NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.

MÉTODO PARA LA
DETERMINACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.

Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.

JOSE MELJEM MOCTEZUMA, Director General de Control Sanitario de Bienes y Servicios, por acuerdo del
Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en los
artículos 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 38, fracción II, 47 de la Ley Federal
sobre Metrología y Normalización; 194 fracción I de la Ley General de Salud; 2o. fracción III, 34, 37, 40 y
demás aplicables del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades,
Establecimientos, Productos y Servicios; 8o. fracción IV y 13 fracción I del Reglamento Interior de la
Secretaría de Salud.

PREFACIO

En la elaboración de la presente norma participaron los siguientes organismos e instituciones:

SECRETARIA DE SALUD

Laboratorio Nacional de Salud Pública

Dirección General de Control Sanitario de Bienes y Servicios

SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA

Instituto Nacional de Pesca

SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y DESARROLLO RURAL

Comisión Nacional del Agua

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

INDUSTRIAS VINICOLAS PEDRO DOMECQ

JUGOS DEL VALLE, S.A. DE C.V.

LABORATORIO FERMI, S.A.

LABORATORIO ICCABI, S.A. DE C.V.

LECHE INDUSTRIALIZADA CONASUPO, S.A. DE C.V. LICONSA

SIGMA ALIMENTOS, S.A. DE C.V.

SOCIEDAD MEXICANA DE NORMALIZACION Y CERTIFICACION, S.C.

NORMEX
0. Introducción

Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos cuando se encuentran
presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias,
como en las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del método analítico utilizado para
su detección.

Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clínicas y los métodos empleados para estos
casos se adaptaron posteriormente para su detección en alimentos. Las modificaciones a los métodos
consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas
presentes en un alimento, debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.)
y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.

Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son
esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo,
aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación
serológica de los microorganismos.

1. Objetivo y campo de aplicación

1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece un método general para la determinación de Salmonella en
alimentos.

1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas
físicas y morales que requieran efectuar este método en productos nacionales y de importación para fines
oficiales.

2. Fundamento

La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste
de 5 pasos básicos:

2.1 Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que
permite restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica estable.

2.2 Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella e
inhibir otros organismos presentes en la muestra.

2.3 Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento
de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.

2.4 Identificación bioquímica, este paso permite la identificación génerica de los cultivos de Salmonella y la
eliminación de cultivos sospechosos falsos.

2.5 Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.
3. Referencias

Esta norma se complementa con la siguiente Norma Oficial Mexicana:

NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su

análisis microbiológico.*

4. Definiciones

Para fines de esta norma se entiende por:

4.1 Detección de Salmonella: determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos en una

masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con esta norma.

4.2 Salmonella: microorganismo patógeno perteneciente al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram negativo,
aerobio, no esporulado que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos y que presentan además las
características bioquímicas y serológicas descritas cuando los procedimientos se efectúan de acuerdo con
esta norma.

8. Procedimiento

8.1 Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella

Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de
muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se recomienda
una muestra de 25 g o más.

8.1.1 Procedimiento general para la preparación de muestras

Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min.
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca
y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o
ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.

8.2 Aislamiento de Salmonella

8.2.1 Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar
suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato
y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede
emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.

8.2.2 Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el

mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.
8.2.3 Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde
brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen,
agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).

Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.

Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.

8.2.4 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las
siguientes características:

Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las
colonias pueden aparecer completamente negras.

Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias
fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias
pueden aparecer completamente negras.

Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o sin
brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas
cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o
no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias
fermentadoras de la lactosa son rojas.

8.3 Identificación bioquímica

8.3.1 Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.

Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro
con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo.

Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC.

Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario retomar
más colonias.

8.3.2 Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las
colonias que den las siguientes reacciones:
8.3.2.1 Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en
la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación
de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la
punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.

8.3.2.2 Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la
lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar.
La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo
largo de la punción.

8.3.2.3 Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios
TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en 8.3.3.

8.3.3 Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos,
deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar
S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos
que muestren reacciones atípicas en ambos medios.

8.3.4 Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones
atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior
y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.

8.3.5 Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se
recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de
ambos medios de enriquecimiento.

8.3.6 Prueba de ureasa

8.3.6.1 Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar
el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a
35ºC.

8.3.6.2 Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de
cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en
baño de agua.

Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin
cambio de color del medio).

8.5 Pruebas bioquímicas complementarias

Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, realizar
las pruebas que se describen a continuación:

8.5.1 Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo
manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.
8.5.2 Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:

8.5.2.1 Agar citrato Simmons

Inocular por estría el tubo.

Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.

Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

8.5.2.2 Medio SIM

Inocular por punción.

Incubar 24 h a 35 ± 2ºC.

Movilidad.

Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.

Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.

Producción de ácido sulfihídrico.

Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.

Prueba negativa: ausencia de color negro.

Producción de indol

Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.

Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.

Prueba negativa: sin cambio de color.

8.5.2.3 Caldo RM-VP

Inocular un tubo con el medio.

Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.

8.5.2.3.1 Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h.

Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol.

Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%.

Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).

Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente.

Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.

Prueba negativa: sin cambio de color.

Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.

8.5.2.3.2 Prueba de rojo de metilo (RM)

Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.

Interpretar los resultados inmediatamente.

Prueba positiva: desarrollo de color rojo.

Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.

8.5.2.4 Caldo malonato

Inocular un tubo conteniendo el medio.

Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

Prueba positiva: desarrollo de color azul.

Prueba negativa: sin cambio de color.

8.5.2.5 Caldo manitol

Inocular un tubo conteniendo el medio.

Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.

Prueba negativa: sin cambio de color.

8.5.3 Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las bacterias
investigadas. Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para
las pruebas bioquímicas convencionales.