ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO EN PLANTAS C4 Y CAM...

Análisis estructural del aparato

fotosintético en plantas C4 y CAM
mediante microscopía
de fluorescencia/confocal
JUAN DEDIOS ALCHÉ RAMÍREZ,
ADELA OLMEDILLA ARNAL
y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA*

Resumen quantification of the activity of the different components of

the photosynthetic apparatus.
Se ha realizado un estudio histológico de hojas de diversas
plantas C4 y CAM mediante microscopía de epifluorescencia The use of these Cell Biology tools, will allow the design of
y microscopía de barrido láser confocal. El análisis de la new experiments in order to improve the knowledge regard-
autofluorescencia emitida por los tejidos de la hoja constitu- ing the physiology of these plants, by analyzing the autoflu-
ye un método rápido, sencillo y no disruptivo para establecer orescence emitted by their photosynthetic apparatus under
la organización básica de los tejidos fotosintéticos y no several environmental conditions.
fotosintéticos. Dicho estudio ha permitido clasificar las plan-
tas analizadas en varias categorías estructurales, además de
sugerir un carácter mixto C4 / CAM para algunas de ellas.
Introducción y objetivos
Los resultados obtenidos indican que la microscopía confo-
cal, aparte de mejorar ostensiblemente la resolución respec-
to a la epifluorescencia estándar, probablemente permita La autofluorescencia de los tejidos vivos es un
desarrollar nuevas aplicaciones, como discriminar la distribu- fenómeno natural que se debe a la presencia de metabo-
ción específica de los fotosistemas I y II en plantas C4, o
litos endógenos y compuestos fluorescentes orgánicos e
cuantificar la actividad de los diferentes componentes del
aparato fotosintético. inorgánicos. En las células vegetales, la autofluorescen-
La utilización de estas herramientas de Biología Celular
cia se deriva principalmente de la presencia de clorofila
permitirá, gracias a su facilidad de uso, diseñar experimentos y lignina, y es especialmente evidente cuando se usan
destinados a ampliar el conocimiento de la fisiología de estas longitudes de onda de excitación en el rango del azul y
plantas, analizando la autofluorescencia específica emitida el ultravioleta.
por su aparato fotosintético en distintas condiciones am-
bientales. El uso de microscopía de epifluorescencia, y mi-
croscopía de barrido láser confocal puede contribuir a
Summary
la caracterización de la estructura general de los tejidos,
así como a la localización precisa de determinados
A histological study of leaves from several C4 and CAM
componentes celulares (Zobel y March, 1993). La
species has been carried out by using epifluorescence and
confocal laser scanning microscopy. The analysis of the clorofila en concreto presenta un pico de absorción a
autofluorescence emitted by leaf tissues, represents a rapid, 488 nm. La emisión de fluorescencia de los fotosiste-
easy and non-disruptive method to determine the basic mas I y II es sin embargo diferencial (Edwards et al.,
histological structure of both photosynthetic and non-pho-
tosynthetic tissues. The present study allowed us to classify
2001), estando dominada por fluorescencia por encima
the plants analyzed into several categories on the basis of de 700 nm en el caso del PSI, y por debajo de 700 nm
their structure, as well as to suggest a mixed C4 / CAM nature en el caso del PSII, aunque existen fenómenos de
for some of them.
reabsorción de ambas radiaciones emitidas. Un estudio
The results obtained here indicate that confocal microscopy, detallado de los diferentes espectros de emisión ha
in addition to significantly improving the resolution over
permitido en algunas plantas C4 obtener información
standard epifluorescence, may allow the development of
new applications such as the discrimination of the specific sobre la distribución individual de ambos fotosistemas
distribution of photosystems I and II in C4 plants, or the (Pfündel y Neubohn, 1999).
En este trabajo se pretende usar técnicas de micros-
* Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de plantas.
Estación Experimental del Zaidín. CSIC. Profesor Albareda 1. 18008-
copía de epifluorescencia y microscopía de barrido láser
Granada, España. confocal para:

115
JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ, ADELA OLMEDILLA ARNAL y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA

– implantar un método rápido, sencillo y no en las Figs. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. En cada una de
disruptivo que permita establecer la estructura dichas figuras se muestran los tejidos de la hoja tras
histológica básica de los tejidos fotosintéticos y irradiar consecutivamente con luz azul (a), azul/violeta
no fotosintéticos en plantas C4 y CAM. (b), roja (c) y ultravioleta (d).
– Obtener datos sobre la distribución específica La irradiación con luz azul (a) produce autofluo-
de ambos fotosistemas fundamentalmente en rescencia verdosa en las paredes celulares, observándo-
plantas C4 que permitan su inclusión en los se el tejido fotosintético como fluorescencia rojiza.
diversos subtipos funcionales. Una imagen similar se produce cuando se irradia con
luz azul/violeta (b), aunque la autofluorescencia de las
paredes celulares aparece en este caso reducida con
Materiales y métodos
respecto a la luz azul. La irradiación con luz roja no
Para realizar el estudio, se obtuvieron secciones produce una discriminación precisa de las estructuras
transversales (aprox. 0,5 mm) de hojas de las siguientes tisulares (c), mientras que la fluorescencia azul de las
especies de plantas C4: Cyperus rotundus (Cyperaceae), paredes celulares tras irradiar con luz ultravioleta (d)
Cynodon dactylum (Poaceae), Atriplex halimus (Cheno- muestra la distribución general de los tejidos, entre
podiaceae), Amaranthus blitoides (Amaranthaceae), Por- los que destacan fundamentalmente los tejidos con-
tulaca oleracea (Portulacaceae), Salsola opossitifolia y ductores. La utilización alternativa de dichas longitu-
Salsola vermiculata (Chenopodiaceae), así como de Se- des de onda permite de forma diferencial analizar la
dum sediforme (Crassulaceae) (planta con metabolismo estructura tisular de la hoja por una parte, y discrimi-
CAM). Dichas secciones fueron obtenidas a mano con nar donde se encuentran los tejidos fotosintéticos, es-
un escalpelo de acero. Las secciones se colocaron en pecialmente en aquellas combinaciones de filtros que
portaobjetos con una gota de agua, se cubrieron con un más se ajustan a los espectros de absorción de la clo-
cubreobjetos y se observaron con un microscopio de rofila (azul y azul/violeta).
epifluorescencia Nikon TE-2000U utilizando las si- La primera observación claramente apreciable es
guientes combinaciones de filtros: que la anatomía de las hojas C4 estudiadas, presenta
la denominada estructura «Kranz», que difiere funda-
– B-2A (EX 450-490 DM 505 BA 520) –azul–
mentalmente de la de estructura clásica y bien cono-
– BV-2A (EX 400-440 DM 455 BA 470) –azul/
cida (asimétrica dorsiventral) de las plantas C3. Los
violeta–
cloroplastos de las plantas C3 son de estructura ho-
– G-2A (EX 510-560 DM 575 BA 590) –rojo–
mogénea, mientras que pueden localizarse dos tipos
– UV-2A (EX 330-380 DM 400 BA 420) –ultra-
de cloroplastos en plantas C4: por una parte, las célu-
violeta–.
las del mesófilo contienen cloroplastos con la estruc-
Las imágenes fueron capturadas con una cámara tura clásicamente descrita mientras que las células de
Nikon Coolpix 4500 a una resolución de 2272x1704. la denominada vaina poseen cloroplastos sin grana, es
Se realizaron observaciones complementarias con decir, cloroplastos aparentemente «deficientes» en su
un microscopio de barrido láser confocal Nikon C1 funcionalidad. Esta peculiaridad no afecta al ciclo
utilizando un láser de argón (488 nm) y un módulo de Calvin, puesto que únicamente afecta a las reaccio-
diascópico DIC para luz transmitida. Los filtros utiliza- nes lumínicas de la fotosíntesis. En estas plantas, la
dos fueron los siguientes: (1DM 488/543/633; 2DM primera unión del dióxido de carbono (reacción de
530, 3DM 625, Em 515/30, 585/40 665LP). En todos Hatch-Slack) ocurre en las células del mesófilo, mien-
los casos se utilizó un «pinhole» de pequeño tamaño tras que la incorporación en carbohidratos (ciclo de
(30 µm) y un objetivo Plan Apochromat 60.0x/1.40/ Calvin) tiene lugar en las células de la vaina. Ambos
0.21. Las imágenes fueron procesadas con el software procesos de la fotosíntesis están separados espacial-
Nikon EZ-C1 viewer (2.10). mente en este tipo de plantas, y ambos tipos de teji-
dos, también denominados PCA: Photosynthetic Car-
Resultados y discusión bon Assimilation tissue —mesófilo— y PCR: Pho-
tosynthetic Carbon Reduction tissue —vaina—, son
Las imágenes de epifluorescencia de las secciones claramente distinguibles debido a su autofluorescencia
de hojas de las distintas especies estudiadas se muestran diferencial.

116
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO EN PLANTAS C4 Y CAM...

TABLA 1

Resumen de las características observadas en los tejidos

fotosintéticos de las especies analizadas

Especie Familia Tipo Subtipo morfológico. Características

Cyperus rotundus Cyperaceae C4 Estructura concéntrica monocapa de la vaina y el mesófilo,
típica Kranz. Autofluorescencia mesófilo > autofluorescen-
cia vaina
Cynodon dactilum Gramineae C4 Estructura concéntrica monocapa de la vaina y el mesófilo,
típica Kranz. Kranz autofluorescencia mesófilo < autofluo-
rescencia vaina
Atriplex halimus Chenopodiaceae C4 Kranz modificada: Estructura concéntrica monocapa de la
vaina. Mesófilo monocapa rellenando todo el espacio
central de la hoja. Autofluorescencia mesófilo < autofluo-
rescencia vaina
Amaranthus blitoides Amaranthaceae C4 Kranz modificada: Estructura concéntrica monocapa de la
vaina y mesófilo multicapa con células Kranz y no-Kranz.
autofluorescencia mesófilo < autofluorescencia vaina
Salsola opossitifolia Chenopodiaceae C4 Kranz tipo Salsoloide con un mesófilo en empalizada,
vaina monocapa y tejido almacenador de agua con cloro-
plastos. Autofluorescencia mesófilo < autofluorescencia
vaina
Salsola vermiculata Chenopodiaceae C4 Kranz tipo Salsoloide con un mesófilo en empalizada,
vaina monocapa y tejido almacenador de agua con cloro-
plastos. autofluorescencia mesófilo < autofluorescencia
vaina
Portulaca oleraceae Portulacaceae C4/CAM Kranz atípica (hojas con constitución crasa y presencia de
células mucilaginosas). Vaina concéntrica monocapa.
Mesófilo radial monocapa. Autofluorescencia mesófilo <
autofluorescencia vaina
Sedum sediforme Crassulaceae CAM Estructura CAM: mesófilo con grandes células altamente
vacuoladas e indiferenciadas. Cloroplastos periféricos en
dichas células

En general, las plantas C4 poseen la estructura Cyperus rotundus (Cyperaceae)

«Kranz», claramente discernible en cuanto que el mesó-
filo y la vaina se localizan formando anillos concéntri- En el caso de Cyperus rotundus (Figs. 1 y 2), se
cos alrededor de los haces vasculares. Sin embargo en aprecia claramente la estructura Kranz, integrada por
muchos casos, esta estructura típica no es tan claramen- anillos concéntricos formados por monocapas de célu-
te identificable, o presenta ligeras modificaciones como las del mesófilo y de la vaina respectivamente, alrede-
se describe en algunas de las especies analizadas en este dor de los haces vasculares, que contienen esclerén-
trabajo y se resume en la Tabla 1. quima. No se aprecia lamela suberizada en las células
La observación de las estructuras fotosintéticas me- de la vaina. Se observan claramente ambas epidermis,
diante microscopía confocal permite obtener detalles es- formadas por células de gran tamaño en el haz y células
tructurales de mayor resolución que las técnicas de epi- de pequeño tamaño en el envés.
fluorescencia estándar (Figs. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16). Mediante microscopía confocal se puede apreciar
La realización de secciones ópticas permite además la el aspecto diferencial de ambos tipos de células, tanto
realización de otra serie de técnicas que incluyen la cuan- en su forma (redondeada los de la vaina, más elongadas
tificación de la señal obtenida, y la reconstrucción 3D de las del mesófilo) como en la intensidad de su autofluo-
los tejidos, como se muestra en algunos de los materiales rescencia (relativamente superior en células del mesófi-
adicionales incluidos en el CD (adjunto a este libro). lo que en las de la vaina).

117
JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ, ADELA OLMEDILLA ARNAL y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA

2
FIGURAS 1 y 2. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de Cyperus rotundus observada mediante
microscopía de epifluorescencia con irradiación azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 1a, b, c y d
respectivamente) y microscopía confocal con y sin luz transmitida (Fig. 2a y b, respectivamente). PCR:
Photosynthetic Carbon Reduction tissue. PCA: Photosynthetic Carbon Assimilation tissue. HV: haces vasculares.

118
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO EN PLANTAS C4 Y CAM...

Cynodon dactilon (Poaceae) son y Dallwitz, 1992 y posteriores). Se aprecia mesófilo

con clorénquima radiado, atravesado por columnas de
La mencionada estructura Kranz está igualmente células del mesófilo, que constituyen una única capa.
bien representada en Cynodon dactylum (Figs. 3 y 4) Todos los haces vasculares (HV) van acompañados de
donde se puede apreciar que la capa única de tejido fo- esclerénquima. Las imágenes de microscopía confocal
tosintético reductor de carbono (PCR: Photosynthetic muestran ambos tejidos compuestos por células clara-
Carbon Reduction tissue) alrededor de los haces vascu- mente diferenciadas. En este caso las células de la vaina,
lares primarios se interrumpe abaxialmente. Las células de aspecto redondeado, son mayores en tamaño y po-
del PCR carecen de lamela suberizada. Algunos autores seen mayores niveles de autofluorescencia que las del
describen esta especie como C4 de tipo centrípeto (Wat- mesófilo. Epidermis del envés con micropelos.

4
FIGURAS 3 y 4. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de
Cynodon dactilum observada mediante microscopía de epifluorescencia con
irradiación azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 3a, b, c y d respectivamen-
te) y microscopía confocal con (Fig. 4b y c) y sin luz transmitida (Fig. 4c). PCR:
Photosynthetic Carbon Reduction tissue. PCA: Photosynthetic Carbon Assimila-
tion tissue. HV: haces vasculares.

119
JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ, ADELA OLMEDILLA ARNAL y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA

Atriplex halimus (Chenopodiaceae) vaina está compuesta por una capa de células de gran
densidad y altamente autofluorescentes que rodean a los
La familia Chenopodiaceae es especialmente intere- tejidos conductores, con la excepción de la zona abaxial.
sante en relación a la amplia variedad que presentan las El mesófilo se muestra como una única capa alrededor
estructuras responsables de la asimilación del carbono de la vaina y de los haces vasculares, pero que completa
en sus diferentes especies. Dicha familia incluye desde todo el espacio central de la hoja. Sus células son estruc-
especies estrictamente C3 o C4, a intermedias C3/C4 y turalmente muy diferentes a las de la vaina, mucho más
C4/CAM (Voznesenseskaya et al., 1999). En el caso de elongadas, y con mucha menos autofluorescencia. La
Atriplex halimus, la estructura Kranz típica descrita en estructura anatómica de Atriplex ya ha sido ampliamen-
las especies anteriores presenta una ligera modificación te descrita por diversos autores, y recientemente revisada
(Figs. 5 y 6): el tejido fotosintético se engloba como un por Jacobs (2001) mediante otras técnicas de examen.
compartimiento central, rodeado de ambas epidermis Los datos aportados por dicho autor son plenamente
integradas por células de gran tamaño. En este caso, la consistentes con nuestras observaciones.

6
FIGURAS 5 y 6. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de
Atriplex halimus observada mediante microscopía de epifluorescencia con
irradiación azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 5a, b, c y d respectiva-
mente) y microscopía confocal con luz transmitida (Fig. 6). PCR: Photosyn-
thetic Carbon Reduction tissue. PCA: Photosynthetic Carbon Assimilation
tissue. HV: haces vasculares.

120
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO EN PLANTAS C4 Y CAM...

Amaranthus blitoides (Amaranthaceae) en contacto directo con la vaina, aunque algunas

(denominadas células no-Kranz en el mencionado tra-
La estructura anatómica del aparato fotosintético bajo) no están en contacto con la vaina. Dichas células
de diversas especies de Amaranthus ha sido descrita en son especialmente prominentes en áreas en las que
detalle mediante microscopía óptica (Fisher y Evert, forman una red de células fundamentalmente orienta-
1982) y electrónica (Hong et al., 2005). La estructura das en horizontal, justo debajo de la epidermis. La
que mostramos en el presente trabajo, correspondiente autofluorescencia de las células de la vaina, y el tamaño
a Amaranthus blitoides, se ajusta bastante a dicha de estas células, es superior en todo caso al de las células
descripción (Figs. 7 y 8): las células de la vaina integran del mesófilo (tanto en células Kranz como no-Kranz).
una única capa de forma concéntrica alrededor de los Estos dos tipos de células del mesófilo son indistingui-
haces vasculares. La mayoría de las células del mesófilo bles en cuanto a características morfológicas y nivel de
(denominadas células Kranz por dichos autores), están autofluorescencia entre sí.

8
FIGURAS 7 y 8. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de
Amaranthus blitoides observada mediante microscopía de epifluorescencia
con irradiación azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 7a, b, c y d
respectivamente) y microscopía confocal con luz transmitida (Fig. 8). PCR:
Photosynthetic Carbon Reduction tissue PCA(K): Photosynthetic Carbon
Assimilation tissue con células tipo Kranz. PCA(N-K): Photosynthetic Carbon
Assimilation tissue con células tipo no-Kranz. HV: haces vasculares.

121
JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ, ADELA OLMEDILLA ARNAL y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA

Salsola opossitifolia y Salsola vermiculata subepidermales. Se observa un haz vascular mayor,

(Chenopodiaceae) inmerso en el centro del tejido que almacena agua y que
forma la región central de la hoja. En dicho tejido se
Ambas especies presentan en sus hojas la denomi- observan igualmente numerosos cloroplastos. También
nada anatomía Krankz de tipo Salsoloide, definida por se observan haces conductores menores justo bajo la
Carolin et al. (1975). Esta estructura se caracteriza por vaina. La autofluorescencia mostrada por la vaina es
la presencia de dos capas clorenquimatosas (un mesófi- netamente superior a la mostrada por el mesófilo en
lo en empalizada y una capa correspondiente a la vaina) empalizada en el caso de S. vermiculata, con sólo ligera
de forma continua alrededor de la periferia de la hoja diferencia en intensidad entre ambas capas en el caso de
(Figs. 9-12). Hay una capa de células redondeadas S. oppositifolia. En ambos casos la morfología de las

10
FIGURAS 9 y 10. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de Salsola
opossitifolia observada mediante microscopía de epifluorescencia con irradia-
ción azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 9a, b, c y d respectivamente) y
microscopía confocal con (Fig. 10a, c) y sin luz transmitida (Fig. 10b). PCR:
Photosynthetic Carbon Reduction tissue PCA: Photosynthetic Carbon Assimila-
tion tissue. HV: haces vasculares. Las flechas azules muestran la localización de
cloroplastos presentes en el tejido almacenador de agua.

122
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO EN PLANTAS C4 Y CAM...

células integrantes de ambas capas es bastante diferente. casi nulo hasta ser incluso superior en densidad a las
Estructuras de este tipo han sido descritas en detalle en células del mesófilo o de la vaina. Voznesenskaya et al.
varias especies de la tribu Salsoleae por Voznesenskaya et (1999) revisan y discuten sobre la base de sus observa-
al. (1999). Las especies de esta tribu poseen, como ya ciones la posibilidad de que dicho tejido contribuya a la
ha sido descrito, un tejido que almacena agua y que asimilación del carbono y sobre el origen del CO2
ocupa el centro de las estructuras asimiladoras. La utilizado por este tejido. También se discute en dicho
extensión de este tejido varía entre aproximadamente trabajo la posibilidad sugerida por algunos autores de la
un 25 a un 45% del volumen total de la hoja. existencia de un cierto grado de metabolismo tipo
Dependiendo de la especie, el número de cloroplastos CAM (Crassulacean Acid Metabolism) en las células de
presentes en las células de este tejido puede ser desde este tejido de almacén de agua.

11

12
FIGURAS 11 y 12. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de Salsola
vermiculata observada mediante microscopía de epifluorescencia con irradia-
ción azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 11a, b, c y d respectivamente) y
microscopía confocal con (Fig. 12a, c) y sin luz transmitida (Fig. 12b). PCR:
Photosynthetic Carbon Reduction tissue PCA: Photosynthetic Carbon Assimila-
tion tissue. HV: haces vasculares. Las flechas azules muestran la localización de
cloroplastos presentes en el tejido almacenador de agua.

123
JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ, ADELA OLMEDILLA ARNAL y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA

Portulaca oleracea (Portulacaceae) como la presencia de células mucilaginosas o células

de almacén de agua en el mesófilo. La vaina está
En el caso de Portulaca oleracea (Fig. 13 y 14) se integrada por una capa única de células alrededor de
puede observar estructura C4 (Kranz) ligeramente atí- los haces vasculares. Las células del mesófilo tam-
pica, ya que las hojas tienen una constitución crasa. bién tienen disposición radial alrededor de la vai-
No se diferencian claramente haces vasculares prima- na, aparentemente en una única capa de células, aun-
rios y menores. Dichos haces carecen de células de que existe discontinuidad entre vaina y mesófilo debi-
transferencia del floema. Watson y Dallwitz (1992) y do a la presencia de una estructura intermedia. Tam-
Guralnick y Jackson (2001) describen una fisiología bién aparecen algunos cloroplastos periféricos en las
intermedia entre C4 y CAM para esta especie, así células de almacén de agua.

13

14
FIGURAS 13 y 14. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de
Portulaca oleracea observada mediante microscopía de epifluorescencia con
irradiación azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 13a, b, c y d respectiva-
mente) y microscopía confocal (Fig. 14a) y microscopía confocal y luz
transmitida (Fig. 14b). PCR: Photosynthetic Carbon Reduction tissue PCA:
Photosynthetic Carbon Assimilation tissue. HV: haces vasculares. Las flechas
azules muestran la localización de cloroplastos presentes en células mucilagi-
nosas/tejido almacenador de agua.

124
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO EN PLANTAS C4 Y CAM...

Sedum sediforme (Crassulaceae) objeto de inhibir esta pérdida durante la insolación

intensa (la transpiración vía cutícula permanece intac-
Esta especie corresponde a una planta de tipo ta) estas plantas han desarrollado un mecanismo que
suculento con metabolismo de tipo CAM, denomina- permite la captación de CO2 durante la noche. El
do de esa forma por ser frecuente entre las especies de dióxido de carbono prefijado es almacenado en vacuo-
esta familia. Las reacciones químicas de acumulación las como malato (e isocitrato), y es usado durante el día
del CO2 son similares a las de las plantas C4, aunque en para la fotosíntesis.
este caso la fijación del CO2 y su asimilación no están La anatomía de estas plantas está por tanto alta-
separadas espacialmente, sino en el tiempo. Las plantas mente especializada para esta función y ha sido descrita
CAM se dan esencialmente en regions áridas. La en detalle en diversas especies (Nelson et al., 2005). En
apertura de los estomas para la captación del CO2 está el caso de Sedum sediforme (Figs. 15 y 16), las gruesas
siempre conectada con grandes pérdidas de agua. Con hojas constan de una epidermis con estomas, y un

15

16
FIGURAS 15 y 16. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de
Sedum sediforme observada mediante microscopía de epifluorescencia con
irradiación azul, azul/violeta, roja y ultravioleta (Fig. 15a, b, c y d respectiva-
mente) y microscopía confocal con y sin luz transmitida (Figs. 16 a y b
respectivamente). Las flechas azules muestran la localización de cloroplastos
presentes en células indiferenciadas del mesófilo. HV: haces vasculares.

125
JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ, ADELA OLMEDILLA ARNAL y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA

mesófilo homogéneo con numerosos células CAM que se encuentra la planta como la humedad atmosfé-
densamente empaquetadas. No aparecen, como ocurre rica, temperatura, insolación etc. Los métodos mostra-
en las plantas C3 y C4 varios tipos celulares claramente dos aquí, por su simplicidad, permiten un estudio
diferenciados, sino que las células del mesófilo son detallado en numerosos órganos y a diferentes tiempos,
bastante indiferenciadas entre sí. Contienen una gran prácticamente sin preparación previa de las muestras,
área vacuolada, que aporta a la planta una elevada lo que facilita enormemente el estudio de dichos
capacidad de acumulación de ácidos C4 y de agua. Los cambios.
cloroplastos son claramente visibles en la periferia de Una ventaja adicional de este tipo de técnicas es su
estas células, gracias a su autofluorescencia tras excitar posible utilización conjunta con otra serie de técnicas,
con diversas longitudes de onda. Se aprecian haces por ejemplo con la inmunolocalización de enzimas
vasculares secundarios a lo largo de toda la estructura relacionadas con la fijación y asimilación del carbono,
del mesófilo. mediante técnicas igualmente de fluorescencia.
Las descripciones anteriores, realizadas sobre la Durante los pasados 150 años han ido desarro-
base de la emisión de autofluorescencia tras utilizar llándose numerosos métodos de tinción para especi-
diversas longitudes de onda de excitación, en microsco- menes vegetales, que incluyen el uso de colorantes
pía de epifluorescencia, y tras excitar con un láser 488 tan comunes como la safranina, hematoxilina, Fast
en microscopía confocal, son comparables en resolu- Green, Orange G, Alcian Blue… Numerosos textos
ción, y en muchos casos ofrecen más detalles estructu- documentan las posibles utilizaciones de estos colo-
rales que otras técnicas de observación utilizadas fre- rantes y detallan sus protocolos de utilización. Mu-
cuentemente en la literatura con el mismo objetivo. chos de estos colorantes son además altamente fluo-
Algunas de las técnicas mayoritariamente utilizadas rescentes, de forma que muchas tinciones clásicas
para discriminar entre los tejidos fotosintéticos y la como la safranina, el anaranjado de acridina, rodami-
estructura general de la hoja, incluyen: i) uso de na etc., además de algunos fluorocromos específicos
tinciones específicas de almidón con sales de yodo como el sirofluor (específico para teñir calosa), o el
(Osmond, 1974), ii) microscopía óptica de luz trans- calcofluor (tiñe específicamente paredes celulares),
mitida tras fijar las hojas con etanol, teñir con safranina producen una fluorescencia intensa que puede ser
y montar (Fisher y Evert, 1982), iii) inmunolocaliza- utilizada también con fines discriminatorios y analíti-
ción a microscopía óptica y electrónica de enzimas cos del tejido fotosintético.
específicos de la fotosíntesis como RUBISCO, RuBP- El uso de señales fluorescentes, y la elevada versati-
CO, PEPC, NAD-ME y NADP-ME (ej. Castrillo et lidad de las técnicas de análisis de imágenes asociadas a
al., 1997; Voznesenskaya et al., 1999; Hong et al., microscopía de fluorescencia, que se multiplica en el
2005), iiii) fijación, inclusión de las hojas y observación caso de la microscopía confocal permite además prever
de secciones finas y ultrafinas a microscopía óptica y muchas otras aplicaciones entre las que citamos sola-
electrónica (Gutierrez et al., 1974; Crookston y Ozbun, mente algunas:
1975; Lawton, 1988). – La señal autofluorescente es fácilmente cuanti-
Son muy limitadas las referencias que hemos ficable utilizando el software adecuado, y per-
conseguido encontrar en la literatura sobre el uso de la mite la discriminación anatómica sobre la base
autofluorescencia y la microscopía confocal para la de dicha cuantificación. Como ejemplo, la
descripción morfológica de los tejidos fotosintéticos en Figura. 17 muestra el análisis de la emisión
plantas C4 y CAM (ej. Pfündel y Neubohn, 1999; total de fluorescencia determinando un cambio
Nelson et al., 2005). Sin embargo, el potencial de este de color a unos determinados niveles de satura-
tipo de técnicas es muy elevado, y a ello se una la ción. Este método permite fácilmente compa-
facilidad de preparación de las muestras, condiciones rar los niveles de emisión de la vaina y el
ambas que permiten el diseño de muy diversos experi- mesófilo.
mentos. – Pfündel y Neubohn (1999) utilizaron micros-
Como ejemplos cabe citar que muchas plantas copía confocal para discriminar la localización
tienen fisiología intermedia C3-C4 o C4-CAM, despla- de los fotosistemas I y II en plantas. Aunque en
zada temporalmente, desplazada en diferentes órganos, el presente trabajo no es posible discriminar la
o dependiendo de las condiciones ambientales en las emisión de fluorescencia de los fotosistemas I

126
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DEL APARATO FOTOSINTÉTICO EN PLANTAS C4 Y CAM...

FIGURA 17. Autofluorescencia en secciones transversales de hojas de Cynodon

dactylon (a), Portulaca oleracea (b) y Cyperus rotundus (c) observada mediante
microscopía confocal. En amarillo se muestran las regiones con saturación del
nivel de fluorescencia emitida. PCR: Photosynthetic Carbon Reduction tissue
PCA: Photosynthetic Carbon Assimilation tissue.

y II debido a que se carece de un sistema de canales, permitiendo una mejor discriminación

microscopía espectral y los filtros barrera utili- de la información. Dichos sistemas realizan
zados no discriminan entre fluorescencia por además secciones ópticas de forma que pueden
encima y por debajo de 700 nm, el método obtenerse imágenes perfectamente claras y níti-
descrito puede tener un elevado interés para das del interior de preparaciones de hojas com-
correlacionar la localización de ambos fotosiste- pletas o de secciones gruesas de dichas hojas,
mas y el subtipo de planta C4 (NADP-ME, como se muestra en el presente trabajo. Dichas
NAD-ME, PEP carboxiquinasa), el carácter secciones pueden ser realizadas secuencialmente
intermedio C4/CAM o ciertas características a lo largo del eje z, con la utilización de
inusuales, como la fotosíntesis C4 en ausencia de unidades motorizadas, y utilizarse posterior-
estructura anatómica de tipo Kranz (Voznesens- mente para realizar reconstrucciones tridimen-
kaya et al., 2002). sionales del tejido. Algunas de estas reconstruc-
– El control digital de la microscopía confocal ciones se aportan en el presente volumen como
permite una clara separación de las diferentes material adicional en formato video (ver CD
señales de emisión fluorescente en distintos adjunto).

127
JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ, ADELA OLMEDILLA ARNAL y MARÍA ISABEL RODRÍGUEZ GARCÍA

Es por tanto amplísimo el potencial de podemos Amaranthus retroflexus (Amaranthaceae): Morphology y

Anatomy». American Journal of Botany 69, 1133-1147.
prever para estas técnicas en cuanto al análisis de la GURALNICK, L.J. y JACKSON, M.D., 2001. «The Occurrence y
fisiología de la fotosíntesis. Estamos seguros que en los Phylogenetics of Crassulacean Acid Metabolism in the Portu-
años futuros, con su desarrollo progresivo, constituirán lacaceae». International Journal of Plant Sciences 162, 257-
herramientas imprescindibles para dicho estudio. 262.
GUTIÉRREZ, M.; GRACEN, V.E. y ADWAREDS, G.E., 1974.
«Biochemical y cytological relationships in C4 Plants». Planta
119, 279-300.
Agradecimientos HONG, J.; JIANG, D.A.; WENG, X.Y.; WANG, W.B. y HU, D.W.,
2005. «Leaf anatomy, chloroplast ultrastructure, y cellular
localisation of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxyge-
Agradecemos a Julio López Gorgé allá donde se nase (RuBPCO) y RuBPCO activase in Amaranthus tricolor
encuentre, el habernos introducido en este maravilloso L.». Photosynthetica 43, 519-528.
JACOBS, S.W.L., 2001. «Leaf anatomy y ultrastructure in the
mundo de las relaciones fisiológicas y adaptativas de
Chenopodiaceae (Caryophyllales)». J. Torrey Bot. Soc. 128,
estas plantas con su entorno, así como su dirección, 236-253.
ánimo e interés durante el tiempo en que nos condujo a LAWTON, J.R., 1988. «Ultrastructure of Chloroplast membranes
lo largo del proyecto de la Fundación Ramón Areces in leaves of maize y ryegrass as revealed by selective staining
methods». New phytol. 108, 277-283.
que respalda esta obra homenaje. Sabemos que este NELSON, E.A.; SAGE, T.L. y SAGE, R.F., 2005. «Functional leaf
trabajo habría sido especialmente de su interés, y en él anatomy of plants with crassulacean acid metabolism». Func-
hemos puesto igualmente el nuestro. tional Plant Biology 32, 409-419.
OSMOND, C.B., 1974. «Leaf anatomy of Australian saltbushes
Finalmente, gracias a la Fundación Ramón Areces
in relation to photosynthetic pathways». Australian Journal of
por la financiación de este estudio, y especialmente a Botany 22, 39-44.
Ana Belén Robles Cruz por el material botánico del PFÜNDEL, E. y NEUBOHN, B. 1999. «Assessing photosystem I y
mismo. II distribution in leaves from C4 plants using confocal laser
scanning microscopy». Plant, Cell y Environment 22, 1569-
1577.
VOZNESENSKAYA, E.V.; FRANCESCHI, V.R.; KIIRATS, O.; ARTYUS-
Referencias bibliográficas HEVA, E.G.; FREITAG, H. y EDWARDS, G.E., 2002. «Proof of
C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Bienertia cy-
cloptera (Chenopodiaceae)». The Plant Journal 31, 649-662.
CAROLIN, R.C.; JACOBS, S.W.L. y VESK, M., 1975. «Leaf VOZNESENSKAYA, E.V.; FRANCESCHI, V.R.; PYANKOV, V.I. y
structure in Chenopodiaceae». Botanische Jahrbücher fur Syste- EDWARDS, G.E., 1999. «Anatomy, chloroplast structure y
matishe Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie 95, 226- compartmentation of enzymes relative to photosynthetic
255. mechanisms in leaves y cotyledons of species in the tribe
CASTRILLO, M.; ASO, P.; LONGART, M. y VERMEHREN, A., 1997. Salsoleae (Chenopodiaceae)». Journal of Experimental Botany
«In situ immunofluorescent localization of ribulose-1,5-bi- 50, 1779-1795.
phosphate carboxylase/oxygenase in mesophyll of C4 dico- WATSON, L., y DALLWITZ, M.J., 1992 onwards. «The grass
tyledonous plants». Photosynthetica 33, 39-50. genera of the world: descriptions, illustrations, identification,
CROOKSTON, R.K. y OZBUN, L., 1975. «The occurrence y y information retrieval; including synonyms, morphology,
ultrastructure of Chloroplasts in the phloem parenchyma of anatomy, physiology, phytochemistry, cytology, classification,
leaves of C4 dycotiledons». Planta 123, 247-255. pathogens, world y local distribution, y references». Version:
EDWARDS, G.E.; FURBANK, R.T.; HATCH, M.D. y C. OSMOND, 6th October 2005. http://delta-intkey.com’.
B., 2001. «What Does It Take to Be C4? Lessons from the ZOBEL, A.M. y MARCH, R.E., 1993. «Autofluorescence reveals
Evolution of C4 Photosynthesis». Plant Physiology 125, 46- different histological localizations of furanocoumarins in
49. fruits of some umbelliferae y leguminosae». Annals of Botany
FISHER, D.G., y EVERT, R.F., 1982. «Studies on the Leaf of 71, 251-255.

128