UNIVERSIDAD NACIONAL

“PEDRO RUIZ GALLO”

PARASITOLOGIA
CLINICA Biología

PROFESOR:
Manuel Farcio Villarreal
ALUMNA:
Santos Cano Elmy

Lambayeque, octubre del

2018
 PRÁCTICA N. 12
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay o ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas)
I. INTRODUCCIÓN
Técnica de laboratorio que usa anticuerpos ligados a enzimas a fin de detectar y medir la
cantidad de una sustancia en una solución, como el suero. La prueba se hace usando una
superficie sólida a la que los anticuerpos y otras moléculas se adhieren. En la etapa final,
se produce una reacción enzimática que causa un cambio de color que puede leerse
mediante el uso de una máquina especial. Hay muchas formas diferentes en las que el
enzimoinmunoanálisis de adsorción se puede hacer. El enzimoinmunoanálisis de
adsorción se puede usar para ayudar a diagnosticar ciertas enfermedades. También se
llama ELISA.

II. OBJETIVO

 Capacitar al estudiante con las técínicas para el diagnóstico serolorico por

métodos indirectos altamente especializado de infecciones parasitarias.

III. MATERIALES

 Biológicos
Muestra de suero sanguíneo
 De laboratorio
Alcohol etílico de 700
Pinza metálica.
Micropipetas de rango variable (10- a 100 y de 100- 1000).
Tipos de 100uL y 1000uL.
Porta Tipos.
Caja rígida para eliminación
de punzocortantes.
Kit para prueba de ELISA.
Equipo lector de ELISA.

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 - OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SUERO
1. Mantener en todo momento las medidas de bioseguridad: Utilizar EPP (Equipos de
protección personal). Desinfectar, esterilizar y eliminar los materiales utilizados en,
la práctica.
2. Desinfectar con alcohol la zona de venopunción.
3. Realizar la extracción de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante y de
preferencia con retractor de coágulo.
4. Dejar en reposo las hasta que la muestra haya coagulado y el coagulo se haya
retraído.
5. Centrifugar por 5 minutos a 2500 RPM.
6. Separa el suero sanguíneo en un tubo limpio o crio vial con la ayuda de una pipeta
de transferencia.

- PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

1. Preparación de Solución de lavado (Buffer)

 24.5 ml de Agua destilada desionizada.

 Adicionar 0.5 mL de solución de Concentrado.

2. Preparación de la Sustrato.
• 50 u de sustrato A + 50 u de sustrato B (para I prueba).
* Utilizar Volúmenes iguales de A y B dependiendo la cantidad de pruebas a
realizar.
Nota.
* Una vez preparados las soluciones deben conservarse en refrigeración 40C.
* Antes del uso de las mismas, mantener los reactivos de trabajo y preparados a
temperatura ambiente por lo menos 20 minutos.
* Tener al alcance un frasco con agua destilada.

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IV. PROCEDIMIENTO

1. Realizar la Calibración del reactivo a utilizar en el Equipo Lector de ELISA, según

lo indica el protocolo del fabricante.

2. Colocar los pocillos (impregnados con antígenos) en la placa.

A B

C
D

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 Evitar tocar las paredes de los
pocillos con los dedos.

3. Agregar 50 uL de Muestra (suero o calibrador)

Agregar la muestra

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 Agregar el calibrador

4. Agregar 100 uL de Enzima al pocillo y homogenizar rotando suavemente por 30

segundos.

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 5. Incubar por un tiempo de 60 minutos.

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 6. Después de la incubación realizar lavados con solución de lavado (buffer),
eliminando el exceso de solución de lavado por decantación y sacudiendo la placa
suavemente sobre el papel secante (3 lavados)

A B

D C

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  El lavado
7. Agregar sirve
100 µl de para en
sustrato eliminar aquellos
el pocillo antígenos
e incubar o anticuerpos
por un tiempo que no han
de 15 minutos.
reaccionado.
* Preparación del sustrato
 Así mismo el buffer contiene el Tween 20, el facilita la separación de
sustancias actuando como humectante, detergente y fungicida.

Sustrato A Sustrato B

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 8. Transcurridos
los 15 minutos. Agregar 50µL de solución STOP y dejar en reposo por 30
segundos.
A
B

D C

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 9. Llevar la placa a la bandeja de lectura del equipo.

10. Ingresar a la configuración de la prueba a realizar y realizar la lectura.

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 V. RESULTADOS:
VI. CONCLUSIONES:
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Pruebas de interferencia en química clínica. Pautas aprobadas EP7-A (2002)

Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico.
Lequin, R.M. Inmunoensayo enzimático (EIA) / Ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas (ELISA). Química Clínica. 2005. 51:12 2415-2418
VIII. CUESTIONARIO
 Describa los diferentes tipos de ELISA
 ELISA directo

Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que
se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican
la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles
negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, ...)
pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo,
se incluyen controles positivo ELISA Directo.

Consta de las siguientes etapas:

 Fijación al soporte insoluble (tapizado) de antígenos específicos. Lavado para

eliminarlos antígenos fijados deficientemente o no fijados.
 Adición de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los
anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
 Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
 Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. (soluciones donde
se encuentra el antígeno buscado).

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Fundamento: El antígeno se inmoviliza en una placa de micropocillos, para ser después
detectado directamente mediante un anticuerpo conjugado, por ejemplo, a una enzima
como HRP.

Uso más frecuente: Para analizar la respuesta inmune frente a un determinado antígeno.

VENTAJAS DESVENTAJAS

 Rapidez  Puede generar mayor ruido de fondo

 Menor probabilidad de cometer debido a que todas las proteínas de la
errores durante el ensayo, debido al muestra pueden quedar inmovilizadas en
menor número de pasos y reactivos la placa (tanto nuestro antígeno de interés
utilizados. como el resto), resultando en
inespecificidad.
 Menor flexibilidad, ya que requiere el uso
de un anticuerpo primario específico
conjugado para cada antígeno de interés.
 Menor sensibilidad, debido a que no existe
amplificación de la señal.

El
conjugado es un anticuerpo unido covalentemente con una molécula
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 marcadora (por ejem. Peroxidasa), el cual reconoce a su vez otra molécula de
anticuerpo

 ELISA indirecto

Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la

anterior. Los controles positivos y negativos son los
mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos:
uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado
contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por
presentar una amplificación de señal debida a la unión de
dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el
ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia
indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo
sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de
antígenos.

Consta de las siguientes etapas:

 Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto

de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no
fijados.
 Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
 Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran
fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no
hayan reaccionado.
 Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reacción si se desea.
 Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

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Fundamento: En este caso, el antígeno que se inmoviliza sobre la placa es
posteriormente detectado en dos pasos. Primero, un anticuerpo primario sin marcar se
une específicamente al antígeno, y después, se añade un anticuerpo secundario
conjugado a una enzima que se unirá al primario, amplificando la señal.

Uso más frecuente: Para determinar la concentración total de anticuerpo en una

muestra. El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de
anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente
causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica,
proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos
en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos
contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar
anticuerpos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección

VENTAJAS DESVENTAJAS

 Alta sensibilidad, ya que varios  Posible reactividad cruzada por el uso

anticuerpos secundarios conjugados de anticuerpos secundarios que podrían
pueden unirse a un mismo anticuerpo incrementar el ruido de fondo.
primario.  El procedimiento es más largo que en un
 Mayor flexibilidad, siendo posible el ELISA directo, con pasos de incubación
uso de diferentes anticuerpos adicionales.
primarios con un único secundario
conjugado.

 ELISA sándwich

(Ensayo de captura de antígeno y detección mediante

inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en
el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica
la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que
será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el

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material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno
marcado. Así pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base
que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una
gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el
segundo anticuerpo

Fundamento: Este ensayo requiere el uso de parejas de anticuerpos primarios que

reconozcan distintos epítopos de un mismo antígeno. La placa se tapiza con uno de ellos,
que actuará como anticuerpo de captura. Posteriormente, se añadirá la muestra con el
analito de interés, y finalmente el segundo anticuerpo que actuará como anticuerpo de
detección. Este anticuerpo de detección puede estar marcado con una enzima (ELISA
sándwich directo), o sin marcar haciendo uso posterior de un anticuerpo secundario
conjugado (ELISA sándwich indirecto).

Uso más frecuente: Para el análisis de muestras complejas, ya que no es necesario

purificar previamente el antígeno.

VENTAJAS DESVENTAJAS
 No siempre es sencillo conseguir un par de
 Alta sensibilidad
 Alta especificidad, por el uso de dos anticuerpos adecuado, pudiendo dar lugar a

anticuerpos primarios reactividad cruzada entre ambos.

 Flexible, pudiendo detectarse la señal
por método directo o indirecto

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 Influencia del antígeno y del suero para la estandarización de la prueba de ELISA

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