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    Practica 4

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    Kevin Jorge Velarde
    El documento describe los procedimientos para realizar tinción simple y diferencial de muestras microbiológicas utilizando un microscopio óptico. Explica los tipos de colorantes, métodos de fijación y las funciones de la tinción. El objetivo es conocer la morfología de microorganismos mediante la observación de sus formas, agrupaciones y reacciones a colorantes. Se proveen instrucciones para la tinción de muestras de levaduras, agua de pecera, vinagre y chicha utilizando violeta de cristal

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    El documento describe los procedimientos para realizar tinción simple y diferencial de muestras microbiológicas utilizando un microscopio óptico. Explica los tipos de colorantes, métodos de fijación y las funciones de la tinción. El objetivo es conocer la morfología de microorganismos mediante la observación de sus formas, agrupaciones y reacciones a colorantes. Se proveen instrucciones para la tinción de muestras de levaduras, agua de pecera, vinagre y chicha utilizando violeta de cristal

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    PRACTICA 4

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    PRACTICA No.

    OBSERVACIÓN DE CÉLULAS MICROBIANAS


    4. INTRODUCCIÓN

    El medio ambiente contiene una diversidad muy grande de formas microscópicas.


    Estas formas de vida denominadas microorganismos interactúan con sus entornos,
    realizando acciones beneficiosas y perjudiciales para los mismos. El conocer sus
    formas y otras características de estos seres microscópicos es una necesidad para los
    profesionales relacionados con su manipulación, para poder aprovecharlos o en su
    caso poder eliminarlos de un determinado proceso.

    4.1. FUNDAMENTO TEÓRICO

    En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona


    importante información para la identificación temprana y definitiva de los
    microorganismos (Decré & Barbut. 2000). En la valoración de las muestras, es
    trascendental el poder de resolución del microscopio, el cual se define como la
    capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos
    del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de
    resolución de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza
    detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y
    de la apertura numérica del objetivo empleado. El máximo poder de resolución en un
    microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere de una amplificación
    entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del ojo humano es de
    aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han
    desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los
    microorganismos (Keller, 2013). Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser
    aplicadas dentro del campo de la microbiología.

    Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras,
    y otros. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los

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    Ing. J. Edgar Ferná ndez Ugarte Pá gina 1
    cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos
    de minerales procesados y manipulados en el laboratorio.

    Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al


    microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que por medio
    del uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación (Fung, 1998); además, la
    presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas, nos
    permite clasificar a las bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes
    funciones:

    1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

    2. Revelan su forma y tamaño.

    3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.

    4. Producen reacciones químicas específicas.

    Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del
    mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción
    diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante,
    (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados
    con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular
    (inmunocitoquímico) (Keller, 2013).

    El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se asegura


    que la preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que se recomienda
    realizar al mismo tiempo de la evaluación de la muestra clínica, la tinción de un agente
    infeccioso ya identificado mediante esa tinción, el cual funcionará como un control
    positivo.

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    Ing. J. Edgar Ferná ndez Ugarte Pá gina 2
    Algunas técnicas tintoriales como Gram o Ziehl-Neelsen requieren antes de su proceso
    la fijación de las muestras, con la finalidad de preservar la arquitectura estructural y
    química de las células (Madison, 2001).

    Existen dos tipos de fijadores: físicos y químicos. Entre los procesos de fijación físicos
    se tienen los siguientes: desecación, calor seco, calor húmedo, ultrasonido y
    microondas, mientras que los procesos de fijación químicos se pueden clasificar como
    oxidantes y reductores, de acuerdo con sus propiedades químicas.

    Entre los agentes químicos oxidantes se encuentran: óxido crómico, ácido acético,
    ácido pícrico, acetona, dicromato de potasio. Los agentes químicos reductores son:
    formaldehído, glutaraldehído, etanol, metanol, paraldehído y otros (Calvo, 2009). Quizá
    el método físico con mayor utilización en microbiología es el calor seco, que consiste
    en exponer directamente la laminilla a la flama del mechero, con esto se logra detener
    los procesos vitales de las células y los microorganismos. Sin embargo, la
    sobreexposición, o la exposición en una zona incorrecta de la flama (zona fría, zona
    caliente y zona de fusión) repercutirán en el efecto deseado; es muy común provocar
    alteraciones morfológicas y destrucción celular. Este método preserva el extendido por
    poco tiempo, por lo que se recomienda utilizar un método químico, que precipite
    proteínas, antes de teñir.

    Los métodos químicos ofrecen mejores resultados para la fijación, ya que son líquidos
    con alto potencial de difusión intracelular y detienen procesos enzimáticos que
    provocan autolisis. Los reactivos poseen la capacidad de interactuar con biomoléculas
    como proteínas, glicoproteínas, peptidoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas,
    pigmentos, ácidos pécticos y nucleicos. El metanol es el reactivo que se encuentra al
    alcance de todos los laboratorios; es un reactivo reductor, deshidratador, y es
    clasificado como fijador coagulante, de tal manera, coagula proteínas y las hace
    insolubles, pero sin desnaturalizarlas. Se preserva la arquitectura de la pared celular y
    evita la sobrecoloración. El metanol tiene un potencial reductor mayor que el etanol. La
    concentración ideal es > 99%.

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    4.2. OBJETIVO GENERAL

     Conocer la morfología de diferentes tipos de microorganismos.

    4.2.1. OBJETIVOS ESPECIFICOS

     Afianzar en las técnicas de tinción simple y diferencial.

     Familiarizarse con el uso del microscopio.

     Familiarizarse con las formas, agrupaciones y reacciones frente a los diferentes


    colorantes por parte de los microorganismos.

    4.3. MATERIAL A UTILIZAR

     Muestras de: Levaduras, agua de pecera, vinagre y chicha.

     Portaobjetos.

     Vaso de precipitado

     Asa de platino.

     Pizeta

     Mechero Bunsen

    4.3.1. REACTIVOS

     Violeta cristal

     Lugol

     Fucsina básica

     Alcohol
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    4.4. PROCEDIMIENTO

    4.4.1. PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION SIMPLE

    1. Realizar el frotis

    2. Realizar fijación

    3. Violeta cristal 30 seg

    4. Enjuagar con agua 2 seg

    5. Secar y observar.

    4.4.2. PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION DIFERENCIAL

    1. Realizar el frotis

    2. Realizar fijación

    3. Violeta cristal 30 seg

    4. Enjuagar con agua 2 seg

    5. Aplicar Lugol por 1 min

    6. Enjuagar con agua

    7. Lavar con alcohol al 95% por 10-30 seg

    8. Enjuagar con agua

    9. Aplicar safranina por 30-60 seg.

    10. Enjuagar con agua.

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    CUESTIONARIO

    1. Luego de realizar la observación microscópica reporte lo siguiente:

    COLOR EN
    FORMAS DE GRUPO DE CLASIFICACION
    MUESTRA TINCIÓN DE
    MICROORGANISMOS MICROORGANISMO SEGUN GRAM
    GRAM

           

           

           

           

           

           

           

           

           

           

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    Ing. J. Edgar Ferná ndez Ugarte Pá gina 6
           

    2. Detalle las características morfológicas, indique su clasificación según la tinción


    de Gram y mencione el efecto que producen los siguientes microorganismos
    (Además realice un esquema coloreado):

    a. Clostridium botulinum

    b. Salmonella thiphi

    c. Vibrio cholereae

    d. Campilobacter jejuni

    e. Saccharomice cerevisiae

    f. Penicillium notatum

    g. Aspergilliu oryzae

    h. Aspergillius nyger

    3. Indique la capacidad total de amplificación mínima y máxima con la que se


    trabajó en el proceso de observación microscópica. (Realice el cálculo).

    4. Mencione los sistemas de un microscopio óptico.

    5. ¿Qué es la capacidad de resolución de un microscopio?

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    Ing. J. Edgar Ferná ndez Ugarte Pá gina 7
    6. ¿Es posible observar virus en un microscopio óptico? Fundamente su
    respuesta.

    7. ¿Qué método de observación recomendaría para estudiar el movimiento de


    bacterias portadoras de flagelos?

    Bibliografía:

    A.N.C. Delaat, A. (2000). Microbiología, México: Editorial interamericano.

    Decré D, Barbut F, Petit JC.(2000). Role of the microbiology laboratory in the diagnosis
    of nosocomial diarrhea. Pathol Biol (París).

    Calvo GA, Esteban RFJ, Montuenga FL. (2009). Técnicas en histología y biología
    celular. 2nd ed. Madrid Spain: Elsevier.

    Fung DC, Theriot JA. (1998). Imaging techniques in microbiology. Curr Opin Microbiol.

    Gamazo,C., López, I., Goñi, P. y Díaz, R. (2002). Manual práctico de microbiología,


    España: Editorial Masson.

    Jack, D. (2002). Principios de desinfección, esterilización y reprocesamiento de


    instrumental médico y de laboratorio, España: Editorial iberoamerica.

    Keller PJ. (2013). Imaging morphogenesis: technological advances and biological


    insights. Science.

    Madison BM. (2001). Application of stains in clinical microbiology. Biotech Histochem.

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