INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Laboratorio de Bioqumica Microbiana
Balance de fermentacin. Integrantes: Esquivel Arviz Lizbeth Garca Paredes Jazmn Martnez Arce Claudia Lizethe Morn Carpio Abigail Vilchis Torrez Joel David

Grupo 5IV1 Seccin 1

Profesores: Susana Alfaro Aguilar Eduardo Montoya Daz

Hiptesis y diseo experimental Objetivos Registro de datos Manejo de datos Discusin de resultados Conclusiones Referencias Biliogrficas

3% 1% 3% 4% 5% 3% 1%
1

Hiptesis.
Si la fermentacin llevada a cabo por Saccharomyces cerevisiae es una fermentacin alcohlica entonces tendr como productos el Etanol y liberacin de CO2. S las determinaciones por el mtodo de Conway para etanol, gravimtrico de CO 2 y glucosa residual se llevan a cabo con la mayor precisin posible, entonces tendr un ndice de O/R cercano a 1.

Diseo experimental.
Se realiza un micro-ensayo de fermentacin con Saccharomyces cerevisiae, utilizando glucosa como sustrato, en el cual se cuantificar los productos obtenidos: etanol y dixido de carbn, as como la glucosa residual. Mtodo de Conway Se basa en el poder oxidante del dicromato de potasio (K2Cr2O7) en cido sulfrico (H2SO4), el Cr2O7= de color amarillo-naranja produce, por reduccin, al in cromoso de una tonalidad verde-azul que es oxidado cuantitativamente cido actico (CH3COOH) y agua. 2 K2Cr2O7 +8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 2 K2SO4 + 2 CH3CHOO + 2 Cr2(SO4)3 + 11 H2O El in reducido es colorido, se puede leer en el espectro visible a 445nm debido a que sta es la longitud de onda mxima a la que absorbe el dicromato de potasio. Lo que se lee realmente es el dicromato que no reaccion, ya que al aumentar la concentracin de etanol aumenta el cromato. La grfica resulta ser una recta cuya pendiente es negativa. Determinacin de C02 por gravimetra. A partir de la formacin de bicarbonato de sodio por la reaccin del CO2 con el NaOH se pone a reaccionar con BaCl2 se forma el precipitado BaCO3 que se recolecta en papel filtro y por diferencias de pesos entre el papel filtro sin el precipitado y el papel filtro con el precipitado se obtiene la cantidad de precipitado que en base a la conversin por un factor gravimtrico se cuantifica la cantidad de CO2 producido durante la fermentacin. 2 NaOH + CO2 Na2CO3 + H2O Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2 NaCl CO2 BaCO3 Determinacin de la glucosa residual Se realizara por medio del mtodo del DNS. El cual se basa en la reduccin del DNS (color amarillo) por la Glucosa (azcar reductor) al acido 3-amino-5-nitrosalicilico (Fig. 1) de color rojo previo calentamiento por 10 min en bao mara en ebullicin. El cual el 3-amino-5-nitrosalicilico es equivalente a la concentracin de glucosa en el medio, siendo as que se leer la absorbancia a 540nm en el espectrofotmetro.

Ilustracin 1. Reaccin del DNS con la glucosa como azcar reductor.

Reactivos. Reactivo
N2

Funcin
Crea una atmosfera de anaerobiosis dentro del matraz lo que permitir el desarrollo de la fermentacin. Detiene el proceso de fermentacin. Llevar a volmenes indicados, realizar lavado o aforar. Realizar los lavados del precipitado formado por el mtodo de gravimetra para la determinacin de CO2.

cido tricloroactico Agua destilada Agua detilada libre de CO2

DNS en tartrato de sodio- La determinacin de azcares reductores, involucra la oxidacin del potasio grupo funcional aldehdo presente. Carbonato de potasio saturado Agente liberador del etanol.

Cloruro de bario al 5% en agua Forma un precipitado (BaCO3) con el CO2, para ser determinado por libre de CO2 gravimetra. Dicromato de potasio Glucosa Glucosa 100 mg/mL Etanol 1500mg/mL Agente atrapante de etanol, este realiza una oxidacin sobre el etanol Sustrato a fermentar. Se realiza la curva tipo para determinar la glucosa residual. Se realiza la curva tipo para la derminacin de etanol por el mtodo de Conway. Reacciona con CO2 de la fermentacin para la formacin de Na2CO3. Neutralizante de Ac. Tricloroactico. Mantiene el pH a 6.8 constante durante la fermentacin. Microorganismo que realiza la fermentacin. S. cerevisiae.

NaOH 10% KOH 10% Regulador de fosfatos Suspensin Celular

Objetivos generales.
Realizar un micro ensayo para la fermentacin de glucosa por la levadura Saccharomyces cerevisae para la cuantificacin de sus productos. Llevar a cabo un proceso de fermentacin utilizando una levadura de uso industrial y conocer la eficiencia de dicho proceso.

Objetivos especficos.
Cuantificar los productos de inters liberados durante un proceso de fermentacin (etanol y dixido de carbono) a travs del mtodo de Conway, para el caso del etanol y gravimetra, para el caso de CO2. Realizar un balance de fermentacin utilizando los datos obtenidos experimentalmente. Determinar la prdida de carbono efectuada durante el proceso de fermentacin de Saccharomyces cerevisiae.

Registro de datos.
1. Curva tipo etanol.
Tabla 1. Curva tipo de etanol 1500 mg/mL leda a 445nm.

g de etanol 0 250 500 1000 1500 2000 2500

Absorbencia a 445nm 1.075 0.979 0.849 0.691 0.520 0.432 0.220

Grfica 1. Curva tipo de etanol preparada de 0 a 2500g de etanol para el mtodo de Conway ledo a 445nm.
1.200 1.000 0.800 A 445 nm 0.600 0.400 0.200 0.000 0 500 1000 1500 2000 2500 g de etanol y = -0.0003x + 1.0453 R = 0.9899

2. Determinacin de etanol formado en la fermentacin.

Tabla2. Absorbancia obtenida a 445nm por el etanol producido en la fermentacin de glucosa por S. cerevisiae.

Muestras 0.2 mL de muestra fermentada 0.4mL de muestra fermentada 1.0 mL de muestra testigo 3. Curva tipo de glucosa

Absorbencia a 445 nm 0.419 0.551 0.902

Tabla 3. Curva tipo de glucosa 100 mg/mL a 540nm por mtodo colorimtrico DNS.

g de glucosa 0 100 200 300 400 500

Absorbencia a 540nm 0 0.188 0.405 0.656 0.883 1.098

Grfica 2. Curva tipo de glucosa preparada de 0 a 500g por el mtodo del DNS leda a 540 nm.
1.2

1 y = 0.0022x - 0.0207 R = 0.9986

0.8 A 540nm

0.6

0.4

0.2

0 0 100 200 300 g de glucosa 400 500

4. Determinacin de glucosa residual por la fermentacin

Tabla 4. Absorbancia obtenida a 540nm por la glucosa residual producida de la fermentacin de glucosa por S. cerevisiae.

Muestras 0.2 mL de sobrenadante diluido 1:10 0.4 mL de sobrenadante diluido 1:20 1 mL de sobrenadante testigo sin diluir

Absorbencia a 540nm 0.325 0.221

5. Determinacin de CO2
Tabla 5. Determinacin de BaCO3 por el mtodo gravimtrico a travs de diferencia de pesos de papel filtro.

Muestras Papel filtro Papel filtro + BaCO3 BaCO3 de fermentacin Papel filtro Testigo Papel filtro + BaCO3 Testigo BaCO3 Testigo

Peso en gramos (g) 0.8131 0.9261 0.1130 0.8158 0.8548 0.0390

Manejo de datos.
1. Determinacin de etanol producido durante la fermentacin. Ecuacin de la recta y = ax+b Ecuacin emprica r2=0.9899 a=-3.28x10-3 b = 1.0445 Despeje de x y= - 3.28x10-3 X + 1.0445

Se sustituyen los datos de A (445nm) obtenidos en la tabla anterior en la ecuacin de la recta obtenida de la curva tipo de Etanol.

Problema: Alcuota 0.2ml: ( )( ) ( )( )

Alcuota 0.4ml: ( )( ) ( )( )

Testigo: ( )( ) ( )( )

Se obtiene un promedio de la interpolacin de los testigos:

y se le resta al testigo el promedio del problema para obtener:

Y se obtiene al fin el nmero de moles deEtanol formado en la fermentacin en mmoles, tomando en cuenta que se tienen 46mg/mol de Etanol tericamente:

n= 2. Determinacin de glucosa residual. Ecuacin de la recta y = ax+b Ecuacin emprica y= 2.236 x10-3 X + 0.0206

r2=0.999 a= 2.236x10-3 b = 0.0206 Despeje de x

Se sustituyen los datos de A (540nm) obtenidos en la tabla anterior en la ecuacin de la recta obtenida de la curva tipo de Glucosa. Problema (dilucin 1:20): ( )( ) ( )( )

( Testigo:

)(

)(

)(

y se le resta al testigo el resultado del problema para obtener:

Se obtiene la glucosa fermentada, tomando en cuenta que se tienen 180mg/ml de Glucosa inicial: Glucosa inicial: 180g --- 1M--- 1000 ml 360g --- 2M ---1000 ml x-------------- 0.5 ml

Y se obtiene as el nmero de moles de Glucosa fermentada en mmoles:

3. Determinacin de CO2. Fg= factor gravimtrico

Se resta BaCO3 testigo a BaCO3 de fermentacin para despus multiplicarlo por el factor gravimtrico y obtener con este el nmero de moles de BaCO3 obtenidos en la fermentacin.
( )( )

)(

4. Balance de fermentacin. Tabla 6. Balance de fermentacin. 1 (mmol) Fuente de Carbono Glucosa Productos EtOH CO2 2 (mmol) 3 4 5 6 (mmol) N de C

0.663

1.358 0.375

2.048 0.566

-2 +2 1.131

-4.096

4.096 0.566 = 4.662

2 1

Columna 3:

H=-0.5

O= +1 CO2: O = +1 X 2 = +2

Etanol (CH3-CH2-OH): H = -0.5 X 6 =-3 O = +1 X 1 = +1 = -2

Columna 4: Productos oxidados CO2= (0.564)(2)= 1.131 Columna 6: 1 mmol x 6= 6mmol 2.048mmol x 2= 4.096 mmol 0.566 x 1 = 0.566 mmol ndice O/R:

Columna 5: Productos reducidos EtOH= (2.048)(-2)= -4.096

% de Carbono recuperado: 6 mol --- 100 % 4.662 mol --- x % X=77.7 %

Discusin.
Cuando en una fermentacin se producen varios productos finales la bacteria dispone de diferentes alternativas para reoxidar del NADH, no existe a priori una estequiometria definida. En cada caso concreto, segn sea la bacteria y las condiciones de cultivo, puede cuantificarse tanto el consumo de glucosa (u otro sustrato) como la produccin de productos finales I. Las levaduras como microorganismos quimiohetertrofos, necesitan compuestos orgnicos como fuentes de carbono y energa (FCE). Los glcidos, principalmente las hexosas, son los compuestos ms utilizados como FCE tanto para el metabolismo aerbico como anaerbico VIII. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismos muy utilizado en la microbiologa industrial, en la produccin de pan, grasas glicerina y la ms importante la de bebidas fermentadas I. En las levaduras, bajo condiciones anaerbicas el NAD+ se regenera por medio de la fermentacin alcohlica: la conversin del piruvato en etanol y CO2. Mediante dos reacciones consecutivas catalizada por dos enzimas III (ilustracin 2). Por cada mol de glucosa que entra en la va Embden Meyerhof Parnas se producir 2 moles de piruvato, los cuales al incorporase al metabolismo fermentativo (fermentacin alcohlica), se producir 2 moles de dixido de carbono y 2 moles de etanol. Esto es muy importante que sea tomado en cuanta en el momento de elaborar un balance de fermentacin IX.

Ilustracin 2. Reacciones llevadas a cabo en fermentacin alcohlica.

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Por lo anterior podemos decir que S. cereviciae, en condiciones de anaerobiosis, por cada mol de glucosa produce 1 mol de Dixido de carbono y 1 mol de etanol, por esta razn nuestros clculos dependen de muchos factores, tales como el mtodo y los errores cometidos durante su ejecucin. Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis (fermentacin del pulque) y otras levaduras como Leuconostoc descomponen la glucosa para producir etanol, reoxidando NADH aunque cabe mencionar que la estequiometria vara dependiendo el microorganismo, pues tericamente no tienen la misma relacin de productos oxidados y reducidos y en la prctica estos pueden variar an ms. La fermentacin alcohlica es un proceso muy complejo; el incremento de la concentracin de etanol a medida que transcurre la fermentacin supone un obstculo para el correcto crecimiento y desarrollo de la levadura por los efectos negativos que esto conlleva. El etanol afecta la permeabilidad de la membrana celular disminuyendo su selectividad, de forma que las levaduras en un medio con alta concentracin alcohlica pierden propiedades funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimasVIII. Una diferencia importante entre las levaduras silvestres y las levaduras de vino cultivadas es su tolerancia al etanol. La mayor parte de las levaduras silvestres pueden tolerar solamente alrededor de un 4 % v/v de etanol; cuando la concentracin de alcohol llega a este punto, la fermentacin se detiene.X Los balances de fermentacin son esenciales para su aplicacin en la industria, el principal objetivo del anlisis de las fermentaciones es el de dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia un producto metablico de importancia industrial, y obtener el mximo rendimiento posible. VIII Ahora bien en la prctica se realizo un microensayo de una fermentacin alcohlica, una de las fermentaciones que solo tiene dos productos metablicos: el etanol y el dixido de carbono. Los cuales se les determin su concentracin por los mtodos de Conway y gravimtrico, respectivamente, para conocer el % de carbono recuperado en el proceso fermentativo, as como tambin se determin la concentracin de glucosa fermentada. Estos mtodos pueden presentar interferencias que afectan los balances de fermentacin. El mtodo de Conway, como ya hemos mencionado, se basa en la oxidacin del alcohol por accin de una solucin de dicromato de potasio en medio cido por cido sulfrico. El alcohol es oxidado cuantitativamente a cido actico y el dicromato es reducido a cromo trivalente, de acuerdo con la siguiente reaccin. 2 K2Cr2O7 +8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 2 K2SO4 + 2 CH3CHOO + 2 Cr2(SO4)3 + 11 H2O En cuanto a la manera en que fue llevado a cabo el experimento, podemos decir que fue adecuada, ya que se estuvo al tanto de que no se mezclaran el contenido de la cmara central (K2Cr2O7), con el contenido de la cmara externa (H2SO4 y K2CO3) y se procur recuperar la mayor cantidad posible de K2Cr2O7. El rendimiento terico estequiomtrico para la transformacin de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1g de glucosa XI. Nosotros obtuvimos una recuperacin de 1.358 mmol de Etanol que correspondera a 67.9% del total, tomando como base 2 mmol de Etanol. Por lo que podemos decir que nuestro rendimiento fue bueno. Como resultados observamos en la tabla 6 el balance de fermentacin obtenido, el rendimiento de la reaccin se aprecia en el porciento de carbono recuperado, siendo este entre 80% y 100%. Cuando hay un bajo rendimiento es atribuido a una prdida de productos, en el caso del CO2, una fuga en el sistema, o en el caso de que en el sistema presentara un escaso residuo de oxigeno en el medio, el cual se vera afectado por el efecto 11

PasteurI. En el caso de la glucosa pudo ser una interferencia del mtodo del DNS como no controlar el Ph, ya que el mtodo reacciona en condiciones alcalinas, el no controlar la temperatura ya que es a ebullicin durante 10 minutos,se podra utilizar un mtodo como el de glucosa oxidasa es un mtodo de referencia por su alta especificidad gran sensibilidad. El mtodo se basa en la siguiente reaccin enzimtica: -D-Glucsa + NAD D-glucono-lactona + ,

catalizada por la glucosa-dehidrogenasa; por adicin simultnea de mutarotasa se aumenta la velocidad de la reaccin. Se determina finalmente la cantidad del formado, la cual es proporcional a la concentracin de glucosa. La lectura se hace fotomtricamente a una longitud de onda de 340 366 nm.XII Este mtodo es apropiado para la determinacin de glucosa en diversos jugos y nctares de fruta (naranja, durazno, tomate) y de verduras (zanahoria), como tambin en vinos y mieles. Dada la especificidad de la glucosadehidrogenasa frente a la glucosa, no reacciona con la fructosa, ni la sacarosa. Se eliminara la incubacin a ebullicin ya que la incubacin es a temperatura ambiente y el tiempo de incubacin ya que son 5 mim adems de poder trabajas con alcuotas pequeas.VIII La ventaja del mtodo de Conway, es que el material y el equipo que se utiliza para la determinacin es ms accesible, aunque tambin presenta una fuerte desventaja, ya que es relativamente inespecfico, ya que otros alcoholes, cetonas y aldehdos reducen el dicromato, as como tambin existe la posibilidad de la descomposicin del dicromato por exposicin a la luz y considerando que es un mtodo indirecto de oxido reduccin colorimtrico y depende del complejo colorido que se forma por la reaccin del dicromato con el etanol, ste no es muy estable, con lo que se pierde la intensidad del color y el complejo colorido no tiene la misma absorcin por lo que produce una seal distinta a la inicial y existe prdida. Otra situacin a considerar por prdida es que el etanol presenta una elevada presin de vapor, en donde es parcialmente miscible y la presin atmosfrica es relativamente baja. Otras formas para determinar etanol son: Cromatografa de gases Micro difusin Determinacin por picnmetro Determinacin enzimtica (Alcohol Deshidrogenasa) Titulacin Si bien los mtodos sugeridos requieren del tratamiento previo el que podra presentar mayores inconvenientes sera la determinacin por medio de una titulacin, ya que presenta interferencias en el mtodo, al no ser especfico para un sola especie qumica y en general para un cambio de vire solo depende el pH. Asimismo, la relacin de productos oxidados entre productos reducidos es de 0.276 (donde el producto oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH), lo que significa que existe mayor cantidad de productos reducidos que de oxidados y a sabiendas de que para determinar la cantidad de CO2 se realiz por un mtodo gravimtrico, podemos pensar que de entrada, el CO2 no se captur totalmente en el NaOH acuoso y por consiguiente en los lavados no se encontrara el CO2 en su totalidad, tambin podemos considerar como una prdida con slo destapar el matraz microfermentador ya que el gas contenido en este es CO2. Sabiendo que se 12

trata de un mtodo gravimtrico, tambin se puede considerar que hay prdidas al momento de realizar los lavados, ya que pudieran quedar trazas de BaCO3 en el matraz y obviamente estas no son cuantificadas. Viendo las anteriores situaciones podemos considerar que la relacin entre la cantidad de productos oxidados y reducidos (O/R) no es cercana a uno debido a que durante las determinaciones para cada producto, pudieron haber tenido prdidas de producto en la determinacin de la relacin, y podemos corroborarlo con nuestro por ciento de carbono recuperado. Notamos que la cantidad de carbono recuperado en funcin de la glucosa suministrada a Saccharomyces cerevisiae, existe un rendimiento del 77.7 %, cuando las prdidas de CO2 permitidas estn en un intervalo del 87-95%. Por lo que en cuanto a recuperacin de CO2 podemos decir que fue deficiente. Tomando en cuenta, la citas bibliogrficas y los antecedentes, podemos dar anlisis de la prdida de producto que existi o que delimit la cuantificacin total de los productos en medida de la glucosa que se aadi para obtener etanol y dixido de carbono y deducir que las variaciones presentadas por la relacin de los productos oxidados y reducidos se debi meramente a errores aleatorios tanto del mtodo como de los analistas, sabiendo que Saccharomyces cerevisiae se encontraba en las condiciones ptimas para llevar a cabo la fermentacin.

Conclusiones.
El ndice O/R fue de un valor de 0.276 donde el producto oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH por lo que no se llev a cabo un flujo de carbonos correspondiente nicamente a la fermentacin alcohlica. La recuperacin de CO2 fue deficiente al tener un rendimiento de 77.7% con respecto a los intervalos establecidos de 87-95% Los errores en la fermentacin representados en el balance de fermentacin pudieron verse en su mayora por errores de los analistas al formarse ms producto reducido durante la fermentacin. La fermentacin por Saccharomyces cerevisiae debido al anlisis de sus productos fue una fermentacin alcohlica. Para un mejor balance de fermentacin para la cepa utilizada S. cerevisiae es necesario utilizar equipos para evitar su prdida de gas y un equipo que se encuentre estable para su ptimo manejo.

Referencias bibliogrficas.
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VIII.

IX. X. XI.

XII.

Mercedes Ferreyra, Mara., 2006, Tesis Doctoral, Estudio del proceso biotecnolgico para la elaboracin de una bebida alcohlica a partir de jugo de naranja, Facultad de Ciencias de la Alimentacin. UNER, Universidad Politcnica de Valencia. Departamento de Tecnologa de alimentos. Ralph S. Becker y Wayre G. Ventwort, Qumica General, Ed. Revert. Madrid.1997, pp. 521-523. O. Soto Cruz, J. Pez Lerma, Art. Balances en procesos de fermentacin: Anlisis de consistencia y flujos metablicos. Revista mexicana de ingeniera qumica Vol. 4. Mxico, 2004, pp. 59. Vzquez, H. J., y Dacosta O. Fermentacin alcohlica: Una opcin para la produccin de energa renovable a partir de desechos agrcolas, UAM Unidad Azcapotzalco, Departamento de Sistemas, Mxico, Mayo 2007. Thomas M. Devlin, 2004, Bioqumica: libro de aplicaciones clnicas, 4ta edicin. Ed. Reverte Espaa, pg. 657-659

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