Instituto de Microbiología Bioquímica

Centro de Investigación del Cáncer

CSIC/Universidad de Salamanca

Departamento de Microbiología y Genética

Universidad de Salamanca

Salamanca, 21-22 de Mayo de 2007

X Reunión de la Red Temática

Biodegradación de Lignina y Hemicelulosa
Aspectos Enzimáticos, Químicos y Moleculares. Aplicaciones Industriales y Medioambientales

Fotos: Ramón Santamaría

Nuestro agradecimiento especial al Centro de Investigación del Cáncer

de Salamanca por facilitarnos el uso de sus instalaciones para el

desarrollo de esta reunión
 X Reunión de la Red Temática
Biodegradación de Lignina y Hemicelulosa
Aspectos Enzimáticos, Químicos y Moleculares
Aplicaciones Industriales y Medioambientales

Salamanca, 21-22 de Mayo de 2007

Organización:
José Manuel Fernández Ábalos
Ramón Santamaría Sánchez

Instituto de Microbiología Bioquímica

Departamento de Microbiología y Genética
Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Universidad de Salamanca

Colaboración:
F. Javier Pastor
Coordinador General de la Red Temática
Universidad de Barcelona

Financiada por el Programa Nacional de Biotecnología

Ministerio de Educación y Ciencia
Programa

Lunes, 21 de Mayo de 2007

14:00 Comida de Bienvenida. Hotel ABBA-Fonseca

16:00-20:00 Sesiones Científicas

Centro de Investigación del Cáncer

16:00-17:40 Sesión I: Procesos Industriales I

Moderadoras: María Jesús Martínez y Enriqueta Arias

16:00 Ángel T. Martínez. CIB, CSIC. Madrid

Cambios en la lignina durante la obtención de pasta de eucalipto libre de cloro
usando una etapa enzimática.

16:25 Katiuska González Arzola. Universidad de La Laguna. Tenerife.

Estudio comparativo de la acción de mediadores redox de lacasa en la
transformación de ligninas.

16:50 Diego Moldes. U.P.C. Terrassa, Barcelona.

Blanqueo de pasta kraft de eucalipto con sistema lacasa-HBT. Estudio de las
condiciones de operación.

17:15 Úrsula. Fillat. U.P.C. Terrassa, Barcelona.

Blanqueo de pasta de lino mediante el sistema lacasa mediador: Optimización
de las variables de proceso.

17:40 Descanso y Café

18:15-20:00 Sesión II: Nuevas Enzimas

Moderadores: Ramón Santamaría y José M. Dorado

18:15 Mª Enriqueta Arias. UAH. Alcalá de Henares, Madrid.

Aprovechamiento del potencial enzimático de Streptomyces para la resolución
de problemas medioambientales

18:40 Elvira Romero. CIB, CSIC. Madrid

Estudio de una nueva aril-alcohol oxidasa fúngica
19:05 Pere Picart. UB. Barcelona
Identificación y caracterización molecular de la liquenasa Cel12A de
Stachybotrys atra

19:30 Margarita Díaz. IMB CSIC/USAL. Salamanca

Estudio del procesamiento de la xilanasa Xys1 de Streptomyces halstedii JM8

21:30 Cena. Casino del Tormes

Martes, 22 de Mayo de 2007

9:00-13:45 Sesiones Científicas

Centro de Investigación del Cáncer
9:00-10:45 Sesión III: Estudios Básicos y Metodológicos
Moderadores: Javier Pastor y Ángel T. Martínez

9:00 José Manuel Fernández Ábalos. IMB CSIC/USAL. Salamanca

Estudio de reguladores de la expresión de genes de enzimas hidrolíticas en
Streptomyces coelicolor.

9:25 Juan Antonio Tamayo. IATA CSIC. Burjasot, Valencia

Caracterización funcional y regulación del gen regulador xlnR de Aspergillus
nidulans.

9:50 Mª Paz Martínez Alcázar. U. San Pablo-CEU. Madrid

Estrategias para el análisis y screening de metabolitos secundarios en
extractos fúngicos.

10:15 José Muñoz Dorado. U. de Granada. Granada

Oxidasas multicobre de Myxococcus xanthus, un ejemplo de evolución de
parálogos.

10:40 Descanso y Café

11:15-13:00 Sesión IV: Procesos Industriales II

Moderadores: Teresa Vidal y Gumersindo Feijoo

11:15 José Luis Copa Patiño. UAH. Alcalá de Henares, Madrid.

La enzima feruil esterasa en panificación.
11:40 Edith Cadena. U.P.C. Terrassa, Barcelona.
Alternativa biotecnológica para desarrollar propiedades fisicomecánicas del
papel: aplicación de celulasas.

12:05 Marcel Vilaplana. UAB. Cerdanyola del Vallès, Barcelona

Diseño de un bioreactor para degradar hidrocarburos alifáticos clorados
mediante el hongo Trametes versicolor.

12:30 Mª Teresa Moreira. ETSI. USC, Santiago de Compostela

Optimización de la eliminación de compuestos recalcitrantes de baja
solubilidad en agua en reactores bifásicos.

13:00 Discusión Final y Conclusiones. F. Javier Pastor

14:00 Comida de Despedida. Hotel ABBA-Fonseca

 Sesión I
Procesos Industriales I
 Cambios en la lignina durante la obtención de pasta de
eucalipto libre de cloro usando una etapa enzimática
David Ibarraa, María Isabel Cháveza,, Susana Camareroa, María Jesús Martíneza, Jesús Jiménez-Barberoa,
Ángel T. Martíneza, Javier Romerob, Jorge Rencoretc, Ana Gutiérrezc, José Carlos del Ríoc
a
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Ramiro de Maeztu 9, E-28040 Madrid; bCIT, ENCE, Ctra.
Campañó, Ribeiro Vao, E-36157 Pontevedra; cInstituto de Recursos Naturales y Agrobiología, CSIC,
Apdo. Postal 1052, E-41080 Sevilla; [email protected]

Se han estudiado los cambios en la composición de la lignina de Eucalyptus globulus, formada por
unidades siringilpropano (S) y guayacilpropano (G), y las modificaciones de las uniones entre estas
unidades (formadas por enlaces C-O-C y C-C) durante la fabricación de pasta kraft y su posterior
blanqueo totalmente libre de cloro (TCF) en una secuencia O-O-L-Q-PoP que incluía una etapa
enzimática con lacasa-mediador (L) tras una doble deslignificación con O2 (O-O) y seguida de blanqueo
con peróxido alcalino (PoP, primer paso bajo O2 presurizado) (1). La lignina de la madera de esta especie,
aislada como MWL (milled-wood lignin), resultó ser un polímero básicamente lineal con una relación S/G
superior a 3 (estimada mediante pirólisis analítica) y un predominio de enlaces tipo β–O-4' (79% de las
cadenas laterales) y resinol (16%) estimados mediante resonancia magnética nuclear (NMR) en
experimentos HSQC (heteronuclear single quantum correlation) (2). También incluye pequeños
porcentajes de enlaces β-1', y de tipo fenilcumarano y espirodienona. La cocción kraft produce
degradación de las cadenas laterales de las unidades de lignina, dando lugar a una despolimerización
parcial y a la solubilización de la lignina alterada (lignina kraft aislada de las lejías de cocción)
caracterizada por un alto contenido fenólico (estimado mediante NMR de muestras acetiladas),
predominio de enlaces de tipo resinol (77%) y relación S/G mayor de 5. Por el contrario, la lignina
residual que permanece en la pasta cruda, aislada mediante un método puesto a punto para este tipo de
pastas (4), siguió siendo muy semejante a la MWL. Durante el blanqueo, además de ciertos cambios en la
composición y tipos de enlaces, se observó una alteración oxidativa de la lignina residual, tal como
indicaron señales específicas en la región aromática de los espectros HSQC y la presencia de marcadores
de pirólisis con cadenas oxidadas. Esta alteración oxidativa fue especialmente notable (casi 60% de las
unidades S mayoritarias) en la lignina aislada tras la etapa L (3). Utilizando experimentos HMBC
(heteronuclear multiple bond correlation) fue posible determinar que esto se debía a la formación de
estructuras de ácido siríngico (C4 eterificadas) mientras que tras la deslignificación con O2 predominaban
las estructuras de tipo acetosiringona. El análisis de la lignina residual tras la etapa final con peróxido,
comparada con la obtenida tras un simple tratamiento alcalino, reveló que la mayor parte de la lignina
alterada durante la etapa L era eliminada por el álcali utilizado en la etapa PoP, dando lugar a un descenso
del índice kappa y a una lignina más semejante a la encontrada antes de las etapas oxidativas, aunque con
menor contenido en estructuras de tipo resinol y mayor porcentaje de unidades con grupos carboxilo. Sin
embargo, fue necesaria la acción del peróxido para alcanzar el alto grado de blancura, superior a 91%
ISO, encontrado en la pasta final. Estos resultados se han obtenido en el marco de dos contratos ENCE-
CSIC y los proyectos europeos PELAS (QLK3-99-590) y BIORENEW (FP6-2004-NMP-NI-4-02456).

(1) Ibarra, D.; Camarero, S.; Romero, J.; Martínez, M. J.; Martínez, A. T. Integrating laccase-mediator
treatment into an industrial-type sequence for totally chlorine free bleaching eucalypt kraft pulp. J. Chem.
Technol. Biotechnol. 2006, 81, 1159.
(2) Ibarra, D.; Chávez, M. I.; Rencoret, J.; del Río, J. C.; Gutiérrez, A.; Romero, J.; Camarero, S.;
Martinez, M. J.; Jiménez-Barbero, J.; Martínez, A. T. Lignin modification during Eucalyptus globulus
kraft pulping followed by totally chlorine free bleaching: A two-dimensional nuclear magnetic resonance,
Fourier transform infrared, and pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry study. J. Agric. Food
Chem., en prensa (March 15, 2007).
(3) Ibarra, D.; Chávez, M. I.; Rencoret, J.; del Río, J. C.; Gutiérrez, A.; Romero, J.; Camarero, S.;
Martínez, M. J.; Jimenez-Barbero, J.; Martínez, A. T. Structural modification of eucalypt pulp lignin in a
totally chlorine free bleaching sequence including a laccase-mediator stage. Holzforschung, en prensa.
(4) Ibarra, D.; del Río, J. C.; Gutiérrez, A.; Rodríguez, I. M.; Romero, J.; Martínez, M. J.; Martínez, A. T.
Isolation of high-purity residual lignins from eucalypt paper pulps by cellulase and proteinase treatments
followed by solvent extraction. Enzyme Microb. Technol. 2004, 35, 173.
 Estudio comparativo de la acción de mediadores redox de
lacasa en la transformación de ligninas
Katiuska González Arzola a, María del Carmen Arévalo b, Miguel Ángel Falcón a
Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad de La Laguna, 38206, Tenerife, España
Departamento de Química Física, Universidad de La Laguna, 38206, Tenerife, España
[email protected]

Dos tipos de ligninas, una purificada de acículas de pino canario (PL) y otra industrial obtenida
mediante el método de Kraft (KL), fueron sometidas a sistemas constituidos por la actividad lacasa de
Fusarium proliferatum y diferentes mediadores: 2,2´-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-ácido sulfónico
(ABTS) y dos compuestos de los llamados tipo N-OH (1-hidroxibenzotriazol, HBT y ácido violúrico,
VA). Los cambios producidos por los sistemas lacasa-mediador en las ligninas fueron analizados
mediante cromatografía de exclusión molecular en HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) y
espectrofotometría UV-Vis. Así mismo se estudió la capacidad oxidativa de los mediadores sobre ambas
ligninas mediante voltametría cíclica.
El sistema lacasa-ABTS mostró una importante despolimerización de ambas ligninas, siendo
mayor para la PL (42,2%, frente a un 14,2% para la KL). Los espectros UV-Vis de las fracciones
despolimerizadas de la PL (~ 200 Da) mostraron dos picos intensos a 250 y 350 nm, ausentes en los
controles, así como incrementos significativos de las absorbancias a 260, 270 y 300 nm (12 y 26 veces,
respectivamente), lo que sugiere la introducción de nuevos grupos funcionales en la cadena lateral y/o en
el anillo aromático (Polcin y Rapson, 1969). Las fracciones de baja masa molecular procedentes del
tratamiento de la KL también presentaron aumentos en la absorbancia a esas longitudes de onda, siendo
notable el hecho de que desaparece el espectro típico de las ligninas en dichas fracciones. El
voltamograma cíclico del ABTS mostró los potenciales estándar (E0´) de las dos especies oxidadas: 440
mV para el catión (ABTS.+) y 854 mV para el dicatión (ABTS+2). El ABTS presentó los mejores
resultados catalíticos en presencia de las ligninas, siendo mayor la oxidación para la KL, que fue oxidada
más intensamente por el catión, mientras que la PL fue catalizada principalmente por el dicatión. Este
hecho podría explicarse por las diferencias encontradas en los rangos de potenciales de oxidación de las
ligninas, que empieza en valores superiores para la PL, lo cual podría ser debido a un mayor contenido en
compuestos no fenólicos.
Por el contrario, el tratamiento con los mediadores N-OH (VA y HBT) dio lugar a una intensa
polimerización de ambas ligninas, superior a la observada cuando se añade lacasa sola, detectándose un
incremento de alrededor de un 40% para la KL y de un 20% para la PL en las fracciones de alta masa
molecular (por encima de 5,6 kDa), aunque también se observó una pequeña fracción despolimerizada en
presencia de VA (3,19%). Los espectros de ambas ligninas tratadas con estos mediadores mostraron
alteraciones en las regiones comprendidas entre 260-270 nm y 300-340 nm, que resultaron ser superiores
cuando se empleó VA como mediador. Los voltamogramas cíclicos del VA mostraron una mayor
oxidación para la KL, hecho que se puede atribuir al bajo potencial redox de dicho mediador (E0´ 632
mV). Sin embargo, el HBT mostró un potencial de oxidación muy superior (~ 850 mV) aunque resultó ser
electroquímicamente inestable y el efecto observado sobre ambas ligninas fue un desplazamiento de los
potenciales de oxidación hacia valores más negativos, probablemente debido a la formación de
compuestos con potenciales más bajos.
En conclusión, los efectos de los sistemas lacasa-mediador fueron diferentes en función del tipo
de lignina y del mediador empleado. Los mejores resultados electrocatalíticos se obtuvieron con el ABTS,
siendo oxidada más intensamente la KL por el catión y la PL por el dicatión. El ABTS fue el único
mediador que despolimerizó ambas ligninas, que además presentaron importantes cambios espectrales. La
adición de los mediadores N-OH (VA y HBT) generó una intensa polimerización, superior a la detectada
para la lacasa sola. La electrooxidación mediada por el VA fue mayor para la KL, mientras que el HBT
produjo un desplazamiento de los potenciales de oxidación en ambos casos.

REFERENCIA

Polcin J, Rapson WH (1969) The interpretation of UV and visible spectrum of lignin. 55th Annual
Meeting of the Technical Section. Canadian Pulp and Paper Association. Montreal, pp 28-31.
 Blanqueo de pasta kraft de eucalipto con sistema
lacasa-HBT. Estudio de las condiciones de operación
Diego Moldes, Teresa Vidal.
Universitat Poliècnica de Catalunya. Departamento de Ingeniería Textil y Papelera
C/ Colom 11. 08222 Terrassa (Barcelona)
[email protected]

Los sistemas lacasa – mediador suponen una gran esperanza para la introducción de etapas
enzimáticas en el sector pastero y papelero ya que pueden permitir la deslignificación selectiva de la pasta
de papel (1). En estos sistemas la capacidad de oxidación del enzima, normalmente limitada a
subunidades fenólicas de la lignina, se amplia gracias a la generación de compuestos oxidantes derivados
de la reacción de lacasa con el mediador.

En este trabajo se ha empleado el mediador de referencia HBT para llevar a cabo el blanqueo de pasta
kraft de Eucalyptus globulus y determinar las condiciones de funcionamiento más apropiadas para este
sistema lacasa – mediador. Para ello se ha utilizado un reactor presurizado de 4 litros en el que el
blanqueo de la pasta con lacasa – HBT se realizó en condiciones variables de consistencia y presión de
oxígeno durante diferentes tiempos de tratamiento. Este tratamiento enzimático de la pasta (etapa L) se ha
completado paralelamente con una extracción alcalina (etapa E) y un blanqueo con peróxido de hidrógeno
en condiciones alcalinas (etapa P). La comparación de estos tratamientos se realizó en base a los valores
obtenidos de índice kappa y blancura.

El sistema lacasa – HBT permitió mejorar las propiedades finales de la pasta. Este resultado, si bien
no es evidente después de la etapa L, sí lo es tras las etapas E o P, lo que indica que el tratamiento
enzimático produce una lignina más accesible a posteriores tratamientos. En cuánto a la variación de las
condiciones en la etapa L, no se encontraron diferencias significativas para los valores de consistencia
ensayados. El tiempo de tratamiento, que varió desde 2 a 8 horas, tampoco ejerció un efecto importante
en los resultados finales e incluso se observó un efecto adverso para los tratamientos más largos (8 horas)
en los que se produjo un ligero aumento del índice kappa y un descenso de la blancura, probablemente
debido a procesos de polimerización del HBT en los componentes de la pasta. El aumento de la presión
de oxígeno en el interior del reactor sí produjo un efecto positivo en las propiedades finales de la pasta.
Como norma general se obtuvieron mejoras de 0,5 en índice kappa y 3-4 % en blancura para los
experimentos realizados a 6 bares de presión de oxígeno en comparación con los experimentos sin adición
del mismo.

La determinación de la condiciones más adecuadas para conseguir máximos niveles de

deslignificación de la pasta de papel supone un paso importante para conocer el proceso de blanqueo
enzimático y para abordar nuevos estudios relacionados con los sistemas lacasa – mediador.

Referencias

(1) Bajpai, P. Biological Bleaching of Chemical Pulps. Crit. Rev. Biotechnol. 2004, 24(1): 1-58.

Agradecimientos:

Diego Moldes agradece al MEC la financiación de su contrato a través del programa Juan de la
Cierva.
Proyectos: “Desarrollo de nuevos procesos de blanqueo de pastas para papel de alta calidad e interés
estratégico utilizando sistemas enzimáticos mejorados”. (MEC) ENZPULP : CTQ2005-08925-C02-01.
“White biotechnology for added value products from renewable plant polymers: Design of tailor-made
biocatalysts and new industrial bioprocesses”. (EU) BIORENEW. NMP2-CT-2006-026456
 Blanqueo de pasta de lino mediante el sistema lacasa
mediador: Optimización de las variables de proceso
U. Fillata, T. Vidala, M.B. Ronceroa
a
Universitat Politècnica de Catalunya, CIPAGRAF, Colom 11, 08022 Terrassa
E-mail [email protected]

La industria de papel y pasta en los países industrializados utiliza las fibras no madereras para obtener
pastas de alta calidad para la fabricación de papeles especiales con un alto valor añadido. Mientras el
blanqueo con secuencias ECF no causa problemas especiales, usar una secuencia TCF para este propósito
es más complicado. Las enzimas oxidativas han sido poco estudiadas en relación al blanqueo de pastas no
madereras, tanto en secuencias ECF como en TCF. Las enzimas oxidativas como la lacasa, mejoran los
procesos de blanqueo de pastas y ahorran reactivos. En el sistema lacasa mediador, la enzima oxida al
compuesto químico (el mediador) en un radical estable que a su vez oxida el polímero de lignina.

En este trabajo se evalúa la influencia de las variables del sistema lacasa mediador (dosis de lacasa y
de mediador, tiempo de tratamiento y presión de oxígeno) en las propiedades de las pastas (índice kappa y
blancura). Las propiedades de la pasta se analizan después de aplicar una secuencia TCF (LE), donde L es
una etapa de tratamiento enzimático con lacasa y HBT y la etapa E es una extracción alcalina. La etapa L
se optimiza mediante un plan estadístico de cuatro variables. Los márgenes de variación de las cuatro
variables son: dosis de lacasa (1 a 20 U·g-1), dosis de HBT (0,1 a 2 %), tiempo de tratamiento (0,5 a 6,5 h)
y presión de oxígeno (2 a 6 bar).

Los modelos matemáticos obtenidos predicen un índice kappa entre 7,0 y 3,0 y una blancura de pasta
entre 43,8 y 65,5 %ISO dependiendo de las variables de proceso. La variación de la presión de oxígeno
entre 2 y 6 bar no afecta a las propiedades de la pasta. En general, un aumento en las demás variables
estudiadas produce una disminución del índice kappa y un aumento de blancura de la pasta. Aunque los
modelos predicen dosis límites de reactivos, un aumento en estas dosis no produce una variación
adicional de las propiedades de las pastas, Figura 1.

8 56
7
Blancura (%ISO)

tiempo 52
Índice kappa

6
X3=-1 tiempo
5 X3=0 48 X3=1
4 X3=1 X3=0
44
3 X3=-1
2 40
-0,5 -0,5
0,0 0,0 -1,0
0,5 -0,5 -1,0 0,5
0,0 -0,5
X2 - mediador 1,0 0,5 0,0 X2 - mediador 1,0 0,5
1,0 1,0
X1 - enzima X1 - enzima

Fig. 1. Índice kappa y blancura.

Referencias

(1) Camarero S.; García O.; Vidal T.; Colom J.F.; del Río J.C.; Gutiérrez A.; Gras J.M.; Monje R.;
Martínez J.; Martínez A.T. Efficient Bleaching of non-wood high-quality paper pulp using laccase-
mediator system, Enzyme and Microbial Technology. 2004. 35(2): 113-120.

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado gracias al proyecto del MEC (CTQ2005-08925-C02-01/PPQ), al Proyecto

Europeo Integrado del Sexto Programa Marco (NMP2-CT-2006-026456) y a la beca DURSI
(2005FI00139). Los autores agradecen a CELESA y a Novozymes el haber subministrado la pasta
inicial y la lacasa.
 Sesión II
Nuevas Enzimas
 Aprovechamiento del potencial enzimático de
Streptomyces para la resolución de problemas
medioambientales
Mª Enriqueta Arias, José Manuel Molina, Raquel Moya, Ana García, Aura Lyli Orozco, Juana Rodríguez,
Francisco Guillén, Mª Isabel Pérez y Manuel Hernández
Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad de Alcalá. 28871 Alcalá de Henares. Madrid
E-mail: [email protected]

En los últimos años nuestro grupo de investigación se ha centrado en el estudio de la capacidad de los
estreptomicetos para proporcionar valor añadido a distintos residuos lignocelulósicos, así como en el
aprovechamiento de sus enzimas oxidativas para resolver problemas medioambientales derivados de las
industria papelera y textil. Con este objetivo, se han seleccionado distintas cepas de Streptomyces
productoras de actividad lacasa, en las que se ha evaluado su capacidad para ser utilizadas en la
biotransformación de pulpa de café, en el bioblanqueo de pastas de papel, así como en la decoloración y
destoxificación de tintes empleados en la industria textil.

La pulpa de café es el subproducto principal del café procesado en húmedo en países en vías de
desarrollo como Nicaragua y constituye un excedente agrícola muy contaminante debido a su contenido
en cafeína, taninos y polifenoles. En el estudio realizado, se evaluó la capacidad de distintas cepas de
Streptomyces para degradar mediante fermentación en estado sólido, los componentes tóxicos de la
misma, así como para incrementar su contenido en nitrógeno proteico, con vistas a su utilización en la
alimentación animal. El análisis del sustrato fermentado mediante Py-GC/MS, puso de manifiesto la
capacidad de las cepas para disminuir el contenido en polifenoles, tanto en sus derivados monometoxi
como dimetoxilados, así como para incrementar el contenido en proteinas del sustrato.

Otro aspecto de la capacidad degradativa de Streptomyces actualmente en estudio, está dirigido al

aprovechamiento de la producción extracelular de radicales hidroxilo (vía ciclo redox de quinonas
catalizado por una reductasa intracelular y la propia lacasa) para la eliminación de contaminantes de
naturaleza aromática. Hasta la fecha se ha comprobado la capacidad de Streptomyces cyaneus para
degradar BTEX, así como para degradar y destoxificar un amplio número de colorantes de variada
estructura (azo, antraquinona, ftalocianina e índigo).

Paralelamente, se ha llevado a cabo la caracterización físico-química y molecular de la lacasa de

Streptomyces ipomoea, poniéndose de manifiesto que esta enzima presenta una serie de características
ventajosas para ser utilizada en la resolución de problemas medioambientales, entre las que cabe señalar,
su versalitidad al pH dependiente de sustrato y su resistencia a altas concentraciones de cloruro sódico. El
clonaje y sobreexpresión de esta enzima, permitió analizar su efecto en el bioblanqueo de pastas kraft de
eucalipto, así como en la decoloración y destoxificación de colorantes textiles. Cabe destacar la capacidad
de esta enzima para incrementar la blancura de la pasta en presencia de ABTS a pH 4,5 y su efecto en el
ahorro de peróxido de hidrógeno. El ensayo del sistema lacasa-acetosiringona sobre el colorante Reactive
Green 19 a pH 8, produjo un 80% de decoloración y un 40% de destoxificación del mismo.
 Estudio de una nueva aril-alcohol oxidasa fúngica
Elvira Romero, Ángel T. Martínez, María Jesús Martínez
Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, Spain
E-mail del autor ponente: [email protected]

El trabajo comenzó hace unos años con el aislamiento de un hongo de un disco compacto (CD)
encontrado en Belice. En este CD se observaban a simple vista varias zonas deterioradas que comenzaban
desde los bordes y afectaban principalmente a la capa de metal reflectante, permaneciendo intacta la capa
de laca y pintura. Tras esterilizar en superficie este CD, el único microorganismo que creció en diferentes
medios de cultivo fue un hongo, identificado morfológicamente como un hongo de tipo Geotrichum(1).
Utilizando diferentes tipos de CD (audio y grabables) pudimos comprobar que este hongo era capaz de
reproducir in vitro síntomas similares a los encontrados en el CD original, cuando se incubaba a
temperatura ambiente y humedad de saturación. Las hifas del hongo crecen dentro de los fragmentos de
CD, solubilizando el aluminio y destruyendo la capa reflectante de este soporte (impidiendo su lectura).
El análisis de fragmentos de CD con un microscopio de barrido confirmó que el hongo también destruye
la información grabada en los CD-audio como “pits” y “lands” sobre la capa de policarbonato,
confirmando que el hongo degrada este polímero aromático. El análisis del la región ITS del DNA
ribosomal, sus características morfológicas y el patrón de enzimas que hemos detectado en medio líquido
nos indican que el hongo aislado del CD biodeteriorado es un hongo de tipo a Geotrichum que se
corresponde con un anamorfo de Bjerkandera adusta(2). Dado que existen muy pocos microorganismos
capaces de degradar el policarbonato, nos propusimos caracterizar el sistema enzimático de este hongo y
estudiar las posibles aplicaciones biotecnológicas que pudiera tener.
Esta cepa produce en un medio basal, con glucosa, peptona y extracto de levadura, una enzima de tipo
aril-alcohol oxidasa (AAO) y una peroxidasa que oxida Mn2+ a Mn3+, esta última sólo en presencia de
MnSO4 en el medio de cultivo. La AAO es una flavoenzima extracelular que cataliza la oxidación de
alcoholes aromáticos a sus correspondientes aldehídos. Esta enzima se ha purificado y caracterizado en
Pleurotus y Bjerkandera(3,4,5), comprobándose en P. eryngii que participa en la producción extracelular de
H2O2 y, en presencia de hierro, en la producción de radical hidroxilo(6). También se ha purificado y
caracterizado otra oxidasa de alcoholes aromáticos, la vainillil-alcohol oxidasa (VAO), descrita por
primera vez en Penicillium simplicissimum(7). Esta última flavoenzima es intracelular y oxida sólo
alcoholes 4-hidroxibencílicos. La AAO purificada del anamorfo de B. adusta, utilizando columnas de
intercambio iónico y exclusión molecular, es una flavoenzima extracelular que oxida eficazmente
alcoholes aromáticos no fenólicos pero también alcohol vainíllílico (no oxidado por la AAO de P.
eryngii). En la actualidad se está completando su caracterización y se están estudiando las constantes
cinéticas de esta enzima utilizando sustratos que oxida la AAO de P. eryngii y no la VAO de P.
simplicissimum y viceversa.

Referencias
(1) García-Guinea, J., Cárdenes, V., Martínez, A.T. y Martínez, M.J. Fungal bioturbation paths in a
compact disk. Naturwissenschaften 2001, 88, 351.
(2) Romero, E., Speranza, A.M., García-Guinea, J., Martínez, A.T. y Martínez, M.J. An anamorph of
Bjerkandera adusta responsible of compact disc degradation: study of the colonization and deterioration
processes. FEMS Microbiol. Lett. 2007 (en prensa)
(3) Bourbonnais, R. y Paice, M.G. Veratryl alcohol oxidases from the lignin degrading basidiomycete
Pleurotus sajor-caju. Biochem. J. 1988, 255, 445.
(4) Muheim, A., Waldner, R., Leisola, M.S.A. y Fiechter, A. An extracellular aryl-alcohol oxidase from
the white-rot fungus Bjerkandera adusta. Enzyme Microb. Technol. 1990, 12, 204.
(5) Guillén, F., Martínez, A.T. y Martínez, M.J. Substrate specificity and properties of the aryl-alcohol
oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii. Eur. J. Biochem. 1992, 209, 603.
(6) Guillén, F., Gómez-Toribio, V., Martínez, M.J. y Martínez, A.T. Production of hydroxyl radical by the
synergistic action of fungal laccase and aryl alcohol oxidase. Arch. Biochem. Biophys. 2000, 383, 142.
(7) de Jong, E., van Berkel, W.J.H., van der Zwan, R.P. y de Bont, J.A.M. Purification and
characterization of vanillyl alcohol oxidase from Penicillium simplicissimum. A novel aromatic alcohol
oxidase containing covalently bound FAD. Eur. J. Biochem. 1992, 208, 651.
 Identificación y caracterización molecular de la
liquenasa Cel12A de Stachybotrys atra
P. Picarta, F.I.J. Pastora, P. Díaza, F. Goedegebuurb
a
Departamento de Microbiología, Universidad de Barcelona, Av. Diagonal 645, 08028 Barcelona,
España. b Genencor, a Danisco Division. Archimedesweg 30. 2333CN Leiden. Holanda.
[email protected]

Se ha aislado una nueva cepa fúngica con un elevado poder celulolítico a partir de material téxtil
en descomposición. Su caracterización morfológica y secuencia de rDNA han permitido identificarla
como Stachybotrys atra. La nueva cepa mostró una elevada secreción de celulasas al cultivarla en medio
mineral suplementado con paja de arroz. La celulasa cruda secretada por la cepa mostró el máximo de
actividad celulasa a 70 ºC y pH 5, y se mantuvo estable a 60 ºC durante 3 horas. Los análisis zimográficos
mostraron que Stachybotrys atra BP-A produce diversas enzimas celulolíticas, incluyendo varias
endoglucanasas. Una de ellas ha sido clonada mediante amplificación por PCR con primers degenerados
deducidos de la celulasa CelA de Memmoniella echinata, hongo relacionado taxonómicamente con
Stachybotrys atra. El gen clonado, cel12A, contiene una pauta de lectura abierta de 848 pb, interrumpida
por dos intrones de 73 pb y 58 pb, respectivamente. El gen completo desprovisto de intrones fue
amplificado por PCR de fusión y clonado en Aspergillus niger bajo el control del vector de expresión
pRAXdes2. El enzima clonado fue purificado y caracterizado a partir de sobrenadantes de cultivos de la
cepa de Aspergillus niger recombinante. Los resultados mostraron que el enzima era muy activo sobre β-
1,3-1,4 glucanos (β-glucano de cebada y liquenano) mientras que su actividad sobre carboximetilcelulosa
era muy baja y no mostraba actividad sobre celulosa cristalina. La actividad específica mostrada por el
enzima indicó que se trata de una liquenasa (1,3-1,4-β-D-Glucano 4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.73). El
enzima mostró un peso molecular aparente de 26 kDa y actividad máxima a 45 ºC y pH 6. Los análisis
mediante cromatografía de capa fina de los productos de hidrólisis de liquenano y β−glucano de cebada
mostraron que el enzima libera una mezcla de productos desde estos sustratos, incluyendo
celooligosacáridos de 2-4 unidades y productos de movilidad intermedia, sugiriendo la presencia de
enlaces β-1,3 en los productos de reacción.
 Estudio del procesamiento de la xilanasa Xys1 de
Streptomyces halstedii JM8.
Margarita Díaza, José Manuel Fernandez-Abalosa, Jose L. Copab, Juan Soliverib y Ramón Santamaríaa.
a
Instituto de Microbiología Bioquímica/Departamento de Microbiología y Genética (Univ. Salamanca/CSIC).
Edificio Departamental. Campus Miguel de Unamuno. 37007 Salamanca. bDepartamento de Microbiologia y
Parasitología, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid.
Email: [email protected]

Los microorganismos del género Streptomyces intervienen en la degradación de lignocelulosa a través

de una batería de enzimas entre las que se encuentran lacasas, xilanasas, celulasas etc. Nuestro grupo seleccionó
hace años una cepa de Streptomyces, identificada como S. halstedii JM8, por su producción de xilanasas y
celulasas. En estos años hemos clonado y estudiado los genes y proteínas correspondientes y realizado
mutaciones tanto en las regiones regulatorias como en las regiones codificantes.

Una de las proteína que hemos estudiado con mayor detalle es la xilanasa Xys1 por la elevada
producción que se obtiene al clonar el gen en distintos hospedadores y por la posible aplicación industrial. En
este aspecto, hemos valorado esta enzima sobre piensos animales y se esta valorando en la obtención de pasta
papelera. En estas posibles aplicaciones industriales consideramos de sumo interés el poder bloquear el
procesamiento proteolítico que sufre la enzima al acumularse en el medio de cultivo y que provoca la separación
de los dominios catalítico y de unión a celulosa que componen la enzima. Para ello, se han abordado dos
estrategias una de ellas consistió en la deleción del linker que une ambos dominios y la otra estrategia es la
obtención de proteínas híbridas con la proteína Xyl30 aislada a partir de S. avermitilis UAH30. Este enzima
posee también dos dominios, un dominio catalítico y un dominio de unión a xilano pero es más resistente al
procesamiento proteolítico. Los resultados obtenidos de estos trabajos parecen apuntar a que las proteasas
responsables del procesamiento no tienen especificidad en su secuencia de corte sino que reconocen alguna
secuencia en la región de unión a sustrato y posteriormente procesan la proteína en otro punto
independientemente de la secuencia que allí exista.

Por otro lado se han empleado las señales regulatorias del gen que codifica Xys1 para desarrollar
vectores de expresión que nos permiten obtener grandes cantidades de otras proteínas de interés como celulasas,
amilasas y proteasas de distintos Streptomyces. Así mismo hemos demostrado su utilidad para la expresión
heteróloga de otras proteínas como la xilanasa X22 (producto del gen xlnA) de Aspergillus nidulans, o distintas
proteínas de Thermus thermophilus.
 Sesión III
Estudios Básicos y Metodológicos
 Estudio de reguladores de la expresión de genes de
enzimas hidrolíticas en Streptomyces coelicolor
Emma Kecka, Javier Encinar del Dedoa, Ramón I. Santamaría Sáncheza, Margarita Díaz Martíneza, b, José
Manuel Fernández Ábalosa, b
a
Instituto de Microbiología Bioquímica (CSIC/Universidad de Salamanca), Campus Miguel de Unamuno,
37007 Salamanca; bDepartamento de Microbiología y Genética, Universidad de Salamanca, Campus
Miguel de Unamuno, 37007 Salamanca.
[email protected]

La secuenciación del genoma de Streptomyces coelicolor y otros representantes del mismo género ha
permitido sacar a la luz la complicada red de posibles interacciones genéticas que controlan la expresión
de genes en estos microorganismos, también la de genes relacionados con la degradación de polímeros
vegetales. Podemos así abordar el estudio de la regulación de la expresión génica en Streptomyces con
nuevas estrategias de genómica funcional, y plantearse, incluso, la generación de cepas alteradas en la
producción de determinadas enzimas de interés en la degradación o modificación de estos polímeros.
Hemos iniciado un estudio de reguladores de la producción de enzimas hidrolíticas empleando una
aproximación primero bioinformática y luego de clonación/deleción de genes de presuntos reguladores.

Es bien conocido que los genomas de bacterias poseen una gran economía de DNA codificante, de
manera que es frecuente encontrar juntos en el genoma los genes estructurales de muchas rutas
metabólicas y los de sus correspondientes reguladores directos, activadores o represores. Es habitual, por
tanto, que los operones de genes de enzimas de degradación de polímeros vegetales vayan asociados a
presuntos reguladores de diversas familias: LacI, GntR, LysR, AraC, MarR, etc. En el caso de los genes
correspondientes a celulasas, xilanasas, mananasas, pectinasas, etc, su regulación estará coordinada con
mecanismos más globlales relacionados con el uso de fuentes de carbono alternativas a la glucosa. Un
barrido del genoma de S. coelicolor mantenido en http://streptomyces.org.uk nos ha permitido establecer
asociaciones de genes de enzimas con los de reguladores cercanos a ellos. Ante la diversidad de familias
de presuntos reguladores, hemos centrado nuestra atención en los que pertenecen al grupo estructural de
LacI, el ejemplo clásico de regulador negativo, de inducción mediante azúcares solubles y conexión con
el uso de fuentes de carbono alternativas. En S. coelicolor se detectan 35 de estos genes y, comparados
entre sí, se pueden detectar agrupaciones que parecen correlacionarse con determinados operones de
degradación de polímeros y sistemas de internalización de azúcares.

Estamos comenzando a analizar los reguladores tipo LacI, que denominamos “scoLacIs”, asociados
linealmente con operones de celulasas, celobiasas y transporte de celobiosa. Para este análisis
pretendemos generar mutantes nulos de estos reguladores, en los que esperaríamos observar una
desrepresión constitutiva de los operones cercanos, y cepas de sobreexpresión ectópica del cada regulador
previamente clonado, que quizás mostraran hiperrepresión. Para la deleción y para la clonación
sistemática de los correspondientes scoLacIs, empleamos técnicas de recombinación homóloga
(REDIRECT), acoplada a sistemas de multiexpresión por recombinación específica (GATEWAY,
Invitrogen). Estas técnicas permiten la manipulación simultánea y sistemática de varios genes en varios
contextos de expresión diferentes, y pueden ser de aplicación a trabajos similares en otros
microorganismos.
 Caracterización funcional y regulación del gen
regulador xlnR de Aspergillus nidulans

Juan Antonio Tamayo, Elsy Tamayo, Adela Villanueva y Margarita Orejas

Departamento de Biotecnología. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos. Consejo Superior

de Investigaciones Científicas. Apartado de Correos 73, 46100 Burjassot (Valencia)
E-mail del autor ponente: [email protected]

Dada la importancia de las xilanasas en la industria de los alimentos y del papel, así
como en fitopatogénesis, en los últimos años se han caracterizado en detalle diferentes
xilanasas y se han clonado, en hongos y bacterias, varios genes que las codifican. En
general, la síntesis de estas enzimas está controlada por dos mecanismos: inducción
específica por el sustrato o derivados y represión por catabolito de carbono. Un
conocimiento más detallado de los mecanismos moleculares que regulan su producción
sería de gran utilidad para la mejora dirigida de cepas. El hecho de que Aspergillus
nidulans esté muy bien caracterizado genéticamente, ha motivado su uso como
organismo modelo en estudios sobre la regulación de genes que en otros hongos tienen
una clara importancia industrial. El sistema xilanolítico de A. nidulans comprende una
batería de al menos tres endoxilanasas, codificadas por los genes xlnA, xlnB y xlnC y
una β-xilosidasa codificada por el gen xlnD, cuya transcripción en presencia de xilano o
xilosa depende del regulador positivo XlnR. Estos genes están además controlados por
el regulador CreA, que impide su transcripción en presencia de glucosa, y por el
regulador de pH ambiental PacC.

En trabajos anteriores habíamos establecido que en A. nidulans el regulador CreA

reprime la transcripción de los genes xlnA y xlnB de manera diferente; mientras que la
represión de xlnA tiene lugar mediante un mecanismo de “doble llave”, toda la represión
de xlnB tiene lugar de manera indirecta. Estos resultados indicaban la existencia de un
mecanismo de represión en cascada y nos llevaron a clonar y caracterizar el gen
regulador xlnR para comprobar si éste formaba parte de la misma. La presencia en su
promotor de 11 dianas de unión para la proteína CreA y 2 dianas PacC sugería que la
transcripción de xlnR podría estar a su vez regulada por los reguladores de amplio
dominio CreA y PacC, y que por tanto el complejo xilanolítico de A. nidulans estaría
controlado por una compleja cascada de reguladores transcripcionales. El hecho de que
la expresión del gen indicador goxC (codifica glucosa oxidasa) situado bajo el promotor
del gen xlnR se reprime por glucosa vía CreA y que la expresión constitutiva de xlnR
ocasiona la desrepresión completa de la transcripción de los genes xlnA y xlnB en
presencia de glucosa, apoyan la hipótesis anterior.

Además, con el fin de conocer qué otras proteínas se están co-secretando en las
condiciones de cultivo inductoras del sistema xilanolítico (presencia de xilosa/xilano, a
pH ácido y pH alcalino) y a su vez caracterizar nuevas proteínas extracelulares
codificadas por el activador transcripcional XlnR, se está analizando el subproteoma
extracelular (secretoma) de A. nidulans mediante electroforesis bidimensional.
Resultados preliminares serán también presentados.
 Estrategias para el análisis y screening de metabolitos
secundarios en extractos fúngicos.
M.P. Martínez-Alcázar a M.P. Lorenzoa, ,M. Caamañoa, M.T. Troyab , F. Rubioa, M.J. Prieto c, D.
Lorenzob
aFacultad de Farmacia,CEU- Universidad San Pablo. bLab. Protección de Maderas, CIFOR-
INIA,cFKR-QUIMICA

Se describe la estrategia del desarrollo de un procedimiento analítico de HPLC/MS adecuado para el

análisis de extractos fúngicos, así como la puesta a punto de un proceso de fraccionamiento por SPE de
dichos extractos. Por el procedimiento desarrollado, se han estudiado unos extractos de medios de
cultivo de determinados hongos del género Mycena, (1) que muestran una marcada inhibición del
crecimiento de otros hongos patógenos para las maderas. El trabajo realizado puede ser considerado
como un inicio al estudio metabolómico de dicho género de hongos , que permita realizar un “screenig “
de metabolitos con potencial actividad antifúngica, contra los hongos que atacan a la madera.

Los metabolitos (MTBs) secundarios de los hongos (2) son aquellos compuestos, generalmente, de
bajo peso molecular que no están genéticamente codificados pero que son sustratos, intermedios o
productos de sus reacciones metabólicas de crecimiento o normal funcionamiento. Son secretados al
medio de cultivo y constituyen el denominado exometaboloma fúngico (3) pudiendo ser usados para su
clasificación taxonómica. Como en todo experimento de metabolómica las etapas del proceso han sido:
cultivo del organismo, toma de muestra y extracción; analisis, tratamiento de datos e interpretación de
los mismos.

La gran diversidad de estructuras químicas, y por tanto de propiedades físico-químicas, que pueden
presentar los metabolitos y el rango dinámico de concentraciones de los mismos, de pmol/L a mmol/l a
veces imposibilita el análisis simultáneo de todos los MTBs. El acoplamiento HPLC/MS (4), que une la
capacidad de separación de la cromatografía líquida de alta resolución, a la selectividad de la
espectrometría de masas en análisis cualitativos, ha sido la herramienta analítica empleada en el
estudio. Los resultados del estudio ponen de manifiesto una mayor producción de metabolitos cuando
los hongos se han cultivado en presencia de un hongo patogeno.

Referencias
(1) Dafemer, M.; Anke, T.; Hellwig, V.; Steglich, W.; Sterner, O. 1998, J. Antibiot. 51, 816-822.
(2) Handbook of Secondary Fungal Metabolites, Cole, R.J., SchweikertM. A., Jarvis, B.B.
2005, Academic Press.
(3) Smedsgaard J, Nielsen J., 2005 ,J. Exp Bot 56(410):273–286.(4) Smedsgaard J, Frisvad C. 1996 J. of
Microb. Methods 25, 5-17
 Oxidasas multicobre de Myxococcus xanthus, un
ejemplo de evolución de parálogos
Juana Péreza, María Celestina Sánchez Sutila, Nuria Gómez Santosa, Aurelio Moraleda Muñoza, Ligia O.
Martinsb, y José Muñoz Doradoa
a
Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. Avda. Fuentenueva
s/n. E-18071 Granada. España. bInstituto de Tecnologia Química e Biológica (ITQB). Universidade Nova
de Lisboa. Avda República. 2785-901 Oeiras. Portugal
E-mail del autor ponente: [email protected]

Myxococcus xanthus es una bacteria del suelo que presenta un ciclo de desarrollo único entre los
procariotas desencadenado por el agotamiento de nutrientes. En estas condiciones, las bacterias se
mueven por deslizamiento y se agregan en ciertos puntos originando unas estructuras macroscópicas
denominadas cuerpos fructificantes, en cuyo interior los bacilos vegetativos móviles y alargados sufren
un proceso de diferenciación y se convierten en células de resistencia denominadas mixósporas. Estas
esporas son células estáticas y cocoideas.

Para culminar con éxito este ciclo de desarrollo, las células tienen que superar las condiciones
medioambientales adversas que existen en el suelo en un momento durante el cual los niveles energéticos
son bajos. Pero además, los bacilos tienen que sufrir cambios morfológicos profundos, para lo que
necesitan reorganizar la envuelta celular. Por todo ello, el ciclo de desarrollo es una etapa crítica para la
supervivencia de la bacteria.

Entre los factores adversos del suelo cabe destacar la presencia de compuestos aromáticos de diversa
naturaleza y de metales pesados, entre los que cabe mencionar el cobre. Entre las enzimas implicadas en
la destoxificación de estos dos tipos de compuestos tóxicos destacan las oxidasas multicobre. El genoma
de Myxococcus xanthus ha revelado la presencia de tres genes que codifican proteínas de esta familia, el
mayor número codificado en un genoma caracterizado hasta el momento. Esta abundancia hace que se
planteen preguntas tales cómo ¿por qué esta elevada redundancia génica?, ¿está alguna oxidasa
multicobre implicada en el ciclo de desarrollo?, ¿su actividad permite clasificarlas como lacasas o como
metalooxidasas? El estudio de los perfiles de expresión de cada uno de los genes, así como la
caracterización de mutantes de deleción en fase en cada gen y las medidas de diferentes tipos de
actividades enzimáticas en los extractos celulares de dichos mutantes nos ha permitido responder, al
menos en parte, a este tipo de preguntas. Dichos resultados serán presentados en la reunión.
 Sesión IV
Procesos Industriales II
 La enzima feruil esterasa en panificación
Copa-Patiño JL.a, Arenas M.a, Caballero A.b, Soliveri J.a
a
Dpto de Microbiología y Parasitología, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, 28871 Madrid;
b
Emilio Esteban S.A. 47170 Renedo, Valladolid
[email protected]

El ácido ferúlico (AF) es un compuesto fenólico que aparece unido por enlaces éster a las cadenas de
arabinoxilano (AX) presentes en las harinas. En general hay poco AF en forma libre, estando la mayoría
unido al AX que no es extraíble con agua. Su presencia afecta a la agregación del gluten y a su
extensibilidad, y por tanto tiene consecuencias en las características reológicas de las masas y en el
proceso de panificación. El efecto sobre el gluten puede ser debido a dos causas: a una “acción indirecta”
al permitir el AF la unión de cadenas de AX, lo que conlleva un aumento de la viscosidad y la aparición
de una malla que impide la correcta agregación del gluten; y/o a una “acción directa” al permitir que las
cadenas de AX se una a las proteínas, impidiendo de esta manera la agregación del gluten. Para algunos
autores la “acción directa” no esta clara, y señalan que es sólo la malla de AX la que afecta a la
agregación del gluten. Sin embargo, para otros autores sí se producen uniones covalentes del AF de las
cadenas de AX a las proteínas.

Se han descrito distintos tipos de enzimas que estén relacionadas con el AF y que puedan tener un
papel en los procesos de panificación. Estas enzimas son: Peroxidasas (E.C. 1.11.1.7), Lacasas (E.C.
1.10.3.2) y Feruil esterasas (FAE) (E.C. 3.1.1.73). Las dos primeras son enzimas oxidativas o también
llamadas fenoloxidasas. Ambas enzimas actuarían como agentes gelificantes de cadenas de AX a través
de la dimerización del AF esterificado, y se han encontrado de forma endógena en harinas de cereales,
pero en cantidades limitadas. Las enzimas FAE, al contrario de las lacasas y peroxidasas, impiden la
gelificación, ya que hidrolizan el enlace éster que une el AF a las cadenas de AX. Esta actividad se ha
detectado en harinas y, aunque los niveles no son muy elevados, los valores son muy constantes entre las
diversas variedades del trigo.

Nuestro grupo de investigación ha obtenido un complejo enzimático enriquecido en actividad FAE. El

complejo ha sido utilizado como aditivo de harinas, estudiándose su efecto sobre las características
reológicas de la masa y sobre el proceso de panificación. En términos generales, los resultados obtenidos
muestran que el uso de nuestro complejo enzimático con actividad FAE permite obtener masas en las que
la P disminuye y la L aumenta, obteniéndose relaciones P/L óptimas y equilibradas para diferentes
procesos de panificación y bollería, no apreciándose disminución en la fuerza (W) o consistencia de la
masa. Nuestra hipótesis es que la acción de la enzima FAE es la causante de los efectos observados, ya
que su acción impediría la gelificación de las cadenas de AX, y por lo tanto no aumentará la viscosidad ni
se produciría una interferencia en la formación del gluten.
Alternativa biotecnológica para desarrollar propiedades
fisicomecánicas del papel: aplicación de celulasas
Cadena, E.M.a, Chiriac, I.A.b, Vidal, T.a, Colom, J.F.a, Pastor, F.I.J.b, Díaz, P.b, Torres, A.L.a
a
Universidad Politécnica de Cataluña, Departamento de Ingeniería Textil y Papelera, Colom 11, 08222,
Terrassa.; bUniversidad de Barcelona, Dpto de Microbiología, Diagonal 645, 08028, Barcelona.
E-mail: [email protected]

En los procesos papeleros el refinado es una operación fundamental, su principal objetivo es preparar
las fibras para alcanzar propiedades de resistencia deseables en el papel fabricado; esta operación
modifica la morfología de las fibras eliminando parcialmente las paredes primaria y secundaria externa
provocando una rotura de enlaces de hidrógeno intrafibra, acortamiento de la fibra, formación de finos,
fibrilación interna y externa, aumento sensible de la superficie y volumen específico (incremento de los
puntos de contacto en la formación del papel) entre otros efectos que favorecen el incremento en las
propiedades fisicomecánicas del papel. El consumo energético requerido por los equipos de refinado
implica elevados costos de operación, estudios realizados en este campo se enfocan a minimizar el
consumo energético con la aplicación de alternativas biotecnológicas (enzimas) para incrementar los
mecanismos de cohesión entre las fibras en la formación del papel e intervenir como coadyuvantes en la
operación de refinado de pastas al actuar como biocatalizadores altamente eficientes y específicos para
determinadas reacciones químicas implicando degradación o transformación en los componentes
celulósicos a determinadas condiciones de operación.

La modificación de los constituyentes de la madera y fibras por el uso de enzimas del tipo “celulasas”
origina un elevado interés, investigaciones reportan la posibilidad de modificar las paredes celulares de
las fibras celulósicas y revelan un incremento en la respuesta al refinado de pastas mejorando el drenaje y
propiedades de resistencia del papel, permitiendo mayor productividad y ahorros en la energía de
refinado. Sin embargo existe controversia sobre sus efectos tras el refinado mecánico, para algunos
autores la aplicación de endoglucanasas producen un deterioro de las propiedades del papel y pasta, de
esta forma se desconoce la verdadera acción de las enzimas como coadyuvante del refinado. En este
trabajo se busca verificar y determinar los efectos de esta enzima con la aplicación de celulasas Cel9B de
Paenibacillus s.p. BP-23, la relevancia de esta investigación radica en la utilización de celulasas
modificadas, y así contribuir a identificar las características moleculares de las celulasas que inciden en su
aplicabilidad a las fibras celulósicas al igual que variables operatorias que afecten el tratamiento
enzimático.

En pastas kraft (Eucalyptus globulus) con secuencias de blanqueo ECF y TCF se aplican celulasas
(Cel9B) del tipo B-1,4-endoglucanasa de Paenibacillus barcinonensis, caracterizadas a partir del clon
recombinante Escherichia coli/pC7, se evalúa una dosis de 2500 IU/kg p.s, a una consistencia del 10%;
posteriormente al tratamiento enzimático se realizan refinados en un molino PFI. La caracterización de las
pastas y papeles con tratamiento enzimático revelan una modificación de la fibra que puede llevar a una
deslaminación de las capas externas o bien podríamos referirnos a un ablandamiento de la fibra, de esta
forma incrementaría la resistencia al desgote (mayor ºSR) y favorecería la accesibilidad del agua a las
capas internas de la fibra (%IRA -%WRV-); la acción de Cel9B sobre las propiedades del papel se
manifiestan acelerando el desarrollo de algunas propiedades como el índice de estallido, tracción, plegado
y en permeabilidad Bendtsen, en la que se obtienen incrementos de hasta de un 75% con respecto a la
pasta inicial. Los resultados son promisorios, las pastas tratadas requieren menos energía mecánica que
las refinadas convencionalmente. Así la respuesta positiva causada por Cel9B puede considerarse como
un biorefinado.

Agradecimientos

Ministerio de Educación y Ciencia: Proyecto CTQ2004- 07560-C02-01/PPQ “Estudio y optimización de

nuevos procesos de refinado y blanqueo de pastas de papel reciclado aplicando métodos biotecnológicos.
Programa AlBan “Becas de alto nivel de la Unión Europea para América Latina”. Código AlBan
E04D036666CO.
 Diseño de un bioreactor para degradar hidrocarburos
alifáticos clorados mediante el hongo Trametes
versicolor
Gloria Caminal1, Montserrat Sarrà2, Teresa Vicent, Marcel Vilaplana2
1
Unitat de Biocatàlisis Aplicada associada al IIQAB (CSIC-UAB), EQ, ETSE, UAB, 08193 Cerdanyola
del Vallès (Barcelona), 2Departament d’Enginyeria Química (EQ) i Institut de Ciència i Tecnologia
Ambiental (ICTA), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 08193 Cerdanyola del Vallès,
(Barcelona).
[email protected]

El tricloroetileno (TCE) se clasifica dentro del grupo de los hidrocarburos alifáticos clorados (CAH’s). Es
un compuesto líquido, no inflamable a temperatura ambiente, tóxico, con una solubilidad muy baja en
agua y una alta volatilidad. Sus principales usos son como solvente para limpieza en seco y para limpieza
de metales.

Este compuesto es un contaminante que se encuentra en una gran cantidad de suelos y acuíferos en todo
el mundo y por ejemplo, figuraba en el puesto dieciséis de la Comprehensive Environmental Response,
Compensation, and Liability Act (CERCLA) del año 2005, la cual engloba las principales sustancias
tóxicas y contaminantes existentes.

La degradación biológica es una de las posibilidades parar tratar este compuesto. Dentro de los
tratamientos biológicos, la degradación anaerobia es la más estudiada y su mecanismo de degradación se
conoce como decloración reductiva, obteniéndose etileno como producto final, el cual es un compuesto
poco contaminante. El principal problema de este tipo de degradación es que se puede producir una
acumulación de los productos intermedios de degradación, cis-dicloroetileno o cloruro de vinilo, si las
condiciones de degradación no son óptimas. En cambio, la degradación aerobia se encuentra muy poca
referenciada.

Nuestro grupo de investigación ha demostrado la capacidad del hongo de podredura blanca Trametes
versicolor para degradar de forma aerobia este contaminante. Los productos finales de degradación del
TCE son cloral, CO2 e iones cloruro.

El principal objetivo de este trabajo es el diseño de un bioreactor trifásico para degradar TCE mediante el
hongo Trametes versicolor en forma de pellets. Para conseguir este objetivo es necesaria cierta
información previa, como son las ecuaciones de equilibrio entre las tres fases, la cinética de degradación
del contaminante, el consumo de nutrientes por parte del hongo, incluyendo el consumo de oxígeno, y las
restricciones del sistema.

La distribución de TCE entre la fase sólida i la fase líquida se encontró experimentalmente y la ecuación
se ajusta a la isoterma de Freundlich; por otro lado, la distribución del contaminante entre la fase líquida y
la fase gas se obtuvo de la bibliografía. Los valores de degradación experimental obtenidos a diferentes
concentraciones iniciales de TCE se ajustaron a una pseudo-cinética de Michaelis-Menten y se cuantificó
el consumo de nutrientes por parte del hongo.

Teniendo en cuenta las características del proceso de degradación, el bioreactor seleccionado debe ser
totalmente hermético i debe operar en régimen discontinuo. Las restricciones del sistema y toda la
información obtenida se han integrado dentro de un grupo de ecuaciones que permiten analizar la
influencia de los parámetros de diseño sobre los resultados estimados. Entre todos los parámetros del
sistema, es especialmente interesante el volumen de fase gas en el reactor, el cual debe ser pequeño para
minimizar la cantidad de contaminante en fase gas pero, a la vez, debe ser suficiente para contener la
cantidad de oxígeno necesaria para que los hongos lleven a cabo la degradación de TCE.
 Optimización de la eliminación de compuestos
recalcitrantes de baja solubilidad en agua en reactores
bifásicos
Gemma Eibes, M. Teresa Moreira, Gumersindo Feijoo, Juan M. Lema
Departamento de Ingeniería Química. Escuela Técnica Superior de Ingeniería. Universidad de Santiago
de Compostela. 15782 Santiago de Compostela
[email protected]

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son contaminantes ambientales procedentes

principalmente de la industria del procesado de carbón y de fuel así como de la pirólisis de compuestos
orgánicos. Estos compuestos se caracterizan por poseer una baja solubilidad en agua y una alta
hidrofobicidad, lo cual resulta en baja biodisponibilidad. Antraceno, un HAP tricíclico, se encuentra en
concentraciones elevadas en ambientes contaminados de hidrocarburos. Existen numerosos estudios sobre
la capacidad de los hongos de podredumbre blanca para degradar antraceno y ha sido directamente
relacionada con su sistema de degradación ligninolítico. Sin embargo, esta biodegradación está
generalmente limitada por la baja solubilidad del antraceno en medio acuoso. La adición de un disolvente
orgánico incrementa en gran medida la disponibilidad del contaminante. Los reactores bifásicos consisten
en un disolvente inmiscible que contiene el compuesto tóxico, mientras que en la fase acuosa se encuentra
el enzima y los demás substratos y cofactores necesarios para completar el ciclo catalítico. Este trabajo
trata de la degradación de antraceno en reactores bifásicos mediante el empleo de la peroxidasa versátil
(VP) de Bjerkandera adusta [1,2].

La selección del disolvente es un paso clave en la operación de reactores bifásicos. Se ha considerado

la utilización de varios disolventes incluyendo aceites minerales y vegetales, alcoholes, alcanos, cetonas y
ésteres debido a su alto punto de ebullición, bajo coste, mínima toxicidad y disponibilidad comercial. Con
el objetivo de evitar índices muy elevados de KSW se seleccionaron dos disolventes: aceite de silicona, log
KSW 3,7, y dodecano, con un valor intermedio 4,5. El segundo factor considerado en la selección del
disolvente es la interacción con la enzima. La inactivación de la enzima fue superior en medio con
dodecano, incluso a mayores áreas interfaciales que el aceite de silicona

La optimización del proceso de degradación se ha

realizado en un reactor de tanque agitado considerando
tanto los parámetros que afectan al ciclo catalítico de la
enzima (peróxido de hidrógeno, ácido orgánico) como
aquellos que mejoran la transferencia de materia
(velocidad de agitación, fracción de disolvente). En
condiciones óptimas se obtuvo una completa
degradación de 360 mg/L del antraceno presente en la
fase orgánica tras 56 h de operación. Asimismo se
evaluó la presencia de un tensioactivo, tanto en la
transferencia de materia como en la estabilidad
enzimática. Triton-X 100 dio lugar a coeficientes de
transferencia de materia superiores y mayor estabilidad
de la enzima.
Figura 1. Reactor bifásico de tanque agitado para la
eliminación de antraceno

Referencias

(1) Eibes, G.; Moreira, M.T.; Feijoo, G.; Daugulis, A.J.; Lema, J.M. Operation of a two-phase partitioning bioreactor
for the oxidation of anthracene by the enzyme manganese peroxidase. Chemosphere, 2007. 66,
(2) Eibes, G.; López, C.; Moreira, M.T.; Feijoo, G.; Lema, J.M. Strategies for the design and operation of enzymatic
reactors for the degradation of highly and poorly soluble recalcitrant compounds. Biocatalysis and Biotransformation,
2007, (en prensa)
Lista de participantes
Enriqueta Arias
Departamento Microbiología y Parasitología. Universidad de Alcalá Facultad
de Farmacia, Alcalá de Henares, 28871 Madrid
[email protected]

José María Barrasa

Departamento de Biología Vegetal. Universidad de Alcalá
28871 Alcalá de Henares (Madrid)
[email protected]

Edith Marleny Cadena Chamorro

Departamento Ingeniería Textil y Papelera. Universidad Politécnica de
Cataluña C/ Colom, 11. 08222 Terrassa. Barcelona
[email protected]

Gloria Caminal
Unitat de Biocatàlisis Aplicada associada al IIQAB (CSIC-UAB), EQ, ETSE,
UAB, 08193 Cerdanyola del Vallès. Barcelona
[email protected]

José Luis Copa Patiño

Departamento Microbiología y Parasitología. Universidad de Alcalá Facultad
de Farmacia, Alcalá de Henares, 28871 Madrid
[email protected]

Pilar Díaz
Departamento de Microbiología. Universidad de Barcelona. Av. Diagonal 645,
08028 Barcelona.
[email protected]

Margarita Díaz Martínez

Departamento de Microbiología y Genética. Instituto de Microbiología
Bioquímica CSIC/Universidad de Salamanca. Campus Miguel de Unamuno.
37007. Salamanca
[email protected]

Gumersindo Feijoo Costa

Departamento de Ingeniería Química. Facultad de Ciencias. Universidad de
Santiago de Compostela. Avda. Alfonso X el Sabio s/n. 27002 Lugo.
[email protected]

José Manuel Fernández Ábalos

Departamento de Microbiología y Genética. Instituto de Microbiología
Bioquímica CSIC/Universidad de Salamanca. Campus Miguel de Unamuno.
37007. Salamanca
[email protected]

Úrsula Fillat Latorre

Departamento Ingeniería Textil y Papelera. Universidad Politécnica de
Cataluña. C/ Colom, 11. 08222 Terrassa. Barcelona
[email protected]
Katiuska González Arzola
Departamento de Microbiología y Biología Celular, Universidad de La Laguna,
38206, Tenerife.
[email protected]

Aldo E. González Becerra

Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). Campus de la Ciudad
Universitaria. C/ Ramiro de Maeztu 9, E-28040 Madrid
[email protected]

Ana Gutiérrez Suárez

Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS, CSIC).
Reina Mercedes 10, Apartado 1052, 41080 Sevilla
[email protected]

Emma Keck
Instituto de Microbiología Bioquímica. CSIC/Universidad de Salamanca.
Campus Miguel de Unamuno. 37007. Salamanca
[email protected]

Angel T. Martínez
Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). Campus de la Ciudad
Universitaria. C/ Ramiro de Maeztu 9, E-28040 Madrid
[email protected]

María Jesús Martínez

Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). Campus de la Ciudad
Universitaria. C/ Ramiro de Maeztu 9, E-28040 Madrid
[email protected]

Mª Paz Martínez Alcázar

Facultad de. Farmacia. Universidad San Pablo-CEU. Urb. Montepríncipe.
28668 Boadilla del Monte (Madrid)
[email protected]

Ramiro Martínez Gutiérrez

Novozymes Spain. Doctor Velazquez 22, 28224 Pozuelo de Alarcón, Madrid
[email protected]

Diego Moldes Moreira

Departamento Ingeniería Textil y Papelera. Universidad Politécnica de
Cataluña. C/ Colom, 11. 08222 Terrassa. Barcelona
[email protected]

Fernando Publio Molina Heredia

Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla y CSIC.
Avda. Américo Vespucio nº49 CP41092 Sevilla
[email protected]
Mª Teresa Moreira Vilar
Ingeniería Química /USC. Escuela Técnica Superior de Ingeniería: C/Lope
Gómez de Marzoa s/n. 15782 Santiago de Compostela
[email protected]

Mª José Moreno Porta

Torras Papel
[email protected]

Ignacio Moreno Echanove

Plant Bioproducts, S.L.
[email protected]

José Muñoz Dorado

Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de
Granada. Avda. Fuentenueva s/n. 18071 Granada
[email protected]

Margarita Orejas
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos/Consejo Superior de
Investigaciones Científicas Apartado de correos 73, 46100-Burjassot
(Valencia).
[email protected]

Francisco Javier Pastor

Departamento de Microbiología. Universidad de Barcelona. Av. Diagonal 645,
08028 Barcelona.
[email protected]

Maria Isabel Pérez Leblic

Departamento Microbiología y Parasitología. Universidad de Alcalá Facultad
de Farmacia, Alcalá de Henares, 28871 Madrid
[email protected]

Pere Picart
Departamento de Microbiología. Universidad de Barcelona. Av. Diagonal 645,
08028 Barcelona.
[email protected]

Francisco Manuel Reyes Sosa

Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla y CSIC
Avda. Américo Vespucio nº49 CP41092 Sevilla
[email protected]

Manuel Rodríguez Monteagudo

Torras Papel
[email protected]

Elvira Romero
Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC). Campus de la Ciudad
Universitaria. C/ Ramiro de Maeztu 9, E-28040 Madrid
[email protected]
Javier Romero
Grupo Empresarial ENCE. Dirección de Desarrollo e Innovación. Marisma de
Lourizán s/n. 36153 Pontevedra.
[email protected]

Ramón I. Santamaría Sánchez

Instituto de Microbiología Bioquímica. CSIC/Universidad de Salamanca.
Campus Miguel de Unamuno. 37007. Salamanca
[email protected]

Juan Soliveri de Carranza

Departamento Microbiología y Parasitología. Universidad de Alcalá Facultad
de Farmacia, Alcalá de Henares, 28871 Madrid
[email protected]

Juan Antonio Tamayo

Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos/Consejo Superior de
Investigaciones Científicas Apartado de correos 73, 46100-Burjassot
(Valencia).
[email protected]

Teresa Vidal Lluciá

Departamento Ingeniería Textil y Papelera. Universidad Politécnica de
Cataluña. C/ Colom, 11. 08222 Terrassa. Barcelona
[email protected]

Marcel Vilaplana
Unitat de Biocatàlisis Aplicada associada al IIQAB (CSIC-UAB), EQ, ETSE,
UAB, 08193 Cerdanyola del Vallès. Barcelona
[email protected]