UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS INFORME DE

Facultad de Ciencias básicas e ingenierías LABORATORIO

Departamento de Biología y Química BIOQUÍMICA

RECONOCIMIENTO DE LOS DISTINTOS FACTORES

INHIBIDORES DE LA ENZIMA PAPAÍNA

Cristian Camilo Villalba Rey, Laura Valentina Zuñiga Ochoa, Fany Yulieth Gordillo León
Programa de Biologia, Departamento de Biologia y Química,
Universidad de los Llanos
Vereda Barcelona, km 12 vía a Puerto López, Villavicencio 500017, Meta, Colombia.
1
[email protected], [email protected].
3
[email protected]

Resumen
Se realizaron diferentes pruebas con el fin de medir la actividad enzimática de la papaína
(proteolítica). Se realizó la preparación de solución enzimática que contenía 50g de papáina
verde y 100mL de agua. Para esto se realizaron pruebas de inhibición enzimática, en donde
se midió la actividad en presencia de metales pesados (mercurio), en solucion de cisteína que
actúa como activador enzimática de la papaína, EDTA y soluciones de pH ácidos y alcalinos,
estás se compararon con un blanco en presencia de leche y papaína. Se observó una
disminución importante de la actividad enzimática en la prueba de metales pesados y en pH
muy bajos. Concluyendo que este tipo de enzimas son altamente proteolíticas, y no son
específicas para ciertas proteínas, sin embargo pueden ser utilizadas en distintos tipos de
éstas, en donde se incluye la caseína.
Palabras clave: Coagulo, papaína, temperatura, pH, reactivos, Enzima, leche.

Abstract

Different tests were performed to measure the enzyme activity of papain (proteolytic). The
enzymatic solution containing 50g of green papain and 100mL of water was prepared. For this
purpose, enzymatic inhibition tests were performed, where the activity was measured in the
presence of heavy metals (mercury), in cysteine solution that acts as enzymatic activator of
papain, EDTA and acid and alkaline pH solutions, these were compared with a target in the
presence of milk and papain. An important decrease of enzymatic activity was observed in the
test of pe-sados metals and in very low pH. Concluding that this type of enzymes are highly
proteolytic, and are not specific for certain proteins, however they can be used in different
types of these, where casein is included.
Keywords: Coagulum, papain, temperature, pH, reagents.
 DILATACIÓN TERMICA
Claudia Patricia Negrete Varela, Ana María Petro Villalba

1. Introducción
La papaya tiene una composición nutritiva que La papaína (EC.3.4.22.2) Hidrolizan su sustrato
incluye proteínas, carbohidratos, vitaminas, en fragmentos peptídicos muy pequeños. Estas
calcio, potasio y fosforo considerándose una enzimas necesitan cisteína para activarse y
fruta con altas propiedades nutritivas, al igual realizar la hidrolisis. El pH óptimo es neutro, pH
que en su composición los frutos inmaduros 7,2, pero tolera variaciones entre 4 y 9,5. La
tienen tal vez el más alto contenido de una temperatura también oscila entre 5 ºC y 66 ºC.
enzima proteolítica conocida como enzima Esto se debe a que la conformación de una
papaína. proteína depende de las atracciones y
La papaína, se caracteriza por ser un polvo repulsiones entre los aminoácidos cargados
Amorfo, granuloso de color blanco, grisáceo o negativamente y los cargados positivamente.
Parduzco; ligeramente higroscópico e insoluble Además algunas cadenas laterales de
en agua y en la mayoría de solventes aminoácidos pueden actuar como ácidos o
orgánicos. Es soluble en alcohol etílico y bases débiles que desarrollan funciones críticas
metílico.La papaína bruta, contiene un poco de en el sitio activo del enzima.
agua, glúcidos, ácidos orgánicos y una mezcla
de enzimas, dónde destacan las denominadas Peptidasas cisteínicas (EC 3.4.22. Las
proteasas que actúan rompiendo los enlaces peptidasas cisteínicas presentan gran analogía
peptídicos en cualquier lugar de la cadena en el mecanismo catalítico con las serínicas; en
peptídica en la que se hallen situados ambos grupos la enzima y el sustrato forman un
(endopeptidasas), esta también contiene complejo covalente debido a que el nucleófilo
pequeñas cantidades de otros enzimas: papaya es parte de un aminoácido. El dador de
peptidasa A, lipasa y lisozima (enzima que protones en todas las peptidasas cisteínicas
rompe las paredes de las células bacterianas) identificadas es un residuo de histidina y el
(Chávez.(1998). nucleófilo es el grupo sulfidrilo de un residuo de
Teniendo en cuenta las caracteriscas de este cisteína (Obregón, w. d. (2008.).
tipo de enzima y su actividad que también viene Dado que el mecanismo catalítico de estas
regulada por el pH de la solución enzimática. enzimas utiliza a la cisteína como donador de
El pH óptimo o intervalo de pH de cada enzima protones, se pueden activar con tioles de bajo
es diferente y cuando varía, la conformación de peso molecular como tioglicolato, ditiotreitol, 2-
la enzima se altera, produciéndose un cambio mercaptoetanol o cisteína (Ibarlucea, I., &
en el estado de ionización de grupos del sitio López, G.(2008).
activo y llegando a no ser funcional. (Lehninger, 2. Sección experimental
a. (2006). Las proteasas poseen una extrema Para un buen uso de la práctica serán necesarios
especificidad. Pueden reconocer en la los siguientes materiales y reactivos: tubos para
macromolécula, uniones peptídicas particulares centrifugadora, tubos de ensayo, beaker, pipetas,
entre muchas del mismo tipo. pinzas, gradilla, espátula, gasa, embudo de
vidrio, licuadora y papel tornasol; reactivos:
cisteína, acetato de sodio, EDTA, HgCl 2,
Cisteína y Papaína.
2
 Actividad enzimática II – enzimas proteolíticas

hidróxido de amonio, HCl, H2O2, NaOH, papaya y 1%

leche. Se lavó muy bien los materiales, esto HgCl2 - 2 - - -
garantiza un buen procedimiento en la práctica. Repos
o 2
Procedimiento 1. Preparación de la solución min
enzimática Con ayuda de la licuadora, se tritura Agua 2 2 2 2 -
una parte de papaya verde 50g en donde se EDTA - - 2 - 2
agrega 100mL de agua destilada, se licua por Cisteín - - - 2 2
varios minutos hasta obtener una mezcla a
uniforme, esto es llevado a un beaker que tiene
como base de filtrador un pedazo de gasa. Procedimiento 4. Efecto del pH sobre la
Después de unos minutos de remueve la gasa y actividad enzimática.
se obtiene la solución enzimática.
En 4 tubos, se adiciona 10 gotas de solución con
Procedimiento 2. Ensayo estándar actividad respectivos reactivos presentes en la tabla 2,
enzimática. después se dejan reposar por 10 minutos y se
En un tubo de ensayo se adiciona 3 mL de leche adiciona 4 mL de leche a cada tubo de ensayo
y se añade 10 gotas de solución enzimática, seguidamente con ayuda de papel indicador se
seguidamente se llevan al baño María con una prosigue a determinar el pH, depositando el
temperatura de 50ᴼC hasta obtener la formación papel en los tubos y pocos minutos después se
de coágulo. retira.
Procedimiento 3. Efecto de compuestos Tabla 2. Mezclas para observar el efecto del pH
químicos sobre la actividad de la papaína REACTIV tubo 1 tubo 2 tubo 3 tubo 4
En 5 tubos de ensayo rotulados, se adicionan OS (gotas (gotas (gotas (gotas
diferentes reactivos (tabla 1) en donde a cada ) ) ) )
tubo se adicionan 10 gotas de solución Solución 10 10 10 10
enzimática de la papaína ,5 mL de leche y se enzimátic
agita lentamente después los tubos se llevan a a
baño maría con temperatura de 50ᴼC hasta NaOH 4 - - -
observar cambios significativos en las 0.25 M
reacciones. HCl 0.25 - - 4 -
M
Tabla 1. Efecto de compuestos químicos sobre la
actividad catalítica). NH4(OH) - - - 4
0.25M
REAC tubo tubo tubo tubo tubo
TIVO 1 2 3 4 5 3. Resultados y análisis
(gota (gota (got (gota (got
s) s) as) s) as) En las tablas 1 y 2 muestran la adición de los
Soluci 10 10 10 10 10 reactivos a la solución de la papaína y leche. Con
ón iguales cantidades de solución enzimática y en
enzim las tablas 3 y 4 se presentan los resultados de
ática los procedimientos respectivamente.
H2O2 2 - - - -
 DILATACIÓN TERMICA
Claudia Patricia Negrete Varela, Ana María Petro Villalba

Tabla 4. Efecto del pH sobre la actividad conocida como enzima papaína. El hecho de que
enzimática. En los tipos de papaya. las variaciones no fueran muy notorias a nivel
Actividad enzimática (Si/No) organoléptico pudo darse por el grado de
Tubo Papaya pH Papaya pH transparencia de la papaína obtenida de papaya
No. verde madura verde, cabe denotar que si había presencia de
1 No 12 Sí 12 coágulos en todos, en donde había variación del
2 Si 6 Sí 6 grado en el cuál se presentaban, esto debido a
3 No 1 No 2 que a cada tubo se le agregaron diferentes
4 Si 9 Sí 9 reactivos, en el caso del EDTA esté actuaria
cómo un formador de complejos con los iones
metálicos y estos a su vez no son capaces de
Tabla 3. Resultados actividad enzimática de la reaccionar con la solución, junto con la cisteína
papaína en el tubo cinco consiguiendo hidrolizar el
ACTIVIDAD ENZIMATICA sustrato, como resultado una mayor cantidad de
Tubo Papaya verde Papaya madura coágulos sin embargo en el tubo cuatro en donde
No. solo tenemos cisteína y agua los cambios
1 Sí Sí aunque son notorios, no son tan grandes cómo
en el tubo cinco.
2 Sí Sí
3 Sí Sí
Las variaciones en las condiciones de
4 Sí Sí
coagulación pueden afectar diferencialmente las
5 Sí Sí
dos etapas de la coagulación de la leche. Así,
La papaína posee una alta actividad proteolítica, Eck (1990) estableció que el fenómeno de la
teniendo en cuenta que las proteasas poseen coagulación es fuertemente dependiente de la
una extrema especificidad. Pueden reconocer en temperatura, con mayor velocidad a 40-42°C.
la macromolécula, uniones peptídicas Esta influencia de la temperatura es
particulares entre muchas del mismo tipo, para consecuencia de la conjunción de dos efectos,
este caso principalmente su interacción con la uno sobre la reacción enzimática y el otro sobre
caseína. la fase de coagulación.
La papaína hidroliza su sustrato en fragmentos
peptídicos muy pequeños y es esto lo que
apreciamos en cada una de las pruebas llevadas
a cabo, en donde además interactúan con otros
reactivos cómo la cisteína que es le necesaria
para activarse y realizar la hidrolisis, lo que a
nivel visual nos permite apreciar algunos
coágulos esto es debido a que la papaína actúa
como coagulante de la leche al ser una enzima
de origen vegetal (Romero, et 2004). Es
importante resaltar que aunque sean más
notorios los cambios en los tubos que contenían
papaya madura, los mayores contenidos de
papaína se presentan en la papaya verde, según
Chávez.(1998 )los frutos inmaduros tienen tal vez
el más alto contenido de una enzima proteolítica
4
 Actividad enzimática II – enzimas proteolíticas

coagulación en menor medida con respecto a los

otros esto dado por la presencia del cloruro de
mercurio (HgCl2) el cual vendría a ser un gran
inhibidor de enzimas en especial si estas poseen
grupos sulfhidrilos (SH) causando un cambio en
su estructura y función, la papaína es la enzima
presente en la solución enzimática,
adicionalmente, el HgCl2 es un metal pesado que
ha resultado como inhibidor especifico de la
catalasa (Pérez, 2015).

Figura 2. Formación de coagulo de enzima.

Figura 4. Soluciones para observa el efecto

sobre el pH.

Para la evaluación de la actividad enzimática

bajo condiciones de pH primero hay que tener
en cuenta que la papaína maneja unas escalas
de pH óptimo el cual es neutro, pH 7,2, sin
embargo tolera variaciones entre 4 y 9,5. La
Figura 3. Coagulación para la solución
temperatura también oscila entre 5 ºC y 66 ºC.
enzimática con distintos reactivos.
En los tubos donde el pH era muy bajo, en los
En el tubo uno se presenta una reacción cuales se utilizó ácido fuerte, la enzima se
enzimática por actividad del peróxido de desnaturaliza y no podemos ver ninguna
hidrogeno, no se afecta al punto de llevar a la reacción, algo similar ocurre cuando el pH es
desnaturalización, ya que la enzima tiene una muy básico, para muestras de papaína
amplia tolerancia a cambios de temperatura y obtenidas de papaya verde, las cuáles debían
esto se debe porque al calentarse la muestra
presentar mayor cantidad de la enzima que la
incrementa la energía cinética y el movimiento,
favoreciendo la velocidad de la reacción (Pérez, madura, las reacciones corresponden los
2015). Para el tubo dos se encuentra una grados de pH tolerados por la enzima.
 DILATACIÓN TERMICA
Claudia Patricia Negrete Varela, Ana María Petro Villalba

Referencias.
 Lassoudiere A, La papaína (producción,
propiedades y utilización), Frutas, Vol. #
21,
1969, Pág. 11 – 12
 Chávez, Enzimología, Editorial Goudelias,
1998.
 LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M.,
Principios de Bioquímica, 4º Edición, Ed.
Figura 4. Determinación de pH con papel Omega,
tornasol Barcelona, 2006, p. 212
 OBREGÓN, W. D. (2008.). Hidrolasas de
El pH del tubo 1 inhibe la actividad enzimática látex de especies del género araujia.
haciendo conspicua la coagulación debido al Purificación y caracterización de las
factor limitante en la que puede ser enzimas proteolíticas.
desnaturalizada la solución enzimática por la alta
 IBARLUCEA, I., & López, G. (9. de
basicidad del NaOH. El tubo 2 muestra que sin
Diciembre. de 2008.). The Industrial
presencia de reactivos inorgánicos presenta el
Enzimologist. Recuperado el 5. de
pH optimo y natural para llevar a cabo la
Octubre. de 2014., de
coagulación, por lo que valores cercanos a este
http://theindustrialenzymologist.blogspot.c
son estables, a comparación del tubo 3 la adición
om/2008/11/enzimas-del-cuajo-para-
del HCl que tiene un pH cercano a uno que
la-produccin-de.html
conlleva a las enzimas a un mínimo o nula
 Eck, A. (1990). El queso. 1ª edición.
actividad. Por último, el tubo 4 con el hidróxido
de amonio con un pH de 9 alcanza a tener una Ed. Omega.
apenas notable actividad enzimática con poca Barcelona, España.
coagulación.  Romero. T., Hernández-Gutiérrez, R.,
Mateos-Díaz, J., Sandoval-Fabián, G.,
4. Conclusiones Chel-Guerrero, L., Rodríguez-Buenfil, I., &
Gallegos-Tintoré, S. (2004). Proteolytic
La papaína es muy estable, además al
adicionársele reactivos que causan activity in enzymatic extracts from Carica
desnaturalización en otras enzimas estas siguen papaya L. cv. Maradol harvest by-
presentes. products. Process Biochem, 44(1), 77-82.
A mayor aumento de la temperatura la actividad  Pérez Espinosa, H. (2015). Catalasa para
enzimática es mayor, lo cual la temperatura el manejo del peróxido de hidrógeno en la
optima oscila entre 35 y 50ºC, pero un aumento
industria textil [recurso electrónico].
por encima de esta causa la desnaturalización de
la enzima.
El hidróxido de sodio al ser una base fuerte que
desnaturaliza la papaína de la papaya
Los catalizadores biológicos demuestran ser
eficientes debido a su alta especificidad.