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    Purificación Parcial de Lisozima de Clara de Huevo

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    El estudiante realizó una purificación parcial de la lisozima de la clara de huevo mediante cromatografía de intercambio iónico. Se obtuvieron cuatro fracciones y se cuantificó la actividad enzimática y concentración de proteínas en cada una. La Fracción 4 presentó la mayor pureza de lisozima, aunque tuvo menor actividad enzimática total que la Fracción 1 sin purificar. El proceso eliminó otras proteínas como la ovoalbúmina.

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    Purificación Parcial de Lisozima de Clara de Huevo

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    El estudiante realizó una purificación parcial de la lisozima de la clara de huevo mediante cromatografía de intercambio iónico. Se obtuvieron cuatro fracciones y se cuantificó la actividad enzimática y concentración de proteínas en cada una. La Fracción 4 presentó la mayor pureza de lisozima, aunque tuvo menor actividad enzimática total que la Fracción 1 sin purificar. El proceso eliminó otras proteínas como la ovoalbúmina.

    Título original

    Purificación Parcial de Lisozima de clara de huevo

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    El estudiante realizó una purificación parcial de la lisozima de la clara de huevo mediante cromatografía de intercambio iónico. Se obtuvieron cuatro fracciones y se cuantificó la actividad enzimática y concentración de proteínas en cada una. La Fracción 4 presentó la mayor pureza de lisozima, aunque tuvo menor actividad enzimática total que la Fracción 1 sin purificar. El proceso eliminó otras proteínas como la ovoalbúmina.

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    El estudiante realizó una purificación parcial de la lisozima de la clara de huevo mediante cromatografía de intercambio iónico. Se obtuvieron cuatro fracciones y se cuantificó la actividad enzimática y concentración de proteínas en cada una. La Fracción 4 presentó la mayor pureza de lisozima, aunque tuvo menor actividad enzimática total que la Fracción 1 sin purificar. El proceso eliminó otras proteínas como la ovoalbúmina.

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    de 7

    Instituto Politécnico Nacional

    Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

    LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

    “Purificación parcial de lisozima de clara de huevo”

    ALUMNO: Juárez Castillón Luis Enrique

    GRUPO: 4IV1

    SECCCIÓN: 3
    Objetivos
    El alumno:
    a) Realizará una purificación parcial de la lisozima de la clara de huevo por
    cromatografía de intercambio iónico.
    b) Cuantificará la actividad de la lisozima en las cuatro fracciones que se
    obtienen durante el proceso de purificación.
    c) Determinará la actividad específica de las cuatro fracciones que se obtienen
    en el proceso de purificación.
    d) Calculará algunos de los parámetros involucrados en la cromatografía por
    intercambio iónico.

    Cromatografía por intercambio iónico


    Separa moléculas basadas en las cargas totales que presentan a un pH
    determinado.

    Resultados
    Tabla 1. Actividad de la lisozima en las fracciones obtenidas.
    Fracción A450 A450
    tiempo cero después de 2 min ∆A450/min ∆A450/min/ml

    F1 0.74 0.62 0.06 2


    F2 0.74 0.726 0.007 0.233333333
    F3 0.738 0.718 0.01 0.333333333
    F4 0.74 0.668 0.036 1.2

    Tabla 2. Curva de calibración de albúmina por el método de Bradford.


    A595
    Tubo No. Cantidad de proteína (µg)
    Serie A Serie B
    1, 1' 2 0.147 0.156
    2, 2' 4 0.278 0.288
    3, 3' 6 0.354 0.378
    4, 4' 8 0.478 0.472
    5, 5' 10 0.558 0.546
    0.6
    y = 0.0511x + 0.0564
    0.5 R² = 0.9927

    Absorbancia (595nm)
    0.4

    0.3
    Serie A
    0.2 Serie B

    0.1

    0
    0 2 4 6 8 10 12
    Concentración de proteína (µg)

    Tabla 3. Determinación del grado de purificación de la Lisozima.


    Fracción Actividad Concentración de Actividad específica(actividad Purificación de
    enzimática proteínas (mg/mL) enzimática/ mg de proteína) lisozima (veces)
    ∆A450/min/ml
    F1 2 4.125244618 0.484819734 1
    F2 0.233333333 3.009784736 0.077524924 0.159904638
    F3 0.333333333 1.85518591 0.179676512 0.370604782
    F4 1.2 0.423679061 2.832332564 5.842032333

    Cálculos
    A595 Cantidad de proteína por Dilución
    interpolación en curva
    tipo(µg/mL)
    0.478 8.250489237 500
    0.364 6.019569472 500
    0.246 3.71037182 500
    0.143 1.694716243 250
     Porcentaje de retención del intercambiador

     Porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima

    Discusión

    Como sabemos, el desarrollo de esta práctica se hizo con la técnica de


    cromatografía por intercambio iónico. Recordando que su fundamento se basa en
    la separación de moléculas por las cargas totales de estas mismas.
    Sin embargo, nuestra proteína a la cual se le hizo el proceso de purificación
    parcial fue la lisozima, por lo que gracias a su pH se vió favorable la técnica de
    cromatografía por intercambio iónico.

    Por otro lado, para la purificación de esta proteína se obtuvieron cuatro fracciones.
    Una vez obtenidas estas fracciones, se utilizó la suspensión de las células de
    Micrococcus lysodeikticus (a 450nm y tiempo 0).
    Posteriormente a la solución se le agregó 30 μL de la fracción correspondiente,
    después del tiempo establecido (dos minutos) se anotó la absorbancia dada.
    Analizando, se observa que la actividad enzimática es proporcional a la
    disminución de la absorbancia a 450nm.

    Finalmente se elaboró una curva de calibración empleando el método de Bradford,


    esto con la finalidad de determinar la cantidad de proteína. Observamos también
    que la cantidad de proteína va disminuyendo parcialmente durante cada fracción ,
    siendo la fracción 1 la que contiene mayor cantidad de proteína, debido a que esta
    fracción contiene clara de huevo diluida, mientras que la fracción 4 contiene menor
    cantidad de proteína indicando que sólo tenemos la lisozima.

    Conclusiones
    • Se comprobó que la cromatografía por intercambio iónico es la más
    apropiada para la purificación de la lisozima.
    • Se cuantificó y determinó la actividad específica de las cuatro fracciones.
    • Se calculó algunos parámetros como porcentaje de retención del
    intercambiador y porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima.

    Preguntas Extra
    1. Además de Micrococcus lysodeikticus, menciona 3 microorganismos con lo que
    se pueda medir la actividad enzimática de la lisozima.
    • Sarcina lute
    • Bacillus subtilis
    • Bacillus megaterium
    2. ¿Qué reacción cataliza la lisozima?
    Cataliza la hidrólisis de enlaces glicosídicos β (1-4) entre el ácido N-
    acetilmurámico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG) del peptidoglicano de la pared
    celular de las bacterias.
    3. ¿Qué carga superficial presenta la CM-celulosa activada?
    Positiva, ya que las cargas positivas están alrededor de las cargas negativas de la
    CM-celulosa y así las partículas positivas de la lisozima se adhieran.
    4. ¿Qué carga tiene la lisozima al pH del regulador A, es mayor a su punto
    isoeléctrico?
    El pI de la lisozima es de 10.7, el regulador A esta a pH de 10, por lo tanto es
    menor a su pI y la molécula estará protonada.
    5. Explique qué característica de la lisozima es la base para esta purificación, es
    decir para separarla de otras proteínas en la mezcla.
    La lisozima tiene un punto isoeléctrico de 10.7, dos unidades de pH superior al
    resto de las proteínas que están presentes en la clara del huevo. Gracias a esto se
    puede separar la lisozima del resto de las proteínas por medio de cromatografía
    por intercambio iónico.
    6. ¿Porque eluye la lisozima con el regulador B?, ¿Cuál es el ion clave?
    La lisozima quedo adherida a la CM-celulosa, para que la lisozima eluya, se debe
    de cambiar el pH o añadir sales que compitan por la muestra.
    Como sabemos el regulador B es glicina/NaOH 0.1M, pH 10, conteniendo 0.6 M
    de NaCl; este contiene NaCl que es una sal, por lo tanto, compite con la lisozima,
    permitiendo que esta eluya.
    7. ¿Para qué sirven los lavados con regulador A?
    Para activar la CM-celulosa y eliminar proteínas que no son la lisozima.
    8. Al final para lograr la elución de la lisozima, ¿utilizamos cambio de pH o adición
    de sales?
    Adición de sales, agregamos regulador B que contiene NaCl.
    9. ¿Cuál fue el propósito de la purificación si la Fracción 1 (F1-antes de la
    purificación) presenta mayor actividad enzimática que la Fracción 4 (F4-después
    de la purificación)? ¿Qué moléculas se eliminaron?
    La clara de huevo contiene, además de lisozima otras enzimas que pueden ayudar
    a proteger de microrganismos.
    Se eliminaron proteínas como la ovoalbúmina que contiene la clara del huevo y
    otras enzimas.
    10. ¿Si se hubiera medido la cantidad de proteínas en la fracción que se desechó,
    sería: mayor o menor que en la Fracción 3?, ¿mayor o menor que en la Fracción
    4?
    Menor a la fracción 4 y mayor a la fracción 3.
    11. ¿Qué pasaría con la actividad enzimática si las fracciones obtenidas no se
    mantuvieran en hielo?
    Las enzimas tienen una temperatura óptima.
    Esto quiere decir que, al aumentar la temperatura, la actividad enzimática
    (velocidad de reacción) aumenta, pero llega un punto donde si se sigue
    aumentando la temperatura la actividad enzimática disminuye.
    Se mantiene en hielo para que la enzima no comience a desnaturalizarse.
    12. Con sus palabras defina a que se refieren el porcentaje de retención del
    intercambiador y el porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima.
    El porcentaje de retención del intercambiador, nos indica la interacción se los
    iones con la carga de la fase estacionaria.
    El porcentaje de recuperación de la actividad de la lisozima, nos indica cuanta
    lisozima se logró purificar.
    13. Mencione 3 ejemplos de uso en la industria de: Cosméticos
    • Es utilizada en la industria para diferentes fines por su demostrada actividad
    antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas y su actividad antiviral.
    Muchas modificaciones de la proteína permiten ampliar su espectro
    antibacteriano logrando así afectar a bacterias Gram-negativas.
    • Funciona como conservante en algunos productos.
    • Se usa en cremas hidratantes como antibacteriano.
    Referencias
     Carrillo, W. (2013). Lisozima: Actividad antibacteriana y alergenicidad.
    Recuperado el: 25/06/2020, de: Instituto de Investigación en Ciencias de la
    Alimentación (CIAL-CSIC-UAM) Madrid- España. Sitio web:
    http://www.revistasan.org.ar/pdf_files/trabajos/vol_14/num_4/RSAN_14_4_3
    14.pdf
     Berg J., Tymoczko J., Stryer L., “Bioquímica”. 6ª edición. Ed. Reverté
    (2008), pp. 69.70.

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