UNIVERSIDAD DEL AZUAY

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

ESCUELA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

“Producción de etanol a partir de suero de leche hidrolizado”

Trabajo de graduación previo a la obtención del título de:

INGENIERO EN ALIMENTOS

Autora:

Vanessa Alexandra Chimbo Peñaloza

Director:

Claudio Esteban Sánchez Jáuregui

CUENCA, ECUADOR

2015
 DEDICATORIA

Dedico este trabajo principalmente a Dios, por haberme dado la vida y permitirme el
haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional.

A mi madre, por ser el pilar más importante y demostrarme que lo que se hace con
amor da buenos resultados, su apoyo incondicional es único sin importar nuestras
diferencias de opiniones. A mi padre, a pesar de nuestra distancia física, siento que estás
conmigo siempre, y aunque nos faltaron muchas cosas por vivir juntos, sé que este
momento es tan especial para ti como lo es para mí.

A mis hermanos: Priscy, mi ejemplo a seguir, aunque no llegue a ser tan grande como
tú, soy tus reflejos, y Pau mi impulso para mirar siempre adelante (dejando de llorar) y
tomándolo todo tan relajado, los amo infinitamente

Al amor de mi vida Ricardo, mi motivación, por ser mi apoyo contaste e

incondicional, por enseñarme tantas cosas lindas

Sin ustedes no hubiese logrado esta meta.

“La dicha de la vida consiste en tener siempre algo que hacer, alguien a quien amar y
alguna cosa que esperar”. Thomas Chalmers

II
 AGRADECIMIENTOS

Ha sido un año lleno de esfuerzos y sacrificios, cerrada esta etapa, me queda agradecer
principalmente a Dios por permitirme llegar a esta instancia del camino, en donde me
vuelvo toda una profesional

Gracias a mis padres por ser los principales promotores de mis sueños, gracias mami
por estar dispuesta a acompañarme cada larga y agotadora noche de estudio, fue lo mejor
su compañía y la llegada de sus cafés era para mí como agua en el desierto, sus palabras de
apresuro por hacerme el vestido gracias infinitas amiga mía; gracias papi por siempre
desear y anhelar siempre lo mejor para mi vida, gracias papi por ser tan celoso y no dejarme
casar antes de ser toda una profesional, por cada consejo y por cada una de sus palabras
que guiaron durante mi vida

De igual manera agradecer a mi profesor de Investigación y de Tesis de Grado, Ing.

Claudio Sánchez por su visión crítica de muchos aspectos cotidianos de la vida, por su
rectitud en su profesión como docente, por sus consejos, que ayudan a formarte como
persona e investigador, y sobre todo por ser mi buen amigo y ahora colegas.

A mi ñaña por darme el aliento necesario en los momentos en que todo se veía negro,
y mi gordo gracias por esas sonrisas y aquella malanoche en la que te quedaste junto a mí.

Finalmente, a mi novio quien lloró y sonrió en cada momento junto a mí y fue capaz
de contenerme cuando todo iba mal. Gracias por amarme como solo tú lo puedes hacer,
desde ahora empiezan nuestros sueños y metas juntos

III
 ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA......................................................................................................II
AGRADECIMIENTO...............................................................................................III
ÍNDICE DE CONTENIDOS .................................................................................... IV

INDICE DE ANEXOS.............................................................................................VII

ÍNDICE DE TABLAS Y GRÁFICOS ..................................................................... IX

RESUMEN…………………………………………………………………..……XII

ABSTRACT...........................................................................................................XIII

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1

CAPITULO 1 SUERO LÁCTEO .................................................................. 2

1.1. DEFINICIÓN Y ANTECEDENTES ........................................................ 2

1.2. EXTRACCIÓN ......................................................................................... 3

1.3. COMPOSICIÓN Y VALORES ENERGÉTICOS .................................... 4

1.4. TIPOS DE LACTOSUERO ...................................................................... 4

1.4.1. Suero dulce de leche .............................................................................. 5

1.4.2. Suero ácido de leche .............................................................................. 5

1.4.3. Suero de leche concentrado ................................................................... 6

1.5. COMPOSICIÓN VALORES ENERGÉTICOS Y ALIMENTICIOS ..... 6

1.5.1. Proteínas................................................................................................. 7

1.6. APLICACIÓN DEL SUERO LÁCTEO ................................................... 9

IV
1.6.1. Lactosuero como producto post desecho ............................................... 9

1.6.2. Aplicaciones industriales ....................................................................... 9

1.7. PROTEÍNA UNICELULAR ................................................................... 12

1.7.1. Fermentación alcohólica ...................................................................... 13

1.7.2. Biomasa ............................................................................................... 13

1.7.3. Microorganismos ................................................................................. 14

1.7.4. Sustratos para la obtención de biomasa ............................................... 15

1.7.5. Pretratamiento del suero ...................................................................... 15

1.7.6. Saccharomyces Cerevisiae ................................................................... 16

1.8. ENZIMOLOGÍA ..................................................................................... 17

1.8.1 PRODUCCIÓN DE ENZIMAS POR FERMENTACIÓN ..................... 17

1.9. LA LACTOSA ........................................................................................ 17

1.9.1 ENZIMA B-GALACTOSIDASA ........................................................... 17

1.10. HIDRÓLISIS DE LA LACTOSA ........................................................... 18

1.11. GLUCOSA Y GALACTOSA ................................................................. 19

1.12. Ruta Metabolica ...................................................................................... 20

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA ............................................................... 21

2.1. MÉTODOS Y TÉCNICAS ..................................................................... 21

2.1.1 Metodología general del trabajo .......................................................... 21

2.2. UBICACIÓN ........................................................................................... 23

2.2.1. Toma de muestras ................................................................................ 23

2.2.2. Estudio de laboratorio .......................................................................... 24

2.3. DESARROLLO ....................................................................................... 24

V
2.3.1. Control microbiológico de crecimiento de cepas LAB ....................... 24

2.4. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES ....................................... 25

2.5. MATERIA PRIMA Y TRATAMIENTO TÉRMICO DEL SUERO DE

LECHE................ .................................................................................................. 27

2.5.1. Primer tratamiento térmico .................................................................. 27

2.5.2. Segundo tratamiento térmico ............................................................... 28

2.6. ANÁLISIS DEL SUERO DESPROTEINIZADO .................................. 28

2.6.1. Determinación del porcentaje de hidrólisis ......................................... 29

2.6.2. Determinación del contenido de glucosa ............................................. 29

2.7. SUPLEMENTACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO ............................. 33

2.7.1. Inóculo ................................................................................................. 33

2.8. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS ....................................................... 34

2.8.1. Aislamiento de levaduras ..................................................................... 34

2.8.2. Condiciones del cultivo ....................................................................... 36

2.9. DESTILACIÓN ....................................................................................... 36

2.9.1. Determinación de la pureza de la disolución (grado alcohólico)......... 37

2.9.2. Determinación de metanol y alcoholes superiores en el etanol destilado,

por cromatografía de gases ............................................................................... 38

2.10. DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................... 42

2.10.1. Diseño factorial 2³ .............................................................................. 42

2.10.2. Desarrollo experimental ..................................................................... 43

2.11. ANALISIS SENSORIAL ........................................................................ 46

VI
 CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................ 47

3.1. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS DE PROPIEDADES FÍSICO-

QUÍMICA DEL SUERO DE LECHE .................................................................. 47

3.1.1 Suero hidrolizado durante el proceso de fermentación ........................ 48

3.2. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS DE PORCENTAJES DE

LACTOSA INICIAL Y FINAL ............................................................................ 53

3.3. DESARROLLO Y COMPORTAMIENTO DE LAS LEVADURAS .... 54

3.4. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS EN CUANTO A LA PUREZA

DEL GRADO ALCOHÓLICO ............................................................................. 55

3.5. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS EN CUANTO A

CUANTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS DE ALCOHOL ................................... 56

3.6. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE DETERMINACIÓN ............ 56

3.7. RESULTADOS DE LAS INTERACCIONES DOBLES Y TRIPLES

ENFOCADAS EN EL DISEÑO FACTORIAL.................................................... 60

3.8. ELABORACION: SYRUP ..................................................................... 62

3.9. ANALISIS DE LA BEBIDA ALCOHOLICA ....................................... 64

Interpretación de resultado y análisis sensorial: Syrope con maracuyá para bebidas

alcohólicas. ........................................................................................................... 64

Capítulo 4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................... 66

CONCLUSIONES ................................................................................................ 66

RECOMENDACIONES ...................................................................................... 68

Referencias bibliográficas ............................................................................ 69

VII
 Índice de anexos ..................................................................................... 73
Anexos............................................................................................................. 73
ANEXO 1: Suero de leche. Requisitos NTE INEN 2594:2011 ...................... 74
ANEXO 2: FICHA TECNICA AGAR SABOURAD .................................... 78
ANEXO 3: DETERMINACION CUANTITATIVA DE GLUCOSA ........... 80
ANEXO 4: PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES ACUOSAS DE
ETANOL ......................................................................................................... 81
ANEXO 5: NORMA TECNICA INEN 1837:2015 SOBRE BEBIDAS
ALCOHOLICAS (LIMITE MAXIMO DEL CONTENIDO DE ETANOL
METANOL, FURFURAL, ALDEHIDOS Y ALCOHOLES SUPERIORES)
......................................................................................................................... 87
ANEXO 6: FICHA DE CATACION .............................................................. 90
ANEXO 7: IMÁGENES …………………………………………………….91

VIII
 ÍNDICE DE TABLAS Y GRÁFICOS

Tabla Nº 1. Requisitos físico-químicos del suero de leche líquido................. 4

Tabla Nº 2. Origen y principales características de los lactosueros derivados de
la elaboración de quesos............................................................................................. 4
Tabla Nº 3. Composición de lactosuero dulce y ácido........................................ 6
Tabla Nº 4. Contenidos en vitaminas del lactosuero........................................... 7
Tabla Nº 5. Composición proteínica del lactosuero dulce y ácido........................ 8
Tabla Nº 6. Propiedades funcionales de la leche y el lactosuero........................... 12

Tabla Nº 7. Reacción general para la producción de biomasa microbiana 14

Figura 1. Propiedades de diferentes β-galactosidasas.......................................... 18

Figura 2. Proceso de hidrolisis de la lactosa........................................................ 19

Figura 3. Ruta metabólica de la glucosa y galactosa............................................. 20

Tabla No8.
Tabla Nº 9. Hidrólisis de la lactosa...................................................................... 28

Tabla Nº 10. Resultados del análisis del suero desproteinizado............................ 29

Tabla Nº 11. Ficha del reactivo utilizado.......................................................... 30
Tabla Nº 12. Esquema de pipeteo.......................................................................... 31
Tabla Nº 13. Uso de reactivos en laboratorio........................................................ 31
Tabla Nº 14. Lectura en el espectrofotómetro....................................................... 32
Tabla Nº 15. Equivalencias.................................................................................... 33
Diagrama Nº 2. Diluciones de muestras para cuantificación de Saccharomyces
cerevisiae................................................................................................................... 35

IX
 Tabla Nº 16. Valores de punto de ebullición......................................................... 37
Tabla Nº 17. Ajuste de cromatógrafo................................................................ 41
Figura Nº 4. Diseño factorial 2³ y su representación geométrica........................ 43
Tabla Nº 18. Variables de diseño experimental..................................................... 44
Tabla Nº 19. Respuestas del diseño experimental................................................. 44
Tabla Nº 20. Cantidades estándar respecto de las variables.................................. 44
Tabla Nº 21. Matriz del diseño experimental de mezclas con las variables
identificadas................................................................................................................ 45
Tabla Nº 22. Inóculos de acuerdo al diseño experimental..................................... 45
Tabla Nº 23. Variables de respuesta en los diferentes experimentos.................. 46
Tabla Nº 24. Datos del suero antes del proceso de hidrólisis................................ 48
Tabla Nº 25. Porcentaje de hidrólisis alcanzado................................................... 48
Tabla Nº 26. Siembra de levaduras en el día 0...................................................... 49
Tabla Nº 27. Proceso de fermentación................................................................... 49
Gráfico Nº 1. Porcentaje de sólidos solubles......................................................... 50

Gráfico Nº 2. Desarrollo del grado alcohólico en relación a sus días de

fermentación…………………………………… ................................... 51
Gráfico Nº 3. Variación delpH.............................................................................. 52

Gráfico Nº 4. Producción de CO2.......................................................................... 53

Tabla Nº 28. Datos de lactosa inicial y final.......................................................... 53

Gráfico Nº 5. Comportamiento de las levaduras durante el proceso de

fermentación.............................................................................................................. 56

Tabla Nº 29. Pureza del grado alcohólico.............................................................. 55

Tabla Nº 30. Concentración de metanol.............................................................. 56

X
Gráfico Nº 6. Contenido de metanol presente en las muestras.............................. 57

Tabla Nº 31. Concentración de aldehidos............................................................. 57

Gráfico Nº 7. Contenido de aldehídos presente en las muestras.......................... 58

Tabla Nº 32. Concentración de alcoholes superiores............................................ 58

Gráfico Nº 8. Contenido de alcoholes superiores presente en las muestras......... 59

Gráfico Nº 9. Contenido de etanol presente en las muestras................................. 60

Tabla Nº 33. Resultado del diseño factorial y su efecto de interés........................ 61

Tabla Nº 34 y 35. Resultados según ficha de catacion………………………65

Gráfico Nº 10. Normal Plot................................................................................... 65

XI
 Chimbo Peñaloza 1

INTRODUCCIÓN

La industria láctea alrededor del mundo es una de las principales de la industria

alimenticia de origen animal. Genera grandes recursos, y su forma de producción depende
de las tecnologías utilizadas, produciendo leche y derivados. En el marco ecuatoriano, la
leche es producida principalmente por pequeños ganaderos, quienes venden su producción
láctea a las marcas de expendio y procesamiento de lácteos.

De esta manera, se ha establecido en el desarrollo de este trabajo, que el suero de

leche es el producto residual más abundante de la industria láctea, y por ende, un residuo
que puede causar daños al ambiente. Su desecho, representa un serio impacto ecológico,
entre los más grandes de la industria láctea. Por este motivo, se ha propuesto obtener etanol
apto para el consumo humano, el cual servirá como un producto alternativo que puede
servir para el desarrollo de pequeñas industrias lácteas; se presenta las condiciones óptimas
para obtener un alto grado alcohólico por medio de un proceso biotecnológico, la obtención
de este, es de uso específico para el desarrollo de una bebida alcohólica.
 Chimbo Peñaloza 2

SUERO LÁCTEO

1.1. DEFINICIÓN Y ANTECEDENTES

Es uno de los residuos más abundantes en las industrias lácteas. Se define como “un
subproducto líquido obtenido después de la precipitación de la caseína y de la grasa durante
la elaboración del queso (Parra Huertas, 2009, pág. 4967)”; lo cual quiere decir que es un
residuo que queda de la elaboración de quesos, el mismo que “(...) representa del 80% a
90% del volumen total de leche procesada (Superintendencia de Industria y Comercio,
2013, pág. 10)”.

En el documento emitido por la Superintendencia de Industria y Comercio de

Colombia (2013) se señala que el suero lácteo “(...) contiene el 50% de los nutrientes de la
leche y una alta proporción de proteínas hidrosolubles”. Además de esto, por la aplicación
de nuevas tecnologías, “se obtienen concentrados de proteína de suero con un 40% a 80%
de proteínas, y aislados de proteínas de suero con porcentajes proteínicos mayores al 80%
(...) (pág. 9)”.

Pueden existir tres clases de lactosuero, las cuales dependen del producto primario con el
que fue elaborado el producto; estas son: el suero dulce, el suero semiácido y el ácido. Los
primeros pueden ser reutilizados por su alta concentración de proteínas, que va de un 25 a
80% (García-Morales, Álvarez Gallego, & Paredes Gil, 2014), para elaborar alimentos de
consumo humano o animal; lo que no puede ocurrir con el suero ácido, que necesitaría un
proceso adicional para regular su pH por lo que es desechado, generalmente.

Existe una caracterización positiva del suero como para explorar y experimentar en la
búsqueda de productos alternativos. Sin embargo, el desecho del suero lácteo ha sido y
sigue siendo uno de los grandes problemas de la industria alimentaria, ya que éste
representa una ingente fuente de recursos que simplemente son desechados a las
alcantarillas en la mayor parte de los casos, llegando también a sumar en el impacto
causado por la contaminación ambiental.
 Chimbo Peñaloza 3

El vertido directo de estas aguas residuales a las redes de saneamiento urbanas suele
ocasionar problemas graves en el funcionamiento de las estaciones depuradoras. En estos
efluentes se pueden encontrar elevadas concentraciones de sales, por ejemplo en las
salmueras de las industrias del aderezo o en el caso del lactosuero de las queserías,
pesticidas no degradados (…). Por ello, se suele exigir un tratamiento in-situ en las
instalaciones que las generan que suelen ser sometidas al correspondiente control y
regulación por las autoridades competentes. (García-Morales, Álvarez Gallego, & Paredes
Gil, 2014)

Se crearon nuevas tecnologías. Estos aspectos son abordados en la siguiente cita:

Identificamos la evolución de las tecnologías del suero y sus aplicaciones en alimentos y

encontramos que desde 1977 y hasta 1982 esta tecnología estuvo en una etapa emergente.
Desde ese año y hasta la actualidad la tecnología se encuentra en una etapa de crecimiento,
caracterizada por una alta actividad de patentamiento, un alto impacto competitivo de las
tecnologías que se desarrollan y un gran número de competidores (Superintendencia de
Industria y Comercio, 2013, pág. 16).

1.2. EXTRACCIÓN

Se puede obtener la proteína, de la mejor calidad a través de procesos químicos, como es

el intercambio iónico y la microfiltración. Es posible aislarla de otras formas; sin embargo,
las fórmulas resultan muy elevadas en lactosa, grasa y ceniza. Las medidas para su
tratamiento, (Moya Mora, 1995):

 Oxidación de la materia orgánica suministrando grandes cantidades de

oxígeno.
 Producción de biocombustible por fermentación anaeróbica.
 Utilización directa de la materia orgánica como alimento.
 Coagulación/floculación de partículas en suspensión.

El queso, además de proteínas, contiene entre un 20 % a 30 % de grasa dependiendo

del tipo de queso elaborado, sin embargo, aún queda grasa remanente en el suero de leche.
Por último, la concentración de lactosa que permanece en el suero de leche es igual o muy
 Chimbo Peñaloza 4

similar a la concentración de lactosa presente en la leche de partida para la elaboración del

queso (Franchi M., 2010).

1.3. COMPOSICIÓN Y VALORES ENERGÉTICOS

Tabla Nº 1. Requisitos físico-químicos del suero de leche líquido

Requisitos Suero de leche dulce Suero de leche ácido Método de ensayo
Min. Máx. Min. Máx.
Lactosa, % (m/m) -- 5,0 -- 4,3 AOAC 984.15
Proteína láctea, %
0,8 -- 0,8 -- NTE INEN 16
(m/m) (1)
Grasa láctea, %
-- 0,3 -- 0,3 NTE INEN 12
(m/m)
Ceniza, % (m/m) -- 0,7 -- 0,7 NTE INEN 14
Acidez titulable, %
(calculada como -- 0,16 0,35 -- NTE INEN 13
ácido láctico)
pH 6,8 6,4 5,5 4,8 AOAC 973.41
(1) el contenido de proteína láctea es igual a 6,38 por el porcentaje de nitrógeno total determinado.
FUENTE: INEN 2594: 2011

1.4. TIPOS DE LACTOSUERO

Ácidos y los dulces. Su origen y características se describen a continuación:

Tabla N° 2. Origen y principales características de los lactosueros derivados de la elaboración de

quesos
LACTOSUEROS ÁCIDOS LACTOSUEROS DULCES
Provienen de la fabricación de Provienen de la fabricación de
ORIGEN
quesos fresco y de pasta blanda quesos de pasta cocida y prensada
Una parte de la lactosa se ha
Pobres en ácido láctico y en calcio
CARACTERÍSTICAS transformado en ácido láctico y
y fósforo
son ricos en Ca y P
FUENTE: Revista AIDIS, 2012

1.4.1. Suero dulce de leche

Posee mayor concentración de lactosa respecto al contenido de acidez. En la siguiente

cita se describe la forma en que se produce: “Si en la coagulación de la leche se utiliza
 Chimbo Peñaloza 5

enzimas de lactosuero se denomina dulce (Parra Huertas, 2009, pág. 4967)”. Se acota sobre
el tipo de enzimas utilizadas que: “(...) se obtiene de la elaboración del queso mediante el
uso de enzimas proteolíticas o cuajo, las cuales actúan sobre las caseínas de la leche y las
fragmentan, haciendo que éstas se desestabilicen y precipiten (Hernández-Rojas & Vélez-
Ruiz, 2014, pág. 14)”.

En otra cita, se dice que el suero de leche “(...) se obtiene en el proceso de elaboración
del queso cuando a la leche líquida, previamente pasteurizada, se la añade el cuajo,
fermento natural contenido en el estómago de los rumiantes que posee una enzima que hace
coagular la leche (Discovery Salud, 2001)”.

El suero dulce en su composición “está basado en la coagulación por la renina a pH

6,5 (Parra Huertas, 2009, pág. 4968)”, aunque la temperatura ambiente baja hasta un pH
4,5. Como se indicó anteriormente, el suero dulce “tiene mayor lactosa y mayor proteína
respecto al ácido (ibíd.)”.

1.4.2. Suero ácido de leche

A diferencia del suero dulce, tiene mayor cantidad de acidez con referencia al
contenido de lactosa, y se deriva de la elaboración de “(...) queso, caseína o productos
similares (INEN, 2594:2011, p. 1)”. Se anota en la siguiente cita:

(...) se genera mediante la precipitación ácida de la caseína, la cual se logra

disminuyendo el pH de la leche a un valor de 4.5 o 4.6. A este pH se alcanza el
punto isoeléctrico de la mayoría de las caseínas presentes; en este punto, la carga
eléctrica neta de la proteína es igual a cero, lo cual produce que la micela de
caseína se desestabilice y precipite, dejando en solución solamente las proteínas
de tipo séricas (Hernández-Rojas & Vélez-Ruiz, 2014, pág. 14).
 Chimbo Peñaloza 6

1.4.3. Suero de leche concentrado

Su composición básica se define de la siguiente manera: “Es el producto obtenido por

la remoción parcial de agua de los sueros, mientras permanecen todos los demás
constituyente en las mismas proporciones relativas (INEN, 2594:2011, pág. 1)”.

1.5. COMPOSICIÓN VALORES ENERGÉTICOS Y ALIMENTICIOS

Las proteínas aportan nutricionalmente, es asi que son parte de la alimentación y dieta
de las personas.

Contiene más de la mitad de los sólidos presentes en la leche original, incluyendo

alrededor del 20% de las proteínas (lactoalbúminas y lactoglobulinas), la mayor
parte de la lactosa, minerales (calcio, fósforo, sodio y magnesio) y vitaminas
hidrosolubles (tiamina, ácido pantoténico, riboflavina, piridoxina, ácido
nicotínico, cobalamina y ácido ascórbico) (Hernández-Rojas & Vélez-Ruiz, 2014,
pág. 15).

Distribución de los componentes que se encuentran en el suero:

Tabla N° 3. Composición de lactosuero dulce y ácido

SUERO DE LECHE DULCE SUERO DE LECHE ÁCIDO
COMPONENTE
(g/L) (g/L)
Sólidos totales 63,0 – 70,0 63,0 – 70,0
Lactosa 46,0 – 52,0 44,0 – 46,0
Grasa 0,0 – 5,0 0,0 – 5,0
Proteína 6,0 – 10,0 6,0 – 8,0
Calcio 0,4 – 0,6 1,2 – 1,6
Fósforo 0,4 – 0,7 0,5 – 0,8
Potasio 1,4 – 1,6 1,4 – 1,6
Cloruros 2,0 – 2,2 2,0 – 2,2
FUENTE: Hernández-Rojas y Vélez-Ruíz, 20141

1
Fuente que a su vez cita el cuadro de Panesar (2007) y Callejas (2012).
 Chimbo Peñaloza 7

Este gran contenido de nutrientes genera aproximadamente 3,5 kg de demanda

biológica de oxígeno (DBO) y 6,8 kg de demanda química de oxígeno (DQO) por
cada 100 kg de lactosuero líquido (Muñi et al., 2005), siendo la lactosa, el
principal componente de sólidos que contribuye a la alta DBO y DQO (Cahuasquí,
2013, pág. 12).

Tabla Nº 4. Contenidos en vitaminas del lactosuero

NECESIDADES DIARIAS
VITAMINAS CONCENTRACIÓN (mg/ml)
(mg)
Tiamina 0,38 1,5
Riboflavina 1,2 1,5
Ácido nicotínico 0,85 10-20
Ácido pantoténico 3,4 10
Piridoxina 0,42 1,5
Cobalamina 0,03 2
Ácido ascórbico 2,2 10-75
FUENTE: Parra Huertas, 2009

1.5.1. Proteínas

El contenido proteínico que es presentado en la Tabla N° 5, es el más alto en volumen

después de la lactosa, siendo el principal componente nutricional presente en este líquido,
como ya se ha mencionado anteriormente. El suero dulce contiene entre 6 g/L y 10 g/L de
proteínas, mientras que el suero ácido tiene entre 6 g/L y 8 g/L. El tipo de proteínas que
contiene el lactosuero se absorben de manera inmediata, se argumenta en la siguiente cita:
“Las proteínas de suero de leche son proteínas rápidas, llegan al yeyuno casi
inmediatamente después de entrar en el estómago (Hernández-Rojas & Vélez-Ruiz, 2014,
pág. 16)”, es decir, son bastante aprovechadas por el cuerpo humano. Además, estas
proteínas tienen un alto valor biológico, como se anota a continuación: “Debido a su
contenido de aminoácidos esenciales, el valor biológico de las proteínas de suero de leche
es alto comparado con el de otras proteínas (Hernández-Rojas & Vélez-Ruiz, 2014, pág.
16)”.

Las cuatro proteínas principales que aporta el suero de leche a la nutrición son: β-
lactoglobulina (β-LG), α-lactoalbúmina (α-La), albúmina de suero sanguíneo (BSA) e
inmunoglobulina (lg). Además otras proteínas que se presentan en menor proporción, las
 Chimbo Peñaloza 8

cuales se enumeran en la siguiente cita: “lactoferrina, transferrina y la fracción lactolin

proteosa-peptona (PP) (Hernández-Rojas & Vélez-Ruiz, 2014, pág. 16)”. Funciones
que cumplen estas proteínas:

Tabla N° 5. Composición proteínica de lactosuero dulce y ácido

PROTEÍNA FUNCIÓN BIOLÓGICA
Transportador (retinol, palmitol, ácidos grasos, vitamina D y
colesterol)
β-Lactoglobulina Aumento de la actividad esterasa pregástrica
Transferencia de inmunidad pasiva
Regulación de la glándula mamaria en el metabolismo del fósforo
Prevención del cáncer
α-Lactoalbúmina Síntesis de lactosa
Tratamiento de la enfermedad inducida por el estrés crónico
Función antimutagénica
Alguminas del suero Prevención del cáncer
Inmunomodulación
Prevención y tratamiento de diversas infecciones microbianas
Inmunoglobulinas (infecciones de las vías respiratorias superiores, gastritis, caries
dental, diarrea, entre otras)
Actividades antibacterianas, antivirales, antifúngicas
Lactoferrina Evita varias infecciones microbianas y varios tipos de cáncer
Actividad prebótica
Biosidas y actividades biostáticas
Lactoperoxidasa
Prevención de cáncer de colon y cáncer de piel
Interacción con toxinas, virus y bacterias (mediada por la fracción de
carbohidratos)
Glicomacropéptidos
Control de la formación de ácido en la placa dental
Actividad inmunomoduladora
Osteopontina Mineralización ósea, se utiliza para el tratamiento del cáncer
Efectos inmunoestimulantes
Proteasas peptonas
Prevención de la caries
FUENTE: Hernández-Rojas, Vélez-Ruíz, 20142

2
Adaptado por los autores por Mendes da Silva, 2011.
 Chimbo Peñaloza 9

1.6. APLICACIÓN DEL SUERO LÁCTEO

Varias empresas y organizaciones educativas de diversos países han desarrollado

múltiples aplicaciones al suero. Muchas de estas, han sido ya patentadas para su uso legal
en diversos productos.

Las aplicaciones más comunes pueden encontrarse en la elaboración de alimentos

como “bebidas, el yogur, los quesos untables, en la industria cárnica en embutidos, la
panificación, la confitería e, inclusive, en la industria farmacéutica (Superintendencia de
Industria y Comercio, 2013, pág. 10)”.

1.6.1. Lactosuero como producto post desecho

Casi la mitad del líquido se desecha hacia drenajes, a través de los cuales se llega a
contaminar los ríos, considerado entre los productos alimenticios más contaminantes. Por
ejemplo, representa un gran desgaste para los suelos por la presencia de nitrógeno el cual
es soluble en agua, por lo cual este “disminuye el rendimiento de las cosechas, pero además
se observa el fenómeno de lixiviación (Valencia Denicia & Ramírez Castillo, 2009, pág.
27)”, pudiendo llegar a descomponer varios minerales y filtrándose en las aguas
subterráneas, un verdadero peligro para la salud y los ecosistemas.

Para reducir el impacto se sugiere un tratamiento in situ anterior a la eliminación en

el alcantarillado normal.

1.6.2. Aplicaciones industriales

“Los productos del suero, incluyendo la lactosa, mejoran la textura, realzan el sabor
y color, emulsifican y estabilizan, mejoran las propiedades de flujo y muestran muchas
otras propiedades funcionales que aumentan la calidad de los productos alimenticios (Parra
Huertas, 2009, pág. 4967)”.
 Chimbo Peñaloza 10

Entre los usos que se han podido investigar, se enumeran: concentrados, hidrolizados,
aislados, fórmulas infantiles, producción de etanol, biomasa, levadura para panificación,
producción de exopolisacáridos, ácidos orgánicos, ácido acético, ácido propiónico, ácido
láctico, quesillo, quesos, bebidas fermentadas, bebidas refrescantes, etc.

a) Concentrados.

Puede ser aplicado en varios productos alimenticios, dependiendo del porcentaje de

proteína que contenga; entre los más comunes, están: sustituto de leche descremada,
yogurt, queso procesado, algunas bebidas, salsas, fideos, galletas, helados, pasteles,
derivados lácteos, panadería, carne, fórmulas para el consumo infantil (siendo este último
aspecto bastante útil debido a las propiedades proteínicas y nutricionales del suero de
leche). Por otra parte, el concentrado con un 80 % de proteína, es utilizado “como
gelificación, emulsificantes y formación de espuma (Parra Huertas, 2009, pág. 4971)”. Así,
se define al concentrado de proteína de suero de leche en la cita a continuación:

(...) es definido por el Código de Estados Unidos de Regulaciones Federales como

la sustancia obtenida por la eliminación de suficiente constituyente no proteico a
partir de lactosuero para que el producto seco final contenga no menos del 25%
de proteína (Parra Huertas, 2009, pág. 4970).

b) Hidrolizados.

Sirven en varios casos, “como suplementación dietética o necesidades fisiológicas,

para personas de la tercera edad, bebés prematuros, atletas que controlan el peso a través
de dietas y niños con diarrea (Parra Huertas, 2009, pág. 4972)”.

En esta otra cita, se define sobre los beneficios de la hidrólisis: “Las proteínas de
suero hidrolizadas contienen un alto nivel de péptidos bioactivos y complejos minerales de
leche. Estos dos ingredientes muestran ciertos componentes promisorios para el desarrollo
de alimentos funcionales, destinados a mejorar la salud cardiovascular (Hernández-Rojas
& Vélez-Ruiz, 2014, pág. 20)”.
 Chimbo Peñaloza 11

c) Aislados.

Este contiene “por lo menos un 80% de proteína, es extremadamente bajo o libre de

lactosa y no contiene grasa (Sevilla Chávez, 2005, pág. 11)”.

d) Etanol.

Debido a las características propias del lactosuero, es posible a través de un proceso

químico, la producción de etanol, utilizando tratamientos de diferentes índoles, entre los
cuales, se utiliza la fermentación del líquido (Araujo, y otros, 2015, pág. 305):

 Fermentación por carga con microaereación.

 Fermentaciones continúas a diferentes tasas de dilución.
 Métodos de inmovilización de levaduras termotolerantes.
 “Cultivos por lote alimentado con ciclos repetidos”.

Sobre el tipo de preparación de este producto, la siguiente cita señala que “la
producción de etanol es una alternativa viable, tanto si se utiliza suero con dilución normal
como concentrado, aunque con esta última el proceso es más eficiente (...) (Garibay,
Ramírez, & Munguía, 2004, pág. 199)”. En cambio, sobre el tipo de suero, hay algunos que
consideran que “es imprescindible trabajar con suero concentrado para evitar destilar
grande volúmenes de caldo con baja concentración de etanol (Garibay, Ramírez, &
Munguía, 2004, pág. 199)”.

Sobre el margen de ganancias, para que una planta de producción de etanol las genere
de manera significativa y sustentable, se debería por lo menos procesar 500000 litros de
suero de leche diarios, por lo que se necesitaría de una inversión considerable para este fin
(Garibay, Ramírez, & Munguía, 2004).
 Chimbo Peñaloza 12

Tabla 6. Propiedades funcionales de la leche y lactosuero.

PROTEÌNAS DE
PROPIEDADES CASEÍNAS
LACTOSUERO
Muy alta capacidad de retención
CRA incrementándose con
Hidratación de agua (CRA) con formación
desnaturalización de proteína
pegante a alta concentración
Insoluble a punto isoeléctrico Insoluble a pH 5 si es termo
Solubilidad
(pI) desnaturalizado
No gelificaciòn térmica excepto
en presencia de calcio. Gelificación térmica desde 70ºc:
Gelificaciòn
Gelificaciòn micela por influencia de pH y sales
quimosina
Soluciones muy viscosas a pH Soluciones no muy viscosas
Viscosidad básico y neutral. Viscosidad más excepto si son termo
baja a pH desnaturalizadas
Excelentes propiedades
Buenas propiedades
emulsificantes a pH básico y
Propiedades emulsificantes emulsificantes excepto a pH 4-5
neutral
si es termo desnaturalizada
Baja estabilidad espumante
Retención muy variable con la
Retención de sabores Buena retención de sabores
desnaturalización
Propiedades espumado Baja estabilidad espumante Excelente estabilidad espumante
Fuente: Hui (1993)

1.7. PROTEÍNA UNICELULAR

Sirve para que los componentes puedan aumentar su composición química. Para su
producción se requiere algún tipo de microorganismo que sirva como “agente biológico”
para que sea posible producir proteínas mediante la fermentación (Taron Dunover, Pérez
Mendoza, & Martínez Zambrano, 2012). En la siguiente cita, se conceptualiza:

Se denomina proteína unicelular o bioproteína (Molk et al. 2002), a aquella

obtenida de la biomasa microbiana de algas, bacterias, levaduras y hongos
filamentosos, cultivados en condiciones fermentativas apropiadas y controladas
que garanticen una adecuada tasa de crecimiento, por medio del aprovechamiento
de sustratos baratos compuestos por o enriquecidos con carbono, nitrógeno y
fósforo (Chacón Villalobos, 2004, pág. 94).
 Chimbo Peñaloza 13

1.7.1. Fermentación alcohólica

En términos generales “indica la degradación aeróbica o anaeróbica de un substrato

orgánico a diversos productos, por la acción de levaduras y algunas bacterias que producen
enzimas para realizar dicha función y obtener energía en forma de ATP (Garzón Castaño
& Hernández Londoño, 2009, pág. 30)”. Se requieren diferentes lapsos de fermentación,
los cuales dependen del microorganismo utilizado en la experimentación y del resultado
que el investigador espera (Taron Dunover, Pérez Mendoza, & Martínez Zambrano, 2012,
pág. 190).

Entre las fermentaciones de mayor uso está la fermentación alcohólica, “que permite
degradar azúcares en alcohol y dióxido de carbono (...) (Garzón Castaño & Hernández
Londoño, 2009, pág. 30)”. Se presenta conforme a la siguiente reacción química:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Para llegar a este tipo de degradación, se utilizan diversos tipos de levadura, siendo
la más utilizada la Saccharomyces cerevisiae. Acerca del nivel estequiométrico de la
fermentación, se cita:

“(...) la secuencia de transformaciones para degradar la glucosa hasta dos

moléculas de alcohol y dos de dióxido de carbono es un proceso muy complejo,
puesto que al mismo tiempo la levadura debe utilizar la glucosa y otros nutrientes
adicionales para poder reproducirse (Garzón Castaño & Hernández Londoño,
2009, pág. 31)”.

1.7.2. Biomasa

Descrita en su uso y función, es el incremento de la masa celular, la cual sirve para la

reproducción de proteína a partir de un sustrato (como lo es en este caso la levadura. A
través de un proceso de reacción bioquímica entre células y lactosa, se producen las células
microbianas, y depende de varios factores para que esta aumente, entre estos: el uso de
 Chimbo Peñaloza 14

microorganismos, condiciones de ambiente, entre otros (Parra Huertas, 2009). La ecuación

a través de la cual se expresa la biomasa es, según Chacón Villalobos (2004) citando a su
vez a Rojas (1995) y Suharto & Redyowatu (2003):

Tabla 7. Reacción general para la producción de biomasa microbiana

FUENTE: Chacón Villalobos (2004)

Para la obtención de biomasa se “requiere de una fuente de carbono a fermentar3 (…)

Algunas de estas fuentes suelen ser pobres en nitrógeno y minerales, por lo cual es
necesaria una suplementación con sales de amonio ó otras fuentes de nitrógeno (Chacón
Villalobos, 2004, pág. 102)”. La misma cita señala que “se libera energía y gases como el
CO2”. Requiere además de una fuente de oxígeno para que pueda incrementarse la masa
del cultivo. La masa final tiene un mayor valor proteico.

1.7.3. Microorganismos

Existen diversas especies de bacterias, actinomicetes, mohos y levaduras, los cuales

pueden utilizar el carbono y la energía existentes para su crecimiento. Entre los
microorganismos capaces de fermentar el disacárido están (Parra Huertas, 2009):

 Candida lipolytica (cuyo sustrato de conversión son los n-alcanos)

 Candida novellus (cuyo sustrato de conversión son los n-alcanos)
 Candida utilis (cuyo sustrato de conversión es el etanol y licores sulfíticos)
 Fusarium graminearum (con un sustrato de glucosa de calidad alimentaria)

3
Los cuales son una serie de sustratos, como los descritos en el presente trabajo
investigativo.
 Chimbo Peñaloza 15

 Gliocladium deliquenscens (con un sustrato de licores de maíz)

 Kluyveromices fragilis (cuyo sustrato de conversión es el suero de quesería)
 Saccharomyces cerevisiae (cuyo sustrato son las melazas)

1.7.4. Sustratos para la obtención de biomasa

Para los procesos metabólicos, es necesario encontrar fuentes de carbono, por ser
materias primas de bajo costo. “Dentro de las fuentes de carbono fósiles se encuentran los
hidrocarburos o compuestos petroquímicos que han sido empleados y/o estudiados para la
producción de proteína unicelular, algunos de estos son los n-alcanos que contienen el
metano, metanol, etanol, entre otros (Zumbado Rivera, 2005, pág. 15)”.

1.7.5. Pretratamiento del suero

Es necesario tomar en cuenta que se debe esterilizar el suero de leche para luego pasar
a la fermentación del mismo para eliminar todo vestigio de microorganismos que pudieran
contaminar el producto. En la etapa de pretratamiento, normalmente se realiza la
clarificación, el desnatado y el pasteurizado “para que el suero que será utilizado luego
como materia prima de productos de mayor valor agregado cumpla con las condiciones y
características requeridas por los distintos procesos a los que será sometido (Parzanese,
2011, pág. 5)”.

“El fraccionamiento del suero lácteo proporciona una interesante posibilidad

comercial en la fabricación de productos alimenticios (Parzanese, 2011, pág. 1)”.

Con la finalidad de “eliminar al máximo las sustancias grasas presentes en forma de

microagregaciones de manera que no perjudiquen el proceso de UF posterior”, para luego
acondicionar el suero, “de tal manera que se hayan removido los finos de caseína (...) y las
sustancias grasas”; en otras palabras, puede declarárselo como “libre de grasa (Parzanese,
2011, pág. 6)”.
 Chimbo Peñaloza 16

Se sigue con la ultrafiltración, donde “las membranas de ultrafiltración son capaces

de retener las proteínas mientras que las sales y lactosa se eliminan junto con el agua que
atraviesa la membrana” (Parzanese, 2011, pág. 6)”.

1.7.6. Saccharomyces Cerevisiae

Es una levadura, un hongo unicelular, del grupo de los ascomicetos. En la naturaleza

se encuentra sobre sustratos ricos en azúcares o en los exudados y savias dulces de algunas
plantas. El término "levadura" (de"levare" en la acepción de subir o levantar) remite a la
experiencia visual de la masa del pan que se "levanta" cuando se añade levadura a la harina.
Su nombre alternativo de "fermento" viene del latín fervere, que quiere decir hervir y
proviene del movimiento del mosto durante la producción de vino o cerveza. Los nombres
anglosajones y germánicos (yeast, heffe) también se refieren a la acción de hervir o hacer
espuma. El conocimiento y percepción de la levadura está absolutamente condicionado por
sus propiedades de fermentación del pan, el vino o la cerveza. Se entiende por levadura
seca a aquella cultivada y separada del líquido nutritivo, sometida a prensado para quitarle
el exceso de humedad.

Según la cita, Saccharomyces cerevisiae “(...) ha sido ampliamente estudiada, pero se

conoce poco acerca de su capacidad como microorganismo probiótico, ya que las
investigaciones se han enfocado en otros microorganismos de mayor uso (Ortiz, y otros,
2008, pág. 139)”. Por ser un producto natural, durante muchos años esta especie de
levadura ha formado parte de la dieta del hombre, y es utilizada en muchos alimentos y
bebidas fermentadas debido a que mejora el perfil nutricional de los mismos. Su contenido
en treonina e isoleucina no es superado por ningún otro alimento vegetal. Sólo tiene niveles
relativamente bajos de metionina y cisteina. (Pérez, 2010).
 Chimbo Peñaloza 17

1.8. ENZIMOLOGÍA

Las enzimas tienen la capacidad de producir reacciones químicas, además cumplen

funciones como catalizadores biológicos y son de naturaleza proteica, influyendo en ciertas
ocasiones sobre la calidad del suero

1.8.1 PRODUCCIÓN DE ENZIMAS POR FERMENTACIÓN

La biosíntesis de la enzima b-galactosidasa (conocida también como lactasa) se produce

gracias al uso de la levadura Kluyveromyces fragilis, la cual permite utilizar la lactosa como
fuente de carbono y energía. Así, estas enzimas pueden ayudar a obtener lactosa.

1.9. LA LACTOSA

La lactosa es un disacárido, abundante en la naturaleza. Está presente en la leche de los

animales y su nivel depende de la especie, por ejemplo su concentración en la leche de vaca
es de 4.7% a 5.2% y en la leche humana es de 6.5%. (Garibay, Ramírez, & Munguía, 2004)
Se la conoce como azúcar de la leche. (Ege, 2004) La lactosa está formada por “glucosa y
galactosa, es prácticamente el único carbohidrato presente en la leche (Garibay, Ramírez,
& Munguía, 2004)”.

1.9.1 ENZIMA B-GALACTOSIDASA

Conocidas como lactasas su sustrato es la lactosa, y son capaces de separarla en los

dos azucares que la componen. Al momento de ser hidrolizada se desdoblan sus azúcares
que son glucosa y galactosa, los productos poseen mayor dulzor. Los factores, Figura Nº
1, que influyen son la temperatura y el pH, sus rangos óptimos varían. (Bustamante
Gavilanes, 2014, pág. 13)”.
 Chimbo Peñaloza 18

Las primeras presentan una actividad óptima en un pH entre 3 a 5 y una temperatura

entre 46 y 55 °C, mientras que las otras tienen rango de pH de 6,5 a 7,3 y temperaturas
entre 35 y 40 °C.

La principal levadura utilizada para la obtención de lactasa es la Kluyveromyces

lactis.(McSWEENEY.2000)

Figura 1: Propiedades de diferentes β-galactosidasas.

Fuente: McSWEENEY. Dairy Chemistry and Biochemistry. Thomson Science, 2000.

1.9. HIDRÓLISIS DE LA LACTOSA

Proceso en el cual; el agua actúa como disolvente. Es producida por la enzima lactasa (β-
galactosidasa) que se encuentra de manera natural en el intestino delgado de los mamíferos.
Actúa mediante “la inclusión de una molécula de agua que rompe el enlace glucosídico que
une los dos monosacáridos (Garibay, Ramírez, & Munguía, 2004)”.

Se puede añadir enzimas β-galactosidasas a la leche para lograr la hidrólisis. El

problema con este proceso es la obtención, aislamiento, inmovilización y transporte de
lactasa desde hongos, levadura y bacterias. Ángela Moya presenta dos procesos por los
 Chimbo Peñaloza 19

cuales se puede inmovilizar y aislar de manera efectiva y económica dichas enzimas: “se
ha conseguido hidrolizar la lactosa mediante lactasa inmovilizada. También ha sido posible
la hidrólisis inmovilizando β-galactosidasa sobre silocromo C-80 (Moya Mora, 1995)”.
Concluye señalando que se pudo, mediante el último proceso, conseguir una efectividad
del 80%.

Figura 2: Proceso de Hidrólisis de lactosa.

Fuente: GÖSTA BYLUND, Manual de industrias lácteas, 2003.

1.10. GLUCOSA Y GALACTOSA

Son azúcares simples o monosacáridos formados por seis átomos de carbono, el momento
de ser ingerido se convierte en glucosa en el hígado como aporte energético, su principal
fuente proviene de la ingesta de lactosa de la leche.

Su fórmulas molecular C6H12O6, igual para estos dos azucares, la galactosa difiere de la
glucosa por ser un epímero de esta en el Carbono número 4, es decir, que el grupo de
alcohol de este carbono está dirigido hacia la izquierda.

Para lograr un proceso óptimo con la mayor producción de glucosa y galactosa es necesario
un tiempo largo de reacción lo que encarece su producción.
 Chimbo Peñaloza 20

1.11. Ruta Metabólica

Inicialmente, la galactosa es fosforilada por la galactoquinasa para formar galactosa-1-

fosfato. La epimerización de la galactosa-1-fosfato a glucosa1-fosfato requiere la
transferencia de UDP desde la uridinafosfoglucosa (UDP-glucosa) catalizada por la
galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, esto genera UDP-galactosa y glucosa-1-fosfato.

La UDP-galactosa es epimerizada a UDP-glucosa por la UDP-galactosa 4 Epimerasa y el

resultado es aumento de la síntesis de glucógeno.

En ayunas la UDP-glucosa formada se utiliza para metabolizar a la galactosa dando

glucosa-1-fosfato, que entonces es convertida a glucosa6-fosfato por la fosfoglucomutasa.

La epimerasa cataliza una reacción reversible la glucosa puede convertirse en galactosa,

para la síntesis de lactosa (en glándula mamaria), proteoglicanos, glicolípidos y
glicoproteínas.( Stephanopoulos G , Aristidou A , Nielsen J. 2006)

Figura 3. Representación de la ruta metabólica de síntesis de glucosa y galactosa

Fuente: Stephanopoulos G , Aristidou A , Nielsen J, 2006.

 Chimbo Peñaloza 21

CAPÍTULO 2. METODOLOGÍA

2.1. MÉTODOS Y TÉCNICAS

Los métodos que son los que guían los procedimientos para la presente investigación
son: por un lado el cuali-cuantitativo y por otro el experimental. Esto porque en el trabajo
se procesan datos específicos (estadísticos, numéricos) sobre una base experimental propia
del tema, la cual está determinada en cierto punto por la calidad del producto final (tanto
en estructura como en sabor) que será tomado en cuenta. Con esta finalidad, se realizaron
los experimentos conforme se indica en los apartados correspondientes para que los
catadores pudieran degustar y discriminar qué productos son los que más aceptación tienen.

2.1.1 Metodología general del trabajo

Para alcanzar los objetivos que se han trazado en este estudio, ha sido necesario aplicar una
metodología general basada en los siguientes pasos:

 Desarrollo de estudios dirigidos a la producción de etanol por vía

fermentativa.
 Sometimiento a un tratamiento térmico para su pasteurización, pudiendo de
esta manera activar las proteínas.
 Inoculación de la muestra con la enzima β-galactosidasa en un tiempo y
temperatura adecuados, donde la cantidad de enzima está relacionada con el
volumen del suero.
 Chimbo Peñaloza 22

DIAGRAMA 1. ESQUEMA GENERAL DEL TRABAJO

°Brix

Porcentaje
pH
de lactosa
Suero
dulce

Porcentaje
de Acidez
glucosa
PASTEURIZACIÓN

72º * 15 segundos
ACTIVACIÓN
DOBLE

Hidrolisis
40º C * 120 min.
INACTIVACIÓN Det.%
hidrólisis
9 72º * 15 segundos

mol
glucosa

Cuantificación

mol mol
galactosa lactosa
 Chimbo Peñaloza 23

ELABORACIÓN: ChimboVanessa

2.2. UBICACIÓN

2.2.1. Toma de muestras

Las muestras del suero fueron tomadas de la Planta de Lácteos Vásquez de la ciudad
de Cuenca (Avenida Don Bosco y Avenida 12 de Octubre). El cultivo utilizado en la
fermentación fue la levadura Saccharomyces cerevisiae, cuyas células fueron mantenidas
en refrigeración a -15º C.
 Chimbo Peñaloza 24

2.2.2. Estudio de laboratorio

El estudio de las muestras fue realizado principalmente en los laboratorios de la

Universidad del Azuay.

2.3. DESARROLLO

2.3.1. Control microbiológico de crecimiento de cepas LAB

Para que se lleve a cabo el control biológico, fue necesario que las muestras que fueran
envasadas en un frasco completamente estéril. Con esta condición dada, se planificaron dos
controles:

Control de crecimiento de cepas LAB (probióticas).- Se preparó para esto agua

peptonada, con la cual se realizó diluciones de entre 101 hasta 108 . El medio en el cual se
sembraron las muestras fue el agar MRS, el cual sirve para el crecimiento de
microorganismos.
 Chimbo Peñaloza 25

2.4. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES

Tabla 8. Operacionalización de variables

VARIABLE VARIABLE
DESCRIPCIÓN INDICADOR
INDEPENDIENTE DEPENDIENTE
Análisis de los mínimos requeridos de ácido láctico para la Porcentaje, que puede
Análisis del suero

Acidez experimentación mediante titulación volumétrica con sosa alcanzar un máximo de

0,1 y como indicador fenftaleína 0,16 %
Análisis de la glucosa siguiendo el método Glucose Liquidor Porcentaje de glucosa
de leche

Glucosa
Human medido en miligramos
Determinación de la lactosa mediante la disminución del Porcentaje de lactosa,
Lactosa
punto de congelación, utilizando un crioscopio medida en miligramos
Porcentaje de pH:
pH Determinación del pH inicial calidad entre 6 y 6,7
grados Brix
Se eliminan los
Pretratamiento del suero de

Esterilización Realización de clarificación, desnatado y pasteurizado microorganismos

patógenos
Recuento de placa de la muestra para diseñar mezclas y para Comportamiento de las
Cuantificación del REP determinar la distribución de las variables para los levaduras en sus etapas
experimentos de crecimiento
Inoculación de la muestra con la enzima β-galactosidasa con
leche

Inoculación Porcentaje de hidrólisis

una cantidad relacionada con el volumen del suero
Temperatura: 72º C Generación de productos
Dos tratamientos térmicos para la Tiempo: 15 seg. químicos, tales como:
esterilización del suero de leche de ácido acético, ácido
Tratamientos térmicos
posibles microorganismos patógenos fórmico, ácido pirúvico,
Temperatura: 40º C
o contaminantes además de alcoholes y
Tiempo: 2:30 horas
F

adehídos
Temperatura: 40º C
tac
en
er
m

ió

Siembra de levaduras Empieza la fermentación Generación de CO2

n

Tiempo: 4 horas
 Chimbo Peñaloza 26

Grados Brix, grados GL,

Propagación de levaduras sobre la muestra, donde se
Propagación de levaduras temperatura, pH, CO2 y
determinan las variables
presión
Hidrólisis durante la Hidrólisis para la disolución con agua que rompe el enlace
Porcentaje de hidrólisis
fermentación glucosídico dada en varios lapsos
Control microbiológico de Control de crecimiento de cepas LAB y de microorganismos
Tiempo y temperatura
crecimiento de cepas patógenos
Determinación del Lectura por duplicado de las muestras en el crioscopio, Determinación de
porcentaje de hidrólisis aplicando fórmula porcentaje de error
Concentración de
glucosa de 400mg/dl
Determinación del contenido Determinación del contenido de glucosa mediante la prueba
Si es mayor a 400mg/dl,
de glucosa GOD-PAD
diluir la muestra 1 + 2
con agua destilada
Determinación de la producción de Temperatura: de Variaciones según
Desarro

Producción del acohol

llo del grado

alcohol 27º C a 28º C fermentación

alcohólico

Variaciones del comportamiento del CO2 dependiendo de su

Producción del CO2 Volúmenes
comportamiento en el proceso de fermentación
Producción de etanol, Según la Norma NTE-
Cromatografía de gases
furfural entre otros INEN 1837:2015
Optimización de la mayor producción y alto grado
Diseño experimental Factorial Matrices experimentales
alcohólico de etanol
Elaboración: Vanessa Chimbo
 Chimbo Peñaloza 27

2.5. MATERIA PRIMA Y TRATAMIENTO TÉRMICO DEL SUERO DE

LECHE

Como se anotó con anterioridad, fue utilizado como cultivo para la fermentación la
levadura Sascharomyces cerevisiae, con unas células mantenidas en refrigeración a -15º C.
De esta manera, se procedería a dar los tratamientos térmicos, los cuales se desarrollan a
continuación:

2.5.1. Primer tratamiento térmico

Antes de la fermentación, es necesario esterilizar el suero de leche previo a la

fermentación para eliminar cualquier tipo de posibles microorganismos patógenos o
microorganismos contaminantes que puedan dificultar el éxito en el experimento por
alterarse la reacción enzimática. De esta manera, se da lugar a la separación de proteínas y
a la activación enzimática. La temperatura y tiempo de pasteurización fue de 72º C / 15
seg. Luego de esto, se dejó reposar el suero para realizar más adelante una filtración al
vacío utilizando papel de filtro (Wathman Nº 1) para poder conservarlo refrigerado.

Adición e inoculación de la enzima.

Aplicados los tratamientos descritos, se mantuvo en refrigeración las muestras. De

esta manera, fue posible dar paso a la adición de la enzima líquida β – galactosidasa (Ha –
Lactase 5200), con un tiempo de inoculación de dos horas y media a 40º C, por lo cual se
pudo obtener suero hidrolizado con un contenido de glucosa de 20 g/L. La cantidad de
enzima utilizada se describe en la siguiente tabla:
 Chimbo Peñaloza 28

Tabla 9. Hidrólisis de la lactosa

Dosis de Ha- Tiempo de Temperatura de

Grado de Hidrólisis
Lactase (ml/L) Reacción (horas) reacción (ºc)
0.3 – 0,5 10 5 20 %
0.5 – 0.8 4 30 50 %
2.9 – 4.4 1 40 80 %

FUENTE: Diseño experimental

Estas dosis son las recomendadas por el proveedor, y probadas con anterioridad en el
presente estudio para el respectivo proceso de hidrólisis de la lactosa, el cual es previo al
proceso de fermentación.

2.5.2. Segundo tratamiento térmico

Ya realizada la hidrólisis, se procede a dar un tratamiento térmico para inactivar a la

Ha –Lactase 5200, pues refrigerada, la lactosa continúa trabajando. En este caso, el proceso
térmico del suero se da a 72 o C por el lapso de 15 segundos.

Reacción

La lactosa es sensible al calor, dándose un proceso de generación de productos ácidos

como el ácido acético, el ácido fórmico y el ácido pirúvico, así como de alcoholes y
aldehídos.

2.6. ANÁLISIS DEL SUERO DESPROTEINIZADO

Al momento de analizar el suero desproteinizado, se determinaron los siguientes

resultados:
 Chimbo Peñaloza 29

Tabla 10. Resultados del análisis del suero desproteinizado

DENOMINACIÓN DESCRIPCIÓN
Acidez Mediante titulación volumétrica con sosa 0,1 N y como indicador fenoftaleína.
ªBrix Lectura directa del brixómetro (marca Atago, modelo Pocket Refractometer).
Lectura directa del potenciómetro (marca Mettler Toledo, modelo Seven
pH
Compact).
CO2 Lectura directa del equipo (modelo Can Need, modelo Beverage KXJ-BCC 200)
Cantidad de glucosa Según los métodos descritos (Glucose Liquidor Human).
FUENTE: Diseño experimental

2.6.1. Determinación del porcentaje de hidrólisis

El grado de hidrólisis se determinó mediante el análisis de descenso en el punto

crioscópico.

Este método se fundamenta en la disminución del punto de congelación, momento en que

se da la hidrólisis de la lactosa, esta se desdobla formándose, glucosa y galactosa
incrementando el contenido solutos en la solución. (Bustamante Gavilanes, 2014, pág.
13)”.

Se utilizó un crioscopio de la marca Funke Gerber, modelo Cryostar I, el cual fue

calibrado antes de ser utilizado. En este equipo fue posible leer cada una de las muestras
por duplicado, evitando de esta manera alterar el resultado en cuanto a porcentaje de error.
se determinó el porcentaje de hidrólisis aplicando la siguiente fórmula (Bustamante
Gavilanes, 2014):

Porcentaje de hidrólisis alcanzada= 3350,77 * Crioscopía final - (Crioscopía

Inicial/0,00285)
 Chimbo Peñaloza 30

2.6.2. Determinación del contenido de glucosa

Para llegar a conocer el contenido de lactosa, se tomó como referencia la normativa

mexicana NMX-F-219 (Dirección General de Normas, 1972)4, aunque no pudo cumplirse
este procedimiento a cabalidad por no haber contado con el nitrato de cobre, el cual no fue
facilitado por los laboratorios donde se realizó el estudio.

Por este motivo, se procedió a aplicar una técnica diferente: se determinó el contenido
de glucosa mediante GOD-PAD (prueba enzimática colorimétrica por glucosa). Así se
aplicó una técnica de espectrofotometría con un compuesto enzimático denominado
glucoperoxidasa, utilizando el espectrofotómetro de marca Thermo Scientific, modelo
Espectroco.

Método.

El reactivo utilizado se denomina Glucose Liquicolor, y a continuación se expone una

ficha con las especificaciones del método utilizado:

Tabla 11. Ficha del reactivo utilizado

Nombre Glucose Liquicolor
Método GOD-PAD
Denominación Método sin desproteinización
Tipo de prueba Prueba enzimática colorimétrica por glucosa
Fuente: HUMAN Diagnostics

En el instructivo que se muestra adjunto en el empaque de este reactivo de marca

comercial Liquicolorª, se cita la manera en que se desarrolla el método: “La glucosa se
determina después de la oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El peróxido
de hidrógeno formado reacciona bajo la catálisis de peroxidasa con fenol y 4-

4
Esta es la normativa que determina un “Método de Prueba para la determinación
de lactosa en leche”.
 Chimbo Peñaloza 31

aminofenazona formando un complejo rojo-violeta usando quinoneimina como indicador

(HUMAN Diagnostics, 2012)”. El principio la reacción refleja la manera en que se
desarrolla este método:

Glucosa + O2 + H2O GOD Ácido glucónico + H2O

2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol POD quinoneimina + 4 H2O

Características de la prueba.

Este método facilita realizar varios procesos importantes para determinar los valores
buscados para un óptimo producto y así desarrollar un sirope para bebidas alcohólicas de
buena calidad. De esta manera, se desarrolla como parte de la información del producto la
siguiente descripción:

La prueba es lineal hasta una concentración de glucosa de 400 mg/dl ó 22.2 mmol/l. Sí la
concentración de glucosa en la muestra es superior a estos límites, diluir la muestra 1+2
con agua destilada y repetir la determinación. Multiplicar el resultado por 3 (HUMAN
Diagnostics, 2012).

Preparación de reactivos.

Fueron preparados en el laboratorio de biotecnología los reactivos RGT y STD, haciendo

una muestra patrón, utilizando el siguiente esquema de pipeteo:

Tabla 12. Esquema de pipeteo

ACCIÓN MACRO SEMI-MICRO
Pipetear en las
STD ó muestra Blanco de reactivo STD ó muestra Blanco de reactivo
cubetas
STD ó Muestra 20 µl --- 10 µl ---
RGT 2000 µl 2000 µl 1000 µl 1000 µl
Mezclar, incubar por 10 minutos de 20 a 25º C ó 5 minutos a 37º C. Medir la absorbancia del STD y las
muestras frente a un blando de reactivo antes de 60 minutos (ɅA).
FUENTE: HUMAN Diagnostics (2012)
ELABORACIÓN: Vanessa Chimbo

Además, se utilizaron en este proceso los siguientes componentes:

 Chimbo Peñaloza 32

Tabla 13. Uso de reactivos en laboratorio

RGT MEDIDA
Buffer fosfato (pH 7,5) 0,1 mol/1
4-aminofenazona 0,25 mmol/1
Fenol 0,75 mmol/1
Glucosa oxidasa > 15 KU/1
Perosidasa > 1,5 KU/1
STD 3 ml estándar
Glucosa 100 mg/dl o 5,55 mmol/1
FUENTE: Diseño experimental

Muestras a cuantificar.

En las cubetas se colocaron dos diferentes tipos de muestras para ser cuantificadas: 20 µl
de suero lácteo hidrolizado y 20 µl de suero lácteo sin hidrolizar. Cada una de estas
muestras fueron mezcladas e incubadas en un lapso de 10 minutos, a una temperatura de
15º C. Se midió así mismo la absorbancia para determinar la glucosa residual, el cual fue
posible leerse en el espectrofotómetro (un Thermo Scientific de modelo Espectrocom), a
una longitud de onda de 500nm.

A continuación, se describe la preparación de estas por cada una de las cubetas:

Tabla 14. Lectura en el espectrofotómetro

MUESTRAS
NÚMERO DE
SUERO SIN SUERO RGT STD
CUBETA
HIDROLIZAR HIDROLIZADO
1 20µl 2000ul
2 2000ul 20ul
3 20µl 2000ul
4 2000ul 20ul
5 2000ul de agua destilada 0 0
FUENTE: Diseño experimental

Una vez tomadas las lecturas del espectrofotómetro, se procede a desarrollar el

cálculo de concentración de glucosa, siguiendo la fórmula que se anota a continuación:

∆𝐴𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
C= 100 (mg/dl)
∆𝐴𝑆𝑇𝐷
 Chimbo Peñaloza 33

Determinación cuantitativa de la glucosa.

Una vez determinado el contenido de glucosa en cada una de las muestras, será
posible obtener la cantidad de galactosa por inferencia según moles de glucosa. Estos están
desarrollados en la siguiente tabla, en la cual se muestran las respectivas equivalencias:

Tabla 15. Equivalencias

1 mol de lactosa 4 moles de ácido láctico
340,64 g de lactosa 360,4 g de ácido láctico
69,5 mg de lactosa 50 mg de glucosa
7 mg de glucosa
Elaboración: Vanessa Chimbo

2.7. SUPLEMENTACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO

Se hizo un suplemento con la adición de 1 gramo de la enzima Ha-Lactase, así como 3 %

de levadura.

2.7.1. Inóculo

Para preparar el inóculo se necesitaron como muestra 1000 ml de suero desproteinizado y

suplementado, ajustándose el pH de este a 5; de esta manera, se fracciona en diferentes
muestras en matraces de 500 ml de Erlernmeyer con tapón de algodón, a la mitad de los
cuales les fue adicionada sacarosa comercial en cantidad suficiente para alcanzar los 16
ºBrix. Estas fueron utilizadas en diferentes intervalos de tiempo, las cuales fueron
agregadas al contenido celular. De esta forma, se mantiene esta mezcla durante 24 horas a
una temperatura de 30º C en cuña de agar/sabourad combinando con agua peptona. Para la
rectificación de este parámetro, fue utilizada la siguiente fórmula:

𝑚(𝐴−𝐵)
Rectificación 100−𝐴

De estos valores, se describen a continuación:

 m= masa del suero en gramos

 Chimbo Peñaloza 34

 A= Brix al que deseamos llegar

 B= Brix inicial del suero

Se incubaron a 28 +/- 2º C, en condiciones estáticas, a fin de que se produzca una

fermentación espontánea predominantemente anaeróbica, efectuándose los análisis
microbiológicos en tres momentos diferentes, como se ha venido anotando. Estos lapsos
fueron:

a. Transcurridas 24 horas, que es cuando empieza el desprendimiento del CO2. En

este momento, las condiciones aeróbicas declinaron por consume del O2 disuelto
en el suero.
b. Transcurridas las 48 horas, que es cuando se da el proceso denominado como
fermentación tumultuosa.
c. A los 5 días, que es cuando termina la fermentación.

2.8. ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS

2.8.1. Aislamiento de levaduras

Fueron tomadas alícuotas de 1 ml de cada suero natural examinado, y se sembraron por

triplicado con el método de cultivo por extendido en placa. El medio de cultivo utilizado
para este procedimiento fue el agar Sabouraud con un 4 % de glucosa. Las placas
inoculadas se incubaron a 25 +/- 2º C con lapsos que oscilan de tres a cinco días. Finalizado
este período, se procedió a examinar macro y microscópicamente a las colonias
desarrolladas, que presentaron alguna diferencia entre ellas (por ejemplo: tamaño, forma y
color de colonias, forma, tipo de agrupación.

El objetivo es desarrollar un recuento de células viables de levaduras, practicando

diluciones sucesivas de la muestra para sembrar un determinado volumen de agar
Sabouraud. Conociendo el número de colonias que crecen en el medio, el inóculo utilizado
y la dilución, es posible determinar las UFC/ml de la muestra inicial-separadas.
 Chimbo Peñaloza 35

DIAGRAMA 2. DILUCIONES DE MUESTRAS PARA CUANTIFICACIÓN DE

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Fuente: Ferreyra, 2006

 Chimbo Peñaloza 36

2.8.2. Condiciones del cultivo

Las variables utilizadas fueron: CO2, grados Brix y tiempo de fermentación. Además, se
realizó un diseño factorial de tres niveles para los tres factores antes mencionados; es decir,
un factorial 2³.

2.9. DESTILACIÓN

Una vez obtenido el líquido previo a su destilación, se utilizó el evaporador rotatorio marca
Buchi R 210/215, junto a un controlador de vacío, el cual ayudó con sus aspiraciones. De
esta manera es posible tener certeza de obtener las soluciones completas. Al momento de
encender y hervir este líquido, los vapores ascendieron para recorrer un tubo con forma de
cuello de cisne hacia el serpentín, el cual estuvo sumergido en un depósito de agua fría,
donde se condensan estos componentes. En este proceso, se ha tomado en cuenta las colas
de destilación, las cuales se describen a continuación:

 Cabezas (55 %): esta primera fracción fue desechada, ya que había estado
constituida por los compuestos más volátiles que el etanol, ya sea acetato de
etilo, el etanol y acetales. Además, aquí se pudo también encontrar restos de
SO2 de soluciones inadecuadas. Cabe recalcar que en esta fase se arrastran las
colas procedentes de la última destilación realizada.
 Flemas (26 % – 28 %): llamado también “corazón”, es la proporción de
alcohol puro, pues la temperatura a la que se destila es de alrededor 78,5º C,
basada en los valores de punto de ebullición para algunos disolventes
comunes. Estas representan alrededor del 40 % del volumen recogido.
 Colas (2 %): esta es la última fracción, la cual contiene bastante agua. Las
colas representan 1,5 % del volumen recogido.
 Chimbo Peñaloza 37

Tabla 16. Valores de punto de ebullición

COMPUESTOS PUNTO DE EBULLICIÓN
Éter etílico 34,6º C
Metanol 64,7º C
Hexano 69,0º C
Acetato de etilo 77,0º C
Etanol 78,4º C
Ciclohexano 80,7º C
Heptano 98,4º C
Tolueno 110,6º C
Etilbenceno 136º C
Fuente: Enríquez García, Raquel

Luego de realizada esta destilación, en todas las muestras se puede percibir un olor
característico, el cual es sumamente profundo. Estas muestras fueron guardadas en envases
de vidrio para evitar la evaporación hasta que haya sido posible determinar su
concentración en cuanto al grado alcohólico.

2.9.1. Determinación de la pureza de la disolución (grado alcohólico)

Para poder determinar la pureza de la disolución, es necesario analizar la densidad de la

mezcla, para lo cual se requirió de un picnómetro donde se alojó la muestra. De esta
manera, se aplica la siguiente fórmula para determinar el volumen en el picnómetro:

(𝑚. 𝑝𝑖𝑐𝑡ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 + 𝑎𝑔𝑢𝑎𝑑𝑒𝑠𝑡𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎 − 𝑚. 𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜)

𝑣. 𝑝𝑖𝑐𝑡ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 =
𝑝. 𝑎𝑔𝑢𝑎(215°𝐶)

Así, aplicando a la muestra una temperatura de 21,5º C, se determinó que existió un

volumen de 998,2 kg/m³. Se midió, así mismo, la masa del picnómetro con agua destilada,
dando unos 23,933 g, cuando la masa del picnómetro vacío es de 16,179 g. Esto dio como
consecuencia, luego de aplicada la fórmula, que el volumen del picnómetro es de 7,768 ml.

Entonces, desde este punto, se obtienen ya con dos elementos importantes para continuar
con el estudio: el volumen del picnómetro y la masa del etanol. Ahora, hace falta obtener
con estos datos la densidad del etanol, la cual se la ha determinado mediante la aplicación
de la siguiente fórmula:
 Chimbo Peñaloza 38

(𝑚. 𝑝𝑖𝑐𝑡ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 + 𝑎𝑔𝑢𝑎𝑑𝑒𝑠𝑡𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎) − 𝑚. 𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜

𝑝. 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 =
𝑣. 𝑝𝑖𝑐𝑛ó𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜

Como se puede deducir de la fórmula presentada, la masa del etanol se obtiene de la resta
de la masa del picnómetro, más la disolución, menos a masa del picnómetro. De esta
manera, se obtiene una densidad de 804,3 kg/m³. Este dato es contrastado con la tabla anexa
(¿?) (tomada de Perry), y así se puede determinar la concentración en masa del grado
alcohólico.

2.9.2. Determinación de metanol y alcoholes superiores en el etanol destilado, por

cromatografía de gases

Tras la obtención de etanol luego del proceso de hidrólisis del suero, se administró un
estricto control en el proceso de destilación y producción del compuesto que se deseaba
obtener, con la finalidad de que las posibilidades de contaminación fueran mínimas, de que
no existan adulteraciones en el resultado final, ni que se produjera metanol. El metanol es
un compuesto cuya detección en los productos para el consumo humano resulta
inconveniente ya que tiene una alta toxicidad. Se ha registrado casos en los que, testeando
productos de consume humano, se ha encontrado metanol en su composición; esto ha
derivado en la manifestación de varias complicaciones orgánicas como intoxicaciones,
ceguera y, en casos extremos, se ha producido la muerte por insuficiencia respiratoria. Es
necesario tomar en cuenta estas consecuencias al momento de desarrollar cualquier tipo de
bebida. A continuación, se dice en la siguiente cita:

La toxicidad por ingestión es de 0,1g metanol/kg peso corporal o más, es

considerada como grave, la ingestión de más de 1 g metanol/kg peso corporal
siendo potencialmente letal. La exposición por inhalación de una concentración
de más de 1309 mg/m3 (1000 ppm) o el contacto prolongado o extenso de la piel
puede causar también toxicidad sistémica (Luna, 2012)

Por estas razones se ha tomado las debidas precauciones durante el proceso llevado a cabo,
asegurando que la presencia del metanol y de los alcoholes superiores se encuentre por
 Chimbo Peñaloza 39

debajo del límite tolerado de acuerdo a las Normas INEN 1837:2015 (Martin, Burggraff,
Dyer, & Buscemi, 1981).

Fundamentos del método.

La cromatografía de gases hace uso de temperaturas altas para volatilizar compuestos, los
cuales se separan conforme pasan a través de la fase estacionaria de una columna y son
detectados para su cuantificación. La cromatografía de gases se define y caracteriza de la
siguiente manera:

Es una técnica analítica que permite separar mezclas de compuestos fácilmente

volatilizables y térmicamente estables en sus componentes individuales. En todas
las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil, a
través de una fase estacionaria con la que es inmiscible fijada a una columna o a
una superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de
la muestra se distribuyan de modo distinto entre ambas. (...). (Abelló Linde, S.A.,
2006)

Cabe resaltar que esta técnica permite separar los componentes de una muestra debido a la
diferente afinidad entre dos fases que resultan inmiscibles entre sí: una estacionaria (liquida
o sólida) y otra móvil (gas o líquida).

Reactivos.

Las disoluciones anotadas a continuación requieren que su preparación se lleve a cabo de

una manera precisa y con las precauciones pertinentes:

 Etanol del 16 % (v/v) en agua desionizada destilada (dd), 100 ml.

 Etanol de 50 % (v/v) en agua (dd), 500 ml.
 Chimbo Peñaloza 40

Disoluciones de reserva

Las siguientes disoluciones necesitan ser preparadas con cantidades conocidas de etanol y
de alcoholes de fusel o metanol:

 10 g de metanol completados a 1000 ml con etanol del 50 % (v/v).

 5 g de alcohol n-propílico, completados a 1000 ml con etanol de 50 % (v/v).
 5 g de alcohol isobutílico, completados a 1000 ml con etanol del 50 % (v/v).

Disoluciones patrones de trabajo.

Estas son preparadas a partir de las disoluciones de reserva con la finalidad de que
contengan distintas cantidades de cada uno de los alcoholes de fusel; se utiliza alícuotas de
estas para obtener las curvas de calibración. Es así que se procede a preparar cuatro
disoluciones de patrones de trabajo, a saber:

 0,5 ml de las disoluciones de reserva 1, 2 y 3 con 4,5 ml de etanol del 50 %

(v/v) y completada a 100 ml con etanol del 16 % (v/v).
 1 ml de las disoluciones de reserva 1, 2 y 3 con 3 ml del 50 % (v/v) y
completada a 100 ml con etanol del 16 % (v/v).
 1,5 ml de las disoluciones de reserva 1, 2 y 3 con 1,5 ml de etanol del 50 %
(v/v) y completada a 100 ml con etanol del 16 % (v/v).
 2 ml de las disoluciones de reserva 1, 2 y 3, completado a 100 con etanol del
16 % (v/v).

Materiales.

 Pipeta mecánica de 1 µl, con sus puntas.

 Matraz de fondo redondo de 500 ml.
 Jeringuilla para el cromatógrafo de GC.
 6 matraces aforados de 100 ml.
 4 matraces aforados de 1000 ml.
 Chimbo Peñaloza 41

Equipos.

 Balanza analítica.
 Una unidad de destilación con un elemento de calefacción que se ajuste al
matraz de fondo redondo de 500 ml.
 Un refrigerante de agua fría.
 Una unidad de cromatografía de gases.

Se requiere ajustar el cromatógrafo bajo las siguientes especificaciones:

Tabla 17. Ajuste de cromatógrafo

Temperatura del inyector 200º C
Temperatura de columna De 70 a 170º C/min
Gas portador de las columnas He a 2 ml/min5
Detector: Ionización de llama
Atenuación: 8 (para todos los desarrollos)
Elaboración: Vanessa Chimbo

Proceso de preparación de la muestra.

1) Llenar hasta el enrase un matraz aforado de 100 ml. con la muestra de alcohol
destilado que se debe analizar.
2) Vertir el alcohol en un matraz de fondo redondo de 500 ml. y enjuagar varias
veces el matraz aforado con agua destilada, para completar la transferencia. Si
resulta necesario, se puede añadir más agua para alcanzar un volumen de la
muestra más agua destilada de aproximadamente 150 ml.
3) Destilar la muestra y recoger el destilado en un matraz aforado de 100 ml. que
esté limpio. Se continuará con la destilación hasta que el matraz volumétrico esté
lleno hasta la línea de aforo.

5
N2 a 20 ml/min en el caso de empaquetadas
 Chimbo Peñaloza 42

4) Adicionar 1 ml de la disolución de reserva de alcohol bencílico, a los 100 ml. de

cada una de las disoluciones de trabajo patrones y de la muestra de alcohol que va
a ser analizada.

Análisis de la muestra y de las disoluciones de trabajo en patrones.

1) Inyectar 1µl. de la disolución de la muestra y de cada una de las disoluciones

patrones de trabajo, en desarrollos separados, en la columna de cromatografía GC
(con una relación de separación 1:20). En el caso de las columnas empaquetadas,
inyectar 5µl.
2) Obtener los cromatogramas y los datos de la integración de los picos.

2.10. DISEÑO EXPERIMENTAL

2.10.1. Diseño factorial 2³

Los tratamientos a los que se someterán las muestras utilizadas en el presente estudio, serán
analizados experimentalmente mediante un diseño factorial, a través del cual se busca
investigar el comportamiento derivado de la interacción de las variables (azúcar, porcentaje
de levadura y tiempo) contrastándolos con los factores de respuesta (CO2, grados Brix,
grados GL). Estas acciones ayudarán a determinar cuáles son las condiciones óptimas que
se deben implementar para la producción de etanol.

Por otro lado, cabe señalar que el diseño factorial 2³ sirve para estudiar el efecto de tres
factores en dos niveles cada uno. Consta de 2³ = 2 * 2 * 2 = 8, es decir 8 tratamientos
diferentes. Los tratamientos del diseño 2³ y su representación geométrica pueden ser
apreciados en la figura 4.

La región experimental ahora es un cubo regular centrado en el origen (0, 0, 0), cuyos
vértices son los ocho tratamientos. La matriz de diseño se construye fácilmente alternando
el signo menos y el signo más en la primera columna, dos menos y dos más en la segunda
 Chimbo Peñaloza 43

columna, y cuatro menos en la tercera. El diseño resulta dispuesto en el orden estándar o

de Yates.

Figura 4. Diseño factorial 2³ y su representación geométrica

ELABORACIÓN: Vanessa Chimbo

Con este diseño se pueden estudiar 7 efectos que corresponden a la ecuación: 2³ - 1 = 7. De

esto se deriva tres efectos principales: A, B, C; tres interacciones dobles: AB, AC, BC, y
una interacción triple ABC.

De manera general, la parte que es de mayor interés para el estudio, se enfoca en los efectos
principales y las interacciones dobles. Sin embargo, aunque de antemano se puede
considerar la interacción triple ABC en el diseño 2³ como un efecto que se puede ignorar,
resulta recomendable asegurarse de que su valor sigue siendo de una minúscula cantidad.
Se debe tomar en cuenta que incluirla en el análisis puede ayudar a mejorar la perspectiva
e interpretación de algunos gráficos, como se podrá apreciar más adelante.
 Chimbo Peñaloza 44

2.10.2. Desarrollo experimental

Para iniciar el diseño experimental se inocularon en cada una de las muestras de suero
hidrolizado, determinadas cantidades de azúcar, levadura y tiempo. El desarrollo de este
proceso experimental se llevó a cabo, en el laboratorio de biotecnología UDALAB de la
Facultad de Ciencia y Tecnología de la Universidad del Azuay.

Variables.

Se determinó las variables para el diseño de las mezclas, con el cual fue posible establecer
la distribución de las variables para las respuestas de los experimentos. Todos estos datos
se pueden ver en las siguientes dos tablas:

Tabla 18. Variables del diseño experimental

Azúcar X1
Porcentaje de levadura X2
Tiempo X3

Elaboración: Vanessa Chimbo

Tabla 19. Respuestas del diseño experimental

X1 CO2
X2 Grados Brix
X3 Grados GL

Elaboración: Vanessa Chimbo

Partiendo del experimento 0, y según las cantidades cuyo soporte consta en la

argumentación bibliográfica del presente trabajo, se derivan las cantidades estándar de las
variables. Estas cantidades constan en la Tabla 20 que se muestra a continuación:

Tabla 20. Cantidades estándar respecto de las variables

x1 Azúcar 79 g
x2 Cepa 3%
x3 Tiempo 5 días

Elaboración: Vanessa Chimbo

 Chimbo Peñaloza 45

Las variables fueron ubicadas en la primera matriz experimental tal y como lo muestra la
Tabla 21 a continuación:

Tabla 21. Matriz del diseño experimental de mezclas con las variables identificadas
x1 x2 x3
Experimento Azúcar Cepa Tiempo
1 1 1 1
2 1 1 -1
3 1 -1 1
4 1 -1 -1
5 -1 1 1
6 -1 1 -1
7 -1 -1 1
8 -1 -1 -1
0 0 0 0

Elaboración: Vanessa Chimbo

Por otro lado, en la tabla 22 se exponen los inóculos para cada una de las 8 muestras, de
acuerdo al diseño experimental propuesto. Es así que, por ejemplo, en el experimento 1, se
adiciona 80 g de azúcar y un 4 % de levadura; este producto requiere ser fermentado
durante 6 días en 1000 ml de sustrato. El mismo proceso aplica al resto de muestras,
teniendo en cuenta las distintas especificaciones para cada caso.

Tabla 22. Inóculos de acuerdo al diseño experimental

x1 x2 x3
Experimento Azúcar (g) Cepa (%) Tiempo (días)
1 80 4 6
2 80 4 4
3 80 2 6
4 80 2 4
5 78 4 6
6 78 4 4
7 78 2 6
 Chimbo Peñaloza 46

8 78 2 4
0 0 0 0

Elaboración: Vanessa Chimbo

Una vez adicionados los inóculos en cada una de las muestras (suero hidrolizado) y
de acuerdo al diseño factorial propuesto, estos fueron incubados y posteriormente
fermentados una temperatura de 38º C.

Consecutivamente, pasado el tiempo requerido, se llevó a cabo distintos análisis respecto

al CO2, grados Brix y grados GL. Las variables de respuesta constan en la siguiente tabla
23:

Tabla 23. Variables de respuesta en los diferentes experimentos

x1 x2 x3 Variables de respuesta
Experimento Azúcar (g) Cepa (%) Tiempo (días) CO2 Brix ºGl
1 80 4 6 0,35 3,9 40,04
2 80 4 4 0,38 5,9 21,00
3 80 2 6 0,33 4,1 28,00
4 80 2 4 0,34 6,6 39,00
5 78 4 6 0,37 3,7 15,00
6 78 4 4 0,36 6,0 28,70
7 78 2 6 0,31 3,3 48,70
8 78 2 4 0,40 6,2 33,80
0 0 0 0 0,41 6,1 40,00

Elaboración: Vanesa Chimbo

2.11. ANALISIS SENSORIAL

Para determinar la aceptación del producto, se reclutará un grupo de personas que realicen
la catación del producto, este panel serán jueces semientrenados, es decir personas que han
recibido un entrenamiento teórico similar, las cuales no requieren de una definición muy
precisa de términos y escalas (Anzaldúa-Morales, 2005). Para realizar la catación, se
elaborará una ficha de cata que consistió en dos puntos principales: un análisis olfativo y
 Chimbo Peñaloza 47

de sabor, en la que se aplique una escala hedónica del 4 al 1, la cual mida el grado de
satisfacción del catador en cuanto a aspecto, olor y sabor del producto

Ver Anexo 6. Ficha de cataciòn

Finalmente se desarrollaron tablas que muestran los resultados obtenidos después de la

valoración del mismo.
 Chimbo Peñaloza 48

CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Es necesario realizar varias tablas y gráficos, los cuales son complementarios a los gráficos,
tablas y diagramas que han sido presentados en los capítulos anteriores, los cuales han
facilitado interesantes resultados, los cuales permiten poder trabajar en la elaboración de
bebidas alcohólicas partiendo del lactosuero, dándole a este producto que comúnmente
desechado, un uso práctico. Todos estos recursos visuales permitirán al lector e
investigador comprender los datos numéricos que ayudan a entender todo el proceso.

Es así que se encuentran a continuación datos iniciales de las muestras, o aquellos

procesuales, así como los terminales de todo lo desarrollado, determinando así valores que
pueden ser contrastados para el estudio. De la misma manera, se desarrollan los respectivos
comentarios de la autora, quien llegó a varias conclusiones por la información de tipo
cuantitativa que se dio de estos procedimientos del trabajo experimental, en función de las
fórmulas, de la teoría y de las herramientas y suplementos que fue posible utilizar gracias
a los laboratorios de la Universidad del Azuay.

3.1. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS DE PROPIEDADES FÍSICO-

QUÍMICA DEL SUERO DE LECHE

En primer lugar los datos iniciales, corresponden a las propiedades físico-químicas, datos
que fue necesario determinar antes del análisis y experimentación para contrastar estos
datos con los del resto del trabajo experimental. Estas lecturas fueron realizadas por
triplicado para así obtener resultados de mayor fidelidad, los cuales están basados en un
cálculo promedial. En otras palabras, los datos que a continuación se presentan son un
promedio de los que fueron anotados al momento de que dio por iniciada la
experimentación. De esta manera, se anota en la siguiente tabla:
 Chimbo Peñaloza 49

Tabla 24. Datos del suero antes del proceso de hidrólisis

Grados Brix 6,80
pH 5,84
Acidez 0,16
Fuente: Estudio de laboratorio
Elaboración: Vanessa Chimbo

Se presentan los resultados desarrollados en el diagrama 1, de planificación de trabajo.

Estos son presentados en las siguientes tablas:

Tabla 25. Porcentaje de hidrólisis alcanzado

Punto Punto
Porcentaje de
Tiempo Temperatura crioscópico crioscópico final
hidrólisis
inicial ºH ºH
3 horas 25º C -0,544 0,780 82,72 %
Fuente: Estudio de laboratorio
Elaboración: Vanessa Chimbo

3.1.1 Suero hidrolizado durante el proceso de fermentación

A continuación, se presentan las tablas correspondientes a los datos de fermentación

tomados con el medidor de CO2; presenta los datos observados y anotados que
correspondieron al día 0, es decir, el día en que se llevó las muestras al laboratorio para ser
examinadas; tabla 26. En cambio la tabla 27 muestra los valores que se obtuvieron durante
el proceso de fermentación correspondiente a 7 días.
 Chimbo Peñaloza 50

Tabla 26. Siembra de levaduras en el día 0

Grados Medidor de CO2
Grados Grados
Brix Temperatura pH
Brix GL CO2 Presión
rectificado
6 16,2 0 28º C 5,6 0,14 vol -4,1 psi
Fuente: Estudio de laboratorio
Elaboración: Vanessa Chimbo

Tabla 27. Proceso de fermentación

Grados Grados Medidor de CO2
Temperatura pH
Brix GL CO2 Presión
Día 1: Propagación de levaduras 15,7 2 27º C 5,3 0,38 vol -4,3 psi
Día 2: Propagación máxima de levaduras 10,5 3,5 27º C 4,8 0,42 vol -4,6 psi
Día 3: Producción de alcohol 8,5 8 27º C 4,64 0,36 vol -4,9 psi
Día 4: Producción de alcohol 7,1 9 28º C 3,47 0,28 vol -5,3 psi
Día 5: Producción de alcohol 5,1 10,5 27º C 3,24 0,21 vol -5,7 psi
Día 6: Producción de alcohol 4,8 13 27º C 3,1 0,18 vol -6,0 psi
Día 7: Producción de alcohol 3,3 15 27º C 3,04 0,16 vol -6,3 psi
Fuente: Estudio de laboratorio
Elaboración: Vanessa Chimbo
 Chimbo Peñaloza 51

El gráfico 1, se indica la variación del porcentaje de sólidos solubles, se observa un

descenso continuo-rápido hasta el día 5 de la fermentación alcohólica con un valor
de 5.1; y a partir de este un descenso lento terminando la fermentación con un valor
de 3.8 en el séptimo día.

Gráfico 1. Variación de los °Brix durante la fermentación

18

16

14

12
Grados Brix

10 y = -1,8571x + 15,286
R² = 0,9009
8

0
Tiempo en días
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

Por otra parte, en el gráfico 2 se observan dos resultados del estudio: el incremento del
volumen y la producción del alcohol. Conforme pasaron los siete días de la fermentación,
se pudo contrastar algunos de estos datos, presentes en el gráfico señalado: por ejemplo,
hasta el día 2 no se había notado un incremento significativo de volumen, mientras que ya
en el tercer día, las muestras experimentaron un incremento de un 8º G, considerado
elevado en comparación de la reacción anterior. Al finalizar la fermentación, esta terminó
en unos 15º GL; esto es en el séptimo día.
 Chimbo Peñaloza 52

Gráfico 2. Desarrollo del grado alcohólico en relación a sus días de fermentación

50

45

40

35

30
Grados GL

y = 6,0798x + 1,8583
25 R² = 0,9696
20

15

10

0
Tiempo en días
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

A continuación, en la tabla 3 se presenta la variación del pH; este gráfico arroja, entre otros,
los siguientes datos:

 La variación del pH muestra un descenso hasta el día 2, manteniéndose por 2

días con un valor de 4.
 Continúa bajando hasta el día 4 con un pH final de 3,5.

Esto podía indicar que la acidificación del medio producido por la fermentación que
realizan las Saccharomyces al producir etanol, ya que es evidente la relación directa entre
la producción de este y el descenso en el pH.
 Chimbo Peñaloza 53

Gráfico 3. Variación del pH

4
pH

2 y = -0,4139x + 5,5975
R² = 0,933
1

0
Tiempo en días
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

Siendo el dióxido de carbono (CO2) un indicador del proceso de fermentación (cuando la

fermentación es proporcional a la rapidez del CO2), se debió anotar las variaciones de su
comportamiento, según lo que se muestra en el gráfico 4. Se puede notar, por ejemplo, que
hasta el día 2 del proceso de fermentación se da el incremento más alto y, aunque empiece
a descender levemente el volumen, nunca deja de producirse fermento. Esta producción se
termina en el día 7, con 0,18 vol de CO2.
 Chimbo Peñaloza 54

Gráfico 4. Producción de CO2

0,45

0,4

0,35

0,3

0,25
CO2

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo en días

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

3.2. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS DE PORCENTAJES DE

LACTOSA INICIAL Y FINAL

Tabla 28. Datos de lactosa inicial y final

Suero sin hidrolizar Suero hidrolizado
164,45 mg glucosa 322,52mg glucosa
228,58 mg lactosa 448,30mg lactosa
23,022mg galactosa 45,15mg galactosa
0,2418g de ácido láctico 0,4743g ácido láctico
Fuente: Estudio de laboratorio
Elaboración: Vanessa Chimbo
 Chimbo Peñaloza 55

Figura 5: Contenido de lactosa inicial, ácido láctico, lactosa y glucosa producida luego del proceso de
hidrolisis en el suero dulce

suero sin hidrolizar suero hidrolizado

glucosa galactosa lactosa acido lactico

3.3. DESARROLLO Y COMPORTAMIENTO DE LAS LEVADURAS

En el estudio realizado en el día 0, se determinó la presencia de 7 log de levadura,

indicando que hubo un incremento por la rectificación de sustrato. Al cabo de 24 horas,
estas experimentan un decrecimiento, llegando hasta 4,5 log de levadura; sin embargo, al
día siguiente empieza una etapa de crecimiento que termina al final del día con una etapa
estacionaria que dura hasta el cuarto día. Empieza un descenso, llegando a 2 log de
levadura.
 Chimbo Peñaloza 56

Gráfico 5. Comportamiento de las levaduras durante el proceso de fermentación

Producción de levaduras
6

0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo en días

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

3.4. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS EN CUANTO A LA PUREZA

DEL GRADO ALCOHÓLICO

Tabla 29. Pureza de grado alcohólico

Experimento Densidad (kg/l) Grados GL

1 935,10 40.04
2 969,01 21,00
3 958,80 28,00
4 938,86 39,00
5 976,87 15,00
6 956,69 28,70
8 916,09 49,70
8 948,90 33,80
0 936,84 40,00

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo
 Chimbo Peñaloza 57

3.5. RESUMEN DE DATOS OBTENIDOS EN CUANTO A

CUANTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS DE ALCOHOL

El rendimiento estequiométrico teórico para la transformación de glucosa en etanol es de

0,165 g de etanol y 0,158 g de dióxido de carbono por 0,32252 g de glucosa.

3.6. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE DETERMINACIÓN

Se aplicó un cálculo para la determinación de metanol, furfural, aldehídos, alcoholes

superiores y alcohol etílico a través de una fórmula, que se reproduce a continuación:

À𝑟𝑒𝑎𝑑𝑒𝑙𝑎𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Porcentaje de metanol= * 0,01mg/ ml * 100 * 100 %
À𝑟𝑒𝑎𝑑𝑒𝑙𝐸𝑠𝑡à𝑛𝑑𝑎𝑟

Gráfico 5. Concentración de metanol

Porcentaje de
Muestra Área de muestra Área Patrón concentración de
metanol
M1 0,6002 4241,2543 0,014 %v/v
M2 0,8121 4241,2543 0,019 %v/v
Fuente: Estudio de laboratorio
Elaboración: Vanessa Chimbo

Las muestras, que presentó un grado superior de metanol fue la muestra 2 (M2), mientras
de la muestra 1 (M1) presentó menor grado de metanol en comparación. Aun siendo la más
alta de las dos muestras analizadas, ninguna sobrepasó el límite aceptado, el cual determina
como mínimo el 0,1 %, y como máximo el 0,2 % (NTE INEN 1837:2011). Estos datos se
reproducen en el siguiente gráfico, donde se evidencia el hecho que ni la barra más alto
correspondiente a M3, no supera los límites señalados:
 Chimbo Peñaloza 58

Gráfico 6. Contenido de metanol presente en las muestras

0,35
Max: 0,3%

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,014 0,019
0,05

0
m1 m2 m3

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

En cuanto a la concentración de furfural, en la bebida alcohólica, no presenta ninguna área

de muestra razón por la que se considera 0 en cuanto a su concentración cumpliendo con
un requisito de 0% según NTE INEN 1837:2015

Tabla 31. Concentración de aldehídos

Porcentaje de
Muestra Área de muestra Área Patrón concentración de
aldehídos

M1 0,5017 43,513,000 0,011 %v/v

M2 0,6039 43,513,000 0,013 %v/v

M1 y M2, presentó una concentración de aldehídos baja, al límite permitido, el cual

determina un mínino de 0% y como máximo 0.05% respecto a NTE INEN 1837:2015.
Estos datos se reproducen en el siguiente gráfico, donde M1= 0.011 Y M2 = 0.013 se
evidencia la presencia de estos, pero en muy baja cantidad; no supera los límites señalados:
 Chimbo Peñaloza 59

Gráfico 7. Contenido de aldehídos presente en las muestras

m3 Max: 0,05%

m2 0,0013

m1 0,0011

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

Tabla 32. Concentración de alcoholes superiores

Porcentaje de
Muestra Área de muestra Área Patrón concentración de
alcoholes superiores

M1 0,8912 40,000,000 0,0022 % v/v

M2 0,9011 40,000,000 0,0023 % v/v

Las muestras, que presentó una concentración superior de alcoholes fue la muestra 2 (M2),
mientras de la muestra 1 (M1) presentó menor concentración aun que la diferencia es
mínima. Aun siendo la más alta de las dos muestras analizadas, ninguna sobrepasó el límite
aceptado, el cual determina como mínimo el 0 %, y como máximo el 0,05 % de acuerdo a
la norma 1837:202. Estos datos se verifican en el siguiente gráfico, donde se evidencia el
hecho de presencia de estos, pero, no supera los límites:
 Chimbo Peñaloza 60

Gráfico 8. Contenido de alcoholes superiores presentes en las muestras

m3 Max: 0,05%

m2 0,0023

m1 0,0022

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

Como se indicó anteriormente, tampoco se obtuvo una concentración cuantificada de etanol

en ninguna de las muestras que hubiera sobrepasado el límite aceptado de 50 %, respecto
a NTE INEN 1837:2011. En el siguiente gráfico, es posible observar en las barras los
límites de contenido de etanol, pudiendo observar claramente que están por debajo.
 Chimbo Peñaloza 61

Gráfico 9. Contenido de etanol presente en las muestras

100%

90%

80%

70%

60% 15
28,7 33,8 40 54
21 28 39 48,7
50% 40,04

40%

30%

20%

10% 5
6 8 9 10
2 3 4 7
0% 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

3.7. RESULTADOS DE LAS INTERACCIONES DOBLES Y TRIPLES

ENFOCADAS EN EL DISEÑO FACTORIAL

Luego de haber realizado los estudios ya descritos, se procedió a analizar elementos

como el CO2, los grados Brix y los grados GL. Como se puede apreciar en la siguiente
tabla, que existió un alto porcentaje de alcohol en el experimento número 7, donde se
trabajó con menor cantidad de cepa, una cantidad mínima de azúcar y el máximo tiempo
obteniendo un porcentaje alto entre estos.
 Chimbo Peñaloza 62

El efecto entre las variables se presenta en la siguiente tabla, donde se determina que
existe un efecto negativo en la variable B: si existen mayor cantidad de esta variable, esta
puede causar efectos nada deseables para los objetivos del experimento; sin embargo, la
variable A aporta con buenos resultados con respecto a C, que es la variable que menos
interferencia presenta. En donde: A= azúcar B= cepa de levadura C= tiempo

Tabla 33. Resultado del diseño factorial y su efecto de interés

Coeficiente Probabilidad
X Y
B -44,76 14,21
BC 1,44 28,43
A 1,84 42,64
AC 6,84 56,86
C 9,24 71,07
AB 32,84 85,29
ABC 58,64 99,50

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo

Gráfico 10. Normal Plot

120

100

80

60

40

20

0
-60 -40 -20 0 20 40 60 80

Fuente: Estudio de laboratorio

Elaboración: Vanessa Chimbo
 Chimbo Peñaloza 63

3.8. ELABORACION: SYRUP

3.8.1 Preparación de un jarabe a una densidad deseada

Concentrado de maracuyá
%AT= 4.7
% Brix= 7

Bebida
ºBx= 6.5
%AT= 0.5
Iaaz= 22

3.8.2 Cálculo factor de dilución

Para obtener una concentración de muestra distinta se requiere realizar una dilución
de la misma para esto se emplea el factor de dilución, el cual se presenta en la siguiente
ecuación. Considerando que de 1 litro de suero se obtiene 120ml de etanol:

 Cálculo dilución:

𝑉1 𝐶1 = 𝑉2 𝐶2

𝑥(42) = 1.5𝑙(15)

1.5𝑙(15)
𝑥=
42

X = 0.535 litros de agua

 Volumen total:
 Chimbo Peñaloza 64

𝑣𝑜𝑙 = 1.5𝑙𝑎𝑙𝑐𝑜ℎ𝑜𝑙 + 0.535𝑙𝑎𝑔𝑢𝑎

𝑣𝑜𝑙 = 2.035𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠𝑑𝑒𝑎𝑙𝑐𝑜ℎ𝑜𝑙𝑑𝑖𝑙𝑢ì𝑑𝑜

3.8.3 Cálculos de dilución del jarabe a una densidad y grados alcohólicos requeridos

 Kd= coeficiente de dilución

𝑎𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧1 4.75
𝑘𝑑 = = = 6.33
𝑎𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑑𝑒𝑙𝑗𝑢𝑔𝑜 0.75

Kd= 1-x
Kd= concentrado + 5.33 de H2O

 Determinar la cantidad S1 (jugo)

100 100
𝑆1 = = = 15.78𝑑𝑒𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜𝑑𝑒𝑝𝑢𝑙𝑝𝑎
𝐾𝑑 6.33

100% = 84.20% jarabe + 15.79% pulpa

100 ∗ 𝐾𝑑 − 100 100 ∗ 6.33 − 100

𝑆𝑐 = =
𝐾𝑑 6.33

84.20𝑆𝑦𝑟𝑢𝑝(𝑗𝑎𝑟𝑎𝑏𝑒𝑖𝑛𝑐𝑙𝑢𝑖𝑑𝑜à𝑐𝑖𝑑𝑜𝑦𝑎𝑧ù𝑐𝑎𝑟)

 Determinar brix del syrup

𝐼𝑎𝑎𝑓 = ì𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒𝑑𝑒𝑎𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
 Chimbo Peñaloza 65

𝐼𝑎𝑎𝑓 ∗ 𝐴𝐽 − º𝐵𝑟𝑖𝑥𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 22 ∗ 4 − 60
º𝐵𝑟𝑖𝑥𝑑𝑒𝑙𝑠𝑦𝑟𝑢𝑝 = = = 5.2º𝐵𝑥
𝐾𝑑 − 1 6.33 − 1

60ºBrix 100%

5.2ºBrix X

X= 8.6ml jarabe + 91.4 ml H20 + etanol (alcohol diluido)

Relación 8.6 pulpa

91.4 agua + etanol

Volumen total 100ml

 Cantidad de azúcar

100𝑚𝑙(12 − 6.5)
= 6.25𝑔𝑎𝑧ù𝑐𝑎𝑟𝑒𝑛100𝑚𝑙𝑑𝑒𝑏𝑒𝑏𝑖𝑑𝑎
100 − 12

3.9. ANALISIS DE LA BEBIDA ALCOHOLICA

Interpretación de resultado y análisis sensorial: Syrope con maracuyá para

bebidas alcohólicas.
 Chimbo Peñaloza 66

Tabla 34.Resultados, según la ficha de catacion en relación al sentido olfativo

Olfativo
Malo
Regular
Bueno
Muy bueno

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Muy bueno Bueno Regular Malo

Acido 70 20 0 0
Frutal 60 30 0 0
Propio 90 0 0 0
Agradable 80 10 0 0

Fuente: Estudio de laboratorio

Tabla 35: Resultados y estadística, según la ficha de catacion en relación al sentido del sabor

Sabor
Malo
Regular
Bueno
Muy bueno

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Muy bueno Bueno Regular Malo

Picante 90 0 0 0
Amargo 90 0 0 0
Acido 80 0 10 0
Dulce 80 10 0 0

Fuente: Estudio de laboratorio

Obtenidos los resultados, acorde a las fichas de cataciòn permiten evaluar la

aceptación del producto, siendo necesario destacar que la bebida obtuvo una
aceptación de un 92 % en un total de personas = 50 que fueron evaluadas; 10
personas por 5 días.
 Chimbo Peñaloza 67

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

Con el desarrollo de este proyecto, se estableció las condiciones óptimas para la

estandarización y producción del proceso de etanol, tomando como variables de
estudio: porcentaje de levadura, cantidad de azúcar y tiempo; y que mediante la matriz
experimental junto al análisis, en cuanto a sus efectos de interés. Se establece las
variables que influyen de manera positiva en el proceso que son: tiempo y cantidad de
azúcar.

Con las variables relevantes, del diseño factorial compuesto y en función de

deseabilidad se estableció el punto y condiciones óptimas para la producción de etanol,
resultando que tanto la menor concentración de azúcar y la menor cantidad de levadura
y por el lapso máximo de tiempo son las mejores condiciones de elaboración en cuanto
a la obtención de etanol.

La fermentación se realizó con éxito, es decir se llevó a cabo la siembra, propagación

de las levaduras en condiciones óptimas, produciéndonos al final un 8% de alcohol,
suficiente para dar paso a la destilación, donde se obtuvo 40% de alcohol etílico ya
destilado, todo esto está dentro de las condiciones que se plantearon.

Los porcentajes de rendimiento fueron buenos, y el tiempo empleado fue acorde al

utilizado a nivel industrial.

Se garantiza, que el etanol obtenido cumplió con los requisitos, en tanto es considerado
apto para el consumo humano sin causar daños a la salud para ello se efectuó un análisis
cromatográfico que nos permite cuantificar las cantidades de metanol, furfural,
alcoholes superiores y aldehídos; con cantidades mínimas y se encuentran dentro de la
norma, lo que garantiza también la inocuidad del mismo
 Chimbo Peñaloza 68

Por medio de la técnica GLUCOSE LIQUICOLOR, se lograron determinar en ambas

muestras cuantitativa e individualmente la glucosa en suero por medio del Kit,
especializado para esta finalidad con la técnica de espectrofotometría, en donde la
reacción en la cual la glucosa del suero fue oxidada a ácido glucónico por medio del
catalizador contenido en el reactivo R2 del mismo kit que contenía glucosa oxidasa;
esta reacción además de obtener como producto al ácido glucónico, se tiene un color
rojizo en la solución el cual era proporcional a la concentración de glucosa presente en
el suero.

La figura 5, Muestra que el medio hidrolizado tiene mayor disponibilidad inicial de

glucosa con 322,52 mg/L en comparación con el suero entero con un valor inicial de
164,45 mg/L, esto debido a la acción de la enzima lactasa (Ha-Lactase), la cual
desdobla la lactosa en glucosa y galactosa. En ambos casos se ve disminuida la glucosa.
Para el suero entero se puede inferir que a medida que el microorganismo desdobla la
lactosa, la convierte de inmediato en ácido cítrico, ya que no se observa una lectura
alta de la glucosa para ninguno de los días.

Se puede concluir que las levaduras Saccharomyces cerevisiae, es un microorganismo

adecuado para la producción de etanol a partir del suero lácteo, observando diferencia
entre el suero entero e hidrolizado, es decir que este microorganismo es capaz de
sintetizar de forma eficiente la lactosa y tomar la glucosa como fuente de energía para
su crecimiento; y así realizar la fermentación para producir alcohol etílico.

La gráfica que muestra el comportamiento en cuanto a las levaduras, se observa cómo

se aclimatan, es decir como su presencia es aglomerada y cuantitativa, duran pocas
horas y a partir de este se da la competencia del alimento (azúcar), entonces se da un
decrecimiento ya que la temperatura afecta directamente el crecimiento de la levadura.
A continuación estas se empiezan a reproducir perfectamente debido a temperaturas
de hasta 32ºC, se da un crecimiento desmedido, En esta etapa casi no se produce etanol,
por lo que tampoco se producirán ésteres, ya que los ésteres se empiezan a producir
cuando se tiene cantidades considerables de etanol.
 Chimbo Peñaloza 69

A partir del tercer día se observa la suficiente reproducción de levaduras, y con el pasar
de los días van a llegar más “cansadas” dando señal de un final de la fermentación; se
da paso a la fase de decline en donde no existe desarrollo y se presencia el rompimiento
enzimático (lisis).

RECOMENDACIONES

Los resultados obtenidos durante la realización del presente trabajo servirán como
base para continuar con una serie de investigaciones de interés actual,
diversificando asi el uso del suero; evitando la contaminación y dejando de lado el
uso de consumo animal. Entre las investigaciones se destacan las siguientes:

 Aplicación de componentes bioactivos de las proteínas del suero para su

aplicación en tratamientos médicos, como es para el control de la
hipertensión arterial usos que se han reportado pero que no han sido a la
fecha ampliamente estudiados, como es también el control del cáncer

 Se requiere más investigación en el ámbito fisiológico y conocer el

beneficio que aportan las proteínas del suero en los productos
nutraceuticos que proveen un beneficio para la salud más allá de la
nutrición básica.
 Chimbo Peñaloza 70

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 Chimbo Peñaloza 74

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXOS
 Chimbo Peñaloza 75

ANEXO 1: SUERO DE LECHE. REQUISITOS NTE INEN 2594:2011

Chimbo Peñaloza 76
Chimbo Peñaloza 77
 Chimbo Peñaloza 78

ANEXO 2: FICHA TECNICA AGAR SABOURAD

 Chimbo Peñaloza 79

ANEXO 3: DETERMINACION CUANTITATIVA DE GLUCOSA

 Chimbo Peñaloza 80

ANEXO 4: PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES ACUOSAS DE

ETANOL
Chimbo Peñaloza 81
Chimbo Peñaloza 82
Chimbo Peñaloza 83
Chimbo Peñaloza 84
Chimbo Peñaloza 85
 Chimbo Peñaloza 86

ANEXO 5: NORMA TECNICA INEN 1837:2015 SOBRE BEBIDAS

ALCOHOLICAS (LIMITE MAXIMO DEL CONTENIDO DE
ETANOL METANOL, FURFURAL, ALDEHIDOS Y ALCOHOLES
SUPERIORES)
Chimbo Peñaloza 87
Chimbo Peñaloza 88
 Chimbo Peñaloza 89

ANEXO 6: FICHA DE CATACION

 Chimbo Peñaloza 90

ANEXO 7: IMÁGENES

Pasteurización: Suero dulce Filtración al frío

Hidrólisis Incubación
 Chimbo Peñaloza 91

Preparación Agar Sabourad - Autoclave Determinación de Glucosa

Dilución de muestras Siembra de levaduras

 Chimbo Peñaloza 92

Potenciómetro Crioscopio

Titulación volumétrica Destilador