Guía de trabajos prácticos 1.

Técnicas y conceptos para el

Objetivo. Familiarizarse con técnicas de Laboratorio, herramientas y cálculos comúnmente realizados

Actividades.
1. Manejo de micropipetas. Las micropipetas son herramientas
fundamentales en los laboratorios de Bioquímica, permiten
manipular eficientemente volúmenes pequeños y su uso correcto
evita contaminar reactivos o soluciones. Sin embargo, es un
equipamiento caro (cada una de ellas puede llegar a costar 80.000
pesos) por lo que debemos cuidar su correcta operación. Durante
la primera parte del laboratorio se aprenderá el manejo correcto de
estas herramientas. Figura 1. Micropipeta.

-No trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores a
los indicados, esto descalibrará y dañará la micropipeta.
-Toda micropipeta utiliza puntas desechables (no utilice la pipeta sin usar la punta apropiada, hacer esto
contaminará la micropipeta y la puede dañar).
-No utilizar la micropipeta con líquidos que atacan el polipropileno.
-No utilizar líquidos que estén emitiendo vapores.
-La temperatura de los líquidos debe estar entre 15 y 40 º C.
-Al poner la punta, asegúrese que sea del tipo correcto y que esté correctamente
ajustada.
Pueden ahondar en su funcionamiento y cuidado en la WEB (por ejemplo en youtube:
http://www.youtube.com/watch?v=FkamMDRVoz8).

2. Concentraciones y volúmenes. Es muy importante recordar que unas de las propiedades intensivas más
importantes que caracterizan una solución es la concentración del soluto. Por lo tanto, todos los resultados
de los laboratorios deben ser expresados e informados en términos de la concentración del soluto de
interés. Ejercicio: suponga que debe realizar 10 soluciones acuosas de dicromato de potasio que abarquen
un rango entre 0 y 3.5 mM del reactivo. Además, cada solución debe tener una concentración de 0.001 M
de HCl04. Prepare una tabla con los volúmenes requeridos para cada solución a partir de soluciones
madres o stock de: 6.8 mM de dicromato de potasio y 0.07 M de HCl04. Considere que las 10 diluciones
deben tener un volumen de 1 ml. Utilice la ecuación Vi x Ci = Vf x Cf para realizar los cálculos. Exprese
la tabla en términos de microlitros (µl) y también en términos de mililitros (ml). Durante el trabajo
práctico Ud. deberá poner en práctica este ejercicio mediante el uso de las micropipetas.

3. Principios y técnicas de espectrofotometría. Una de las formas que la luz puede interaccionar con la
materia es mediante la absorción de fotones. La absorción de fotones ocurre cuando los electrones de
una molécula son excitados a un nivel de energía correspondiente a la energía del fotón incidente o lo que
es lo mismo su longitud de onda. Este fenómeno lo observamos día a día en muchos objetos que vemos y
en algunos casos explica sus diversos colores, por ejemplo el verde de las plantas.

Figura 2. Izquierda: Comparación del espectro de absorbancia de una solución de clorofila b y una solución de clorofila a. Derecha.
Comparación del espectro de absorbancia de una solución de NADH y NAD.

Figura 3. Diagrama de un espectrofotómetro. La fuente de luz suministra un conjunto de longitudes de onda; el selector de longitud
de onda ubicado a continuación (monocromador) permite elegir, desde este conjunto, la longitud de onda de interés, la que es
dirigida-hacia el compartimiento donde se encuentra la muestra. La luz transmitida a través de la muestra es recibida por un detector
que la convierte en una señal eléctrica la que es observada en un sistema de registro.

La cantidad de luz absorbida se conoce como "absorbancia" y siempre es una medida referencial
(ver Anexo). La variación de la absorbancia en función de la longitud de onda de la luz incidente se
conoce como espectro de absorbancia y se origina a partir de múltiples transiciones electrónicas que una
molécula, o un conjunto de ellas, es capaz de sufrir en función de a la energía de los fotones incidentes.
El espectrofotómetro (Figura 3) es un instrumento fundamental del laboratorio porque permite
determinar la cantidad de luz absorbida por moléculas en solución a varias longitudes de onda y así
identificar o caracterizar los solutos presentes en solución. Por ejemplo, los espectros de absorbancia
pueden llegar a ser extremadamente sensibles a los cambios electrónicos que sufre una molécula. A la
derecha de la figura 2 se comparan los espectros tomados para la forma reducida (NADH) u oxidada
(NAD+) del cofactor. Pregunta: ¿Qué longitud de onda utilizaría para determinar si hay o no NADH
presente en una solución?. ¿A qué se debe el cambio de espectro del nucleótido?.
Otro ejemplo: a la izquierda se compara un espectro de absorbancia de una solución clorofila a con una
solución de clorofila b. Pregunta: a partir de esta figura indique ¿cuál es la razón de que las plantas se
vean verdes?.
Otra aplicación derivada de la capacidad de absorber luz por parte de la materia es determinar la
concentración de un soluto en solución. La absorbancia de una solución es la resultante de la luz
absorbida por el soluto más la absorbida por el solvente. Para poder medir sólo la absorbancia del
compuesto cuya concentración se desea conocer, es necesario descartar la absorbancia de las otras
sustancias presentes en la solución (solvente, reactivos, etc.); por lo tanto, en todo método
espectrofotométrico es imprescindible hacer una mezcla que contenga todos los componentes de la
solución excepto aquel cuya concentración desea medirse; ésta se denomina blanco de la reacción, y su
absorbancia debe restarse a las muestras problema y a los patrones.
La relación entre la absorbancia de una solución y la concentración del soluto que absorbe
queda descrita por la Ley de Lambert-Beer, que establece una proporcionalidad directa entre ambas
variables (ecuación 1, ver anexo para su derivación).

Ley de Lambert Beer, predice que la absorbancia de una solución (A) es directamente
proporcional al camino recorrido por la luz a través de la muestra (l, ver figura 3) y a la concentración
del soluto en la solución (c), y que además depende de una constante que es característica para cada
sustancia a una longitud de onda determinada (ɛ). Esta constante se conoce como coeficiente de
extinción y depende de las propiedades químicas del soluto o la molécula en cuestión. Cuando se
determina la concentración de un compuesto en solución mediante espectrofotometría es indispensable
mantener constante el paso de luz para lo cual se usan tubos especiales (cubetas) exactamente calibrados.
Generalmente, se usan cubetas de 1 cm de paso de luz de modo que en estas condiciones la absorbancia
queda determinada por ε y la concentración del compuesto (c). Lo anterior significa que para calcular la
concentración debemos conocer el valor de A y de ε. La forma más exacta para determinar la
concentración de una solución problema es medir su absorbancia y realizar una curva de calibración con
una solución patrón (solución de concentración conocida).
Curva de calibración. Consiste en determinar la absorbancia de una serie de soluciones de
concentración conocida, tratadas con un mismo método y medidas en el mismo tipo de aparato (Figura 4).
Si la variación de la absorbancia en función de la concentración resulta en una línea recta indica que la
relación entre ambas variables es directamente proporcional y por lo tanto se cumple la ecuación 1.
Además, la curva de calibración permite, dentro del intervalo útil del método, calcular el coeficiente de
extinción (ε) a partir de la pendiente de la recta que describe la variación de la absorbancia en función de
la concentración de la solución. Durante este trabajo práctico Ud. realizará una curva de calibración a
partir de las soluciones de dicromato de potasio que construyó en la actividad 2 midiendo la absorbancia
de las soluciones a 380 nm y determinará el valor de ε suponiendo que el paso óptico de la luz a través de
la muestra es de 1 cm.
Preguntas:
-En base a la ecuación 1, ¿a qué corresponde la pendiente de la recta de la recta de la figura 4 ?
-¿Qué blanco utilizara para construir su curva de calibración?
-Utilizando su curva de calibración describa dos formas de calcular la concentración una muestra de
concentración desconocida de Dicromato de potasio.

Figura 4. Ejemplo de curva de calibración:

 
 ANEXO. (modificado de Guía trabajos prácticos de Bioquímica, Facultad de Ciencias
Universidad de Chile).
Teoría.
Cuando la luz atraviesa un medio transparente parte de ella puede ser absorbida, de modo que la
intensidad de la luz transmitida (It) es siempre menor que la intensidad de la luz incidente (Io). En 1760,
Lambert, trabajando con placas de vidrio, encontró que a medida que el espesor del medio transparente,
(1) aumentaba en progresión aritmética (l, 2, 3, 4 ...) la intensidad de la luz transmitida disminuía en
progresión geométrica (16, 8, 4, 2 ...). En otras palabras, la intensidad de la luz transmitida es función de
la intensidad de la luz incidente multiplicada por una potencia de 10 con exponente negativo cuyo valor
depende de una constante (coeficiente de extinción, ε) que es característica para cada medio transparente,
y del espesor del medio. Lo anterior queda expresado en la siguiente relación:

Ecuación 1

En 1852, Beer aplicó estos principios al estudio de la absorción de la luz por soluciones
coloreadas de diferentes concentraciones encontrando las mismas relaciones. A medida que la
concentración de la solución (c) aumentaba en progresión aritmética, la intensidad de la luz transmitida
disminuía en progresión geométrica:

Ecuación 2.

La combinación de las ecuaciones (1) y (2) da como resultado la Ley de Lambert-Beer que
relaciona la disminución de la intensidad de la luz transmitida con la concentración y el camino recorrido
por la luz al atravesar la solución, lo que se expresa matemáticamente como:

Ecuación 3.

En sentido estricto, la ecuación (3) se cumple rigurosamente cuando se usa una radiación
monocromática. Si ambos miembros de la ecuación (3) se dividen por lo se obtiene lo siguiente:

Ecuación 4.

La razón It/Io se llama transmisión o transparencia. Cuando la luz transmitida es igual a la luz
incidente, el valor de la razón es 1 y la solución es totalmente transparente. Si se descarta, por medio de
un control apropiado (blanco), la luz absorbida por las paredes del continente de la solución y el
solvente, y se considera sólo la transparencia de la sustancia disuelta (soluto) cuya concentración se
desea medir, se habla de transmitancia. Lo contrario a la transmisión se denomina opacidad y
corresponde al valor recíproco de ésta, es decir Io/It. Al aplicar logaritmos se obtiene que:

Ecuación 5.

El logaritmo de la opacidad se denomina absorción o extinción. Cuando los términos Io e It se

Ecuación 6.

La ecuación (6) muestra que la absorbancia es directamente proporcional al camino recorrido por la luz y
a la concentración de la solución, y que además depende de una constante que es característica para cada
sustancia a una longitud de onda (A) determinada.

Ecuación 7

De esto se deduce que si el espesor se mantiene constante, la absorbancia de la solución dependerá sólo
de su concentración. Este principio permite determinar la concentración de una sustancia en solución por
medio de la espectrofotometría.
Cuando la concentración de un compuesto y el espesor, o la distancia recorrida por la luz, se hacen
iguales a la unidad, A se hace igual a ε lo que permite determinar su valor; esta cantidad se denomina
coeficiente de extinción. Referido a un solvente y a una longitud de onda particulares, el coeficiente de
extinción es una propiedad específica del compuesto. La unidad comúnmente empleada para medir la
distancia recorrida por la luz es el cm, mientras que la unidad usada para expresar la concentración puede
ser cualquiera que se estime conveniente. No obstante, la unidad de concentración más usada es
moles/litro (M). Si se mide la absorción de una solución 1M puesta en una cubeta cuyo ancho es de 1cm
se obtiene el coeficiente de extinción molar. Cuando la concentración se expresa en g/l se obtiene el
coeficiente de extinción específico.