Cianobacterias Aguas Recreo
Cianobacterias Aguas Recreo
Cianobacterias Aguas Recreo
CARIDAD DE HOYOS ALONSO (*), LAURA VILLÉN DE LA FUENTE (*), DELIA MARTÍN DEL POZO (*),
LAURA CONDE BUENO (*), ANA MARÍA ALONSO GARCÍA (*), MARÍA ELENA GONZÁLEZ RAMOS (*),
MARÍA VERDUGO ALTHOFER (*) y JUAN AVILÉS GARCÍA (*)
RESUMEN Se han detectado afloramientos de microcistinas en masas de aguas de todo el mundo. La aparición de estos aflo-
ramientos puede provocar problemas en la calidad del agua debido a que ciertas especies de cianobacterias son capaces de
producir toxinas –microcistina, anatoxinas, saxitoxina o cilindroespermosina– que provocan riesgos para la salud pública.
Durante los últimos tres años se han muestreado 35 embalses españoles, con el fin de determinar la presencia y concen-
tración de dichas cianotoxinas. Los resultados muestran que en el 70% de las muestras que contenían cianobacterias, las
concentraciones de microcistinas eran superiores al límite recomendado por la Organización Mundial de la Salud en agua
potable. En los próximos cuatro años el CEH continuará con estos estudios en embalses de abastecimiento.
Nº de embalses 75 96 171
Trasona
Ebro
Belesar Aguilar de Campoo
Barcena
Castrelo
Conchas, Las
Cuerda del Pozo
Vencias, Las
Villagonzalo
Santa Teresa
Fuentes Claras Valmayor
San Juan
Picadas
Rosarito
Cazalegas
Guajaraz
Orellana Vicario, El
Zujar
Vega del Jabalón, La
Nogales
Valuengo Brovales Cenajo
Taibilla Ojos
Pedrera, La
Huesna Breña, La
Bornos Arcos
FIGURA 2. Localización de
los embalses estudiados.
La tendencia más habitual sugiere que la dominancia de Fastner et al, 2003). España es en donde se han detectado
cianobacterias se centra en la época estival y en ecosistemas las concentraciones de esta toxina más elevadas en Europa
eutróficos, aunque en algunas ocasiones pueden ser muy (Quesada et al, 2006).
abundantes en ecosistemas con grados tróficos medios. Dentro de las neurotoxinas, la anatoxina, que ha sido
Los datos sobre cianotoxinas en los embalses españoles descrita en algunos países europeos (Bumke-Vogt et al,
son más escasos. Desde el año 2004 al año 2007 se ha lle- 1999), no es muy frecuente en España, al menos es lo que
vado a cabo en el CEDEX un estudio para la Subdirección parecen indicar los primeros datos recogidos en los ecosiste-
General de Gestión Integral del Dominio Público Hidráulico mas investigados. Sólo se ha encontrado en concentraciones
del Ministerio de Medio Ambiente sobre cianobacterias y
cianotoxinas en embalses españoles utilizados para usos re-
creativos o destinados a producción de aguas de consumo. Se
han estudiado un total de 35 embalses (figura 2) algunos de
ellos durante varios años, desde mayo hasta octubre anali-
zándose parámetros fisico-químicos y biológicos (en el CE-
DEX y en la Universidad de Salamanca) y cianotoxinas y to-
xicidad (en la Universidad Autónoma de Madrid).
Los resultados de la primera fase del estudio indican que
las toxinas más abundantes en España son las microcisti-
nas. En nuestro estudio, el 70% de las muestras en las que
las cianobacterias fueron dominantes, presentaron microcis-
tinas (Equiv MCLR) en concentraciones superiores a
1μg/l–1. Si relacionamos estos resultados con los de la tabla
1, más del 15% de los embalses españoles presentarían en
algún momento concentraciones de microcistinas totales su-
periores a 1μg/l–1.
Se ha detectado por primera vez en España cilindrosper-
mopsina. Hasta ahora ha sido encontrada en dos embalses:
Arcos (Guadalquivir), asociada a Aphanizomenon ovalispo-
rum y Vega de Jabalón (Guadiana), asociada a Cylindrosper-
mopsis raciborskii (figura 3). La cilindrospermopsina ha
sido identificada en Europa como un problema emergente,
relacionado aparentemente con la presencia de especies de
FIGURA 3. Cylindrospermopsis raciborskii.
cianobacterias supuestamente invasivas (Padisák, 1997,
bajas en el embalse de Rosarito (Tajo), asociada a Anabaena En este nuevo proyecto se seguirá contando con la cola-
flos-aquae (Carrasco et al, 2007). Otras neurotoxinas impor- boración de la Universidad Autónoma de Madrid y de la
tantes, las saxitoxinas no han sido analizadas durante la Universidad de Salamanca en aspectos nuevos o que re-
primera fase de este estudio, pero en los embalses españoles quieran un trabajo de investigación (revisiones taxonómi-
hay especies de cianobacterias potencialmente productoras cas, análisis de nuevas toxinas, bioensayos con cultivos ce-
de esta toxina y se ha encontrado en aguas portuguesas (Pe- lulares e identificación molecular de cianobacterias
reira et al, 2000) por lo que a partir de este año se analizará productoras de toxinas).
esta toxina en los embalses en los que se pueda sospechar su En el Centro de Estudios Hidrográficos y dentro del Área
presencia. de Medio Ambiente Hídrico, además de continuar con los
Los estudios de toxicidad con Artemia salina y el nema- trabajos que se han venido realizando hasta ahora (mues-
todo Caenorhabditis elegans, han ofrecido resultados algu- treos de campo, análisis físico-químicos, determinación y
nas veces bastante dispares. Este límite de detección es bajo cuantificación de fitoplancton e identificación de las especies
por lo que se va a seguir investigando en estos métodos y se potencialmente tóxicas), se han realizado varias inversiones
van a empezar a utilizar otros bioensayos basados en culti- para la puesta a punto metodologías que permitirán el aná-
vos celulares. lisis de toxinas y toxicidad (figuras 4, 5, 6 y 7).
Por otro lado, los muestreos repetidos de varios puntos,
durante varios años, han permitido estudiar la variabilidad
interanual de cianobacterias. El cociente de variación inte-
5. BIOENSAYOS DE TOXICIDAD
ranual para el biovolumen de cianobacterias es 1,12, es un En la mayoría de los casos la identificación de especies cia-
valor muy alto, mucho mayor que en el caso de la clorofila: nobacterianas potencialmente tóxicas no es suficiente para
0,37. También es muy variable la composición específica de determinar si un afloramiento es tóxico o no ya que varias
un año a otro. Este aspecto debería tenerse en cuenta en la cepas con diferente toxicidad pueden pertenecer a la misma
elaboración de los perfiles de aguas de baño requeridos en la especie. Por ello es necesario caracterizar la toxicidad.
Directiva 76/160/CEE, en los que hay que señalar la propen- Los bioensayos dan una idea de la toxicidad efectiva de la
sión de proliferación de cianobacterias. muestra permitiendo así revelar la existencia de posibles si-
nergias o antagonismos entre compuestos o la presencia de
4. FUTUROS PROYECTOS DEL CENTRO DE ESTUDIOS nuevas sustancias tóxicas que permanecerían ocultas en el
caso de las técnicas analíticas. En toxicología se usa el con-
HIDROGRÁFICOS cepto de la dosis letal 50 (DL50) como la dosis necesaria para
En la primavera del 2008 y dentro de la Encomienda de matar a la mitad de la población en estudio. Esta variable nos
Gestión (2007-2011) firmada entre el CEDEX y la Dirección va a permitir comparar como de tóxicas son diferentes sustan-
General del Agua se va a iniciar el estudio “Identificación cias, de manera que valores pequeños nos van a indicar mayo-
molecular de cianobacterias potencialmente productoras de res toxicidades, dado que es necesario estar expuesto a meno-
toxinas, análisis de cianotoxicidad y bioensayos de toxicidad res dosis para matar al 50% de la población.
mediante nuevos métodos”. Este estudio de cuatro años de El bioensayo con ratones consiste en una inyección intra-
duración es continuación de los realizados anteriormente y peritoneal seguida de una observación durante 24 horas. Es
se va a centrar en embalses destinados al agua de consumo. un método que mide la toxicidad total. Este tipo de ensayos
FIGURA 4. Columna de
rotación y espectrofotómetro
de doble haz (C.E.H).
FIGURA 7. Determinaciones de
microcistinas por HPLC/MS/MS
(C.E.H).
C: \Xcalibur\...\170608\patron8
80 Genesis
RT: 1.03 patron8
60 SN: 48 RT: 14.81
SN: 32
40
20
0 RT: 12.36 NL:
SN: 264 6.91E6
100 m/z=
Relative Abundance
825.00–
80 826.00 MS
60 Nodularina Genesis
patron8
40
20
0 RT: 12.36 NL:
SN: 264 3.30E5
100 m/z=
Relative Abundance
80 1045.00–
1046.00 MS
60 Genesis
patron8
40 Microcistina YR
20
0 NL:
RT: 14.81
SN: 43 6.75E5
100 m/z=
Relative Abundance
80 995.00–
996.00 MS
60 Genesis
patron8
40 Microcistina LR
20
0
RT: 10.63 NL:
100 SN: 237 1.32E7
m/z=
Relative Abundance
80 519.50–
520.50 MS
60 Genesis
RT: 1.03 patron8
40 SN: 76 Microcistina RR FIGURA 8. Cromatograma e
20 iones extraídos de una mezcla
patrón de nodularina,
0 microcistina YR, microcistina
0 10 20 RR y microcistina LR.
Uno de los métodos más extensamente utilizados en G.A. & Quesada, A. 2007. Anatoxin-a occurrence and poten-
HPLC para la detección de cianotoxinas, implica la separa- cial cyanobacterial anatoxina-a producers in Spanish reser-
ción de las toxinas en una columna C18 utilizando un gra- voirs. J. Phycol. 43: 1120-1125.
diente agua y acetonitrilo, ambos con el 0.05% de ácido tri-
fluoroacético (TFA). Codd, G.A., Bell, S.G., Kaya, K., Ward, C.J., Beattie, K.A. &
Las técnicas de detección acopladas a HPLC más emplea- Metcalf, J.S. (1999). Cyanobacterial toxins, exposure routes
das para la determinación de de cianotoxinas en aguas son and human health. Eur. J. Phycol., 34: 405-415.
la detección por fotodiodo-array (HPLC-PDA) y la espectro- Campbell, D. L., Lawton, L. A., Beattie, K. A. & Codd, G.A.
metría de masas (HPLC-MS). La detección por PDA tiene (1994). Comparative assesment of the specificity of the brine
una capacidad limitada a la hora de distinguir entre las di- shrimp and microtox assays to hepatotoxic (Microcystin-LR-
ferentes variantes de microcistinas si estas coeluyen, debido Containing) cyanobacteria. Environmental Toxicology and
a que la mayor parte de las variantes tienen un perfil de ab- Water Quality: An International Journal, 9:71-77.
sorción similar entre 200 y 300 nm, impidiendo en ciertos
casos la correcta identificación. De Hoyos, C., Negro, A.I. & Aldasoro, J.J. 2004. Cyanobacte-
Se puede alcanzar una identificación más exacta de es- ria distribution and abundance in the Spanish water reser-
tas biotoxinas mediante el empleo de la espectrometría de voirs during stratification. Limnetica 23 (1-2): 119-132.
masas (MS), debido a que permite obtener una “huella di- Fastner, J., Heinze, R., Humpage, A.R., Mischke, V., Eagles-
gital” de las toxinas individuales. La espectrometría de ham, G.K. & Chorus, I. 2003. Cylindrospermopsin occu-
masas permite llevar a cabo determinaciones cualitativas rrence in two German lakes and preliminary assessment of
y cuantitativas, y analizar mezclas complejas de compues- toxicity and toxin production of Cylindrospermopsis raci-
tos orgánicos muy diversos con rapidez y sensibilidad, su- borskii (Cyanobacteria) isolates. Toxicon 42: 313-21.
ministrando información estructural de los compuestos
presentes. Está técnica se puede utilizar para la detección Kuiper-Goodman, Falconer, T.I. & Fitzgerald J. (2002). Hu-
y la cuantificación de saxitoxina, anatoxina-a, microcisti- man health aspects. In Toxic cyanobacteria in water. A guide
nas, nodularinas y otras biotoxinas presentes en el agua. to their public health consequences, monitoring and manage-
Además el acoplamiento en tandem de MS/MS permite ment. Chorus, I. & J. Bartram ed.
fragmentar el ión de interés y el análisis de los fragmen-
tos generados, lo que permite una mejor identificación y Kirivanta, J., Sivonen, K. & Niemela, S. I. 1991. Detection of
cuantificación de la toxina analizada. Esto lo convierte en toxiciy of cianobacteria by Artemia Salina biossay. Environ.
un instrumento de diagnostico útil para identificar va- Toxicol. Water Qual. 6:423-436.
riantes de microcistinas de los que no se poseen patrones Metcalf, J.S., Lindsay, J., Beattie, K.A., Birmingham, S., Sa-
e identificarlas de forma inequívoca en muestras ambien- ker, M.L., Torokne, A.K. & Codd, G.A. (2002) Toxicity of Cy-
tales complejas. lindrospermopsin to the Brine Shrimp Artemia Salina: Com-
Pero en general estos métodos requieren un proceso pre- parisons With Protein Synthesis Inhibitors and
vio de limpieza y concentración de la muestra, que en algu- Microcystins. Toxicon, 40, pp. 1115-1120.
nos casos es tedioso y lento. En la actualidad se están reali-
zando estudios encaminados a realizar procesos de una Padisák, J. 1997. Cylindrospermopsis raciborskii (Wo-
forma on-line, combinando el uso de dos columnas cromato- toszynska) Seenaya and Subba Raju, an expanding, highly
gráficas, la primera destinada a la preconcentración de un adaptive cyanobacterium: worlwide distribution and review
volumen determinado de muestra y una segunda columna of ecology. Arch. Hydrobiol. 107 (suppl): 563-93.
destinada a la separación analítica. Esto permite utilizar un Pereira, P., Onodera, H., Andrinolo, D., Franca, S., Araújo,
menor volumen de muestra y una mayor velocidad de análi- F., Lagos, N. & Oshima Y. 2000. Paralytic shellfish toxins in
sis y menor manupilación de la muestra con el consiguiente the freshwater cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae,
deterioro de la misma. isolated from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon, 38:
El laboratorio de Calidad de las Aguas ha adquirido un 1689-1702.
sistema HPLC-MS/MS formado por un sistema E-Quan
para preconcentración on-line, una bomba de ultra-alta pre- Quesada, A. 2003. Cianobacterias y cianotoxinas en España.
sión y un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (TSQ Algas 30: 7-9.
Quantum) (figura 7). Se está realizando la determinación de
diversas cianotoxinas (saxitoxina, anatoxina-a, microcisti- Quesada, A. 2005. Toxicidad de cianobacterias. Biología y
nas, nodularinas) y otras biotoxinas presentes en el agua de ecología de las cianotoxinas. XII Curso sobre Limnología
embalses. En la figura 8 se muestra un cromatograma de aplicada: Embalses, lagunas y ríos. CEDEX. 149-156.
una disolución patrón que contiene tres variantes de micro- Quesada, A., Moreno, E., Carrasco, D., Paniagua, T., Wor-
cistinas y nodularina y los correspondientes espectros de los mer, L. De Hoyos, C and Sukenik, A. 2006. Toxicity of Apha-
iones extraídos. nizomenon ovalisporum (Cyanobacteria) in a Spanish water
reservoir. Eur. J. Phycol. 41: 39-45.
7. BIBLIOGRAFÍA Reynolds, C.S. 1987. Cyanobacterial Water-blooms. Biol.
Bumke-Vogt, C., Mailahn, W. & Chorus, I. 1999. Anatoxin-a Rev., 50: 437-481.
and neurotoxic cyanobacteria in German lakes and reser-
voirs. Environ. Toxicol. 14: 117-25. Sivonen, K. & Jones, G. (1999). Cyanobacterial toxins. . In
Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health
Carrasco, D., Moreno, E.; paniagua, T., De Hoyos, C., Wor- consequences, monitoring and management. Chorus, I. & J.
mer, L, Sanchis, D., Cirés, S., Martín del Pozo, D., Codd, Bartram ed.