Diagnóstico de PCR de Punto Final de Escherichia Coli

DIAGNÓSTICO DE PCR DE PUNTO FINAL DE Escherichia coli ENTEROTOXIGÉNICA
(ETEC), MEDIANTE LA DETECCIÓN DE TOXINAS TERMOLÁBIL Y TERMOESTABLE.
INTRODUCCIÓN
La Reacción en cadena de la polimerasa, es un método in vitro de un número de copias muy alto de un
fragmento específico de ADN, que requiere de un molde o ADN matriz, unos indicadores o primers que
delimitan la zona del ADN matriz que deberá ser copiado, nucleotidos que serán adicionados a la nueva
cadena y el enzima ADN taq pol que se encargará de la síntesis química. (Fonseca y Mateus, 2010).
E.coli enterotoxigénica (ETEC) agente importante de diarrea en humanos, posee como principal
mecanismo de patogenicidad la síntesis de algunas enterotoxinas principalmente la termoestable (st) y la
termolábil (lt) (Pérez, 2001). El objetivo de esta práctica se basa en adquirir conocimiento sobre la técnica
de PCR y aplicarlo al diagnóstico clínico de E. coli enterotoxigénica. En este caso se utilizó PCR para la
determinación de toxinas termoestables (ST) y termolábil (LT) de ETEC que causan daño a nivel
intestinal (Ibarra, 2013). Los genes que codifican para las toxinas se identificaron por su peso molecular,
se determinó el gen ST siendo aproximadamente 182 pb en las muestras 7 y 8, el gen LT siendo
aproximadamente 708 pb en las muestras 2 y 3 para ETEC.
forma automática y reproducible la sucesión de
METODOLOGÍA ciclos de temperatura necesarios para la PCR
La técnica de PCR de punto final se realizo en (Tamay, Ibarra y Velasquillo, 2013).
ciclos de amplificación exponencial de un
fragmento específico de ADN. Los fragmentos, RESULTADOS
en este caso las toxinas termolábil y
termoestable, están determinados por cebadores,
a partir de los cuales la enzima ADN polimerasa,
realiza copias en síntesis exponencial (Corvalán,
2002).
Cada ciclo de amplificación consta de tres
etapas: la desnaturalización a 96 °C, hibridación
a 55 - 65°C y la extensión a 72 °C, dando como
resultado el gen multiplicado, siendo visualizado
los amplicones en geles de agarosa (Torres,
2011). La desnaturalización permite la
separación de las hebras de ADN. Esto permite
que cada hebra sirva de molde para la síntesis de
una nueva molécula de ADN. Se realizo una
mezcla de PCR, se incluyó los primers (Forward Figura 1.
y Reverse) ver anexo 2, Taq polimerasa, los Productos de Amplificación de E. coli en gel de
cuatro dinucleótidos, Cloruro de Magnesio agarosa.
(iones de Mg2+) y los respectivos controles, , 1= blanco 2 = Control positivo de E. coli lt, 3-5= Muestras
MPM=Marcador de peso molecular, 6-7 = Muestras 8
blanco y muestra, esto se repite en varios ciclos.
Control positivo de E coli st.
Los ciclos se llevan a cabo automáticamente en
el termociclador el cual permite llevar a cabo de
Fuente: Datos experimentales obtenidos del 1. Se determino con la técnica de PCR las
laboratorio de Biología Molecular, edificio T12, toxinas ETEC lt y st de E. coli
USAC
En la Figura 1 se observa los productos de 2. Se determinó ETEC con la toxina LT en las
amplificación de E. coli en gel de agarosa muestras 2 y 3 mediante la observación de
expuestos a luz UV. Se confirma la presencia del fragmentos de aproximadamente 708 pb.
gen para la toxina LT (termolábil) de
aproximadamente 708 pb, en el control positivo 3. Se determinó ETEC con la toxina ST en las
para E. coli LT en el carril 2 y en la muestra 3; y muestras 7 y 8 mediante la observación de
la presencia del gen para la toxina ST fragmentos de aproximadamente 182 pb.
(termoestable) de aproximadamente 182 pb, en
el control positivo para E. coli ST en el carril 6 y
muestra 7 REFERENCIAS
DISCUSIÓN
Corvalán, A. (2002). Biología molecular en
En la figura 1 se observa la separación se Infectología: Parte I: Desarrollo y
secuencias de ADN de interés de metodologías. Revista chilena de
aproximadamente 708 pb y 182 pb en la infectología, 19(1), 14-24.
electroforesis. Los pozos 2, 3, 7 y 8 presentan
ETEC. Chávez, E., Martínez, L., Cedillo, M., Gil, C.,
Avelino, F. & Castañeda, E. (2007).
Los pozos 2 y 8 poseían los controles positivos Identificación de cepas de Escherichia
para las toxinas termolábil y termoestable, coli enterotoxigénicas en diferentes
respectivamente. Chávez, y colaboradores en el ambientes. Enfermedades Infecciosas y
2007 realizaron un estudio e indican que la Microbiología, 27(3), 70-74.
secuencia de 700 pb corresponde a la secuencia
génica de enterotoxina termolábil (lt), mientras
que la segunda toxina indica la secuencia Fonseca D., y Mateus H. (2010) Prácticas de
180pb , corresponde a la secuencia génica laboratorio de biología molecular.
termoestable (st). Esto indicó que la muestra 3 Colombia: Universidad de rosario.
contenía ETEC termolábil, y que la muestra 7
contenía ETEC termoestable.
Sin embargo, en las muestras de los carriles 4, 5 Ibarra, C. (2013). Fundamentos de la reacción en
y 6, no se observa ninguno de los genes para las cadena de la polimerasa (PCR) y de la
toxinas st y lt, ya que presentan menos de 100 PCR en tiempo real. Medigrafic, 2(2),
70-78.
pb, sin embargo hay presencia de ADN
bacteriano, que son muestras negativas, no
poseen el gen de las toxinas st y lt.
Pérez, G. (2001). Amplificación de ADN

CONCLUSIONES mediante PCR. Recuperado de:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-
biol-mol/pdf
Tornieporth, J, et. al, (1995) Differentiation of
pathogenic Escherichia coli strains in
Brazilian children by PCR Journal of
Clinical Microbiology, 33(5) 1371-1374
ANEXOS:
Anexo 1
Tabla 1.
Oligonucleótidos iniciadores utilizados en la PCR
y sus respectivos blancos y productos de
amplificación
Factores Inicia Secuencia (5´- 3´) Prod
de dor ucto
virulenci (pb)
a
(genes)
Toxina ST-1 CTGTATTGTCTTTT 182

termoes ST-2 TCACCT
table GCACCCGGTACAA
(st) GCAGGAT
Toxina LT-1 GCGACAAATTATA 707

termolá LT-2 CCGTGCT
bil (lt) CCGAATTCTGTTA
TATATGT
Fuente: Tornieporth et al., 1995

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(ETEC), MEDIANTE LA DETECCIÓN DE TOXINAS TERMOLÁBIL Y TERMOESTABLE.

Pérez, G. (2001). Amplificación de ADN

Toxina ST-1 CTGTATTGTCTTTT 182

Toxina LT-1 GCGACAAATTATA 707

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