar en campo se basó en los
5750-6700 luxes. Cuando las plántulas resultados del ensayo en invernáculo. Se
tuvieron aproximadamente 20 cm de altu- realizaron 4 tratamientos: dos cepas (En-
ra se trasladaron al invernáculo. Los tra- terobacter sp. UYSO10 y Shinella sp.
tamientos fueron inoculados a los 20 y 65 UYSO24), el control positivo (fertiliza-
días desde la aparición de las primeras ción con urea equivalente a 150Kg N/ha,
hojas con 1 x107 células/planta. En los condiciones similares a las realizadas
tratamientos nitrogenados se añadió 20 por ALUR) y el control negativo (sin ino-
ml de una solución de urea equivalente a culación y sin fertilización).
25Kg N/há por maceta a los 20, 35, 65 y Los inóculos fueron preparados 24 h
95 días desde la siembra. El riego se antes de instalar el ensayo. Para eso las
realizó siempre en el plato inferior de la cepas fueron crecidas en matraces con-
maceta, utilizando agua corriente y una teniendo 400ml de medio DYG´s, igua-
vez por semana solución nutritiva lándose la densidad óptica a 560nm
Fahraeus sin N (17). A los 4 meses se (D.O.560nm) de los inóculos entre 0,6-0,8.
cosechó el ensayo midiéndose las varia- Dos bolsas con 200ml cada una de turba
bles biométricas: altura de la planta y estéril (Calister S.A.) se impregnaron
diámetro del tallo. Asimismo se determi- con cada cepa mezclándose cuidadosa-
Parcela 16-tratamiento 3
8m
} 13 14 15 16
2 4 1 3
2m
}
9 10 11 12
3 1 2 4
}
0,60-0,80 m
5 6 7 8
4 3 1 2
Surco (8 m aprox.)
1 2 3 4
<20 tallos continuos
1 2 3 4
40 m aprox. 20 m aprox. a b c
Figura 3. a: diagrama del ensayo de campo en predio del campo experimental de ALUR, Bella Unión.
b: inoculación de esquejes. c: Siembra de esquejes
mente. La eficiencia del proceso de pre- surcos centrales de cada parcela. Asi-
paración del inoculante se verificó por el mismo, muestras de las mismas se se-
recuento en placa en medio DYG´s a caron a 65 °C hasta peso constante y se
tiempo 0 con el fin de obtener las ufc/g obtuvo el peso seco de 3 plantas/parce-
inoculante de cada cepa. Posteriormen- la. Luego, se las molió hasta obtener una
te se determinó por el mismo método la textura tipo polvo, al cual se le analizó el
sobrevivencia de cada cepa a los 7, 30, N-total por el método de Kjeldhal. Para
60, 90 y 120 días desde la inoculación de este análisis se enviaron 0,5 g de mues-
la turba. El personal de campo de ALUR tra al Laboratorio de Suelos, IECA-UN-
preparó los esquejes de la variedad LCP CIEP de la Facultad de Ciencias, Ude-
85-384 previo a su inoculación y siembra laR. Por otra parte el personal de ALUR
(40 cm de largo, con 2-3 yemas). La S.A. determinó: 1) La población: el nº de
inoculación se realizó en un tanque lim- tallos por hectárea (NTH), 2) el rendi-
pio, mezclando 25 g de inoculante con 80 miento cultural: las toneladas de caña
g de adherente S1 (Biagro S.A.) y 4 litros por hectárea (TCH), 3) el peso de tallos
de agua corriente. En la mezcla se su- individuales (PT), 4) el rendimiento indus-
mergieron los esquejes durante 10 min e trial teórico: % de azúcar (RIT), 5) el
inmediatamente se sembraron 20 tallos rendimiento final: toneladas de azúcar
continuos por surco. La inoculación y la por hectárea (TAH), 6) Fibra (FIB), 7)
siembra se realizaron con todas las pre- daños por Diatraea sacharalis, (DIATINT),
cauciones para evitar contaminación en- 8) el largo de cañas individuales (LARCA-
tre los tratamientos. Los esquejes se ÑA) y 9) el número de entrenudos (ENTR).
taparon inmediatamente de colocados Los análisis estadísticos fueron realiza-
en los surcos para evitar su desecación e dos con el paquete estadístico Infostat
inmediatamente se añadió al voleo el ferti- usando ANAVA con un p< 0,05. En caso
lizante fosfatado (138 unidades de P/ha) de obtener diferencias significativas, los
regándose. Esquejes inoculados y no ino- tratamientos fueron comparados usando
culado se transportaron al laboratorio el test de Tukey (29).
con la finalidad de determinar el número
de bacterias/superficie de esqueje, por
recuento en placas en medio LGI-P (me- Estudio de la interacción entre
dio del cual se aislaron las cepas origi- Enterobacter sp.UYSO10 y
nalmente). Siguiendo el manejo rutinario plantas micropropagadas de la
del cultivo, a los 5 días se aplicó herbici- variedad LCP 85-384 mediante
da, a los 90 días se adicionó fertilizante microscopía óptica, electrónica
potásico (160 unidades de K/ha) y a los
de transmisión y de barrido
100 días se añadió a las parcelas con N,
el fertilizante nitrogenado (150 unidades
El aislamiento Enterobacter sp.
de N/ha). A los 3, 8 y 12 meses de
UYSO10 fue seleccionado para la reali-
sembrado el ensayo se determinó la altu-
zación de estudios de infección, coloni-
ra y el número de hojas de tres plantas
zación y abundancia, teniendo en cuenta
elegidas al azar en cada parcela. La
su capacidad de promover el crecimiento
extracción de plantas se realizó en los
de plantas de la variedad LCP 85-384 en dentro de los cultivos de caña estudia-
invernáculo. Plantas micropropagadas en dos. En el Cuadro 1 se muestran los
etapa de enraizamiento de la variedad valores de %Nda obtenidos en las varie-
LCP 85-384 fueron transferidas a un nue- dades de caña teniendo en cuenta los
vo frasco conteniendo medio de cultivo diferentes niveles de fertilización así como
MS modificado (85). Al tercer día los los controles utilizados. En la tabla men-
frascos que no mostraron contaminación cionada, se presentan dos valores de
fueron inoculados con 1 x 10 7 células/ %Nda para la caña: 1-utilizando los valo-
planta de Enterobacter sp. UYSO10. res promedios de δ15N de las plantas
Como control negativo se utilizaron plan- control, 2- utilizando el valor de δ15N del
tas sin inocular. Las plantas fueron cose- sorgo. El sorgo es una gramínea con
chadas a las 6, 12, 24, 48 horas y 6 días similares características a la caña de
post inoculación (pi), separándose el te- azúcar, que mostró un valor de δ15N alto
jido aéreo del radicular. Las muestras en comparación con las restantes plan-
fueron guardadas en PBS: H2O (1:10) tas control. La crotalaria, leguminosa
hasta su análisis. Por cada tratamiento utilizada como control positivo, presentó
se realizaron 4 repeticiones. Como tejido el valor de δ15N más bajo, demostrándose
de estudio, se seleccionaron la base del como era de esperar, una alta fijación de
tallo y las raíces, por ser los sitios con N2 (5).
mayor probabilidad de encontrar bacte- Los valores de %Nda de las muestras
rias endófitas, así como los cultivos pu- de caña de azúcar, mostraron diferen-
ros para su comparación. En el caso de cias significativas independientemente
las muestras para los estudios de mi- del control utilizado, siendo la variedad
croscopía óptica o electrónica de trans- TUC 77-42 (SF) la que obtuvo un valor
misión, las muestras fueron secciona- notoriamente mayor. Al utilizar al sorgo
das y tratadas según las recomendacio- como planta control, los valores de %Nda
nes (49,33). Los cortes se visualizaron de las muestras de caña oscilaron entre
en microscopio óptico de campo claro 13 y 70%, mientras que al utilizar el
utilizando los lentes: 10x, 20x, 40x y promedio de las plantas control oscilaron
100x o en el microscopio electrónico de entre 15 y 62%. Estos resultados de-
transmisión Zeiss EM-900. Para el caso muestran que, en condiciones de cam-
de estudios de microscopía electrónica po, las plantas de caña sin fertilización
de barrido, las muestras fueron tratadas nitrogenada, toman el N mayoritariamen-
según las recomendaciones (63) y obte de la atmósfera, al presentar valores
servadas en un Digital Scanning Micros- de %Nda mayores. En las plantas de
cope Zeiss DSM-962. caña con una fertilización nitrogenada
equivalente a 50 y 150 kg N/ha, no se
5. RESULTADOS Y encontró una correlación con el valor de
%Nda de las muestras (Cuadro 1). Sin
DISCUSIÓN embargo se pudo comprobar un aporte
del N2 atmosférico por parte de las dife-
rentes variedades de plantas. Estos da-
Selección de las variedades de tos están en correlación con los resulta-
caña de azúcar utilizadas por los dos obtenidos empleando la técnica de
productores de ALUR, con dilución isotópica del 15N así como con la
mayor capacidad de FBN literatura (5,6).
(metodología de 15N)
Dilución isotópica del 15N
Abundancia natural del 15N La capacidad FBN por las tres varie-
dades (CP 92-618, TUC 77-42 y LCP 85-
El objetivo de esta aproximación fue el 384), fue estimada mediante el método
de conocer si ocurre un aporte de N de dilución isotópica utilizando una va-
atmosférico a las plantas de caña en riedad de sorgo y maíz como plantas
condiciones naturales de campo. Para referencia, a 2 niveles de fertilización
esto se empleó el método de abundancia 10 y 50 mg N kg -1 (F10 y F50, respec-
natural del 15N, utilizando diferentes es- tivamente). Los valores de % de átomos
pecies como plantas controles, elegidas de 15N en exceso de la parte aérea y de la
Cuadro 1. Evaluación de la capacidad FBN de 5 cultivares de caña de
azúcar cultivadas en Uruguay, en tres niveles de fertilización
nitrogenada, utilizando el método de abundancia natural
del 15N
15 2 3 4
Cultivo Fertilización δ N %Nda %Nda
1
Nitrogenada caña caña
TUC 77-42 AF 5,72 26,77 41,66

LCP 85-384 AF 7,84 ------ 20,03
TUC 77-42 SF 2,99 61,74 69,52
TUC 77-42 BF 6,57 15,86 32,97
LCP 85-384 BF 6,02 22,88 38,56
FAM 81-77 n.d. 7,83 ------ 20,15
CP 92-618 n.d. 6,07 22,31 38,11
TUC 95-24 n.d. 8,46 ------ 13,67
Control sorgo (-) n.d. 9,8 ------ ------
Control (-) promedio n.d. 7,8 ------ ------
Control crotalaria (+) n.d. 0,2 ------ ------
1
AF: alta, 150kg N/ha; BF: baja, 50Kg N/ha; SF: sin fertilizar, sin fertilizar
por 4-5 años. n.d.: no determinado. 2ä 15N: relación 15N/14N en la planta.
%Nda: porcentaje de N derivado de la atmósfera. %Nda 3: %Nda
calculado con el promedio de ä 15N de las plantas control. %Nda4: %Nda
calculado con el valor de ä15N del sorgo como planta control.
hoja +3 de las plantas de caña de azúcar los niveles de fertilización nitrogenada

fueron similares y significativamente así como los factores ambientales em-
menores a los de los controles a los dos pleados (26,38,86,94). Este es el primer
niveles de fertilización (Cuadro 2). Valo- reporte en el país en el cual se demuestra
res similares de peso seco aéreo fueron una contribución de la FBN en variedades
observados entre las diferentes varieda- de caña de azúcar cultivadas.
des de caña de azúcar a los dos niveles
de fertilización ensayados sin embargo
Aislamiento de endófitos-
la media del N acumulado por la caña de
azúcar fue 90 y 60% mayor que las diazótrofos asociados a las
plantas de referencia a F10 y F50 respec- variedades de caña de azúcar
tivamente. Estos resultados indican que en condiciones naturales
las 3 variedades de caña de azúcar obtie-
nen aportes de N mediante la fijación En el marco de este proyecto se
biológica del N y que el %Nda, estimado construyó la primera librería de posibles
para la parte aérea fue entre 41,3 y 58,8% endófitos nativos asociados a las diferen-
a F10, mientras que a F50 fue entre 34,8 tes variedades cultivadas en Uruguay, la
a 49,7% (Cuadro 2). cual contiene unos 596 aislamientos (Fi-
Los resultados del ensayo de dilución gura 4). Debido a que los productores
isotópica del 15N en invernáculo apoyan la propagan la caña de azúcar a partir de los
hipótesis de que existe una contribución tallos, nos focalizamos en aislar las bac-
de la FBN en los 3 cultivares de caña de terias que estaban presentes en los teji-
azúcar plantados en nuestro país y que dos internos de los mismos. Cabe desta-
la misma es afectada por los niveles de car que no se obtuvieron diferencias sig-
fertilización nitrogenada. Estos resulta- nificativas en el número de bacterias
dos son consistentes con la literatura en contadas en placa, al compararse los
el tema, particularmente en Brasil (6,86). diferentes cultivares o los diferentes nive-
Variaciones en los rangos de contribu- les de fertilización nitrogenada. En total
ción de FBN en caña de azúcar (0-72 %) se obtuvieron unos 66 morfotipos diferen-
han sido reportados, debidas básicamente tes al crecer la colección en placas con-
a los diferentes cultivares ensayados, teniendo medio rico TY.
Cuadro 2. Evaluación de la capacidad FBN de tres cultivares de caña de azúcar cultivadas en Uruguay, en dos
niveles de fertilización nitrogenada, utilizando el método de dilución isotópica del 15N
15 Concentración
% N ae % Nda
% Nda 2 Peso seco de N parte N total
Cultivo 1 (S)
(M) aéreo aérea (mg
Parte Hoja +3 Parte -1 -1 -1
Parte (g planta ) (mg g peso planta )
aérea aérea
aérea seco)
F10
CP 92-618 0,17c 0,17a 50,3 a 58,8 a 19,39b 10,4a 203,1a
Tuc 77-42 0,23c 0,20a 41,3 a 51,4 a 25,36a 7,8b 207,6a
LCP 85-384 0,19c 0,20a 51,6 a 58,3 a 25,68a 6,4 bc 167,1b
Maíz 0,39 b - - - 20,56 3,9c 79,9b
Sorgo 0,47 a - - - 27,52 4,3c 117,8b
CV (%) 19,1 24,6 23,4 28,0 17,2 13,8 15,8
F50
CP - - - - - - -
TUC1 1,33b 1,11a 34,8a 44,3a 26,86a 7,5b 199,7a
LCP 0,99c 1,06a 41,2a 49,7a 24,88a 7,7a 188,5a
Maíz 1,69a - - - 18,52 5,0b 86,2b
Sorgo 1,97a - - - 23,25 6,7ab 156,9a
CV (%) 17,7 22,6 17,3 27,1 19,5 17,6 16,7
% N a.e:% de átomos en exceso de N; % Nda: % de N derivado de la atmósfera calculado con maíz y 2 sorgo
15 15 1
como cultivos controles. Los valores en cada columna seguidos por distinta letra difieren significativamente
(p<0,05) de acuerdo al test LSD 0.05. CV: coeficiente de variación (%).
a b
Figura 4. Aislamientos de bacterias endófitas a partir de medios semisólidos selectivos sin N. a y
b-Diferentes morfotipos y aislamientos obtenidos respectivamente.
Determinación de la capacidad Posteriormente a los aislamientos for-

de fijar nitrógeno por los madores de películas en medios semisó-
lidos sin N mencionados, se les evaluó la
aislamientos bacterianos
presencia del gen nifH por PCR, encon-
trándose 103 de los mismos positivos
Con este fin y en primera instancia,
(Figura 5d). La diversidad genómica de
toda la colección fue evaluada por su
los aislamientos nifH positivos fue anali-
capacidad de crecer en los medios semi-
zada por ERIC-PCR encontrándose 26
sólidos sin N: JNFb, LGI-P y LGI. Como
grupos diferentes con una similitud del
resultado de esa aproximación, 180 ais-
80%. De este último grupo, solo 12 ais-
lamientos fueron capaces de producir
lamientos mostraron la capacidad de re-
una película de crecimiento característi-
ducir el acetileno en los ensayos de ARA
co de bacterias diazótrofas (Figura 5a-c).
(Cuadro 4). Diversos estudios han repor-
a b c d
Figura 5. Búsqueda de aislamientos diazotróficas en la colección. a, b y c- Visualización de la altura de la
película de crecimiento de bacterias diazotróficas en medio semisólido sin N. a- película de
crecimiento superficial, b- película de crecimiento sub-superficial y c- película de crecimiento baja.
d- amplificación por PCR del gen nifH. Carriles: 1- Marcador de peso molecular: Generuler 1 Kb
Fermentas, 2-control negativo de la PCR, 3 al 5- aislamientos que amplificaron el gen nifH, 6-
aislamiento que no amplificó el gen nifH.
tado colecciones de endófitos que po- miembros de géneros diazotróficos típi-

seen el gen nifH pero sin embargo pre- camente asociados a caña de azúcar
sentan un bajo porcentaje de aislamien- (ej.: en Brasil), tales como Herbaspiri-
tos ARA-positivos (15). Una explicación llum, Gluconoacetobacter, Azospirillum
posible es que debido a la gran variedad o Burkholderia, todos los cuales perte-
de géneros bacterianos aislados, las con- necen a las Alfa o Betaproteobacterias
diciones empleadas en el ensayo de (30). Una explicación posible es que la
ARA no hayan sido las óptimas para la composición de la comunidad de endófi-
expresión de la nitrogenasa en muchos tos depende de la especificidad entre la
de los aislamientos. Asimismo puede bacteria y el genotipo de la planta, el
ser que los cebadores utilizados no sean clima, el tipo de riego así como los
los óptimos para poder detectar el gen niveles de fertilización utilizados (61). Es
nifH en una colección de aislamientos también de destacar que en el presente
tan diversa. trabajo, las bacterias fueron aisladas de
tallos de caña de azúcar y que los aisla-
mientos endófitos-asociativos menciona-
Identificación de los
dos anteriormente son más abundantes
aislamientos bacterianos y en las raíces (8,31–33,62).
análisis filogenético
Por otra parte, es interesante el hecho
Mediante la amplificación por PCR y de que aunque los posibles endófitos
secuenciación del gen 16S ARNr se iden- aislados fueron provenientes de plantas
tificaron en la colección, bacterias perte- saludables, algunos de los géneros iden-
necientes a los géneros Agrobacterium y tificados han sido reportados como fito-
Shinella (Alfaproteobacterias) y al géne- patógenos de otras especies vegetales
ro Achromobacter (Betaproteobacterias) como por ej. Agrobacterium tumefacien
(Cuadro 3). Sin embargo, el grupo más y Xanthomonas albilineans. Más aún,
numeroso y diverso de bacterias aisla- posibles patógenos de humanos también
das en el presente trabajo pertenece a fueron identificados, incluyendo Steno-
las Gammaproteobacterias, representa- trophomonas maltophila, Pseudomonas
do por los géneros Acinetobacter, Ente- putida y Enterobacter ludwigii (65, 66) sin
robacter, Pantoea, Pseudomonas, Rha- embargo y a pesar del potencial patogé-
nella, Stenotrophomonas y Xanthomo- nico de una minoría de los aislamientos,
nas (Cuadro 3 y Figura 7). Es importante varios de los géneros identificados en el
mencionar que mediante la metodología presente estudio han sido reportados
empleada en este trabajo, no se obtuvie- como endófitos PCV asociados a dife-
ron aislamientos correspondientes a rentes cultivos incluyendo, pero no ex-
Cuadro 3. Similitud de las secuencias nucleotídicos del gen 16s ARNr de los aislamientos bacterianos
endófitos de cultivares comerciales de caña de azúcar
Nº de acceso
Variedad de
Grupo Similitud en la base de
Aislamiento caña de Mejor candidato
ERIC (%) datos NCBI
azúcar
UYSO01 CP 92618 5 Achromobacter xylosoxidans strain X96 (HM137034) 99 JF262577

UYSO02 CP 92618 10 Alcaligenes sp. isolate 159 (AJ002804) 99 JF262578
UYSO03 TUC 7742 4 Acinetobacter sp. BMC-4 (GU451168) 99 JF262567
UYSO04 TUC 7742 26 Agrobacterium tumefaciens strain 30D (GQ337862) 99 JF262579
UYSO05 TUC 7742 17 Enterobacter sp. CY2W15 (HQ231936) 99 JF262584
UYSO06 LCP 85384 17 Enterobacter sp. CY2W15 (HQ231936) 99 JF262585
UYSO07 LCP 85384 17 Enterobacter sp. CY2W15 (HQ231936) 99 JF262586
UYSO08 TUC 7742 17 Enterobacter sp. CY2W15 (HQ231936) 99 JF262587
UYSO09 TUC 7742 19 Enterobacter ludwigii strain K9 (EF175735) 99 JF262588
UYSO10 FAM 8177 24 Enterobacter sp. HY241 (EU784139) 99 JF262582
UYSO11 TUC 7742 2 Pantoea ananatis strain pY2-2 (EU331415) 99 JF262565
UYSO12 LCP 85384 9 Pantoea sp. J1-13-7a (EU816766) 99 JF262566
UYSO13 CP 92618 7 Pantoea agglomerans strain BJCP2 (HM130693) 99 JF262564
UYSO14 TUC 7812 7 Pseudomonas sp. MW6 (HQ231962 ) 99 JF262570
UYSO15 TUC 7742 14 Pseudomonas sp. KW20 (HQ231956) 99 JF262571
UYSO16 TUC 7742 14 Pseudomonas sp. KW20 (HQ231956) 99 JF262572
UYSO17 LCP 85384 25 Pseudomonas sp. GXSCRI B5 (DQ666336) 100 JF262568
UYSO18 LCP 85384 25 Pseudomonas sp. GXSCRI B5 (DQ666336) 100 JF262569
UYSO19 FAM 8177 27 Pseudomonas sp. DK2009-3a (FN600406) 100 JF262574
UYSO20 FAM 8177 N.D. Pseudomonas fluorescens S16 (DQ095904) 99 JF262575
UYSO21 FAM 8177 N.D. Pseudomonas fluorescens LMG 14675 (GU198125) 99 JF262576
UYSO22 TUC 7742 4 Rahnella sp. Pc201 (EU333141) 99 JF262562
UYSO23 TUC 7742 11 Rahnella sp. Pc201 (EU333141) 99 JF262563
UYSO24 TUC 7742 N.D. Shinella sp. CTN-13 (FJ598327) 99 JF262583
UYSO25 TUC 7812 1 Stenotrophomonas maltophilia strain PSM-6 (GQ267817) 99 JF262559
UYSO26 LCP 85384 3 Stenotrophomonas maltophilia strain PSM-6 (GQ267817) 100 JF262555
UYSO27 TUC 7812 3 Stenotrophomonas maltophilia strain PSM-6 (GQ267817) 99 JF262558
UYSO28 LCP 85384 8 Stenotrophomonas maltophilia strain PSM-6 (GQ267817) 99 JF262556
UYSO29 CP 92618 12 Stenotrophomonas maltophilia strain PSM-6 (GQ267817) 99 JF262560
UYSO30 FAM 8177 13 Stenotrophomonas sp. I_Gauze_K_8_5 (FJ267572) 99 JF262561
UYSO31 TUC 7742 15 Stenotrophomonas sp. DNPA8 (FJ404810) 100 JF262573
UYSO32 LCP 85384 N.D. Stenotrophomonas maltophilia strain PSM-6 (GQ267817) 99 JF262557
UYSO33 TUC 7742 N.D. Stenotrophomonas maltophilia strain PSM-6 (GQ267817) 100 JF262554
UYSO34 LCP 85384 18 Stenotrophomonas chelatiphaga strain G-7 (FJ493060) 100 JF262580
UYSO35 TUC 7742 22 Xanthomonas sp. Aed03 (EU740995) 100 JF262581
Figura 6. Árbol filogenético de los aislamientos pertenecientes a las Alfa y Betas-proteobacterias basado
en secuencias del gen 16S ARNr. El árbol fue construido con el programa Mega4 (81) usando el
algoritmo de Neighbour-joining (67) y empleando el modelo de sustitución de Kimura de dos
parámetros. La robustez de cada rama fue estimada con un boostrap de 1000 replicas (73). La cepa
de referencia Bacillus subtillis (HQ536002.1) se usó como grupo externo.
clusivamente a la caña de azúcar (65, tobacter. Miembros de estos géneros

66). han sido extensamente reportado como
Árboles filogenéticos fueron construi- PCV, así como probables endófitos-dia-
dos en base a la secuencia del gen 16S zótrofos asociados a plantas de algodón
ARNr para las Alfa, Betaproteobacterias y caña de azúcar (15,41,85). En particu-
y las Gammaproteobacterias (Figura 6 y lar, A. baumanni LMG 1041, la cual fue
7 respectivamente). aislada como probable endófitas asocia-
da a soja, posee varias potenciales ca-
Los resultados mostraron que la clase racterísticas PCV (36).
más abundante y diversa en la colección
fueron las Gammaprotebacterias. Dentro Finalmente, el orden de las Xantho-
del orden Enterobacteriales, Pantoea, monadales, perteneciente a las Gamma-
Enterobacter, Rhanella y Serratia spp. proteobacteria, estuvo representado por
han sido previamente reportadas como el género Stenotrophomonas y Xantho-
endófitos y/o asociadas a varios cultivos monas. Como se mencionó anteriormen-
de Poaceas. Por ejemplo, especies de te, aislamientos relacionados a S. malto-
Pantoea fueron descriptas como diazó- phila fueron identificados en la colección.
trofos asociados a caña de azúcar y maíz Dicha cepa fue reportada en primera ins-
(45,47), así como endófitos de arroz (90). tancia como patógeno humano, sin em-
Particularmente, especies pertenecien- bargo recientemente también ha sido
tes al género Enterobacter han sido fre- reportada como PCV de diversos cultivos
cuentemente aisladas como endófitos de importancia agronómica (28). Más
asociados a varios plantas (65) y varias aún y de particular importancia para este
han sido reportadas como PCV de caña trabajo, la cepa S. pavanii LMG25348,
de azúcar (46). Por su parte la bacteria fue descripta como probable endófito-
Rhanella aquatilis es conocida por su diazótrofo de caña azúcar (59). En el
capacidad biocontroladora de patógenos caso de las Xanthomonas y aunque X.
en plantas de manzanas y tomates (9) y ha albilineans es un conocido patógeno
sido reportada como FBN en la rizósfera de endófito causante de la enfermedad de la
maíz y trigo (3) así como un posible endó- escaldadura de la hoja en plantas de
fito de plantas de algodón (15). caña de azúcar (33), diversas cepas no-
patogénicas han sido también aisladas
El orden Pseudomonadales de las de suelos y plantas como probables en-
Gammaproteobacterias está también re- dófitos (65).
presentado en la colección, habiéndose
identificado los aislamientos pertenecien- En este trabajo, la clase Betaproteo-
tes a los géneros Pseudomonas y Acine- bacteria está representada por las cepas
Figura 7. Árbol filogenético de los aislamientos pertenecientes a las Gama-proteobacterias

basado en secuencias del gen 16S ARNr. El árbol fue construido con el programa
Mega4 (81) usando el algoritmo de Neighbour-joining (67) y empleando el modelo
de sustitución de Kimura de dos parámetros. La robustez de cada rama fue
estimada con un boostrap de 1000 replicas (73). La cepa de referencia Bacillus
subtillis (HQ536002.1) se usó como grupo externo.
pertenecientes al género Achromobac- aislamientos que presentaron el gen nifH,
ter, algunas de las cuales han sido des- 21 fueron capaces de solubilizar fosfa-
criptas previamente como probables en- tos, 65 de producir AIA y 10 de producir
dófitos asociados a plantas de citrus y sideróforos (Cuadro 4 y Figura 8).
girasol (65). La producción de fitohormonas como
Los pocos aislamientos de las Alpha- el AIA por bacterias y sus efectos bené-
proteobacteria obtenidos pertenecieron ficos en la promoción del crecimiento
a los géneros Agrobacterium y Shinella. vegetal, ha sido extensamente reportado
Aunque Shinella no ha sido reportada (71,72). Por su parte bacterias solubili-
previamente como endófito, la cepa S. zadoras de fósforo y hierro juegan un
kummorowiae posee el gen nifH y se importante rol en las interacciones plan-
aisló recientemente a partir de nódulos, ta-microorganismo así como en el bio-
describiéndose como una posible bacte- control de fitopatógenos (64,72,89). El
ria simbionte (39). Por su parte y aunque poder disponer de una colección bacte-
el género Agrobacterium es bien conoci- riana que posea diferentes característi-
do por contener ejemplares fitopatóge- cas PCV, es esencial para el desarrollo
nos, algunas cepas han sido descriptas de bioinoculantes efectivos en cultivos
como fijadoras de N en vida libre, así agronómicamente importantes, como lo
como en simbiosis con leguminosas (34). es la caña de azúcar. Aquellas cepas
Asimismo cepas del género Agrobacte- que posean una o alguna de ellas serán
rium han sido también aisladas como pro- candidatos muy prometedores para futu-
bables endófitos de plantas de álamo (85). ros experimentos de promoción del cre-
cimiento vegetal.
Estudio de la capacidad de la
colección de endófitos- Caracterización fisiológica de
diazótrofos de producir los aislamientos: capacidad de
metabolitos con actividad crecer en diferentes fuentes de
promotora del crecimiento C, N y determinación de la
vegetal resistencia intrínseca a
antibióticos
Con la finalidad de evaluar la presen-
cia de posibles características promoto- Para esta caracterización, se selec-
ras del crecimiento vegetal en la colec- cionaron las cepas Achromobacter sp.
ción de probables endófitos nativos aso- UYSO02, Acinetobacter sp. UYSO03,
ciados a caña de azúcar, los aislamien- Enterobacter sp. UYSO10, Panotea sp.
tos nifH positivos fueron seleccionados UYSO13, Pseudomonas sp. UYSO21,
para ensayar la habilidad de solubilizar Rhanella sp. UYSO22, Shinella sp.
fosfatos, de producir ácido-indol acético UYSO24 y Stenotrophomonas sp.
así como de sideróforos (Cuadro 4). Los UYSO27, teniendo en cuenta sus carac-
resultados mostraron que de los 103 terísticas PCV observadas in vitro.
a b c
Figura 8. Características PCV en los aislamientos de la colección. a- ensayo colorimétrico de Sarkowski para
evaluar la producción de AIA, un aislamiento positivo presenta coloración roja en el pocillo de la placa.
b- ensayo de solubilización de fosfatos, un aislamiento positivo presenta un halo translúcido
alrededor de la colonia bacteriana. c- ensayo de sideróforos, un aislamiento positivo presenta un
halo amarillo alrededor de la colonia bacteriana.
Cuadro 4. Características PCV de los aislamientos nativos endofíticos asociados a variedades
comerciales de caña de azúcar
Producción Solubilización Producción de
Variedad de
Grupo de IAA de fosfatos sideróforos
Aislamiento caña de ARA
ERIC (µg/ml) (relación (relación
azúcar
halo/colonia) halo/colonia)
UYSO02 CP 92618 10 - 14,7 2,1 -

UYSO03 TUC 7742 4 + 10,0 2,7 1,9
UYSO05 TUC 7742 17 - 17,0 - -
UYSO06 LCP 85384 17 - 15,6 1,8 -
UYSO07 LCP 85384 17 - 16,8 N.D.
UYSO08 TUC 7742 17 - 13,4 - -
UYSO09 TUC 7742 19 - - 1,9 -
UYSO10 FAM 8177 24 + 10,7 - -
UYSO11 TUC 7742 2 - 16,8 3,0 2,4
UYSO12 LCP 85384 9 - 19,8 - 2,1
UYSO13 CP 92618 7 - 13,9 2,3 -
UYSO14 TUC 7812 7 + - - -
UYSO15 TUC 7742 14 - - - 1,6
UYSO16 TUC 7742 14 - 14,8 - 1,4
UYSO17 LCP 85384 25 - 16,0 - -
UYSO18 LCP 85384 25 - 17,2 - N.D.
UYSO19 FAM 8177 27 + - 1,6 1,9
UYSO20 FAM 8177 N.D. - 22,6 - -
UYSO21 FAM 8177 N.D. + 13,0 - 1,7
UYSO22 TUC 7742 4 + 41,1 1,1 -
UYSO23 TUC 7742 11 + 35,6 - -
UYSO24 TUC 7742 1 + 11,4 - -
UYSO25 TUC 7812 1 - 6,9 - -
UYSO26 LCP 85384 3 - 6,9 - -
UYSO27 TUC 7812 3 + 13,7 - -
UYSO28 LCP 85384 8 - 16,2 - 1,9
UYSO29 CP 92618 12 - 31,8 - -
UYSO30 FAM 8177 13 + - - -
UYSO32 LCP 85384 N.D. - 17,6 - -
UYSO33 TUC 7742 N.D. - 7,6 2,9 -
UYSO34 LCP 85384 18 - - - 3,2
UYSO35 TUC 7742 23 - - - 2,8
Gluconacetobacter diazotrophicus
+ 31,9 N.D. N.D.
PAL5
Herbaspirillum seropedicae H54 + 15,4 N.D. N.D.
Burkholderia tropica PP8 + 0 5,0 N.D.
Azospirillum amazonensis CBAMC + N.D. N.D. N.D.
Sinorhizobium meliloti 1021 N.D. N.D. N.D. 2,2
Crecimiento en diferentes fuentes de Resistencia intrínseca a antibióticos
carbono y nitrógeno
La resistencia intrínseca a antibióti-
Las bacterias suelen presentar dife- cos fue evaluada en los aislamientos
rentes requerimientos de fuentes de C y mencionados. El poseer resistencia a
N para su crecimiento. En particular, en uno o más antibióticos les confiere a las
el estudio de bacterias promotoras del bacterias, ventajas competitivas con res-
crecimiento vegetal, dicha información pecto a otras cepas, además de ser una
es muy útil para delinear las estrategias herramienta experimental importante para
para su aplicación biotecnológica, como el desarrollo de protocolos. Esta resis-
por ejemplo la selección de en qué me- tencia se estudió para 4 antibióticos:
dios de cultivos es mas viable, desde el kanamicina (Km), estreptomicina (Str),
punto de vista industrial, crecer los aisla- espectinomicina (Spc) y ampicilina (Amp)
mientos. Los resultados de estas evalua- a diferentes concentraciones. Dichos
ciones se resumen en el Cuadro 5, en la antibióticos fueron seleccionados debido
misma se observa que las cepas ensaya- a que todos actúan sobre bacterias Gram
das, presentaron similar crecimiento en negativas y pertenecen a diferentes gru-
las diferentes fuentes de C y N evalua- pos de antibióticos: la kanamicina y es-
das. Sin embargo, la sacarosa y la gluco- treptomicina son antibióticos del grupo
sa (a 5g/l) y los aminoácidos L-tirosina, de los aminoglucósidos, la espectinomi-
L-asparagina y L-ácido glutámico, así cina de los glicopéptidos y la ampicilina
como el NH4Cl; fueron las fuentes más de los betalactámicos.
utilizadas de C y N respectivamente. Los resultados obtenidos se resumen
Cuando se ensayaron la sacarosa y Acnr en el Cuadro 6, donde se puede observar
en concentraciones de 100 y 200g/l, se que todas las cepas mostraron resisten-
observó que en ambas concentraciones la cia a la ampicilina y a la espectinomici-
sacarosa fue la más utilizada (Cuadro 5). na, siendo en el primero donde se obser-
En general, todas las cepas presenta- varon mayores niveles de resistencia,
ron alta versatilidad en la utilización de con valores superiores a 1000mg/l. Por
las fuentes de C y de N (Tabla 5). Por su su parte, las cepas Acinetobacter sp.
parte la cepa de referencia, G. diazotro- UYSO03, Enterobacter sp. UYSO10,
phicus PAl-5 fue la única que no utilizó el Pantoea sp. UYSO13 y Pseudomonas
ácido málico como fuente de C. Todas sp. UYSO21, no mostraron resistencia a
las cepas presentaron un máximo creci- la estreptomicina ni a la kanamicina,
miento en la fuente de C de donde fueron mientras que Achromobacter sp. UYSO02
aisladas (ácido málico y sacarosa), con y Shinella sp. UYSO24, no fueron capa-
la excepción de la cepa Stenotrophomo- ces de crecer en presencia de kanamici-
nas sp. UYSO27. Asimismo y si bien, la na únicamente. Más detalladamente,
mayoría de las cepas presentaron valo- Rhanella sp. UYSO22 y Stenotrophomo-
res similares de crecimiento en las fuen- nas sp. UYSO27, mostraron resistencia
tes de C y N ensayadas, Stenotrophomo- a 450mg/l de estreptomicina; Pseudo-
nas sp. UYSO27 presentó un crecimien- monas sp. UYSO21, Rhanella sp .
to notoriamente menor y uniforme al res- UYSO22, Shinella sp. UYSO24, Steno-
to (Cuadro 5). Una característica impor- trophomonas sp. UYSO27, resistieron
tante de resaltar, es que todas las cepas concentraciones de 1000mg/l de ampici-
crecieron en glicerol y Acnr, las cuales lina; Rhanella sp. UYSO22 y Stenotro-
son fuentes económicas de C y accesi- phomonas sp. UYSO27, presentaron re-
bles en nuestro país, lo que se señala sistencia a concentraciones de 650mg/l
como propiedad positiva a tener en cuen- de kanamicina; mientras que las cepas
ta en la formulación de medios de cultivo Rhanella sp. UYSO22 y Stenotrophomo-
bacterianos a escala industrial. Por otro nas sp. UYSO27, mostraron resistencia
lado, fue notorio la producción de una en 800mg/l de espectinomicina. Por lo
sustancia gomosa en el medio de cultivo tanto, las cepas Rhanella sp. UYSO22 y
(probablemente exopolisacáridos), de las Stenotrophomonas sp. UYSO27, no solo
cepas Enterobacter sp. UYSO10 y Rha- presentaron resistencia intrínseca a todos
nella sp. UYSO22 en comparación a las los antibióticos, sino que lo hicieron en las
restantes cepas (Cuadro 5). mayores concentraciones evaluadas.
Cuadro 5. Caracterización bioquímica de aislamientos seleccionados de la colección
Aislamientos ensayados
UYSO02 UYSO03 UYSO10 UYSO13 UYSO21 UYSO22 UYSO24 UYSO27 PAL-5
Fuentes de C
Sacarosa
++ ++ ++* ++ ++ ++* ++ + ++
(5 g/l)
Sacarosa
+ ++ ++* ++ ++ ++* ++ + ++
(100 g/l)
Sacarosa
+ + +* ++ + ++* + + ++
(200 g/l)
Glucosa ++ ++ ++* ++ ++ ++ ++ + ++
Glicerol ++ + ++* ++ ++ ++* ++ + ++
Ácido
málico ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + -
(5 g/l)
Manitol + + ++* ++ ++ ++* ++ + ++
Acnr (5 g/l) + + +* + + + + + +
Acnr
+ ++ ++* ++ ++ ++ + + ++
(100 g/l)
Acnr
+ + +* + + + + + ++
(200 g/l)
Fuentes de N (5 mM)
NH4Cl ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++
L-Tyr ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++
L-Asn ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++
L-Glu ++ ++ ++* ++ ++ ++* ++ + ++
(NH4)2SO4 ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + ++
KNO3 + ++ ++ ++ ++ ++* ++ + ++
Acnr: azúcar de caña no refinada, (NH4)2SO4: sulfato de amonio, KNO3: nitrato de potasio, NH4Cl: cloruro de
amonio, L-Tyr: L-tirosina, L-Asn: L-asparagina, L-Glu: L-ácido glutámico. (-): sin crecimiento; (+): colonias
aisladas en la estría; (++): crecimiento continuo sin colonias aisladas. (*): formación de sustancia gomosa
en el medio de cultivo.
Cuadro 6. Resistencia intrínseca a antibióticos de las cepas bacterianas

Antibióticos ensayados (mg/l)
Aislamientos Str Amp Km Spc
Achromobacter sp. UYSO02 1/20* 250/300* 0 150/200*
Acinetobacter sp. UYSO03 0 100/150* 0 100/150*
Enterobacter sp. UYSO10 0 45/50* 0 15/20*
Pantoea sp. UYSO13 0 50/100* 0 10/20*
Pseudomonas sp. UYSO21 0 >1000** 0 150/200*
Rhanella sp. UYSO22 >450** >1000** >650** >800**
Shinella sp. UYSO24 40/50* >1000** 0 300/350*
Stenotrophomonas sp. UYSO27 >450** >1000** >650** >800**
G. diazotrophicus PAl-5 50/100* 200/250* 40/50* 50/100*
Str: estreptomicina, Amp: ampicilina, Km: kanamicina, Spc: espectinomicina. (0): No
resistente, (*)Resistente/NO resistente. (**)Resistente a concentraciones mayores. En
negrita se destacan los valores mayores.
Evaluación del crecimiento géneros bacterianos a los que pertene-

vegetal en invernáculo en cen. Como referencia se utilizó la cepa
Gluconacetobacter diazotrophicus Pal5
respuesta a la inoculación con
y como control negativo se utilizaron
bacterias endófitas-diazótrofas plantas sin inocular. Los resultados ob-
tenidos para las variables biométricas
En plantas de cañas de azúcar medidas se presentan en la Figura 9 y en
el Cuadro 7. Como se observa en la
micropropagadas de la variedad LCP
misma, los tratamientos inoculados con
85-384
Enterobacter sp. UYSO10 y Shinella sp.
En este ensayo, los aislamientos UYSO24 se diferenciaron significativa-
Enterobacter sp. UYSO10, Pantoea sp. mente (p<0,05) del control negativo para
UYSO13, Rahnella sp.UYSO22, Acine- las variables: peso seco aéreo y diámetro
tobacter sp. UYSO03, Pseudomonas sp. del tallo. En cuanto al peso seco radicu-
UYSO21 y Shinella sp. UYSO24, fueron lar Shinella sp.UYSO24 y Acinetobacter
seleccionados de acuerdo a sus caracte- sp. UYSO03 mostraron diferencias signi-
rísticas PCV in vitro, así como a los ficativas con el control. Por otro lado y
con el fin de determinar si habían diferen-
cias en el crecimiento de la planta se
calculó la relación peso seco aéreo/peso
a seco radicular. Los análisis mostraron
que no existieron diferencias significati-
vas entre los tratamientos ensayados
(datos no mostrados). Por último, cuan-
do se evaluó la altura de los tratamientos,
se observó que las cepas Enterobacter
sp. UYSO10, Shinella sp. UYSO24, Pan-
toea sp. UYSO13, Rahnella sp. UYSO22,
el MIX de aislamientos y Gluconaceto-
bacter diazotrophicus Pal5 se diferen-
cian significativamente del control (Cua-
dro 7). Es de resaltar que el tratamiento
inoculado con la cepa Shinella sp.
UYSO24 mostró diferencias significativas
con el control para todas las variables
b medidas y que la cepa Enterobacter
sp.UYSO10 para tres de ellas (Cuadro 7).
Varios estudios realizados en plantas
de caña de azúcar inoculadas con bacte-
rias aisladas de los mismos cultivos han
mostrado un efecto promotor del creci-
miento vegetal dependiendo, en ciertas
ocasiones, de la especificidad genotipo
planta-genotipo bacteria. Este hecho jus-
tificó la creación de una colección de
bacterias adaptadas a las variedades y a
las condiciones de plantación del cultivo
en Uruguay, así como a la evaluación de
las mismas como promotoras del creci-
miento de las variedades de caña de
Figura 9. Vista del ensayo de PCV de plantas de cañas de azúcar utilizadas en el país. En los pun-
azúcar micropropagadas de la variedad LCP-85- tos anteriores se describió la generación
384, inoculadas con diferentes aislamientos de
de una colección de bacterias aisladas a
interés. De izquierda a derecha: plantas inoculadas
partir de cultivos de caña cultivadas en
con Gluconacetobacter diazotrophicus Pal5,
nuestro país y su caracterización en
aislamientos ensayados ( a-Enterobacter sp.
UYSO10 y b-Shinella sp. UYSO24) y control negativo búsqueda de capacidades PCV in vitro.
sin inocular. En el presente estudio la estrategia adop-
Cuadro 7. Respuestas de plantas micropropagadas de la variedad LCP 85-384, a la
inoculación con aislamientos seleccionados
Variables evaluadas
Tratamiento Peso seco (g) Diámetro Altura
Aéreo Radicular (cm)* (cm)*
Control 0,72 a** 1,29 a 5,09 a 8,14 a
Pseudomonas sp. UYSO14 0,93 a 1,75 ab 5,36 ab 9,04 ab
Pantoea sp. UYSO13 0,97 ab 1,82 abc 5,29 ab 10,34 bcd
Acinetobacter sp. UYSO03 1,08 abc 1,93 bc 5,77 ab 9,64 abc
Rhanella sp. UYSO22 1,09 abc 1,71 ab 5,97 ab 10,14 bcd
Gluconacetobacter diazotrophicus Pal5 1,10 abc 1,75 ab 5,97 ab 10,73 cd
MIX 1,11 abc 1,85 abc 5,7 ab 10,42 bcd
Enterobacter sp. UYSO010 1,46 c 1,6 ab 6,4 b 10,18 bcd
Shinella sp. UYSO024 1,37 bc 2,34 c 6,19 b 11,13 d
MIX: Tratamiento que incluye la mezcla de las 6 cepas ensayadas en este estudio. *Los datos
fueron transformados para cumplir los requisitos para aplicar el test de ANAVA. **Letras
diferentes muestran diferencias significativas aplicando el test de Tukey con un p<0,05.
tada para la evaluación de bacterias se- comparación de variables biométricas de

leccionadas por sus características PCV la planta se observó que, las cepas Ente-
in vitro, fue la inoculación de plantas de robacter sp. UYSO10 y Shinella sp.
caña de azúcar en sistemas asépticos y UYSO24 promovieron significativamente
controlados de laboratorio, proyectando el crecimiento de las plantas. Ambas
sentar la base para futuros ensayos en cepas mostraron, in vitro, la capacidad
sistemas más complejos. Las condicio- de reducir acetileno y producir acido in-
nes de inoculación de plantas de caña de dol-acético bajo las condiciones ensaya-
azúcar micropropagadas con el objetivo das. In vivo promovieron el incremento
de favorecer la colonización endofiticas, del peso seco de la parte aérea así como
fue descripta y optimizada para Glucona- el diámetro y altura del tallo con respecto
cetobacter diazotrophicus Pal5 (32,63). al control y en el caso de Shinella se
Posteriormente, en diversos estudios se observó además, un incremento en el
ha evaluado los efectos PCV de bacte- peso seco radicular. Si bien se observa-
rias asociadas o endófitas sobre plantas ron diferencias en el efecto causado por
micropropagadas así como su distribu- la inoculación de bacterias PCV a los 4
ción en los tejidos de la planta (48,51,71). meses, no debemos descartar que los
Normalmente en los ensayos de PCV, mismos se potencien o aparezcan nue-
las plantas son inoculadas en la etapa de vos efectos a mayores tiempos de cose-
micropropagación para después ser trans- cha como ha sido reportado (51). Aisla-
feridas a maceta de forma de permitir el mientos pertenecientes al género Ente-
desarrollo de la misma. Dependiendo de robacter han sido reportados por su efec-
los objetivos planteados las macetas se to PCV en ensayos de inoculación de
mantienen hasta su cosecha en el inver- plantas de arroz y en el álamo de Virginia
náculo o se considera ésta una etapa de (35,80). Particularmente en el caso de
aclimatación, cuando el destino final es cañas de azúcar micropropagadas, se
su plantación en el campo (21,53). Utili- ha reportado que la inoculación con ce-
zando la metodología recomendada en la pas pertenecientes al género Enterobac-
bibliografía, los aislamientos menciona- ter resultó en la PCV de la planta y la
dos, fueron evaluados en invernáculo y incorporación a los tejidos vegetales de
comparados con la cepa de referencia G. N proveniente de la FBN calculado en un
diazotrophicus Pal5, así como con un 28% (46). En el caso del género Shinella,
control sin inocular. La cosecha del en- este es el primer estudio en que se
sayo se realizó a los 4 meses post- describe como bacteria PCV en asocia-
inoculación y a partir de la medición y ciones no-simbióticas.
En plantas de cañas de azúcar donde se utilizaron inóculos bacteria-
crecidas a partir de esquejes de la nos, muchos de los mismos consiguie-
variedad LCP 85-384 ron diferenciarse del tratamiento control
negativo. Si analizamos la variable altura
Con el fin de evaluar el efecto de la se observa que todos los tratamientos a
inoculación de plantas de caña de azúcar excepción de la inoculación con Pseudo-
con aislamientos bacterianos en un sis- monas sp. UYSO21 se diferenciaron sig-
tema no estéril, se realizó un ensayo en nificativamente del control negativo. Con
invernáculo utilizando esquejes de la va- referencia al diámetro del tallo de las
riedad LCP-85-384, plantados en mace- plantas, solamente los tratamientos ino-
tas, conteniendo suelo de la zona donde culados con Acinetobacter sp. UYSO03
se cultiva caña de azúcar y arena estéril y con Enterobacter sp. UYSO10 se dife-
(1:1). Para esto ocho aislamientos fue- renciaron del control negativo. Por su
ron seleccionados de acuerdo a sus parte, cuando se evaluó el peso seco
características PCV, incluyéndose tam- radicular se observó que todos los trata-
bién, un tratamiento en el cual se inoculó mientos, a excepción del MIX, presenta-
conjuntamente las 8 cepas a ensayar ron diferencias significativas con el con-
(MIX), así como un tratamiento de refe- trol negativo. En particular, es interesan-
rencia donde se inoculó G. diazotrophi- te destacar que aquellos tratamientos en
cus Pal5. Como control negativo se utili- los que se inoculó la cepa Achromobac-
zaron esquejes sin inocular y sin el agre- ter sp. UYSO02, Enterobacter sp.
gado de fertilizante y como positivo es- UYSO10, Pseudomonas sp. UYSO21 y
quejes a los que se les agregó fertilizante Rahnella sp. UYSO22, no presentaron
químico nitrogenado (100 kgN/ha). El diferencias con el control positivo (fertili-
resumen de los resultados obtenidos se zado con N). En cuanto al peso seco
muestra en el Cuadro 8. Como se obser- aéreo, todos los tratamientos a excep-
va, en todas las variables ensayadas, los ción de Achromobacter sp. UYSO02 y
tratamientos mostraron diferencias sig- Pseudomonas sp. UYSO21, presenta-
nificativas con respecto al control positi- ron diferencias significativas con el con-
vo, confirmando así el efecto promotor trol negativo. Por otro lado, se observa
del agregado de dicho nutriente (N) a la que todas las cepas inoculadas presen-
planta. En cuanto a los tratamientos taron en promedio un 36% de incremento
Cuadro 8. Respuesta de esquejes de plantas de azúcar de la variedad LCP-85-384, a la inoculación con

aislamientos seleccionados
Variables evaluadas
Peso seco (g) [N] parte Acumulación
Tratamientos Diámetro
Altura aérea de N parte
tallo
(cm) Parte (mg aérea (mg
(mm) Raíz
aérea N/peso N/planta)
seco)
Control nitrogenado (+) 22,20a 9,06a 1,83a 4,56a 7,06 a 32,17 a
Pantoea sp UYSO13 16,86b 7,19cd 1,45bcd 2,92b 4,98 ef 14,55 bcd
Achromobacter sp. UYSO02 16,44b 7,56bcd 1,48abc 2,24cde 5,11 def 11,44 ef
MIX 16,43b 7,38bcd 1,10de 2,59bcd 5,09 ef 13,18 de
Stenotrophomonas sp. UYSO27 16,36b 7,03d 1,27cd 2,72bc 5,17 cdef 14,07 d
Shinella sp. UYSO24 16,25b 7,25cd 1,35bcd 2,67bcd 6,10 bc 16,28 bc
Acinetobacter sp. UYSO03 16,25b 7,99b 1,38bcd 2,64bcd 4,89 f 12,90 de
G. diazotrophicus Pal5 16,19b 7,41bcd 1,27cd 2,43bcd 6,84 ab 16,61 b
Enterobacter sp. UYSO10 16,00b 7,72bc 1,67ab 2,36cd 6,06 bcd 14,30 cd
Rhanella sp. UYSO22 15,57bc 7,58bcd 1,63abc 2,67bcd 5,10 cdef 13,86 d
Pseudomonas sp.UYSO21 14,43cd 7,12cd 1,48abc 2,15de 6,17 ab 13,25 de
Control (-) 13,19d 6,97d 0,75e 1,79e 5,90 bcde 10,57 f
Los valores en cada columna seguidos por distinta letra difieren significativamente (p< 0,05) de acuerdo
al test LSD Fisher.
en la acumulación de N de la parte aérea de 109 ufc/g de turba, aumentando a los
con respecto al control negativo. Asimis- 30 días un orden (1010 ufc/g), disminuyen-
mo, las cepas Shinella sp. UYSO24, G. do posteriormente a 109 ufc/g y mante-
diazotrophicus Pal5, Enterobacter sp. niéndose así hasta los 120 días. Para el
UYSO10 y Pseudomonas sp. UYSO21 caso de la cepa UYSO24, a tiempo 0 se
presentaron en promedio un 6% de incre- obtuvo un valor del orden de 1010 ufc/g de
mento en la concentración de N de la parte turba, aumentando a los 7 días a 1012 ufc/
aérea con respecto al control negativo. g, disminuyendo a 1010 ufc/g hasta los 90
En resumen, la inoculación con las días y a 109 ufc/g a los 120 días. Estos
diferentes bacterias mostraron un efecto resultados indican que las dos cepas bac-
promotor del crecimiento vegetal en va- terianas tuvieron una buena sobrevivencia
rias de las características evaluadas. En en turba durante los días evaluados, siendo
particular cabe resaltar que la inocula- este sustrato factible de ser usado para los
ción con la cepa Enterobacter sp. experimentos de campo así como para la
UYSO10 se diferenció del control negati- formulación futura de un bioinoculante.
vo en las 6 variables evaluadas. Los Por otra parte, se evaluó en un esque-
tratamientos que mostraron diferencias je inoculado con cada cepa (de acuerdo
al menos en 5 variables fueron: Shinella al procedimiento realizado en campo) y
sp. UYSO24 y G. diazotrophicus Pal5. en un esqueje no inoculado, el número de
Ambas cepas presentaron los mayores bacterias/superficie de esqueje. Los re-
valores de concentración y acumulación sultados mostraron que los esquejes ino-
de N en la parte aérea luego del control culados presentaron 105 ufc/cm2 de tallo,
positivo. Estos resultados apoyan los mostrando únicamente un tipo de colo-
obtenidos en el ensayo de micropropaga- nia, mientras que los tallo sin inocular
ción, mostrando a su vez el efecto PCV presentaron 104 ufc/cm2 de tallo, obser-
de más cepas. Los mismos son muy vándose varias colonias en la placa. Es-
importantes ya que en este sistema, que tos resultados estarían mostrando un
no es estéril, las cepas deben competir efecto marcado de la inoculación sobre
por la colonización con las bacterias que la comunidad bacteriana del esqueje.
ya se encuentran en el suelo y la rizósfe- En el Cuadro 9 se muestran un resu-
ra, así con las que se encuentran en los men de los resultados obtenidos para las
esquejes de la planta. medidas biométricas determinadas para
el ensayo de campo a los 3, 8 y 12
Ensayos de campo de meses. Como se observa en la misma,
promoción del crecimiento no hubieron diferencias significativas entre
los diferentes tratamientos en el peso
vegetal de la mejor combinación
seco y %N-total de la parte aérea de la
bacteria-variedad determinada planta a los 3, 8 y 12 meses de instalado
en los ensayos de invernáculo el ensayo. Asimismo, no se observaron
diferencias en la concentración de N/
En condiciones de campo, se estudió peso seco entre los tratamientos, pero si
la respuesta de plantas de cañas de se observaron diferencias en la acumula-
azúcar de la variedad LCP-85-384, a la ción de N/planta entre Enterobacter sp.
inoculación con los aislamientos Shine- UYSO10 y ambos controles. En la varia-
lla sp. UYSO24 y Enterobacter sp. ble altura de la planta, se observó que el
UYSO10 seleccionados por su capaci- control negativo fue quien obtuvo un valor
dad de PCV en los ensayos de invernácu- mayor a los restantes tratamientos, dife-
lo. Para esto, en primera instancia se renciándose significativamente del trata-
evaluó la abundancia y sobrevivencia de miento inoculado con Enterobacter sp.
las cepas inoculadas en el sustrato utili- UYSO10. Por el contrario, en el número
zado como inoculante. Para cada cepa de hojas, Enterobacter sp. UYSO10 pre-
se determinó las unidades formadoras de sentó un mayor valor, diferenciándose
colonia en el inoculante (ufc/g de turba), significativamente del tratamiento con-
a los 0, 7, 30, 60, 90 y 120 días después trol negativo y del inoculado con Shinella
de inoculada la turba. Los resultados sp. UYSO24. Por otra parte, en el mo-
mostraron que para el caso de la cepa mento de la cosecha del ensayo (12
UYSO10, a tiempo 0 se detectó un orden meses) se evaluaron 11 variables (ver
Cuadro 9. Respuestas de esquejes de plantas de caña de azúcar de la variedad LCP-85-384, a la inoculación
con aislamientos seleccionados en condiciones de campo
Variables evaluadas
3 meses 8 meses 12 meses
% N-total [N] parte Acumulación de % N-total

Tratamiento Peso seco Altura N° % N-total
parte aérea (mg N parte aérea
parte aérea tallo (m) hojas parte aérea parte aérea
aérea N/peso
(g) (mg N/planta)
seco)
Enterobacter sp.
UYSO10 22,92 a 0,90 b 12,00 a 1,89 a 18,85 a 432,04 a 1,58 a 0,59 a
Shinella sp. 21,24 a 0,97 ab 10,00 c 1,76 a 17,55 a 372,76 ab 1,58 a 0,61 a
UYSO24
(C+) 17,67 a 0,93 ab 11,33 ab 2,01 a 20,08 a 354,73 b 1,63 a 0,57 a
(C-) 17,07 a 1,04 a 10,33 bc 1,93 a 19,28 a 329,02 b 1,57 a 0,59 a
12 meses
%N TAH
Altura LARCAÑ NTH RIT
ENTR PT total TCH (t FIB DIATINT
Tratamiento tallo A (nº (% de
(nº) (g) parte (t/ha) azúca (%) (%daño)
(m) (cm) tallo/ha) azúcar)
aérea r/ha)
Enterobacter
sp. UYSO10 2,10 a 14,32 a 430,66 a 118,75 a 0,59 a 126,68 a 54,57 a 11,25 a 6,14 a 13,25 a 4,35 a
Shinella sp. 2,10 a 15,00 a 468,51 a 122,75 a 116,00 a 54,09 a 11,25 a 6,14 a 13,63 a 2,08 a
0,61 a
UYSO24
C+ 2,10 a 14,88 a 426,22 a 123,5 a 0,57 a 128,49 a 54,69 a 11,16 a 6,12 a 13,85 a 1,85 a
C- 2,08 a 13,95 a 436,00 a 123,75 a 0,59 a 111,42 a 48,44 a 11,80 a 5,73 a 13,70 a 1,63 a
ENTR: número de entrenudos, PT: peso de tallos individuales, LARCAÑA: largo de cañas individuales, NTH: nº de
tallos por hectárea (población), TCH: toneladas de caña por hectárea (rendimiento cultural), RIT: rendimiento
industrial teórico (% de azúcar), TAH: toneladas de azúcar por hectárea (rendimiento final), FIB: Fibra, DIATINT:
daños por Diatraea sacharalis. Los valores expresados son la media de tres repeticiones. Medidas que tienen
diferente letra en cada columna son significativamente diferentes por el test LSD-Fisher (α≤0,05).
metodología). Ninguna de las mismas, sobre las mismas aún no comprensibles

presentaron diferencias significativas en su totalidad. Para aprovechar los efec-
entre los tratamientos ensayados. Estos tos positivos de esta interacción, el de-
resultados están acordes con los obteni- safío planteado es poder manejar las
dos por los técnicos de ALUR, quienes comunidades microbianas a favor de la
observan cambios significativos recién al colonización por bacterias benéficas. Sin
segundo año. Teniendo esto en cuenta embargo esto será posible solamente
así como los resultados obtenidos a los cuando se tenga un mejor conocimiento
12 meses es que se decidió continuar un de la ecología y la interacción molecular
año más el ensayo de campo, utilizando de los endófitos y las plantas (65). Por lo
como esquejes los tallos de caña cose- tanto, a la hora de pensar en una bacteria
chados (planta madre). En este caso, la como posible inoculante, es necesario
inoculación se realizará directamente en contar con información ecológica sobre
el surco en cada uno de los tratamientos. las características de su colonización
epi- y endofítica si corresponde (83). Con
Estudio de la interacción entre el fin de estudiar el proceso de infección
Enterobacter sp. UYSO10 y y localización de la cepa Enterobacter
sp. UYSO10, la misma fue inoculada en
plantas micropropagadas de la plantas de cañas de azúcar micropropa-
variedad LCP 85-384 a través de gadas de la variedad LCP 85-384. Mues-
microscopía óptica, electrónica tras de raíces y tallos fueron cosechadas
de transmisión y de barrido a diferentes tiempos con la finalidad de
realizar un seguimiento de la infección
En condiciones naturales las plantas bacteriana, observándose por microsco-
se encuentran en contacto íntimo con pía óptica así como electrónica de trans-
bacterias endófitas, siendo sus efectos misión y de barrido. Los resultados obte-
nidos se presentan siguiendo las etapas observa la apertura espacial de los mis-
definidas en el proceso de interacción: mos, probablemente debido a que las
adhesión, infección y colonización. bacterias degraden la lámina media que
une las paredes de las células vegetales
Adhesión bacteriana a raíces y tallos (Figura 12). Por otra parte, no se visuali-
zaron estructuras de la planta que se
Los resultados de los estudios de encontraran aparentemente involucradas
microscopía óptica y electrónica de ba- en el proceso de infección y conducción
rrido mostraron la presencia de bacterias de las bacterias a través de los tejidos.
individuales y aisladas, adheridas de for- Sin embargo, se observó la producción
ma apolar a la superficie de las raíces a de una sustancia mucosa por parte de la
las 6 horas pi (Figura 10a). A mayores planta (Figura 11b y c). Se conoce que la
tiempos pi, las bacterias se encontraron producción de sustancias de este tipo
únicamente formando agregados ubica- puede estar asociada a respuestas pato-
dos en la zona pilífera de la raíz (Figura génicas, sin embargo las técnicas de
10b-d). Los agregados fueron más fre- microscopía no pueden evidenciarlo.
cuentes y grandes después de las 24
horas pi. Asimismo en un ejemplar se Como resultado de las diferentes
visualizó la adhesión bacteriana en forma aproximaciones realizadas se presenta
de película sobre la emergencia de una un modelo sobre la infección de esta
raíz lateral (Figura 10e). En la misma las bacteria bajo las condiciones ensaya-
bacterias parecen adheridas por una sus- das. En el mismo se propone que en un
tancia mucosa. Es de destacar que las principio las bacterias se acercan a la
aberturas naturales y heridas en la raíz raíz y se adhieren a la misma en forma
son un típico sitio de infección por parte apolar, formando posteriormente agrega-
de bacterias endófitas. Por otra parte, en dos bacterianos en la zona pilífera de la
las muestras analizadas no se observa- raíz. A continuación comienza la infec-
ron bacterias en la superficie de los ta- ción bacteriana de la planta, postulándo-
llos. En el resto del tejido no se observó se como un posible sitio de ingreso las
la formación de agregados ni la presen- aberturas naturales ocurridas por la emer-
cia de películas bacterianas. gencia de raíces secundarias. Una vez
dentro de la planta, el primer sitio de
infección son los espacios intercelulares
Infección y colonización de raíces y
tanto en las raíces como en la base del
base del tallo
tallo, colonizando a continuación los te-
Mediante estudios de microscopía jidos vasculares de la raíz. Finalmente
óptica, se observó la presencia bacteria- esta cepa alcanzaría el tejido vascular
na en casi todos los cortes de raíces y del tallo. El modelo presentado para la
bases de tallos, de plantas de caña de adhesión, vía de infección y colonización
azúcar micropropagadas e inoculadas de plantas de caña de azúcar micropro-
con Enterobacter sp. UYSO10. Los estu- pagadas por Enterobacter sp. UYSO10
dios de visualización de la infección bac- presenta similitudes y diferencias con
teriana a lo largo del tiempo mostraron la otros modelos propuestos en plantas de
presencia de bacterias en los espacios caña de azúcar micropropagadas y los
intercelulares de las raíces a partir de las endófitos diazotrófos: Herbaspirillum se-
6 horas pi. (Figura 11 a y b). A las 12 ropedicae, H. rubrisubalbicans y G. dia-
horas pi, se observaron bacterias en los zotrophicus (Cuadro 10). En las espe-
haces vasculares de las raíces y a partir cies de Herbaspirillum la adhesión se
de las 24 horas post inoculación (pi) se presenta en forma de ataque apolar mien-
las observó tanto en los espacios inter- tras que G. diazotrophicus lo realiza de
celulares como en los haces vasculares forma polar. Sin embargo, a diferencia de
de raíces y base del tallo (Figura 11 c y Enterobacter sp. UYSO10, se encuen-
d). Si bien la mayoría de las veces que se tran formando monocapas y raramente
las encontró en espacios intercelulares agregados. Los sitios de infección des-
fue en el cortex del tallo, también se las criptos para estas tres especies son las
observó en el cilindro central del mismo. zonas de emergencia de las raíces se-
Asociada a la colonización de las bacte- cundarias y principalmente heridas de la
rias en los espacios intercelulares, se epidermis y particularmente en el caso
a b
c d
e f
Figura 10. Adhesión de la cepa Enterobacter sp. UYSO10 a raíces y base de tallos de plantas de
caña de azúcar. a- Microscopía electrónica de barrido (MEB) 6 horas post inoculación
(pi), se observa la adhesión de bacterias aisladas a la superficie de raíces y base del
tallo, b- Microscopía óptica (MO) 12 horas pi, vista de agregados en la superficie de
la base del tallo, c- MEB 24 horas pi, se ve un agregado superficial cerca de la base
de los pelos radiculares, d- MO 6 horas pi, vista de pequeño agregado en la base de
un pelo radicular, e- MEB 24 horas pi, se observa una película bacteriana sobre la
abertura natural de una raíz lateral y f- MO 12 horas pi, se visualiza infección bacteriana
a partir de heridas presentes en la base del tallo.
a b
c d
Figura 11. Micrografías ópticas mostrando la infección de plantas micropropagadas por Enterobacter
sp. UYSO10. Seis horas pi: se observan bacterias en espacios intercelulares en a-raíz y
b- base de tallo. c- 12 horas pi: se observan bacterias infectando los tejidos vasculares
de raíces. d- 24 horas pi:se observa infección en tejidos vasculares de la base del tallo.
Las escalas se muestran en las fotografías. EI: espacios intercelulares, TV: tejido
vascular, R: reacción mucosa de la planta.
Figura 12. Micrografía óptica mostrando la

apertura de los espacios
intercelulares (EI) en plantas
de caña de azúcar micropropa-
gadas e inoculadas con
Enterobacter sp. UYSO10.
Cuadro 10. Modelos de infección de bacterias endófitas-diazótrofas en comparación con el propuesto
para Enterobacter UYSO10
Bacteria
Enterobacter sp.
Etapas H. seropedicae H. rubrisubalbicans G. diazotrophicus
UYSO10
Monocapa,
Individuales de apolar, Monocapa, apolar, Monocapa, polar,
Adhesión
forma apolar. raramente en raramente en forma raramente en forma
radicular
Agregados forma de de agregados de agregados
agregados
Zona de
Zona de emergencia
Zona de emergencia de Zona de emergencia
Sitios de de las raíces
emergencia de las raíces de las raíces
infección en secundarias, heridas
las raíces secundarias y secundarias y heridas
las raíces de la epidermis y
secundarias heridas de la de la epidermis
zona meristemática
epidermis
Colonización
del interior de Intercelular Intercelular Intercelular Intercelular
las raíces
Colonización Monocamada o Monocamada o

Monocamada o
de los vasos Si agregados pequeños
agregados discretos
de xilema discretos agregados
Colonización Espacios
Tejido vascular y Vasos de xilema y Vasos de xilema y
de la base del intercelulares de
parénquima parénquima parénquima
tallo células del cortex
de G. diazotrophicus también se observó asburiae JM22 -algodón. Para ésta cepa

infección en la zona meristemática. En se observó la colonización radicular del
cuanto a la colonización del interior radi- cortex y del tejido vascular, proponiéndo-
cular por las mismas, se observó su se una colonización sistémica debido a
presencia en los espacios intercelulares su presencia en tallos, pecíolo, cotiledo-
y en los vasos de xilema, mostrándose nes, hojas y meristema apical (56, 57).
además en el caso de las especies de iii) Enterobacter sp. 638 -Populus tricho-
Herbaspirillum la inducción de mucus carpa. Esta cepa fue descripta como
por parte de la planta. En cuanto a la endófita debido a su visualización en el
base del tallo, se observó la presencia de interior de los tejidos de Populus tricho-
las cepas de Herbaspirillum en los vasos carpa (79).
del xilema así como en el parénquima, Finalmente, con los resultados obte-
mientras que G. diazotrophicus solamen- nidos en esta parte del proyecto, pode-
te fue observada en los espacios interce- mos postular que el aislamiento Entero-
lulares del cortex (31,32,50). Por su par- bacter sp. UYSO10 es una bacteria en-
te la infección de otras cepas del género dófita de plantas de caña de azúcar,
Enterobacter han sido estudiadas en las constituyendo el primer reporte de un
siguientes interacciones planta-bacteria: aislamiento de éste género como endófi-
i) Enterobacter gergoviae 57-7 -maíz. to asociado a este cultivo. En el presente
Esta cepa fue descripta como un endófito estudio se evaluó la interacción planta-
facultativo de maíz, colonizando las raí- bacteria en un modelo experimental, sir-
ces los tejidos del parénquima y los viendo los resultados generados para
vasos del xilema (1). ii) Enterobacter sentar las bases de futuros ensayos en
plantas no micropropagadas. Cabe des- 7. BIBLIOGRAFÍA
tacar que en estudios comparativos de la
inoculación de P. solanacearum en plan- 1. AN, Q., Y. DONG, W. WANG, Y. LI. and J.
tas de tomate micropropagadas y en LI. 2007. Constitutive expression of the
condiciones de cultivo se ha observado nifA gene activates associative nitrogen
patrones de infección similares (88). fixation of Enterobacter gergoviae 57-
7, an opportunistic endophytic
diazotroph. Journal of Applied
6. CONCLUSIONES Y Microbiology 103:613–620.
RECOMENDACIONES 2. BALDANI, J. I. I. and V. L. L. BALDANI.
2005. History on the biological nitrogen
1- Se comprobó que las diferentes fixation research in graminaceous
variedades de caña de azúcar cultivadas plants: special emphasis on the
en Uruguay son capaces de adquirir par- Brazilian experience. Anais da
te de su N nutricional a partir de la fijación Academia Brasileira de Ciências
biológica del N2 en campo y en condicio- 77:549–579.
nes controladas, siendo la primera vez 3. BERGE, O., T. HEULIN and W. ACHOUAK.
que se realiza este tipo de estudio en 1991. Rahnella aquatilis, a nitrogen-
Uruguay. fixing enteric bacterium associated with
the rhizosphere of wheat and maize.
2- Se dispone actualmente de una
Canadian Journal of Microbiology
colección caracterizada a nivel bioquími-
37:195–203.
co, fisiológico y molecular, de probables
endófitos nativos asociados a variedades 4. BHATTACHARJEE, R. B., A. SINGH and
de caña de azúcar, cultivadas en Uru- S. N. MUKHOPADHYAY. 2008. Use of
guay. nitrogen-fixing bacteria as biofertiliser
for non-legumes: prospects and
3- Probables endófitos diazótrofos fue- challenges. Applied Microbiology and
ron identificados en la colección siendo Biotechnology 80:199–209.
la primera vez que se reporta un aisla-
5. Biggs, I. M., G. R. Stewart, J. R. Wilson
miento perteneciente al género Shinella
and C. Critchley. 2002. 15N natural
como probable endófito. Se comprobó, abundance studies in Australian
en un grupo de aislamientos selecciona- commercial sugarcane. Plant and Soil
dos, la capacidad de promover el creci- 238:21–30.
miento vegetal en ensayos de invernácu-
6. BODDEY, R. M., J. C. POLIDORO, A. S.
lo, cuando fueron inoculadas a plantas
RESENDE, B. J. R. ALVES and S.
micropropagadas o a esquejes de plan-
URQUIAGA. 2001. Use of the 15N natural
tas de caña de azúcar.
abundance technique for the
4- Por primera vez en el Uruguay se quantification of the contribution of N2
inocularon plantas de cañas de azúcar fixation to sugar cane and other
con endófitos-diazótrofos nativos, estu- grasses. Australian Journal of Plant
diándose su respuesta en condiciones Physiology 28:889–895.
de campo. 7. BODDEY, R., O. OLIVEIRA, S. URQUIAGA,
5- Mediante técnicas de microscopía V. REIS, F. OLIVARES and V. L. D.
(óptica y electrónica), se pudo compro- BALDANI. 1995. Biological nitrogen
bar que el aislamiento Enterobacter sp. fixation associated with sugar cane
and rice: contributions and prospects
UYSO10 es un endófito de plantas de
for improvement. Plant and Soil
caña de azúcar siendo la primera vez en
174:195–209.
reportarse.
8. BODDEY, R. M., J. DOBEREINER, E.
6- En su conjunto los resultados CENTRO, N. D. PESQUISA and R. DE.
obtenidos justifican continuar tanto en la 1995. Nitrogen fixation associated with
profundización de la parte aplicada de grasses and cereals: Recent progress
pruebas de inoculación en invernáculo y and perspectives for the future.
campo, así como en la investigación bá- Fertilizer Research 42:241–250.
sica de la interacción planta-microorga-
9. CALVO, J., V. CALVENTE, M. E. DE
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Responsable del Proyecto: Federico Battistoni

Institución Ejecutora: Instituto de Investigaciones Biológicas «Clemente Estable»

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