Técnica de filtración ISO

9308 aplicada al monitoreo

de agua de red
Mg. Silvia Moyano, Mg. Graciela
Marín

Resumen Director Técnico Laboratorio, U.T.N. Facultad

Se evaluó la reproducibilidad de la técnica Regional Villa María, Av. Universidad 450, (5900)
de filtración (ISO 9308-1) para la detección Villa María, Córdoba, 0353-4537500 Int. 201;
de coliformes totales y Escherichia coli, y Proyecto: “Calidad Del Agua Subterránea y
su aplicación en muestras de agua de baja Superficial y Gestión Del Recurso Hídrico en la
contaminación, como el agua de red domiciliaria. Región Centro de la Provincia de Córdoba”. Proyecto
De este modo poder resolver inconvenientes PID Código UTI 1782- Secretaría de Ciencia,
en la interpretación de resultados originados Tecnología y Posgrado- Universidad Tecnológica
debido a la presencia de otros tipos de bacterias Nacional. [email protected]
que no pertenecen al grupo coliformes.
Dichas bacterias desarrollan dando colonias
anaranjadas-amarillas típicas de coliformes en el
medio de Agar de Lactosa TTC con (Tergitol@7) y importancia de métodos de detección confiables
pueden generar falsos positivos. Palabras clave: y con sensibilidad adecuada exige la aplicación
Norma ISO 9308, filtración por membrana, agua de técnicas internacionales que presenten estas
de red, colonias atípicas. características. La prueba estándar para el grupo
53
coliformes en muestras de agua puede realizarse
Abstract mediante las técnicas de fermentación en tubos
This work was evaluated the reproducibility múltiples [1], o de filtro de membrana [2].
of filtration techniques (ISO 9308-1) for Son aplicables estos dos métodos teniendo en
detection of total coliforms and Escherichia cuenta sus limitaciones específicas y el propósito
coli, and its application in water samples with del estudio. La técnica de filtro de membrana,
low pollution, and the corresponding home que consiste en la siembra directa para la
network water. Thus to solve problems related detección y cálculo de la densidad, es tan eficaz
to the interpretation of results caused due to como la fermentación en tubos múltiples para la
the presence of other types of bacterial groups detección de bacterias de este grupo. La Norma
that do not belong to the coliform group. These ISO 9308 para la determinación de coliformes
groups develop resulting orange-yellow colonies totales y Escherichia coli en muestras de agua es
typical of coliform agar medium TTC Lactose la exigida por la comunidad económica europea
(Tergitol @ 7) and can generate false positives. para evaluar la calidad del agua. Esta norma se
Keywords: ISO 9308, membrane filtration, basa en el método de filtración por membrana
network water, atypical colonies. (Norma española ISO 9308) [2].
La modificación de los detalles del
Introducción procedimiento, ha hecho que los resultados
El monitoreo del agua potable provista a una por ambas técnicas sean comparables. Aunque
población es indispensable para garantizar la existen limitaciones a la aplicación de la técnica
calidad de vida debido que puede ser vehículo del filtro de membrana, puede ciertamente ser
de importantes enfermedades infecciosas. La equiparable a la anterior si se emplea teniendo

Forestal, Agronomía y Alimentos

 Moyano y Marín

en cuenta de manera estricta sus inconvenientes Se tuvieron en cuenta algunos detalles

y sus especificaciones técnicas. relacionados con el desarrollo de la Técnica de
Entre los detalles a verificar se encuentra el Filtración por Membrana en donde se filtran 100
hecho que la Norma ISO 9308 establece que ml de muestra utilizando monitores estériles
luego de la filtración de la muestra de agua, descartables con la membrana filtrante. El filtro
la membrana se coloca en placas con Agar de fue colocado en placa con Agar de Lactosa TTC
Lactosa TTC con (Tergitol@7) donde todas las con (Tergitol@7) y luego incubado durante 48
colonias amarillas desarrolladas, sin considerar (±) 2 horas a 36 (±) 1 ºC.
el tamaño, que fueran oxidasa negativa, se Las colonias típicas de coliformes se
pueden clasificar como perteneciente al grupo presentan como amarillas- anaranjadas con o sin
coliformes. halo amarillo (CULTIMED) [6] (MERCK) [7]. A las
Con el fin de desarrollar dicha comparación, colonias desarrolladas se le realizó el aislamiento
se realizó la evaluación de los detalles de en un medio no selectivo (Agar nutritivo)
aplicación de las técnica de filtración en muestras aplicando luego la prueba de la oxidasa (tabletas
de agua de baja contaminación provenientes reactivas). Para la investigación de Escherichia
de red de provisión urbana y otras fuentes con coli, estas colonias fueron sembradas en Agua
similares características [4] [5], para determinar peptonada Indol, para observar la producción
los principales inconvenientes relacionados con de Indol a 44,5 (±) 0,5ºC.
la interpretación de resultados en cuanto a la
presencia de otros tipos de grupos bacterianos Resultados y discusión
no coliformes en muestras con bajo grado de Se obtuvieron los resultados en estas
contaminación que desarrollan dando colonias muestras de baja concentración, por las dos
anaranjadas- amarillas típicas de coliformes técnicas mencionadas, sirviendo ambos grupos
en el medio de cultivo Agar de Lactosa TTC de datos para realizar comparaciones con el fin
con (Tergitol@7), establecido en la Norma ISO de asegurar los resultados, siendo la técnica del
9308-1 para la detección de coliformes totales y número más probable utilizada como técnica
Escherichia coli en muestras de agua. referencial, ya que es con la que se cuenta con
54
mayor experiencia en su aplicación.
Metodología desarrollada y materiales En la aplicación de la técnica de filtración por
utilizados membrana, para la caracterización de las colonias
Con el propósito de evaluar muestras de típicas, se tuvieron en cuenta las características
baja contaminación de coliformes, se realizó el descriptas en los manuales de los fabricantes
muestreo de agua de provisión de red urbana y de medios de cultivo tanto el de Merck y como
de muestras de otros orígenes que presentaban el CULTIMED (MERCK, 1994; CULTIMED, 2003)
antecedentes de esta situación. Se analizaron (tabla 1 y 2). En dichos manuales, se especifica
109 muestras de agua con esta característica que al Agar de Lactosa TTC con (Tergitol@7)
particular, en el Laboratorio de Química y puede agregarse el 2,3,5-Trifenil-2H-Tetrazolio
Microbiología de la Universidad Tecnológica Cloruro (TCC) dando colonias amarillas con
Nacional Regional Villa María. halo (E.coli) o colonias rojas con halo amarillo
Los análisis se realizaron utilizando las dos (coliformes sin E.coli). Durante el desarrollo
técnicas: la de filtración por membrana y el de evaluación de desempeño se observó que
número más probable. En los métodos de el agregado del TCC hace que las colonias
filtración se utilizó la técnica establecida por la de coliformes (sin E.coli) adquieran un color
Norma ISO-9308-1:2000 (Coliformes totales y más anaranjado o amarillo oscuro pero no la
E.coli) [2] y para la del Número Más Probable coloración roja con halo amarillo, establecida en
las técnicas 9221-A y B (coliformes totales) dicho manual (tabla 1).
del Standard Methods For The Examination Of Tabla N° 1: Características de las colonias
Water And Wastewater (SMEWW), 21th (APHA, desarrolladas en Agar de Lactosa TTC con
2005) [1]. (Tergitol@7) según el Manual de Medios de

Revista Argentina de Ingenieria • Año 2 • Volumen IV • Octubre de 2014

Técnica de filtración ISO 9308 aplicada al monitoreo de agua de red

cultivo MERCK. método de filtración por membrana, al cabo de

48 horas de incubación a 36 (±) 1°C, el 36,69 %
(40 muestras de las 109 analizadas) presentaron
colonias anaranjadas - amarillas típicas para
ser confirmadas como coliformes (tablas 3 y
4). Debido al crecimiento de colonias amarillas
desarrolladas en el Agar Tergitol que no
Tabla N° 2: Características de las colonias resultaron ser coliformes cuando se sembraron
desarrolladas en Agar de Lactosa TTC con en Caldo Lauril sulfato simple concentración se
(Tergitol@7) según el Manual de Medios de decidió realizar la observación microscópica de
cultivo CULTIMED. dichas colonias, observándose sólo las aisladas
de 27 muestras (tabla 3).
Tabla N°3: Resultados obtenidos por el
método de filtración por membrana para
coliformes totales (Norma ISO 9308-1-2000).

En la Norma ISO 9308 se establece que

se debe examinar la membrana y contar las
colonias, sin tomar en consideración el tamaño, Las colonias amarillas- anaranjadas con o sin
que presentan un desarrollo del color del medio halo típicas, se sembraron en Agar Nutritivo y
bajo la membrana (Norma española ISO 9308, luego Caldo Lauril Sulfato simple concentración
2000). Esto último (el viraje del medio bajo la para confirmar la pertenencia del grupo
membrana) no pudo ser considerado, debido coliforme. De las 40 muestras con colonias
a la utilización de monitores estériles donde se típicas aisladas, 39 muestras no desarrollaron
coloca el medio de cultivo después del filtrado en Caldo Lauril Sulfato luego de 48 horas de
de la muestra. Por eso se interpretó como incubación a 36 (+) 1°C, lo que descartó que
55
colonias típicas todas las colonias amarillas- sean bacterias coliformes. En la figura 1 se
anaranjadas desarrolladas en Agar de Lactosa observan colonias amarillas – anaranjadas
TTC con (Tergitol@7). desarrolladas no coliformes en Agar de Lactosa
Para ser confirmadas como coliformes se TTC con Tergitol@7 de una muestra de agua de
siguieron las etapas propuestas por la Norma la red domiciliaria.
ISO 9308, de sembrar las colonias típicas en
Agar Nutritivo y realizar la prueba de la oxidasa
(Norma española ISO 9308, 2000). Además
estas colonias desarrolladas en Agar nutritivo
se sembraron en Caldo Lauril Sulfato, que es el
medio de cultivo establecido por el Standard
Methods for the examination of water and
wastewater (APHA, 2005) para la determinación
de bacterias coliformes en muestras de agua por
el número más probable. Se consideró como
perteneciente al grupo coliforme a toda bacteria
capaz de producir turbidez y gas en Caldo Lauril
sulfato.
Las 109 muestras de agua analizadas Fig. N°1: Colonias amarillas “no coliformes” en Agar
por el método de fermentación por tubos de Lactosa TTC con (Tergitol@7) confirmadas por el
múltiples dieron resultados negativos para la no crecimiento en Caldo Lauril sulfato.
determinación de coliformes totales. Por el Sólo en una muestra se desarrollaron

Forestal, Agronomía y Alimentos

 Moyano y Marín

dos colonias amarillas (tabla 4) que fueron

confirmadas como coliformes. Esta confirmación
se basó en que resultaron ser oxidasa negativa y
desarrollaron turbidez y producción de gas en
tubos de Lauril Sulfato simple concentración.
Esta muestra por la técnica del NMP (Collins
C.H. y Taylor C, 1969) (tabla de 5-1-1) presentó
resultado negativo con respecto a coliformes
totales, lo que demostraría la mayor sensibilidad
de la técnica de filtración por membrana en Tabla N° 6: Porcentaje de las distintas
relación al método de fermentación por tubos morfologías presentadas por las colonias
múltiples. Por lo tanto la muestra sería apta amarillas desarrolladas en el Agar de Lactosa
para consumo analizada por la técnica de tubos TTC con (Tergitol@7).
múltiples y no apta con el método de filtración
por membrana (Dipas, 1995; Norma española
ISO 9308, 2000).
Tabla N° 4: Resultados obtenidos por el
método de filtración (Norma ISO 9308-1-2000)
y el Número más Probable en muestras de agua. Ante estos resultados obtenidos se procedió
a la siembra por aislamiento de cepas tipificadas
de Streptococcus agalactiae ATCC 27956,
S.bovis ATCC 9809, S. dysgalactiae ATCC 27957
y Enterococcus faecalis ATCC 19433, donde
En cuanto a la caracterización microscópica de desarrollaron colonias amarillentas pequeñas.
las colonias amarillas-anaranjadas que crecieron El Manual de Merck de medios de cultivo
en Agar de Lactosa TTC con (Tergitol@7), como (MERCK, 1994) para el Agar de Lactosa TTC
puede observarse en las tablas 5 y 6 que se con (Tergitol@7), en el control de calidad de
56
exponen en las páginas siguientes, el 41 % este medio expresa que cuando se realiza la
correspondieron cocos Gram (+) y el 41% de prueba con Enterococcus feacalis ATCC 11700,
bacilos Gram (+) esporulados chicos. el desarrollo de esta bacteria es nulo/ligero con
Es importante resaltar que en dos muestras un viraje amarillento del medio. Esto indicaría
hubo desarrollo de dos colonias anaranjadas con que en muestras de agua con bajo grado de
el viraje total del color del Agar de Lactosa TTC contaminación pueden desarrollar en Agar
con (Tergitol@7) en el monitor por filtración de de Lactosa TTC con (Tergitol@7) otros grupos
color verde a amarillo y que en la observación bacterianos, además de los coliformes. Este
microscópica correspondieron a bacilos Gram inconveniente de la técnica de filtración por
(+) esporulados chicos (tabla 5.) membrana podría ser evitado sembrando las
Tabla N° 5: Observación microscópica de colonias amarillas- anaranjadas desarrolladas en
colonias amarillas- anaranjadas. Agar Tergitol en un medio no selectivo como Agar
nutritivo (tal como lo detalla la Norma ISO 9308),
y luego sembrar estas colonias desarrolladas en
Caldo Lauril simple concentración. La ausencia
de turbidez y de gas en este caldo permite
descartar que la bacteria aislada sea del grupo
de los coliformes.
En relación las morfologías microscópicas
observadas de las colonias amarillas-anaranjadas
típicas crecidas en Agar de Lactosa TTC con
Tergitol@7 se detallan en la tabla 7. Se puede

Revista Argentina de Ingenieria • Año 2 • Volumen IV • Octubre de 2014

Técnica de filtración ISO 9308 aplicada al monitoreo de agua de red

observar que la morfología más predominante, - En el Agar de Lactosa TTC con (Tergitol@7)
tanto en el agua de los pozos de provisión como crecieron colonias amarillas de las cepas
de la red domiciliaria correspondió bacilo Gram tipificadas del género Streptococcus, lo que
(+) esporulados chicos. La otra morfología más confirma la presencia de colonias amarillas
frecuente fue de cocos Gram (+) (31,6% de las en las muestras de agua cuya identificación
colonias amarillas observadas en las muestras microscópica perteneció al grupo de cocos Gram
de agua extraída de la red) (tabla 7). (+).
Tabla N° 7: Porcentaje de las distintas - Luego de la observación microscópica de las
morfologías presentadas por las colonias colonias amarillas- anaranjadas desarrolladas
amarillas desarrolladas en el Agar de Lactosa en Agar de Lactosa TTC con Tergitol@7, la
TTC con (Tergitol@7) morfología predominante correspondió bacilo
Gram (+) esporulados chicos. La otra morfología
bacteriana presente, fue la de cocos Gram (+).
- El inconveniente de la técnica de filtración
por membrana debido al desarrollo de colonias
amarillas-anaranjadas que no son coliformes
Conclusiones en Agar de Lactosa TTC con (Tergitol@7), se
Las conclusiones del estudio en la evaluación puede evitar sembrando estas colonias crecidas
de la técnica de filtración por membrana ISO en un medio no selectivo (Agar nutritivo), en
9308 para la determinación de Coliformes Caldo Lauril simple concentración. La ausencia
totales y Escherichia coli fueron: de turbidez y de gas en este caldo permite
- Para la determinación de Coliformes descartar que la bacteria aislada sea del grupo
totales y E.coli, el método de filtración resulta de los coliformes. Esta modificación de la técnica
ser reproducible, con relación a las técnicas permite confirmar el resultado obtenido.
de fermentación por tubos múltiples, dando
resultados comparables. De las 109 muestras Referencias
de agua potable analizadas los resultados [1] APHA, AWWA, WEF Standard Methods
57
obtenidos con ambas técnicas fueron idénticos for the examination of water and wastewater
en el 99,10%. Ed. 21th, 2005.
- De las 40 muestras de agua que presentaron [2] Norma Española UNE-EN ISO 9308-
crecimiento de colonias amarillas- anaranjadas 1. Detección y recuento de Escherichia coli y
en Agar de Lactosa TTC con (Tergitol@7) cuando de bacterias coliformes. Parte 1: Método de
se sembraron en Caldo Lauril sulfato simple filtración de membrana (ISO 9308-1:2000).
concentración, 39 muestras no mostraron 2000.
turbidez ni producción de gas, confirmando el [3] Moyano Silvia, Pegoraro Lidia, Marín
resultado negativo para coliformes totales. La Graciela. Comparación de técnicas del número
muestra restante dio resultado positivo por el más probable y filtración de membrana para
método de filtración por membrana (2 ufc/100 el análisis microbiológico de agua. III Reunión
ml) y negativo con la técnica de fermentación Anual PROIMCA y I Reunión Anual PRODECA.
por tubos múltiples (< 2 NMP/100 ml). Esto Mendoza. Argentina.2011.
puede indicar una sensibilidad superior de la [4] Moyano Silvia; Marín Graciela; Pegoraro
técnica de filtración con respecto al método Lidia. Aplicación de la técnica microbiológica
del número más probable en niveles bajos de de filtración (ISO 9308-1) en la detección de
contaminación. coliformes totales en muestras de agua con
- En la observación microscópica de las baja contaminación. Congreso Internacional
colonias amarillas desarrolladas en el Agar de sobre Gestión y Tratamiento del Agua- Córdoba,
Lactosa TTC con (Tergitol@7). de muestras de Argentina.2012.
agua potable el 41% correspondieron a cocos [5] CULTIMED. Manual Básico de
Gram (+) y 41 % a bacilos Gram (+) esporulado. Microbiología. España. 2003.

Forestal, Agronomía y Alimentos

 Moyano y Marín

[6] MERCK. Manual de medios de cultivo.

Alemania. 1994.

58

Revista Argentina de Ingenieria • Año 2 • Volumen IV • Octubre de 2014