UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

CARRERA BIOTECNOLOGÍA
INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO VIRTUAL

Datos informativos:

Nombre: Carrera Geovanna; Corrales Joselyn; Iza Lidia; Sotomayor Yonayker

Asignatura: Inmunología y virología Fecha de realización: 11/12/2020
Nivel: Quinto Fecha de presentación: 18/12/2020
Profesor: Mcs. Chico Mayra Práctica N°: Semana 9
Auxiliar de Laboratorio: Ing. Guadalupe Vaca Modo de práctica: Virtual

1. TEMA
Elisa Sándwich
2. OBJETIVOS

General:

Analizar la importancia, metodología y aplicaciones de la técnica de Elisa sándwich

mediante el uso de simulaciones de laboratorio en plataformas virtuales.

Específicos:

• Describir el procedimiento de una prueba ELISA tipo sándwich mediante el uso

de un laboratorio virtual.
• Mencionar las posibles utilidades de un ELISA tipo sándwich en el diagnóstico
de enfermedades.
• Identificar las posibles limitaciones que puede presentar un ELISA tipo sándwich.
3. INTRODUCCION

La técnica de ELISA es un método de reconocimiento en el sistema de elección para

diferentes análisis de antígenos con naturaleza soluble y anticuerpos. Los ELISA se
pueden realizar con una serie de modificaciones al procedimiento básico, obteniéndose
diferentes tipos, los cuales son: directo, indirecto, competitivo y sándwich. Siendo la
última la variante menos común, pero eficaz en la detección de antígenos en una muestra
y la mayor parte de conjunto de pares de ELISA comerciales se basan en este tipo
(Hornbeck, 1992). Por ende, el objetivo del presente ensayo es describir el principio,
aplicabilidad y etapas de un ELISA sándwich.
La característica diferenciadora del ELISA tipo sándwich es que se basa en la adsorción
de un anticuerpo de "captura" en la placa, donde el antígeno diana se detecta mediante el
anclaje entre dos anticuerpos (captura y deducción) que reconocen diferentes epítopos y
el antígeno a medir debe contener al menos dos sitios antigénicos capaces de unirse al
anticuerpo (Alhajj & Farhana, 2020). Los anticuerpos a usarse pueden ser monoclonales
que reconocen un solo epítopo que permite la detección fina y la cuantificación de
pequeñas diferencias en el antígeno o policlonales de captura para reducir tanto antígeno
como le sea posible. ELISA sándwich es generalmente adecuado para medir
macromoléculas con algunas excepciones, por ejemplo, (Boscolo et al., 2013) usó este
tipo de técnica para biotoxinas marinas como las palitoxinas, utilizando antígenos con
diferentes anticuerpos.

Este tipo de ELISA comienza con la inmovilización de un anticuerpo, llamado anticuerpo

de captura, en la placa de microtitulación. Este proceso ocurre a través de interacciones
hidrofóbicas entre los residuos de proteínas no polares y la placa. Después, se bloquea la
superficie de la placa para evitar la adsorción inespecífica de otras proteínas, utilizando
un tampón que contenga ningún antígeno que pueda unirse a los anticuerpos de captura
como Tween 20 (0.05%) o incluyendo albúmina de suero bovino (Hornbeck, 1992). Se
aplica la solución de antígeno y luego de una incubación y lavado, se permite que el
antígeno de la muestra reaccione con el anticuerpo de captura inmovilizado y el antígeno
unido se intercala con un anticuerpo marcado con enzima adicionado para el desarrollo
del color (Kohl & Ascoli, 2017). Este segundo anticuerpo puede ser el mismo que se
utilizó para la captura o ser diferente en términos de la fuente animal específica y las
enzimas ligadas al mismo más comunes son la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la
fosfatasa alcalina (AP).

Posteriormente, el conjugado no unido se lava y se agrega el sustrato. Los sustratos son

fundamentales para los pasos de detección y visualización de un ELISA, que permiten el
desarrollo de la reacción de color mediante catálisis enzimática. Una vez obtenida la
intensidad de color deseada se agrega soluciones de stop y se cuantifica usando un
espectrofotómetro, la señal aumenta al aumentar la cantidad de antígeno (Sakamoto et al.,
1234).

En conclusión, el método de ELISA sándwich permite cuantificar la cantidad de proteína,

hormona o analito de interés en una muestra mediante el uso de anticuerpos. Se ha
utilizado ampliamente en todo el mundo para el diagnóstico, los estudios
farmacocinéticos mediante la monitorización de fármacos y el control de calidad de
productos disponibles comercialmente.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Resultados-Cuestionario

1) Un resultado positivo de ELISA sándwich indica que el suero del paciente

contiene: Antígeno Específico

La técnica de Elisa sándwich se caracteriza por su nivel más alto de sensibilidad con
valores de 2 a 5 veces mayor en comparación con otras técnicas, los resultados positivos
se basan en el recubrimiento de los pocillos con un primer anticuerpo que son lavados
para eliminar el exceso, luego se agrega otra solución con anticuerpos y se repite el lavado
y de esta manera cada antígeno quedará pegado a su anticuerpo respectivo que lo retiene
y otro que lo marca, la sensibilización y especificidad se caracteriza por la amplificación
del segundo anticuerpo (Crook &Payne, 2018).

2) Se puede utilizar un ELISA para: Análisis Cuantitativo

Sí, debido a la evolución de espectrofotómetros que han sido diseñados para la lectura de
los determinados pocillos en filas y columnas de muestras individuales o conjuntas, estos
instrumentos tecnológicos permiten medidas de la densidad óptica de la caracterización
del conjunto de muestras y otros generan tabulaciones de datos para posteriormente
aplicar análisis estadístico, la vinculación entre la máquina de señales como las
computadoras y estos aparatos tecnológicos tiene que ser directa para evitar fallas y
errores sistemáticos o aleatorios al tomar las calibraciones y lecturas de datos

3) ¿Qué no es cierto para una solución tampón de bloqueo?

Altera u oscurece el epítopo para la unión de anticuerpos

La razón fundamental en la que se basa esta respuesta es que la gran capacidad de unión
que poseen los pocillos en la microplaca es mayor que la cantidad de proteína que se
encuentra recubriendo cada pocillo, esto genera que la capacidad de unión residual
empleada por la placa se bloquee, esto principio es solventado por la solución tampón de
bloqueo que favorece la interacción de unión con todos los potenciales sitios en los que
no hay interacción específica y así se elimina el fondo por completo para evitar la
alteración y oscurecimiento del epítopo para la ligación del anticuerpo (Ochoa, 2012).
 4) El paso de lavado se puede realizar con un tampón fisiológico como solución
salina tamponada con Tris (TBS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS)
(Verdadero o Falso): Verdadero

Sí, debido a que esta solución posee propiedades aptas para el proceso de lavado que no
altera la muestra y así pueda eliminar cualquier exceso de anticuerpos, reactivos no unidos
y también una disminución en el fondo del componente muestral, también es
indispensable emplear PBS y otro componente con similares características para que no
haya disminución de la sensibilidad por la elución del antígeno en el pocillo (Yamazaki
et al., 2010).

5) El sustrato de la peroxidasa de rábano picante es: 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina

(TMB)

Las propiedades del sustrato 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) actúa como marcador
cromogénico que participa en la reacción de la HRP donde es catalizada por el TMB sin
coloración en TMB2+ , el cambio de color amarillo basado en este origen se puede
cuantificar en función de la densidad óptica a 450 nm, también facilita este sustrato la
detección en unidades como los picogramos para comparar ensayos quimioluminiscentes
(Vanmechelen et al., 2020)

6) Indique las razones por las que podría no haber color o casi ninguna formación de
color después de la adición del sustrato:

Algunas razones fundamentales que inhiben las reacciones de viraje de color,

detección y visualización son:

• Trabajar con sustratos no estables y altamente tóxicos como el p-nitrofenilfosfato

que dificulta el viraje de color amarillo en el producto causado por el nitrofenilo,
el cual es muy difícil divisar a simple vista.
• Utilizar sustratos que deben solo emplearse para su visualización óptica aparatos
prediseñados respectivamente solo para esos, por ejemplo: sustratos fluorogénicos
requieren de fluorómetros para discernir mejor las reacciones de catálisis en los
cambios de coloración.
• Emplear sustratos que afecten la sensibilidad de los ensayos que se están
ejecutando debido a que puede alterar las reacciones provocando errores el tipaje
y sobre todo en la densidad óptica del compuesto (Yamazaki et al., 2010).
 7) ¿Qué es un ELISA sandwich?

Es una técnica muy utilizada y caracterizada por la mayor sensibilidad en sus ensayos de
inmunoabsorción se basa en el recubrimiento de un pocillo por un primer anticuerpo
denominado anti-antigeno para detectar el antígeno de manera directa, luego se da la
adición y lavado de otros anticuerpos con soluciones de prueba que contienen sustancias
extrañas, para así poder realizar otro lavado y eliminar el conjugado no unido para la
adición de sustrato y posteriormente cuantificar y validar la muestra (Crook &Payne,
2018).

8) Nombre tres agentes necesarios para fabricar el tampón de bloqueo utilizado en

ELISA:

Para la fabricación correcta de este tampón de bloqueo se debe emplear Tween 20 a una
concentración del 0,05%, ya que facilita el bloqueo de cualquier proteína que puede ser
utilizada o de desinterés, otro agente es la albúmina de suero bovina BSA a una
concentración de 0,25% y las condiciones de almacenamiento dependiendo de cada caso,
pero se puede aplicar 4ºC como condición estándar (Yamazaki et al., 2010).

4.2. Discusión

Figura 1. Resultados de ELISA directo

 Tabla 1. Función de los reactivos utilizados en el ensayo de ELISA de sándwich en el
laboratorio virtual

REACTIVOS FUNCIÓN
Solución de captura de Captura al antígeno que luego puede detectarse en un ELISA
anticuerpos directo o en una configuración ELISA indirecta.
Antígeno de prueba Estos antígenos se unen a los anticuerpos de captura
inmovilizados.
Anticuerpo secundario Sirve como el anticuerpo de detección que se unirá
(Conjugado anticuerpo específicamente a la región Fc del anticuerpo.
específico-fosfatasa alcalina)
Solución salina tamponada Son utilizadas en el paso de Lavado para eliminar cualquier
con fosfato neutro (PBS) exceso de anticuerpo de los pocillos de la placa de
Agua desionizada
microtitulación.
Búfer de bloqueo (Blocking Se encarga de bloquear eficazmente la unión inespecífica de los
buffer) reactivos del ensayo a la superficie del pocillo. Además, reduce
el ruido de fondo y mejora la relación señal-ruido.
Solución de sustrato de Induce una señal cromogénica que es medida con un
fosfato de p-nitrofenilo espectrofotómetro u otro dispositivo óptico para determinar la
(NPP) presencia y cantidad del antígeno
Solución de parada (Stop Detiene la reacción del sustrato enzimático alterando el pH del
solution) sistema después de alcanzar la intensidad de color deseada.

Adaptado de: Desarrollo de ELISA sándwich indirecto para la determinación de

antígenos de excreción-secreción de Fasciola hepatica, por Alzamora et al., 2016. Revista
Peruana de Biologia, 23(1), 47–52.

La técnica de ELISA sándwich se caracteriza principalmente porque requiere utilizar

pares de anticuerpos emparejados, es decir, anticuerpos de captura y detección (Tabla 1).
Por lo tanto, cada anticuerpo es específico para región o epítopo diferente y que no se
solapa con el antígeno (Fernández, 2007). Es importante que los pares de anticuerpos
emparejados se prueben específicamente en ELISA para garantizar que detectan
diferentes epítopos y, de esta manera obtener resultados precisos (Ochoa, 2012).

Un aspecto importante a resaltar es que el ELISA sándwich generalmente tiene una mayor
sensibilidad y especificidad (2 a 5 veces más) que el ELISA directo e indirecto, porque
hay dos anticuerpos involucrados en la captura y detección (Alhajj & Farhana, 2020).
Y según Ochoa (2012), ofrece una gran flexibilidad ya que se pueden utilizar tanto
métodos directos (anticuerpo de detección conjugado con enzima) como indirectos
(anticuerpo de detección no está marcado y requiere un anticuerpo secundario del mismo
tipo, pero conjugado con enzima, Tabla 1) (Alzamora et al., 2016). Además, dado que no
es necesario purificar el antígeno antes de la medición, el ELISA tipo sándwich es una
mejor opción para el análisis de muestras complejas. Sin embargo, normalmente es difícil
seleccionar y optimizar los pares de anticuerpos para este inmunoensayo y puede haber
reactividad cruzada entre los anticuerpos de captura y detección (Sakamoto et al., 1234).

Tras los lavados, en la placa se encuentran los anticuerpos iniciales, los antígenos, y el
conjugado correspondiente o los inmunocomplejos formados, pero si en la placa no está
el antígeno únicamente estará en la placa los anticuerpos iniciales. Según Male et al.
(2013), las muestras se llegan a determinar mediante una solución con el sustrato de la
enzima y un cromógeno. El sistema enzima/cromógeno es importante si se desean
resultados óptimos, entre los más utilizados actualmente está: peroxidas/fenilendiamin
(OPD) en la que emplea un cromógenos soluble (Morales, 2010). Cuando la enzima del
conjugado es la peroxidasa, el sustrato es el peróxido de hidrógeno y el cromógeno es el
OPD, mismo que durante la incubación rompe el sustrato y el oxígeno producido hace
que el OPD se oxide, cuya forma oxidada da una tonalidad naranja (Tortora et al., 2007).
A pesar de esto, es necesario frenar la reacción añadiendo ácido para estabilizar el color,
por lo que los pocillos positivos y negativos presentan una coloración naranja y gris
respectivamente, este último debido a que no poseía el antígeno para la reacción (Figura
1).

5. CONCLUSIONES
• Se describió el procedimiento metodológico de la ELISA sándwich para su
realización en el cual se especifica una serie de procesos como recubrimiento de
placas, etapas de lavado y bloqueo con buffers, adición de soluciones antígeno,
enzimas-anticuerpo y sustrato no nocivo para evitar alteraciones en la
cuantificación y optimización de los ensayos que se ejecutan, finalmente la
validación del ensayo depende del uso de un sinnúmero de kits comerciales para
facilitar el tedioso trabajo de protocolos ya establecidos según el tipo de
investigación.
 • Se determinó que las enfermedades infecciosas pueden ser diagnosticadas por
métodos inmunoquímicos mediante a detecciones de un antígeno circundante en
ensayos de tipo sándwich, por lo que llegan a identificar si la infección causada
es de manera viral, bacteriana, fúngica o parasitaria debido a la excelente
sensibilidad y especificidad que posee este método.
• Se identificó que la única limitación que presenta el ELISA sándwich es que la
optimización de anticuerpos puede resultar difícil y costosa, porque puede
producirse una reactividad cruzada entre los anticuerpos de captura y detección.
Por lo que, solo deben usarse productos probados específicamente para este tipo
de ensayo.
6. BIBLIOGRAFÍA

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