Manual Bioquimica 2016 PDF

PRACTICA 1
FOTOCOLORIMETRÍA Y CURVA DE CALIBRACIÓN
Objetivos
1. Analizar los principios básicos de la fotocolorimetría

2. Determinar el espectro de absorción de un compuesto coloreado
3. Seleccionar la longitud de onda óptima o de máxima absorción
4. Realizar la curva de calibración para una solución de albúmina
5. Calcular concentraciones desconocidas de muestras de proteínas
Aspectos Teóricos
La fotocolorimetría es un método que sirve para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el
curso de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática. La técnica consiste en medir la
intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solución coloreada de uno o varios compuestos. La
absorción máxima ocurre a una longitud de onda (λ) característica para cada compuesto y la intensidad de la
energía absorbida a esa longitud de onda, varía proporcionalmente con la concentración del compuesto en una
solución.
El método parece estar restringido a las sustancias coloreadas, sin embargo también se puede extender a los
compuestos incoloros, haciéndolos reaccionar con una especie que genere un producto coloreado.
Absorción de energía por sustancias coloreadas
Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiación electromagnética en la región visible del
espectro, es decir entre 400 y 800 nm (λ). El color que se observa es una combinación de las longitudes de
onda no absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.
Espectro electromagnético
Cuando una molécula absorbe radiación ultravioleta (U.V) o visible, lo que fundamentalmente ocurre es que se
excitan los electrones de valencia que ocupan orbitales moleculares sigma (σ) o simples, π (dobles y triples) y η
(electrones no enlazados). Al absorber un fotón de energía, el electrón puede ocupar un orbital superior
denominado “orbital antienlazante, (*)” generándose una de las siguientes transiciones:
Estas transiciones requieren diferente energía y por lo tanto diferente longitud de onda. Para una radiación, su
contenido energético es inversamente proporcional a su longitud de onda:
ΔE = hν = hc/λ
Donde: ΔE = cantidad de energía
ν = frecuencia de la radiación
h = constante de Planck
c = velocidad de la luz en el vacío
λ = longitud de onda de la radiación
Las transiciones señaladas, que son las que normalmente pueden ocurrir en los compuestos orgánicos, tienen
el siguiente orden de acuerdo con su energía o longitud de onda:
Se observa que la transición que ocurre más fácilmente (menor diferencia de energía) es la η - π*, y la que mas
difícilmente ocurre es la σ - σ*. Las transiciones σ - σ* son las que frecuentemente ocurren en compuestos
saturados y son poco útiles para fines analíticos debido a que requieren mucha energía. Las transiciones π - π*
son las características de los compuestos insaturados (alquenos, alquinos, cetonas, aldehídos, ácidos
carboxílicos, aromáticos), sobre todo cuando tienen dobles enlaces conjugados. Cuando esto ocurre, la
transición es más fácil (menos energía) y la longitud de onda va aumentando, hasta llegar a la región visible del
espectro (400 -800 nm), que es donde absorben las sustancias coloreadas.
Las transiciones η - σ* y η - π* ocurren en las moléculas que tienen pares de electrones libres y aunque son
relativamente poco energéticas, su probabilidad es baja; por ello son poco útiles en el campo analítico.
En los complejos e iones coloreados de los metales de transición (Co, Ni, Cu, Cr, Fe, Zn, etc.), los electrones de
los orbitales “d” de baja energía se promueven a orbitales “d” de alta energía cuando la molécula absorbe
radiación visible. Estas transiciones ocurren porque las moléculas que se acomplejan al ion metálico dividen a
los orbitales “d” del ion en dos grupos: de alta y baja energía.
Espectro de absorción
Para saber con precisión la energía (o la λ) de la transición (o transiciones) que ha ocurrido en una molécula
cuando se irradia con luz U.V. o visible, es necesario determinar para ella una gráfica que relacione la
intensidad de energía que se va absorbiendo a medida que se hace un barrido por la región del espectro que
nos interesa (U.V. o visible, o ambos). Esta gráfica se llama espectro de absorción, y a partir de ella se puede
deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energía, es decir, donde
ocurre la transición electrónica. El conocimiento de λ de máxima absorción facilita la detección de la sustancia
ya sea para determinar su concentración o para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético.
Energía absorbida y concentración (ley de Beer)

La intensidad de la energía absorbida por una especie depende del número de moléculas que sufren la
transición electrónica a la λ seleccionada, y ese número de moléculas depende a su vez de la concentración de
la especie y de la longitud de la celda que la contiene:
A α c x l donde: A = absorción (intensidad de la energía absorbida)

c = concentración de la muestra en mol/L
l = longitud de la celda en cm.
Esta expresión se vuelve una igualdad cuando se introduce una constante de proporcionalidad “ε”:
A = ε x c x l (ley de Beer-Lambert)
ε Se denomina coeficiente de extinción molar o absortividad molar, con unidades M-1cm-1. Es una constante
para cada especie que absorba energía en la región U.V.-visible, y su valor indica la probabilidad de que la
transición electrónica ocurra.
Aplicación de la ley de Beer-Lambert
La aplicación más importante de esta ley es la determinación de concentraciones desconocidas de soluciones

de sustancias que absorben en la región U.V.-visible. Como una primera aproximación y suponiendo
concentraciones cercanas a la de una muestra patrón, la ecuación de Beer-Lambert se puede usar para calcular
la concentración de una muestra problema (igual sustancia que el patrón), midiendo la absorbancia de la
muestra patrón (Apat.) y de la muestra problema (Aprob.). Si las condiciones de las dos mediciones son iguales
(temperatura, sustancia, aparato), se cumple que:
A/C = ε x l = constante
La expresión se puede aplicar tanto a la muestra patrón como a la muestra problema, así:
Apat/Cpat = Aprob/Cprob luego Cprob = Cpat x Aprob/Apat
Para determinaciones más precisas de concentraciones desconocidas y para minimizar al máximo las
desviaciones de la ley de Beer-Lambert, se acostumbra preparar una curva de calibración, a partir de una serie
de soluciones patrón, cuyas concentraciones sean próximas a las de las muestras problema. Tanto a las
soluciones patrón como a las muestras problema se les mide la absorbancia; con los datos de las soluciones
patrón se construye la curva de calibración (A vs. C). Las absorbancias de las muestras problema se llevan a la
curva y se deducen de ahí sus concentraciones.
Cuantificación de proteínas
La cuantificación de las proteínas se puede realizar por diversos métodos con base en algunas de sus
propiedades, como pueden ser los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas de los
grupos aromáticos, la reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, entre otras. En la
reacción de Biuret las sustancias que contengan dos o más enlaces peptídicos, interaccionan con sales de
cobre en soluciones alcalinas, formando un complejo púrpura-violeta, como muestra la siguiente figura.
Dicho complejo se cuantifica espectroscópicamente utilizando como base una curva patrón de proteína
(generalmente con albúmina)
H H
O
N N N
O O O
C C C
2 2+ 2+
Cu
+ Cu + 2 H2O
CH CH CH
R R R
N N N
O
Cadena peptídica H H
Complejo color violeta
Espectrofotómetros
Los espectrofotómetros permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias orgánicas. Estos
equipos fueron diseñados para medir directamente la intensidad de luz que es absorbida y/o transmitida por un
compuesto en una solución. A continuación se muestran los componentes básicos de estos equipos:
En el espectrofotómetro la luz de una fuente continua (lámpara de tungsteno para el visible y lámpara de
deuterio para el ultravioleta), pasa a través de un monocromador que selecciona una banda estrecha de
longitudes de onda del haz incidente. Las longitudes seleccionadas atraviesan la muestra contenida en una
cubeta de vidrio o cuarzo de espesor definido (l). Finalmente, se mide la potencia radiante de la luz que sale.
Materiales:
• Fotocolorímetro • Beaker
• Celdas del fotocolorímetro • Frasco lavador
• Tubos de ensayo grandes
Reactivos:
• Reactivo de Biuret • Muestras problema: caseína, suero

• Solución patrón de gelatina (C = 8 mg/mL) sanguíneo, gelatina (sin sabor) o
• Solución salina al 0.9% albumina
Sección Experimental
A- MANEJO DEL FOTOCOLORÍMETRO.

Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo las recomendaciones
anotadas a continuación:
a. Seleccione la longitud de onda.

b. Ajustar el cero en transmitancia.
c. Colocar la celda o tubo que contiene la solución blanco, la cual se prepara mezclando 2 mL de
reactivo de Biuret con 2 mL de agua destilada.
d. Ajustar el 100% de transmitancia.
e. Retirar el tubo que contiene la solución blanco.
f. Colocar el tubo que contiene la solución problema.
g. Leer la absorbancia o transmitancia.
B- DETERMINAR EL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE UN COMPUESTO.
a. Coloque la longitud de onda en el instrumento a 420 nm.
b. Preparar dos celdas o tubos con suficiente solución (aproximadamente hasta los ¾), utilizando en
una, agua destilada y en la otra una solución de albúmina coloreada con el reactivo de Biuret.
c. Observe que los tubos con las soluciones no tengan burbujas, límpielos externamente con un papel
o tela adecuada.
d. Calibre el instrumento siguiendo las recomendaciones anteriores.
e. Coloque el tubo con la solución problema y anote la absorbancia o transmitancia indicada en el

instrumento.
f. Repita los pasos anteriores pero aumentando la longitud de onda de 20 en 20 nm (continúe tomando
lecturas hasta alcanzar una longitud de onda de 620 nm).
g. Recoja los datos en la siguiente tabla:
λ (nm) Absorbancia λ (nm) Absorbancia

420 540
440 560
460 580
480 600
500 620
520
h. Dibuje una gráfica de absorbancia vs. longitud de onda. La curva obtenida corresponde al espectro
para la estructura del complejo proteínico formado por el reactivo de Biuret. Observe que se
presentará una longitud de onda en la cual habrá una mayor absorción. Esta longitud de onda debe
ser una constante, la cual será tenida en cuenta para posteriores análisis de albúmina.
C. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA SOLUCIONES DE ALBÚMINA
a. Rotule 9 tubos de ensayo y colóqueles las siguientes soluciones como se indica en la tabla siguiente:
TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8
Solución 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2
Patrón (mL)
Solución 0,5 1,0

Problema
Solución 2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,8 1,5 1,0
Salina
Absorbancia
Concentración
b. Agregue en cada tubo 4 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y deje en reposo durante 15 minutos.
c. Coloque en el fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia obtenida en la experiencia

sobre el espectro de absorción (numeral B), mida la absorbancia para cada uno de los tubos y anótelas
en la tabla anterior.
d. Calcule la concentración de proteína en cada uno de los tubos, aplicando la fórmula de dilución (C1 x V1
= C2 x V2) y tabule los resultados de la absorbancia y concentración.
e. Grafique los resultados absorbancia y concentración tabulados en d, la línea resultante corresponde a

la curva de calibración.
f. Del gráfico, determine la concentración de las muestras problema.
g. Calcule las concentraciones de las muestras problema utilizando la ecuación de Beer-Lambert y

compárelas con las obtenidas del gráfico.
Todos los desechos se adicionan a residuos con metales
Preguntas
1. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir?

2. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloreadas?
3. ¿Cuál es el objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas?
4.- ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante?
5. ¿Por qué no se le puede tomar un espectro de absorción a la albúmina sola?
6. ¿Por qué razón se eligió una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la curva de
absorción?
7. ¿Qué significado tiene la pendiente de la gráfica?
PRACTICA 2
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Objetivos
6. Separar en una muestra de suero sanguíneo, las globulinas de las proteínas totales.
7. Calcular la concentración de proteínas totales, globulinas y albúminas en una muestra de suero
sanguíneo.
Aspectos teóricos
Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en las células, constituyen el 50% o más de su
peso seco. Se encuentran en todas las partes de cada célula, ya que son fundamentales en todos los aspectos
de la estructura y función celular. Existen muchas clases de proteínas, cada una de ellas especializada en una
función biológica diferente, que van desde el transporte y almacenamiento de moléculas pequeñas hasta la
organización estructural de las células y los tejidos, pasando por la contracción muscular, la respuesta
inmunitaria, la coagulación de la sangre y la catálisis de cientos de reacciones metabólicas. Además la
información genética es expresada en su mayor parte por las proteínas. La estructura de las proteínas, así
como su relación con su función biológica y actividad constituyen problemas centrales de la bioquímica actual.
Clasificación de las proteínas
a. Según su composición
Las proteínas se clasifican en dos tipos importantes, de acuerdo con su composición. Las proteínas simples,
como la albúmina de suero sanguíneo, nada más producen aminoácidos cuando se hidrolizan; las proteínas
conjugadas, producen otros compuestos además de los aminoácidos como carbohidratos, grasas o ácidos
nucleicos. La porción no aminoácido de una proteína conjugada se denomina grupo prostético.
b. Según su forma tridimensional

Otra forma de clasificar las proteínas es en fibrosas o globulares, según su forma tridimensional. Las proteínas
fibrosas o filamentosas, por ejemplo las de colágeno y las de queratina, consisten en cadenas de
polipéptidos, arreglados lado a lado en largos filamentos. Debido a que estas proteínas son muy resistentes e
insolubles en agua, en la naturaleza sirven para construir materiales estructurales como tendones, pezuñas,
cuernos y músculos. Las proteínas globulares, en cambio suelen estar enrolladas en forma semiesférica y
compacta. Estas proteínas son por lo general solubles en agua y se mueven dentro de las células. La mayor
parte de los varios millares de enzimas conocidas son proteínas globulares. Otros ejemplos, son la insulina y la
hemoglobina.
c. Según su solubilidad
Según este parámetro, las proteínas reciben algunos de los siguientes nombres:
• Albúminas, cuando son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas diluidas.

• Globulinas, solubles en soluciones salinas diluidas pero poco solubles en agua. Se precipitan en
soluciones semisaturadas de sulfato de amonio.
• Prolaminas, solubles en etanol entre 70 y 80% e insolubles en agua.
• Histonas, solubles en soluciones salinas.
• Glutelinas, insolubles en agua, etanol y soluciones salinas, pero solubles en soluciones ácidas y
básicas diluidas.
Proteínas del suero sanguíneo

La sangre es el tejido líquido que circula dentro de los vasos sanguíneos, compuesto casi en la mitad de su
volumen por células como los glóbulos rojos o eritrocitos, glóbulos blancos o leucocitos, plaquetas y por el
plasma, que es la porción no celular y que es el líquido que mantiene a las células en suspensión.
Cuando la sangre se coagula, aparece un líquido remanente que se llama suero, y que se diferencia del plasma
porque ya no contiene los factores de coagulación como la proteína fibrinógeno.
Aunque el plasma sanguíneo contiene una compleja mezcla de sustancias solubilizadas, sus proteínas
representan el 75% de ellas, y una concentración que oscila entre 6 y 8 g por cada 100 mL de suero. Las
principales proteínas del suero sanguíneo son:
• Albúmina: con una concentración de 3 a 4.5 g por 100 mL de suero, es el mayor contribuyente a la
presión osmótica intravascular. Su función principal es la de transportar ácidos grasos y medicamentos.
Los ácidos grasos los llevan desde los adipocitos, donde se generan por hidrólisis de los
triacilgliceroles, hasta los tejidos que los requieren para su oxidación.
Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a las
infecciones. Es un conjunto heterogéneo de proteínas que a veces se designan como α, β y γ-globulinas
y alcanzan una concentración en la sangre entre 3 y 3.5 g por 100 mL.
Métodos para aislar y purificas proteínas
Con el fin de preparar extractos proteínicos a partir del complejo medio celular, se han desarrollado técnicas
que se fundamentan en las diferencias que presentan ellas en su tamaño, su carga, su masa, su solubilidad y
su afinidad por otras moléculas. Estás técnicas son: la centrifugación, la electroforesis, la cromatografía, la
diálisis, ultrafijación y diferencias en la solubilidad en diferentes medios.
En esta práctica se pretende usar las técnicas de centrifugación y fotocolorimetría para separar y cuantificar la
concentración de albúmina y globulinas en el suero sanguíneo, respectivamente. El empleo del reactivo de
Biuret en soluciones con concentraciones diferentes de proteínas, permitirá la medida de la absorbancia para
cada concentración. La determinación precisa de éstas se podrá deducir del dato de absorbancia tomado a una
solución patrón de proteína (con concentración conocida) de la siguiente manera:
Cprob = Cpat x Aprob/Apat
Donde: Apat. Y Cpat. = son la absorbancia y concentración de la solución patrón, respectivamente.

Aprob. Y Cprob. = son la absorbancia y la concentración de la muestra problema, respectivamente.
Materiales:
• Tubos de ensayo grandes • Centrífuga
Reactivos:
• Solución acuosa de NaCl al 0.9% • Solución de biuret
• Solución saturada de (NH4)2SO4 (750 gr en 1 L • Muestra de suero sanguíneo
de agua) humano
• Solución patrón de albúmina o gelatina (0.45 gr
en 100 mL de solución salina)
A. Separación de las globulinas del suero.
a. Coloque en un tubo de centrífuga 1 mL de suero sanguíneo y 4 mL de agua destilada.
b. Agregue a la solución anterior 5 mL de solución saturada de sulfato de amonio, gota a gota y agitando
suave pero constantemente.
c. Deje reposar durante 15 minutos la solución obtenida en b. Luego centrifugue a 2000 r.p.m, por espacio
de 15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas.
d. Separe el líquido sobrenadante de las globulinas y disuelva este precipitado en 5 mL de una solución
salina. Conserve esta solución para determinar el porcentaje de globulinas.
B. Preparación de la solución de proteínas totales.
e. Mida 1 mL de suero sanguíneo en una probeta y dilúyalo hasta completar 20 mL agregándole solución
salina.
C. Medición de la absorbancia en las soluciones que contienen proteínas.
f. Disponga de 4 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones, como se indica en la
siguiente tabla:
TUBOS BLANCO (mL) PATRÓN (mL) GLOBULINAS PROTEÍNAS ABSORBANCIA

(mL) TOTALES (mL)
Solución salina 1,0

Solución 1,0
patrón
Solución de 1,0
globulinas
Suero diluido 1,0
1:20
Solución de 4,0 4,0 4,0 4,0
Biuret
g. Agite cada tubo y déjelo reposar 30 minutos.
h. Lleve cada uno de los tubos al fotocolorímetro, fijado en una longitud de onda (λ ) de 540 nm. Luego de
una previa calibración con el blanco, anote los resultados de absorbancia registrados en el instrumento.
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos con metales1
1
Los residuos de suero sanguíneo se depositan en un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio
Resultados
a. Dilución del patrón:

Calcule la concentración final de la solución patrón de proteínas aplicando la fórmula:
Cf = CiVi/Vf
b. Concentración de proteínas totales en el suero:

Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón con las de proteínas totales y calcule el
porcentaje de estas últimas:
(%) sln patrón x Absorbancia (proteínas totales)

(%) proteínas totales =
Absorbancia (sln patrón)
Sin embargo, esta concentración corresponde a 1 mL de solución de suero sanguíneo, el cual fue diluido
primero 20 veces y luego 5 veces de manera que el resultado final debe ser:
20 x 5 x (%) proteínas totales
c. Concentración de las globulinas:

Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón y de albúmina obtenida con el porcentaje de
la solución patrón y calcule el porcentaje de la solución de globulinas:
(%) sln patrón x Absorbancia (sln globulinas)

(%) globulinas =
Absorbancia (sln patrón)
Sin embargo esta concentración corresponde a la solución de globulinas preparada según la tabla 5-1, la cual
fue obtenida por dilución 1:5:5. En esta forma la solución original del suero sanguíneo debe tener una
concentración 25 veces mayor, o sea:
5 x (%) sln globulinas x5
La dilución con Debido a la dilución

5 mL de solución 1.0 + 4.0 según la tabla
salina
d. Concentración de albúmina de suero:

El porcentaje de albúmina se determina restando de las proteínas totales el resultado de las globulinas:
(%) Albúmina = % Proteína Total - % Globulinas
Preguntas
1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albúmina, con los reportados como normales
para el suero. ¿Existen diferencias? ¿Por qué?
2. Consulte la función de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el procedimiento de

separación de globulinas.
PRACTICA 3
TIROSINASA I: Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimática
Objetivos
8. Extraer el enzima tirosinasa de diferentes fuentes (banano, manzana, papa).

9. Determinar la actividad de la tirosinasa utilizando como sustrato el L-DOPA.
10. Comparar los resultados de actividad de la tirosinasa a diferentes concentraciones y de diferentes
fuentes.
11. Determinar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática.
12. Deducir el pH óptimo en el cual actúa la enzima tirosinasa.
Aspectos teóricos
Catálisis enzimática.
Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan las velocidades de las reacciones bioquímicas. Estas
son altamente específicas, esto significa que una enzima solo actúa en determinadas moléculas, denominadas
sustratos mientras dejan el resto del sistema sin afectar. Se ha calculado que una célula viva puede contener en
promedio alrededor de 3000 enzimas diferentes, cada una de las cuales cataliza una reacción específica en la
que un sustrato se convierte en los productos adecuados. La catálisis enzimática es homogénea porque el
sustrato y la enzima están presentes en disolución acuosa.
Una enzima es, básicamente una proteína, que contiene uno o más sitios activos, donde se llevan a cabo las
interacciones con los sustratos; aunque se ha descubierto actividad catalítica en algunos ARN, a los cuales se
les denomina ribozimas. Estos sitios, en forma estructural, son complementarios de las moléculas de un
sustrato específico, como se muestra en la siguiente figura:
Pardeamiento enzimático
La coloración café oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas y vegetales cuando se cortan,
se denomina pardeamiento, y se debe a la acción de la enzima tirosinasa, que es una monofenoloxidasa, sobre
el aminoácido tirosina, que en presencia de oxígeno, lo va convirtiendo secuencialmente en dopa, dopaquinona
y dopacromo (café oscuro), hasta que termina en un pigmento muy oscuro llamado melanina.
COOH HO COOH O COOH
Tirosinasa Tirosinasa
O2 NH2 O2 NH2
NH2
HO HO O
DOPA Dopaquinona
Tirosina
N O
O CO2 O
COOH
O
O N N
O
O H Dopacromo H
O N
H
Melanina
En esta práctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes vegetales (banano, manzana y
papa), y ponerla en contacto con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el compuesto L-
metildopacromo, que es de color café oscuro; la concentración de éste se puede seguir
fotocolorimétricamente a una λ de 420 nm, que es donde presenta su máxima absorbancia.
CH3 O
Tirosinasa CH3
HO COOH
COOH
O2
O N
NH2
HO
L-metildopacromo H
L-metildopa (incolora) (café oscuro)
La medida de la absorbancia a través del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reacción en
términos de la cantidad de L-metildopacromo que se va formando, o la de L-metildopa que va reaccionando:
ΔAbsorb./Δt = velocidad = + d [L-matildopacromo]/dt = - d[L-metildopa]/dt
Obtención del extracto enzimático

Se conoce como extracto enzimático a una fracción de material animal, vegetal o microbiano, que contiene
una mezcla de varias sustancias pero que se caracteriza por presentar actividad de una o varias enzimas
La preparación general de un extracto enzimático se inicia con la adición al material seleccionado una
solución amortiguadora, que garantice la conservación de la actividad de la enzima objeto de la extracción.
Luego, se tritura en un mortero, se filtra y centrifuga para separar los residuos poco solubles.
Medida de la actividad enzimática

Las velocidades de varias reacciones enzimáticas se pueden usar para comparar la eficiencia de las
enzimas involucradas cuando se expresan en términos de la cantidad usada de éstas. Ello significa que:
Actividad Enzimática = Velocidad de la reacción/Cantidad de enzima
Si se conoce con precisión la concentración molar de la enzima usada, la expresión anterior se llamará
actividad molar de la enzima:
Actividad molar = Veloc./[E] = d[S]/dt x [E] = ηsustrato/ηenzima x t
Donde η son moles
Este valor representa las moles de soluto que es capaz de transformar en producto un mol de enzima por
unidad de tiempo. Esto recibe el nombre de actividad molar de la enzima.
Si no se conocen las cantidades exactas de las enzimas empleadas, se puede usar como factor de
comparación el volumen de los extractos enzimáticos preparados en condiciones similares; no se podrá
hablar de actividad molar, sino simplemente de actividad enzimática:
Actividad enzimática = νreacción/vol. extracto enzimático
= d[s]/dt x mLextracto = Δ[s]sustrato/mLextracto x Δt
De donde Δ[s]sustrato/Δt se puede determinar indirectamente de la pendiente de un gráfico de Absorbancia

vs tiempo, ya que la concentración de sustrato está relacionada con la absorbancia mediante la ecuación de
Beer-Lambert.
Variables que afectan la actividad enzimática

Las enzimas son macromoléculas proteínicas cuya actividad catalizadora se ve influenciada por varios factores:
concentración del sustrato y de la enzima, la ausencia o presencia de cofactores, inhibidores y efectores, el
aumento o disminución de la temperatura y las variaciones del pH.
Para visualizar las mejores condiciones que garanticen el óptimo funcionamiento de una enzima, se tendrá que
proceder a la evaluación de su actividad catalítica, ya sea midiendo la velocidad inicial de la reacción enzimática
en función de uno de los parámetros mencionados anteriormente, o determinando la presencia o ausencia de
un sustrato o de un producto de la reacción, a medida que se varía uno de los parámetros.
Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción

La evaluación del efecto de la concentración de la enzima se hizo en la región de la curva hiperbólica de Vi vs
[S], donde la cinética es de orden cero con respecto al sustrato. Ahí, la enzima se encuentra completamente
saturada y habrá sustrato en exceso. Al adicionar más cantidad de enzima, se encontró un aumento lineal en la
velocidad de reacción, proporcional a la cantidad de enzima agregada.
Efecto del pH sobre la actividad enzimática

La mayoría de las enzimas poseen un pH característico al cual su actividad es máxima; por encima o por debajo
de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en función del pH de muchas
enzimas son acampanados, pueden cambiar considerablemente de forma, como se muestra en la figura
siguiente:
Del gráfico podemos observar que existe un pH (o un rango de pHs) en el cual la actividad de la enzima es
máxima:
• Para la tripsina, que hidroliza péptidos en el intestino, el pH óptimo está alrededor de 8.

• Para las colinesterasas, que se encuentran principalmente en la sangre y en el hígado y catalizan la
hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina, trabajan en un rango de pH entre 7.5 y 10.
• Para la pepsina, que funciona en el estómago, el pH óptimo estará cercano a 2.5.
• La papaína, que es una peptidasa aislada de la papaya, trabaja bien en un rango de pH entre 5 y 9.
La relación entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende principalmente del comportamiento ácido-
base de la enzima y del sustrato. La forma de la curva de actividad-pH varía con la concentración del sustrato,
ya que el valor de KM de muchas enzimas varía con el pH. Las mencionadas curvas son mucho más
significativas si la enzima se mantiene saturada con el sustrato en todos los valores de pH a los que se
experimenta. En muchos estudios de cinética enzimática, el pH se mantiene constante al pH óptimo.
El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual

puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de su curva de pH-actividad. Este hecho
sugiere que la relación pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su
actividad.
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
Al igual que ocurre con la mayoría de reacciones químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas se incrementa en general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y
permanece totalmente activa. La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica, aproximadamente,
por cada 10 ºC de aumento de la temperatura.
Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura óptima,
como muestra la figura siguiente, el pico que se observa al representar la actividad catalítica frente a la
temperatura se produce porque las enzimas, al ser proteínas, se desnaturalizan por la acción del calor y se
inactivan cuando la elevación de la temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura óptima es,
por lo tanto, la resultante de dos procesos:
• El incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura, y,

• El incremento en la velocidad de desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar una temperatura
crítica.
Aunque la mayoría de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60 ºC, algunas de ellas
son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores; por ejemplo, las enzimas
de diversas especies de bacterias termofílicas que habitan en las termas de agua siguen siendo activas a
temperaturas superiores a los 85 ºC.
Materiales:
• Fotocolorímetro • Baño de hielo

• Celdas del fotocolorímetro • Beaker
• Tubos de ensayo grandes • Frasco lavador
• Mortero • Centrífuga
• Silica gel • Lienzo
• Baño maría • Tubos de ensayo grande
• Baño de agua hirviendo • Pipeta
Reactivos:
• Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 4.0, 5.0, 7.2, • Fuente de tirosinasa (banano,
7.5. manzana y papa)
• Solución buffer 0.1 M de borato pH= 8.0, 9.0 y • Hielo picado
10.0
• Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH = 7.2
Nota: esta práctica está dividida en cuatro partes, se recomienda que la parte A y B la realice todo el grupo, y la
C y D se distribuya en dos equipos y al final se compartan los resultados.
A. Extracción de la enzima
a. Coloque 10 g de la fruta en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M

(pH=7,2).
b. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.
c. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.
d. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.
e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solución
como extracto diluido 10 veces. El extracto de manzana no se diluye. Rotule esta solución como
extracto enzimático.
B. Medida de la actividad enzimática
a. En un tubo de ensayo prepare una solución blanco mezclando:
• 1 mL del extracto enzimático

• 3 mL de buffer pH = 7.2
• 1 mL de agua destilada.
b. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a λ = 420 nm.
c. Mezcle en otro tubo de ensayo:
• 1 mL de extracto enzimático
• 3 mL de buffer pH = 7.2
• 1 mL de solución de L-metildopa
d. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el fotocolorímetro y

lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.
e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 30 segundos durante 5 minutos.
f. Repita los pasos c hasta e en otros 3 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de solución de
extracto enzimático de la siguiente manera:
• Adicione a cada tubo, respectivamente, 1.5, 2.0 y 2.5 mL de extracto.

• Complete cada tubo hasta 4 mL con buffer pH = 7.2
• Agregue a cada tubo, a penas vaya a leer en el fotocolorímetro, 1 mL de la solución de L-
metildopa.
g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:
Tiempo (min)/Tubo 1 2 3 4
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
C. Medida de la actividad enzimática con cambio de la temperatura
a. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de extracto de enzima y 3.0 mL de solución de buffer pH = 7.2
b. Introduzca el tubo en un baño maría a 37 oC durante 5 minutos
c. Cuando el tubo se haya enfriado, agréguele 1 mL de L-metildopa, agite y mida la absorbancia igual que
en el caso anterior.
d. Tabule los resultados en la siguiente tabla:
Tiempo (min) Absorbancia 4 oC Absorbancia 37 oC Absorbancia 95 oC

0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
e. Repita el procedimiento anterior pero utilice primero un baño de hielo y después en un baño de agua
hirviendo a 95 oC. Tabule sus resultados en la tabla anterior.
D. Efecto del pH sobre la actividad de enzimática:
a. Marque 12 tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos lo que muestra la siguiente tabla:
Tubo B1 A1 B2 A2 B3 A3 B4 A4 B5 A5
Buffer pH 4.0 3 2
Buffer pH 5.0 3 2
Buffer pH 8.0 3 2
Buffer pH 9.0 3 2
Buffer pH 10.0 3 2
Extracto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
L-metildopa - 1 - 1 - 1 - 1 - 1
b. Mida el pH resultante en cada uno de los tubos
c. Incube los tubos 5 minutos en un baño a 37-40 oC.
d. Adicione a los tubos A1 y B1 1 mL de L-metildopa y agite.
e. Calibre el fotocolorímetro con la solución B1 a λ = 420 nm
f. Lea la absorbancia de la solución A1 y anótela
g. Repita los pasos b hasta f para los otros tubos
h. Tabule los resultados en la siguiente tabla:
Tiempo (min)/Tubo A1 A2 A3 A4
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos no halogenados
Resultados
a. Con los resultados de las dos tablas, haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos,
calcule las pendientes de las curvas y multiplique estos valores por los factores de dilución así:
• Tubo 1: m1 x 10/1.0 = A.E1

• Tubo 2: m2 x 10/1.5 = A.E2
• Tubo 3: m3 x 10/2.0 = A.E3
• Tubo 4: m4 x 10/2.5 = A.E4
Donde m es la pendiente de la curva y A.E es la actividad enzimática. La actividad enzimática con variación de
la temperatura y del pH se calcula igual que el tubo 3.
Absorvancia
A2
A2 - A 1
m=
t2 - t1
A1
t1 t2 tiempo
b. Analice la actividad enzimática de los tubos 1-4, ¿cual es la explicación?

c. Analice la actividad enzimática del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio de la temperatura
(haga el grafico de actividad enzimática vs temperatura) ¿cuál es la explicación?
d. Analice la actividad enzimática del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio del pH (haga el
grafico actividad enzimática vs pH) ¿cuál es la explicación
e. Compare sus resultados con los resultados obtenidos para otra fruta
Preguntas
1. Cuando se trabaja con manzana el extracto no es recomendable diluirlo ¿Por qué?
2. ¿Cuál es la función de la tirosinasa en los animales superiores?
3. De acuerdo con los resultados obtenidos en la práctica, ¿Cuál es la interpretación y explicación que se le da
a la fruta o frutas que tienen una mayor concentración de tirosinasa?
4. ¿Qué se podrá recomendar (y que no se podrá recomendar), para evitar el pardeamiento de las frutas y las
papas cortadas?
Referencia
Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education,
54, 4, 1977, p: 257.
PRACTICA 4
TIROSINASA II: Determinación de la constante Michaelis-Menten y la velocidad máxima
Objetivos
13. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentración del sustrato (L-metildopa).

14. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el método de la curva hiperbólica de Michaelis–
Menten y la ecuación de los inversos o de Lineweaver–Burk.
Aspectos teóricos
Cinética química
La cinética química es el estudio de las velocidades de las reacciones químicas y de los factores que influyen
en ella. La velocidad de la reacción es una medida de la rapidez con que se forman los productos a partir de los
reactantes.
Las reacciones químicas pueden clasificarse sobre una base cinética por el orden de reacción, entre estas
tenemos: reacciones de orden cero, de primer orden, de segundo orden y de tercer orden, según como resulte
influida la velocidad de la reacción por la concentración de los reaccionantes bajo un conjunto de condiciones
determinado como son la temperatura y la adición de catalizadores.
Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad directamente proporcional a la
concentración de un reaccionante. El ejemplo más sencillo es cuando la velocidad de la reacción:
A B
es directamente proporcional a la concentración de A. En este caso la velocidad de la reacción en cualquier
tiempo t, viene dada por la ecuación:
-d [A] / dt = k [A]
en donde [A] es la concentración molar de A y -d [A] / dt es la velocidad a que disminuye la concentración de A.

La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad, la cual, tiene dimensiones del
recíproco del tiempo, s-1. La forma integrada de esta ecuación es:
[A0] kt
ln [A] = (- k) (t) + ln [A]0 ó log =
[A] 2.303
y = m x + b
donde ln es el logaritmo natural, [A]0 y [A] son las concentraciones de A a los tiempos t = 0 y t = t,
respectivamente. Debe aclararse que t = 0 no corresponde al principio del experimento; puede seleccionarse
cualquier tiempo para empezar a medir el cambio en la concentración de A. Por lo tanto, una gráfica de ln [A]
contra t es una línea recta con una pendiente –k. Este análisis gráfico permite calcular la constante de velocidad
k, como se muestra en la figura siguiente:
Para una reacción de primer orden, el tiempo de vida media viene dado por la siguiente expresión:
t ½ = 0.693 / k
la anterior ecuación indica que la vida media de una reacción de primer orden es independiente de la
concentración inicial del reactivo.
Una reacción de segundo orden es una reacción cuya velocidad depende de la concentración de uno de los
reactivos, elevada a la segunda potencia o de la concentración de dos reactivos diferentes, cada uno elevado a
la primera potencia. El caso mas sencillo comprende solo una clase de molécula como reactivo:
2A C
la ecuación de velocidad de segundo orden es:
- d [A] / dt = k [A]2
La constante de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen unidades de 1/ M x s. Por medio del
cálculo, se puede obtener la siguiente expresión para la ecuación anterior:
1 1
= + kt
[A] [A]0
por lo tanto, una gráfica de 1/[A] contra t, es una línea recta con una pendiente k:
Otro tipo de reacción de segundo orden es:
A + B C
donde la ley de velocidad esta dada por:
- d [A] / dt , - d [B] / dt ó d [C] / dt
velocidad = k [A] [B]
la reacción es de primer orden respecto de A y de primer orden respecto de B, por lo que tiene un orden global
de 2.
El tiempo de vida media viene dado por: t ½ = 1 / k [A]0
Observe que la vida media de una reacción de segundo orden es inversamente proporcional a la concentración
inicial del reactivo. Las mediciones de la vida media a diferentes concentraciones iniciales es una forma de
distinguir entre una reacción de primer orden y una de segundo orden.
Las reacciones de tercer orden, que son relativamente escasas, son aquellas cuya velocidad es proporcional al
producto de tres términos de concentración. Algunas reacciones químicas son independientes de la
concentración de cualquier reactivo; son llamadas reacciones de orden cero. En este caso, la velocidad
depende de la concentración del catalizador o de algún otro factor distinto a la concentración de las especies
moleculares que experimentan la reacción.
Cinética enzimática: Ecuación de Michaelis-Menten

Los principios generales de la cinética química de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones
catalizadas por las enzimas, pero éstas muestran también un rasgo característico, que no se observa en las
reacciones no enzimáticas: la saturación con el sustrato. En la figura siguiente vemos el efecto de la
concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima.
A una concentración baja de sustrato, la velocidad inicial de la reacción νo es casi proporcional a la
concentración del sustrato y la reacción, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo.
Sin embargo, a medida que la concentración de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reacción disminuye
y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentración de sustrato; en esta zona el orden de reacción
es mixto.
Con un aumento posterior de la concentración del sustrato, la velocidad de la reacción llega a ser
esencialmente independiente de la concentración de sustrato y se aproxima asintóticamente a una velocidad
constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con
respecto al sustrato, y se dice que la enzima se halla saturada con su sustrato. Todas las enzimas muestran el
efecto de saturación pero varían ampliamente con respecto a la concentración de sustrato que se necesita para
que se manifieste.
El efecto de saturación condujo a algunos investigadores a formular la hipótesis de que la enzima y el sustrato
reaccionan reversiblemente para formar un complejo, como etapa esencial en la reacción catalizada.
L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron una teoría general acerca de la acción y cinética de las enzimas. Esta
teoría que es fundamental para el análisis cualitativo de todos los aspectos de la cinética de las enzimas y de la
inhibición, se ha desarrollado para el caso sencillo de una reacción en la que sólo hay un sustrato.
La teoría de Michaelis-Menten supone que la enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para
formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuación este último se divide en una segunda etapa, para formar
la enzima libre y el producto P:
k+1
E + S ES
k-1
k+2
ES E + P
k-2
La ecuación de Michaelis-Menten es la ecuación de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas
que sólo actúan sobre un sustrato, y se formula como sigue:
vo = Vmax [S]
KM + [S]
De donde: νo = velocidad inicial

Vmax = velocidad máxima
[S] = concentración del sustrato
KM = constante de Michaelis-Menten
De la ecuación de Michaelis-Menten se deriva una relación numérica en el caso especial en que la

velocidad inicial de la reacción sea exactamente la mitad de la velocidad máxima; es decir, cuando ν0 = ½
Vmax (ver figura anterior) KM = [S].
La constante de Michaelis-Menten de una enzima constituye una característica útil e importante, que es
fundamental no sólo para la descripción matemática de la cinética enzimática, sino también para la
determinación cuantitativa de la actividad enzimática en los tejidos y el análisis de algunos mecanismos de
regulación enzimática.
Transformaciones de la ecuación de Michaelis-Menten

La ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son más útiles
para la expresión de los datos experimentales. Una de las transformaciones más corrientes se obtiene
tomando los recíprocos de ambos miembros de la ecuación de Michaelis-Menten:
1 KM 1
= + 1
v0 Vmáx [S] Vmáx
La ecuación anterior es la ecuación de Lineweaver-Burk. Cuando 1/ν0 se representa frente a 1/ [S], se

obtiene una línea recta. La pendiente de la recta es KM/Vmáx, y la intersección sobre el eje 1/ν0 es 1/Vmáx; la
intersección sobre el eje 1/ [S] es -1/KM, como muestra la figura siguiente:
Tal representación doble recíproca tiene la ventaja de que permite una determinación mucho más exacta
del valor de Vmáx, ya que en la representación sencilla de ν0 frente a [S] sólo se obtiene su valor
aproximado.
Otra transformación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene al multiplicar esta por Vmáx, y de un
posterior reagrupamiento se obtiene la siguiente ecuación:
v0 = -KM v0
+ Vmáx
[S]
La representación de ν0 frente a ν0/ [S], llamada representación de Eadie-Hofstee, da los valores de Vmáx y
de KM de una forma sencilla, como muestra la figura siguiente:
Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad anzimática
Esta relación para un sustrato, fue estudiada por los señores Michaelis y Menten, quienes al medir la velocidad
inicial (Vi) en numerosos experimentos donde se mantenía constante la concentración de la enzima y se iba
aumentando la concentración del sustrato, encontraron que:
• A bajas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reacción dependía proporcionalmente de este,

siguiendo una cinética de primer orden: Vi = K [S]; lo que significa que como aún la cantidad de enzima
presente no ha sido totalmente saturada por el sustrato, a medida que éste aumenta, la enzima actúa
sobre él, y la velocidad de la reacción se va incrementado.
• A altas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reacción era independiente de su concentración,

siguiendo una cinética de orden 0: Vi = VM. Ello indica que en condiciones de altas concentración del
sustrato, la enzima se halla saturada por éste, y la reacción ya ha llegado a su máxima velocidad (VM).
Al adicionar más sustrato, la velocidad no aumenta porque no hay enzima disponible para ello.
Gráficamente, la relación hallada entre la velocidad de la reacción y la concentración del sustrato fue de tipo
hiperbólico, como describiendo una transición desde la cinética de primer orden hasta la cinética de orden cero:
Materiales:
• Mortero • Lienzo
• Silica gel
Reactivos:
• Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2 • Fuente de tirosinasa (banano,

• Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0 manzana y papa)
• Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH = • Hielo picado
6.0
Sección experimental
A. Extracción de la enzima
f. Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M

(pH=7,2).
g. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.
h. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.
i. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.
j. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solución
como extracto diluido 10 veces.
B. Medida de la actividad enzimática
a. Prepare una solución blanco mezclando:
• 1.0 mL del extracto enzimático

• 3.0 mL de buffer pH = 6.0
• 1 mL de agua destilada.
b. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a λ = 420 nm.
c. Mezcle en otro tubo de ensayo:
• 1.0 mL de extracto de enzima

• 0.5 mL de solución de L-metildopa
d. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el fotocolorímetro y

e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 30 segundos durante 5 minutos.
f. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la
siguiente manera:
• Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimático.

• Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolorímetro, 1.0, 1.5, 2.0,
2.5 y 3.0 mL de la solución de L-metildopa.
g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:
t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Todos los desechos se adicionan a residuos organicos no halogenados
Resultados
b. Con los resultados obtenidos, haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y
de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial
(Vi), para cada concentración de sustrato [S].
c. Calcule la nueva concentración de sustrato aplicando la fórmula general de dilución:
[S]f = v1 [S]i
v2
Donde: [S]f = concentración final del sustrato
[S]i = concentración inicial del sustrato (0.03M)
v2 = volumen final de la solución (5 mL)
v1 = volumen adicionado de sustrato
d. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:
Tubo [S]f Vi 1/[S] 1/Vi

1
2
3
4
5
6
e. Haga una gráfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/ [S] y de estas determine los valores de KM y Vmax.
f. Compare los valores obtenidos por ambos métodos y determine cual es el más apropiado,
explique.
Referencia
Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical
Education, 54, 4, 1977, p: 257.
PRACTICA 5
TIROSINASA III: Efecto de un inhibidor sobre la constante Michaelis-Menten y la velocidad máxima
Objetivos
15. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentración del sustrato (L-metildopa) en

presencia de NaCN como inhibidor.
16. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el método de la curva hiperbólica de Michaelis–
Menten y la ecuación de los inversos o de Lineweaver–Burk en presencia de un inhibidor.
17. Determinar el tipo del inhibidor y su constante.
Aspectos teóricos
Inhibición de las enzimas

Las enzimas catalizan todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores
enzimáticos se encuentren entre los agentes farmacéuticos más importantes. Por ejemplo, la aspirina (ácido
acetilsalicílico) inhibe la enzima que cataliza el primer paso de la síntesis de prostaglandinas.
El estudio de los inhibidores enzimáticos ha proporcionado información sobre mecanismos enzimáticos y ha

ayudado a definir algunas rutas metabólicas. Hay dos amplias clases de inhibidores enzimáticos: reversibles e
irreversibles.
Un tipo de inhibición reversible común es la que se denomina competitiva, como muestra la siguiente figura:
Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima pero la reacción no tiene lugar
cuando se ha fijado el inhibidor (I). Mientras el inhibidor ocupa el sitio activo impide la fijación del sustrato. Los
inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen al sustrato y que se combinan con la
enzima formando el complejo EI. Debido a que el inhibidor se una de manera reversible a la enzima, se puede
cambiar el sentido de la competición a favor del sustrato añadiendo más de éste.
Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor por lo que la
reacción muestra una Vmáx normal. No obstante, la [S] a la cual Vo = ½ Vmáx, la KM, aumenta en presencia del
inhibidor. Este efecto sobre la Vmáx es diagnóstico de inhibición competitiva, y se pone de manifiesto fácilmente
en una gráfica de Lineweaver–Burk. La constante de equilibrio para la fijación del inhibidor, KI, puede obtenerse
a partir de la misma gráfica.
La inhibición competitiva se utiliza en terapéutica para pacientes que han ingerido metanol, un componente del
los licores adulterados y disolvente que se utiliza como anticongelante. El metanol se convierte en formaldehído
por acción de la enzima alcohol deshidrogenada. El formaldehído lesiona muchos tejidos, siendo la ceguera un
resultado frecuente debido a que los ojos son especialmente sensibles al mismo. El etanol compite de manera
efectiva con el metanol como sustrato de la alcohol deshidrogenada. La terapia para el envenenamiento por
metanol es la infusión intravenosa de etanol, la cual hace que la formación de formaldehído sea suficientemente
lenta para que la mayor parte del metanol se pueda excretar inocuamente por la orina.
Otros dos tipos de inhibición reversible, la no competitiva y la acompetitiva, que a menudo se definen aplicados
a enzimas con un solo sustrato pero que en la práctica sólo se observan con enzimas que actúan con dos o
más sustratos.
Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato, como se muestra en la
siguiente figura:
La fijación del inhibidor no bloquea la fijación del sustrato (y viceversa). La enzima se inactiva cuando está fijado
el inhibidor tanto si el sustrato está presente como si no lo está. El inhibidor disminuye de manera efectiva la
concentración de la enzima activa por lo que decrece la Vmáx. Frecuentemente el efecto sobre KM es nulo
En la inhibición no competitiva, representaciones similares de los datos de velocidad dan la familia de líneas
que se muestran en la figura siguiente, que tienen una intersección común en el eje de 1/ [S]. Esto indica que
KM para el sustrato no es alterada por el inhibidor no competitivo mientras que Vmáx disminuye.
En la inhibición acompetitiva el inhibidor no se combina con la enzima libre ni afecta su reacción con el sustrato
normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo ES para formar un complejo inactivo enzima-
sustrato-inhibidor, el cual no experimenta su transformación posterior en el producto habitual de la reacción:
Lo característico de la inhibición acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece constante al

aumentar la concentración del inhibidor, pero la Vmax decrece.
Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con un grupo de la enzima que es esencial para su
actividad o lo destruyen. Es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible y una
enzima.
En la siguiente tabla se resumen los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de Lineweaver-Burk,
1/V0 frente a 1/ [S].
Materiales:
• Mortero • Lienzo
• Sílica gel
Sustancias:
• Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2 • Fuente de tirosinasa (banano,

• Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0 manzana y papa)
• Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH = • Hielo picado
6.0 • Solución de NaCN 0.1M
Sección experimental
Extracción de la enzima
k. Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M

(pH=7,2).
l. Adicione unos 3 gramos de sílica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.
m. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.
n. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.
o. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solución
como extracto diluido 10 veces.
Medida de la actividad enzimática
p. Prepare una solución blanco mezclando:

• 1.0 mL del extracto enzimático
• 4 gotas (0.2 mL) de solución de NaCN
• 0.5 mL de agua destilada.
q. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a λ = 420 nm.
r. Mezcle en otro tubo de ensayo:
• 1.0 mL de extracto de enzima

• 4 gotas de solución de NaCN
• 0.5 mL de solución de L-metildopa
s. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el fotocolorímetro y

t. Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 30 segundos durante 5 minutos.
u. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la
siguiente manera:
• Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimático.

• 4 gotas de solución de NaCN
• Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolorímetro, 1.0, 1.5, 2.0,
2.5 y 3.0 mL de la solución de L-metildopa.
v. Tabule los resultados en la siguiente tabla:
t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos no halogenados
Resultados
g. Con los resultados obtenidos, haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y
de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial
(Vi), para cada concentración de sustrato [S].
h. Calcule la nueva concentración de sustrato aplicando la fórmula general de dilución:
[S]f = v1 [S]i
v2
Donde: [S]f = concentración final del sustrato

[S]i = concentración inicial del sustrato (0.03M)
v2 = volumen final de la solución (5 mL)
v1 = volumen adicionado de sustrato
i. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:
Tubo [S]f Vi 1/[S] 1/Vi

1
2
3
4
5
6
j. Haga una gráfica de Vi vs [S] y de 1/Vi vs 1/[S] y de estas determine los valores de KM y Vmax.
k. Compare los valores obtenidos por ambos métodos y con los obtenidos en ausencia de
inhibidor (sesión anterior); determine el tipo de inhibidor.
l. Calcule el valor de KI dependiendo del tipo de inhibidor, utilizando las ecuaciones

correspondientes (ver gráficos y tabla en la parte teórica).
Referencia
Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education,
54, 4, 1977, p: 257.
PRACTICA 6
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS
Objetivo
Determinar la actividad de las proteasas al hidrolizar una solución de proteínas
Aspectos teóricos
Las proteínas son hidrolizadas en presencia de enzimas proteolíticas o proteasas, las cuales actúan sobre los
enlaces peptídicos. Esta hidrólisis puede ocurrir en diferentes sitios de la proteína; cuando ocurre en las
posiciones terminales, las proteasas se denominan exopeptidasas (aminopeptidasas o carboxipeptidasas) y
endopeptidasas cuando la hidrólisis se realiza en las posiciones internas, como se muestra la siguiente figura:
R1 O R3 O R5
H H
N N OH
H2N N N
H H
O R2 O R4 O
Endopeptidasas
Aminopeptidasa Carboxipeptidasa
H2O/Proteasas
O R3 O R5
R1
OH + H2N OH
OH + H2N
H2N OH + H2N OH + H2N
R2 O R4 O
O
Las endopeptidasas son específicas a la clase de aminoácido implicado en el enlace peptídico. Entre las
endopeptidasas más comunes se destacan: la tripsina, la pepsina, la quimiotripsina y la termolisina (ver figura).
Escisión Específica de Cadenas Polipeptídicas
H H H R2
N C C N C C
R1 O H O
Aminoácido 1 Aminoácido 2
Método Enlaces Péptidicos escindidos
Tripsina Aminoácido 1 = lisina o arginina

Quimotripsina Aminoácido 1 = fenilalanina, triptófano o tirosina
Pepsina Aminoácido 1 = fenilalanina, triptófano, tirosina y otros
Termolisina Aminoácido 2 = leucina, isoleucina o valina
Bromuro de Aminoácido 1 = metionina
cianógeno
La tripsina es una enzima digestiva secretada por el páncreas al intestino delgado, en forma de su precursor, el
tripsinógeno. La tripsina es muy específica, sólo cataliza la hidrólisis de aquellos enlaces peptídicos en que la
función carbonilo es aportada por el resto de lisina o por el de arginina, con independencia de la longitud o la
secuencia de aminoácidos de la cadena.
La termolisina, que es una proteasa bacteriana termoestable, puede hidrolizar enlaces peptídicos en los que la
función amino es aportada por los aminoácidos no polares, leucina, isoleucina y valina. Es especialmente útil
para la hidrólisis parcial de polipéptidos que no contienen arginina o lisina y son, por lo tanto, resistentes al
ataque por la tripsina.
La cuantificación de los aminoácidos liberados se realiza neutralizando previamente los grupos alfa amino libres
por adición de formaldehído, como se indica en la siguiente figura:
H C H
CH2OH
O
H2N CH C OH + H C H HOH2C HN CH C OH HOH2C N CH C OH
R O O R O R O
N-monometilol N,N-dimetilol
H 2C N CH C OH
R O
N-metileno
Los grupos carboxilo se valoran cuantitativamente utilizando NaOH 0.05N
Materiales:
• Erlenmeyers • Soporte universal

• Bureta • Pinza y nuez
• Baño maría
Reactivos:
• Solución de proteína (gelatina 5%) • Fenolftaleína al 1%

• Solución de pancreatina al 0.5% en buffer de • Solución concentrada de
borato pH = 8.4 formaldehído
• Solución de NaOH 0.05N
a. Mida 25 mL de solución de proteína y colóquelos en un erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL de la

solución de pancreatina (tomar este tiempo como tiempo cero, t0) y ponga la mezcla en un baño maría
a 37ºC.
b. Transfiera 5 mL de la mezcla anterior a un erlenmeyer y caliente hasta ebullición. Esperar 2 minutos y

enfriarla.
c. Adicione 7.5 mL de solución de formaldehído y 3 gotas de fenolftaleína.
d. Titule esta solución con NaOH 0.05N hasta obtener un color rosa pálido permanente. Anote el volumen
utilizado.
e. A partir del tiempo cero contar 15, 30, 45 y 60 minutos y medir en cada intervalo 5 mL de la mezcla
original y repetir el procedimiento descrito en los numerales (b), (c) y (d).
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos

Dispóngalos por el desague
Resultados y preguntas
a. Grafique los equivalente-gramo de NaOH utilizados vs tiempo. La pendiente de esta gráfica

corresponde a la actividad en equivalentes de aminoácidos hidrolizados por minuto y por mL de
solución proteica.
b. Compare el resultado obtenido con el dato reportado (400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima
que cataliza la transformación de 1µmol de sustrato/minute, en condiciones estándar 25 oC y pH optimo.
c. ¿Cuál(es) es (son) la (s) proteasa (s) contenidas en la pancreatina? ¿Cuales enlaces peptídicos son
hidrolizados?
d. ¿Qué otros enlaces peptídicos puede hidrolizar la pepsina fuera de aquellos que contienen los
aminoácidos de Phe, Trp y Tyr?
PRÁCTICA 7
ACCIÓN CATALITICA DE LA LIPASA PANCREÁTICA
Objetivos
18. Determinar la actividad enzimática de la lipasa pancreática al catalizar por hidrólisis una muestra de
triacilglicérido.
19. Analizar el efecto activador del ion calcio (Ca2+), sobre la lipasa.
Aspectos teóricos
La lipasa es una enzima específica para los ésteres en la posición α del glicerol y prefiere ácidos grasos de
cadena larga con más de 10 átomos de carbono. La acción catalítica de la lipasa pancreática tiene lugar en la
interfase agua-lípido de las partículas emulsionadas ó micelas. La presencia de los ácidos biliares que si bien
constituyen a la formación de las micelas, presentan una fuerte inhibición sobre la enzima, la cual es superada
por la adición de una proteína que forma un complejo estabilizador con la lipasa. Esta proteína es denominada
colipasa. La hidrólisis de los triacilglicéridos por acción de la lipasa, se presenta a continuación:
HO C R1
O +
O CH2 O C R1 O CH2 OH
R2 C O CH O + 2 H2 O R2 C O CH
Lipasa
CH2 O C R3 CH2 OH
+
HO C R3
Los factores que afectan la velocidad de hidrólisis son:
a. El pH: Generalmente las lipasas actúan a pH alcalino.

b. La temperatura: La temperatura de acción más efectiva está entre los 30 y 40ºC.
c. Activadores: El ion calcio (Ca2+) aumenta la estabilidad de la lipasa y produce sales de calcio, las cuales
precipitan e impulsan la reacción en sentido directo. Los cloruros (Cl-) y los bromuros (Br-) también
actúan como activadores.
d. Inhibidores: Algunos aniones entre ellos el nitrato (NO3-), el fluoruro (F-) y agentes oxidantes como el
agua oxigenada (H2O2) actúan como inhibidores de la lipasa.
Materiales:
• Tubos de ensayo • Soporte universal

• Bureta • Pinza y nuez
• Erlenmeyers • Baño maría
Sustancias:
• Buffer de borato (pH = 8.4) • Solución de hidróxido de sodio

• Aceite vegetal (NaOH) 0.02N
• Solución enzimática (utilizando 2 pastillas de • Solución de CaCl2 10%
creoflat)2 • Fenolftaleína
2
La solución enzimática se prepara macerando 2 pastillas de pancreoflat, que no contengan sales biliares, en 50 mL de buffer a pH = 8.4 y
conserve la solución en baño Maria a 37ºC
a. Solución blanco: adicione a un tubo de ensayo grande los siguientes componentes:
• 10 mL de agua
• 5 gotas de aceite
• 5 mL de solución enzimática
Caliente el tubo de ensayo por 1 minuto en agua a ebullición, deje enfriar, transvase el contenido a un
erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftaleína y titule con NaOH 0.02N hasta obtener un color rosado
pálido.
b. Disponga de 6 tubos de ensayo y prepare en cada uno las siguientes soluciones como se indican en la
tabla siguiente:
Tubo Aceite Sln. CaCl2 (mL) H2O (mL) Fenolftaleína

(gotas) (gotas)
1 5 - 10 3
2 5 - 10 3
3 5 - 10 3
4 5 0.5 9.5 3
5 5 0.5 9.5 3
6 5 0.5 9.5 3
c. Adicione, gota a gota, NaOH 0.02N a cada uno de los tubos hasta obtener un color rosado pálido igual
al blanco.
d. Coloque los tubos en un baño de agua a 37ºC y adicione 5 mL de solución enzimática a cada uno.
Anote el tiempo de inicio de la reacción.
e. Transcurridos los primeros 15 minutos, caliente los tubos 1 y 4 en agua hirviendo durante un minuto.
Dejelos enfriar, trasváselos a un erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftaleína a cada uno y titule con
NaOH 0.02N. Anote los mL de NaOH utilizados.
f. Transcurridos 30 minutos, efectúe con los tubos 2 y 5, el mismo procedimiento anterior.
g. Transcurridos 45 minutos, efectúa con los tubos 3 y 6, el mismo procedimiento descrito en (e).
Los residuos obtenidos no son considerados

peligrosos dispóngalos por el desagüe
Resultados
m. Con los resultados obtenidos calcule los equivalentes-gramo de NaOH consumidos de la
siguiente manera:
Eq-gNaOH = 0.02 (V – Vb)
Donde: V = volumen gastado de NaOH en cada titulación

Vb = volumen gastado de NaOH en la titulación del blanco
n. Tabule los resultados obtenidos en el numeral anterior y el tiempo registrado en la tabla

siguiente:
Tubo Eq-gNaOH Tiempo (min)

1 15
2 30
3 45
4 15
5 30
6 45
o. Haga una gráfica de Eq-gNaOH vs tiempo para los tubos sin ion calcio, Ca2+ (tubos: 1, 2 y 3) y
para los tubos con ion calcio (tubos: 4, 5 y 6).
p. Calcule la actividad (la pendiente de la curva) en Eq-g/min de ácidos graso hidrolizados.
q. Compare las actividades sin ion calcio, con ion calcio y con el dato reportado*.
* Actividad enzimática de la proteasa: 400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima que

cataliza la transformación de 1µmol de sustrato/minute, en condiciones estándar 25 oC y pH
óptimo.
PRÁCTICA 8
GLICÓLISIS ANAEROBIA (FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA)
Objetivos
20. Determinar las diferentes velocidades en la fermentación de mono, di y polisacáridos.

21. Determinar el efecto de la concentración en el proceso de fermentación.
22. Comprobar la inhibición de la ruta metabólica ocasionada por el NaF.
Aspectos teóricos
El metabolismo: Es el conjunto de reacciones y procesos físico-químicos que ocurren en una célula. Estos
procesos complejos interrelacionados son la base de la vida a nivel molecular, y permiten las diversas
actividades de las células: crecer, reproducirse, mantener sus estructuras, responder a estímulos, etc.
El metabolismo se divide en dos procesos conjugados: catabolismo y anabolismo. Las reacciones catabólicas
liberan energía; un ejemplo es la glucólisis, un proceso de degradación de compuestos como la glucosa, cuya
reacción resulta en la liberación de la energía retenida en sus enlaces químicos. Las reacciones anabólicas, en
cambio, utilizan esta energía liberada para recomponer enlaces químicos y construir componentes de las
células como lo son las proteínas y los ácidos nucleicos. El catabolismo y el anabolismo son procesos
acoplados que hacen al metabolismo en conjunto, puesto que cada uno depende del otro
La glucolisis: Es la vía metabólica encargada de oxidar la glucosa y así obtener energía para la célula. Ésta
consiste de 10 reacciones enzimáticas que convierten a la glucosa en dos moléculas de piruvato, la cual es
capaz de seguir otras vías metabólicas y así continuar entregando energía al organismo.
En la glucólisis, se metaboliza la glucosa en la parte fluida del citoplasma en dos moléculas de piruvato y se
generan dos moléculas netas de ATP de ganancia. Durante este proceso, se activa la molécula de glucosa por
adición de fosfatos provenientes de dos moléculas de ATP para formar bisfostato de fructosa. Este compuesto
se descompone, mediante una serie de reacciones, en dos moléculas de piruvato. Estas reacciones producen
cuatro moléculas de ATP y dos transportadores de electrones, N ADH. Debido a que se consumieron dos ATP
en las etapas de activación, el rendimiento neto de la glucólisis es de dos ATP y dos NADH. La glucólisis,
además de proporcionar un pequeño rendimiento de ATP, consume NAD+ para producir NADH. Una vez, que la
provisión de NAD+ de la célula se ha consumido, la glucólisis se detiene.
La reacción global de la glucólisis es:

+
Glucosa + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi 2 Piruvato + 2NADH + 2ATP + 2H + 2H2O
Los productos de esta reacción, mostrados arriba, son utilizados por la célula en muchas funciones:
• El ATP (Adenosín trifosfato) es la fuente de energía universal de la célula.
• NADH y H+, otorgan la capacidad de reducir otros compuestos pertenecientes a otras vías metabólicas,
o bien para sintetizar ATP.
• El piruvato es la molécula que seguirá oxidandose en el ciclo de Krebs, como parte de la respiración
aeróbica, donde dará origen a más moléculas NADH, que podrán pasar a sintetizar ATP en la
mitocondria
La glucólisis se divide en dos partes principales y diez reacciones enzimáticas, las que se describen a
continuación.
1. La primera reacción de la glucólisis es la fosforilación de la glucosa, para activarla (aumentar su energía) y

así poder utilizarla en otros procesos cuando sea necesario. Esta activación ocurre por la transferencia de un
grupo fosfato del ATP, una reacción catalizada por la enzima hexoquinasa, la cual puede fosforilar (añadir un
grupo fosfato) a moléculas similares a la glucosa, como la fructosa y manosa.
CH2OH
C O
CH2OP
OH D3P
Glucoquinasa OP OP HO OP PO
O ATP ADP Fosfotriosa 5
HO Mg2+ O Fosfohexosa O ATP ADP 4 isomerasa
isomerasa Mg2+ O
HO HO OH OH
OH HO COH
Pi 1 OH 2 OH OH Aldolasa
Glucosa OH Pi 3
CHOH
Glucosa 6P OH HO Fructosa 6P Fosfofructoquinasa HO Fructosa 1-6P
CH2OP
GA3P
NAD
Glicesraldehido 6
3P-deshidrogenasa
Pi
NADH.H
COOH COOH COO-

ATP ADP COO- ATP ADP COOP
Enolasa Fosfoglicerato
C O mutasa Mg2+
COP CHOP CHOH CHOH
Piruvatoquinasa 9 8
CH3 Fosfogliceratoquinasa
10 CH2 CH2OH CH2OP CH2OP
7
ACIDO PEP 2PGlicerato 1-3PGlicerato
PIRUVICO 3PGlicerato
2. En esta reacción, la glucosa-6-fosfato se isomeriza a fructosa-6-fosfato, mediante la enzima fosfohexosa

isomerasa. La isomerización ocurre en una reacción de 4 pasos, que implica la apertura del anillo y un traspaso
de protones.
3. Fosforilación de la fructosa 6-fosfato en el carbono 1, con gasto de un ATP, a través de la enzima
fosfofructoquinasa-1 (PFK1). También este fosfato tendrá una baja energía de hidrólisis. Por el mismo motivo
que en la primera reacción, el proceso es irreversible. El nuevo producto se denominará fructosa-1,6-Bisfosfato.
4. La enzima aldolasa (Fructosa-1,6-bifosfato aldolasa), mediante una condensación aldólica reversible, rompe
la fructosa-1,6-bifosfato en dos moléculas de tres carbonos (triosas): dihidroxiacetona fosfato y Gliceraldehído-
3-fosfato.
5. Puesto que sólo el gliceraldehído-3-fosfato puede seguir los pasos restantes de la glucólisis, la otra molécula
generada por la reacción anterior (dihidroxiacetona-fosfato) es isomerizada (convertida) en gliceraldehído-3-
fosfato. Ésta reacción posee una energía libre en condiciones estandar positiva, lo cual implicaría un proceso no
favorecido, sin embargo al igual que para la reacción 4, considerando las concentraciones intracelulares reales
del reactante y el producto, se encuentra que la Energía Libre total es negativa, por lo que la dirección
favorecida es hacia la formación de G3P.
6. Se utiliza un fosfato inorgánico y una molécula de NAD+ para producir 1,3-bifosfoglicerato y una molécula de
NADH + H+. Esta reacción la cataliza la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa o GAP-deshidrogenasa. Llama
la atención que el fosfato se ha introducido sin utilizar ATP, sino aprovechando la energía producida por la
reacción redox. Ahora, el fosfato que se ha introducido tiene una alta energía por lo que se podrá transferir al
ATP. Esto se conoce como fosforilación a nivel de sustrato.
7. Se desfosforiliza el 1,3-bifosfoglicerato gracias a la fosfoglicerato quinasa, formándose una molécula de ATP
por cada una de 1,3-BPG y dando lugar al 3-fosfoglicerato.
8. Se isomeriza el 3-fosfoglicerato procedente de la reacción anterior dando 2-fosfoglicerato, la enzima que
cataliza esta reacción es la fosfoglicerato mutasa. Lo único que pasa aquí es el cambio de posición del fosfato
del C3 al C2. Son energías similares y por tanto reversibles, con una variación de energía libre cercana a cero.
9. La enzima enolasa propicia la formación de un doble enlace en el 2-fosfoglicerato, eliminando una molécula
de agua formada por el hidrógeno del C2 y el OH del C3. El resultado es el fosfoenolpiruvato.
10. Desfosforilación del fosfoenolpiruvato, obteniéndose piruvato y ATP. Reacción irreversible mediada por la
Piruvato quinasa.
Destino del piruvato

El piruvato formado en la glucólisis puede tomar tres rutas catabólicas alternativas como se muestra en la
siguiente figura:
En condiciones anaeróbicas el piruvato se convierte a dos moléculas de lactato (fermentación láctica que se
realiza en el músculo), y en condiciones aeróbicas el piruvato se convierte a dos moléculas de acetil-CoA que
luego ingresa al ciclo del ácido cítrico (realizado en la mitocondria) y se degrada a CO2 y H2O. Siguiendo esta
vía, donde el aceptor final es el oxígeno, se obtendrán 30 ó 32 ATP, los cuales serán usados por la célula como
fuente de energía para las funciones normales de la célula, como la proliferación, el crecimiento y metabolismo.
Por otro lado, el piruvato bajo condiciones anaeróbicas se convierte en etanol y dos moléculas de dióxido de
carbono, ruta conocida como fermentación alcohólica.
Fermentación alcohólica: glucólisis anaerobia

Es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de oxígeno, originado por la actividad de algunos
microorganismos, como las levaduras, que procesan los carbohidratos para obtener como productos finales:
etanol, dióxido de carbono y dos moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su
metabolismo celular energético anaeróbico. El proceso se muestra en la siguiente figura:
OH Piruvato Alcohol
descarboxilasa deshidrogenasa
O H
O O NADH + H+ NAD+
HO H+ CO2
Glucolisis CH3CH2OH
HO - O
O CH3
OH
Etanol
Acetaldehido
OH CH3
Glucosa Piruvato
Después de la formación del piruvato en la glucolisis, este se descarboxila (pierde CO2), convirtiéndose en
acetaldehído por acción del enzima piruvato descarboxilasa. El proceso se complementa con la reacción que
genera el etanol y el agente oxidante (NAD+), requerido por la levadura para continuar haciendo glucólisis y
disponer de ATP. Esta reacción es promovida por la enzima etanol deshidrogenada, distribuida en todos los
organismos.
Desde el punto de vista energético, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con la
respiración aerobia, ya que a partir de una molécula de glucosa sólo se obtienen 2 moléculas de ATP, mientras
que en la respiración se producen 38. Esto se debe a la oxidación del NADH, que en lugar de penetrar en la
cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgánicos con poco poder oxidante.
La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los
microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas de glucosa y
obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la
fermentación. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos muy habituales en
las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados.
El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza,
la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también etanol mediante la fermentación a
nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible.
Es necesario anotar que se denomina glucólisis al proceso que lleva desde la glucosa al piruvato, sin embargo,
en algunas reacciones intermedias de este proceso es posible el ingreso de otros monosacáridos diferentes a la
glucosa, como fructosa, manosa o galactosa, casos en los cuales se habla de glicólisis.
En la práctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual cierto tipo de levadura es
capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y polisacáridos), midiendo la cantidad de CO2 que se va
generando en el tiempo:
νreacción = d(cant. CO2)/dt
Materiales:
• Tubos de ensayo • Agujas de jeringa

• Beaker • Manguera con 0.35 cm de diámetro y
• Baño maría 3m de largo
• Regla • Solución coloreada (azul de metileno o
• Tapones violeta de genciana)
Sustancias:
• Levadura fresca al 5%3 • Almidón 1 %

• Glucosa 1% y 10% • NaF 0.1M
• Fructosa al 10% • Agua destilada
• Sacarosa al 10%
f. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensión de levadura y 2mL de solución de glucosa al 10%.
g. Tape el tubo de ensayo con un tapón de caucho, agite y atraviese el tapón con una aguja de jeringa
desechable.
h. Tome una manguera para fermentación, adiciónele 1mL de solución coloreada, colóquela a presión en
la boca de la aguja y fíjela a la mesa de trabajo con cinta. Tanto el tapón como la manguera deben
quedar bien herméticos de tal forma que no hayan fugas. Procure que la manguera quede lo mas lineal
posible.
i. Ponga el sistema en un beaker que contenga agua entre 37-40ºC. Tenga cuidado que la manguera no
quede en contacto con alguna superficie caliente y la solución coloreada no esté a más de 50 cm del
tubo.
j. Marque la manguera donde se encuentra la solución coloreada.
3
Esta solución se prepara en un buffer de acetato pH = 5.5
k. A penas comience a moverse la solución coloreada cuente dos minutos y vuelva a marcar la posición
donde se encuentra esta solución.
l. Siga marcando cada dos minutos durante doce minutos.
m. Desconecte la manguera y mida con una regla la distancia recorrida por la solución coloreada cada dos
minutos.
n. Repita los pasos (a) hasta (h) con: glucosa al 1%, fructosa al 10%, sacarosa al 10% y almidón al 1%.
o. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensión de levadura, 2mL de solución de glucosa al 10% y
1mL de agua destilada.
p. Repita los pasos (b) hasta (h)
q. Por último, coloque en un tubo de ensayo 5mL de suspensión de levadura, 2mL de solución de glucosa
al 10% y 1mL de la solución de NaF y repita los pasos (b) hasta (h).
r. Anote los datos en la siguiente tabla:
Carbohidrato Glucosa Glucosa 10% Glucosa 10% Fructosa Sacarosa Almidón

1% con NaF 10% 10% 1%
Tiempo (min) Longitud (cm)
2
4
6
8
10
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos

Dispóngalos por el desague
Resultados
e. Con los datos obtenidos en el numeral anterior calcule la velocidad de la reacción para cada
carbohidrato y complete la tabla.
Carbohidrato νreacción
Glucosa 1%
Glucosa 10%
Glucosa 10% con NaF
Fructosa 10%
Sacarosa 10%
Almidón 1%
Nota: el volumen de CO2 producido se calcula con la fórmula del volumen de un cilindro: V = πr2 h,
donde: r , es el radio de la manguera (0.17cm) y h es el promedio de las longitudes medidas (haga esta
operación con los valores que sean más homogéneos)
a. Escriba la reacción neta balanceada de la fermentación de cada uno de los carbohidratos.
b. Según las ecuaciones del numeral anterior, ¿Dónde ocurriría la mayor producción de CO2? ¿Está ello
de acuerdo con los datos obtenidos experimentalmente?
c. Según la experiencia cual es el orden de los carbohidratos según la rapidez en la fermentación? ¿Cómo
se podría justificar?
d. ¿Cómo interpretaría el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la fermentación?.
Preguntas
e. ¿En que consiste la fermentación láctica y glicérica? ¿En que diferencian de la fermentación etanólica?
f. El arsenato (AsO42-) es químicamente similar al fosfato inorgánico (PO42-) y algunas enzimas que
utilizan fosfato inorgánico pueden utilizar también el arsenato. La producción de ATP en la glucolisis es
inhibida por el arsenato. Identifique las enzimas que pueden ser afectadas.
g. Además de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis. ¿Cuáles son?
h. Enumere algunos inhibidores de la glicólisis

PRACTICA 9
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO SANGUÍNEO
Objetivos
1. Cuantificar el contenido de glucosa en suero sanguíneo

2. Comparar el resultado obtenido con los datos reportados y determinar el estado de salud del paciente
Aspectos Teóricos
Metabolismo de los glúcidos.

La digestión de los polisacáridos se inicia en la boca, en donde la amilasa de la saliva hidroliza el almidón para
dar dextrinas y maltosa. En el estómago, la amilasa de la saliva se inactiva por el pH. En el intestino, a pH más
alcalino, actúan las enzimas procedentes del páncreas como la amilasa pancreática. Finalmente, enzimas de la
mucosa intestinal concluyen la degradación (disacaridasas). Posteriormente los monosacáridos, principalmente
la glucosa, son absorbidos a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo y llevados al hígado por
medio de la circulación portal.
La glucosa es la principal fuente de energía en los seres vivos. Por tal razón es un metabolito fundamental en
los procesos biológicos. La glucosa tras su degradación por la vía glucolítica se obtiene una gran cantidad de
energía en forma de ATP. Alteraciones en el metabolismo de la glucosa conducen a estados de hipoglucemia o
hiperglucemia (diabetes) que producen unos trastornos clínicos que en algunos casos pueden resultar fatales.
La determinación del contenido de glucosa en el suero fisiológico es una prueba indicativa del estado de salud
del individuo y resulta necesaria en los casos de alteraciones metabólicas u hormonales (deficiencia en insulina,
glucagón, etc).
Alteraciones del metabolismo glucídico, la diabetes

Aunque las patologías relacionadas con alteraciones del metabolismo glucídico son muy diversas, vamos a
centrarnos en los trastornos en la regulación del nivel de la glucosa en sangre. Cuando la homeostasis de la
glucosa se rompe por disfunción de cualquier elemento que la mantiene, sobrevienen los síndromes hiper o
hipoglucémicos que, como su nombre indican, conllevan el aumento (>120 mg/dL en ayunas) o la disminución
(<45-50mg/dL) de la glucemia, respectivamente.
Diabetes mellitus
La diabetes mellitus es la causa más frecuente y grave de hiperglucemia. Es una metabolopatía crónica que
aparece como consecuencia de la deficiencia absoluta o relativa de insulina. En estas condiciones, la entrada
de glucosa en las células está disminuida y en consecuencia los niveles en sangre se mantienen elevados
(hiperglucemia). Esta deficiencia da lugar a una serie de complicaciones a largo plazo, lo que origina una gran
morbilidad y mortalidad.
Causas de la diabetes mellitus

La glucosa es un azúcar que proviene de los alimentos que comemos, circula por la sangre y es utilizada por el
organismo para obtener la energía necesaria para desarrollar cualquier tipo de trabajo. La causa de la diabetes
es una anomalía en la producción o el funcionamiento de la insulina por el páncreas.
La insulina es una hormona que fabrica el páncreas, cuya misión es facilitar el paso de los azúcares de la
sangre a las células. Cuando no hay insulina como en los diabéticos jóvenes (Tipo 1), o no funciona
correctamente, como ocurre en los adultos (Tipo 2), el azúcar no pasa de la sangre a los órganos y el
funcionamiento es deficiente. Al tiempo, el azúcar se acumula en la sangre en cantidades superiores a las
normales, apareciendo hiperglucemia. Cuando la glucosa en sangre es superior a 180 mg, el organismo no
puede retenerla, por lo que la elimina por la orina: Glucosuria. En un paciente mal controlado o no tratado
aparecerá hiperglucemia y glucosuria.
Clasificación: Actualmente la diabetes se clasifica en:

a. Diabetes tipo I (déficit total de insulina).
b. Diabetes tipo II (resistencia a la insulina o defecto secretor con resistencia a la insulina, los enfermos al
principio no requieren la administración de insulina).
c. Diabetes secundaria (enfermedades pancreáticas, tumores endocrinos, entre otros).
d. Diabetes gestacional (se detecta durante el embarazo).
¿Cómo se detecta la Diabetes?
El estudio de diabetes se realiza mediante la medición de la glucosa en sangre y en ayunas (glucemia basal) y
se recomienda en las siguientes circunstancias:
• En todos los individuos mayores de 45 años, y repetir cada 3 años mientras sea normal.
• En población más joven cuando existan factores de riesgo.
• Cuando aparezcan síntomas o signos que sugieran diabetes:
- Poliuria (orinar mucho).
- Polifagia (aumento del apetito).
- Polidipsia (beber mucho por sed).
- Pérdida de peso.
- Retinopatía.
- Proteinuria.
- Infecciones urinarias de repetición.
- Infecciones cutáneas de repetición,...
• Cuando el nivel de glucosa plasmática en ayunas está entre 110 y 125, hay que repetir la glucemia y si
persiste, realizar un test de Tolerancia Oral (75g de glucosa disuelta en 300ml de agua que se ha de tomar en
3-5 minutos).
• Pacientes con antecedentes de Hipertensión arterial o trastornos del colesterol.
Determinación de glucosa: para el diagnóstico de la diabetes es necesario determinar la glucemia, pero

¿cómo se cuantifica el nivel de glucosa en una muestra?, Los métodos para determinar la concentración de
glucosa se clasifican en dos grandes grupos:
a) Métodos basados en el poder reductor de los hidratos de carbono (reacción de Benedict, método de la o-
toluidina)
b) Métodos enzimáticos: son los más utilizados, utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa oxidasa,
hexoquinasa) a fin de aumentar la especificidad. Los dos métodos que vamos a citar se pueden utilizar para
determinar la glucosa en muestras de suero, orina y líquido cefalorraquídeo.
b.1.) Método de la hexoquinasa: Es el método de referencia y consiste en dos reacciones acopladas:
Hexoquinasa, Mg++
Glucosa + ATP G-6-PO4 + ADP
G-6-PD
G-6-PO4 + NADP+ 6-fosfogluconato + NADPH + H+
En la primera reacción (específica), catalizada por la enzima hexoquinasa, se fosforila la glucosa formándose
glucosa 6-fosfato. La glucosa 6-fosfato, en una reacción posterior (reacción indicadora), se transforma en 6-
fosfogluconato produciéndose NADPH (1 mol por cada molécula de glucosa). La producción de NADPH origina
un aumento de absorbancia a 340nm. El incremento de absorbancia a esta longitud de onda será directamente
proporcional a la concentración de glucosa.
b.2.) Método de la glucosa oxidasa: Al igual que el anterior consiste en dos reacciones acopladas:
glucosa oxidasa
Glucosa + O2 + H2O ácido glucónico + H2O2
peroxidasa
H2O2 + cromógeno reducido cromógeno oxidado + H2O
En la primera reacción (reacción específica), catalizada por la enzima glucosa oxidasa (GOD), se oxida la
glucosa y se genera H2O2. En la segunda reacción (reacción indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza
la descomposición del H2O2 lo que provoca oxidación de un cromógeno que pasa de su forma reducida
(incolora) a su forma oxidada (coloreada). La aparición del cromógeno oxidado se evalúa mediante un
espectrofotómetro y será directamente proporcional a la concentración de glucosa en la muestra. La 4-
aminoantipirina / fenol es uno de los cromógenos más utilizados, es oxidado por el agua oxigenada en un compuesto
de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm, con un pico de máxima absorbancia a 500 nm.
Glucosa + 1/2 O2 + H2O glucosa oxidasa

Ácido glucónico + H2O2
peroxidasa
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O
Este método (GOD/POD) presenta como desventaja que muchos compuestos presentes en el suero u orina
(bilirrubina, ácido ascórbico y ácido úrico) pueden ser oxidados por el H2O2 producido en la reacción catalizada
por la enzima GOD y por tanto interfieren en el resultado (se da un resultado superior al real).
También se puede cuantificar la concentración de glucosa de la muestra utilizando sólo la primera reacción y
evaluando la cantidad de oxígeno consumido mediante un electrodo de oxígeno. La cantidad de glucosa en la
muestra es directamente proporcional a la cantidad de oxígeno consumido.
Aspectos prácticos a considerar cuando se analiza la glucemia:

1. Centrifugar la sangre lo antes posible: los eritrocitos y leucocitos consumen glucosa, por tanto, si el contacto
con las células es prolongado se pueden dar resultados falsamente bajos (a temperatura ambiente puede
incluso desaparecer al cabo de 6h). Actualmente, existen tubos con separador de suero que funciona como una
interfase entre las células y el suero después de la centrifugación, haciendo que no sea necesario separar el
suero en otro tubo.
2. Si no se van a analizar inmediatamente, se puede refrigerar la muestra o añadir un conservante ej. Fluoruro
sódico.
3. La concentración de glucosa en suero refrigerado es estable durante 3 días.
Materiales, Equipos y Sustancias
Sustancias Materiales y Equipos

Suero sanguíneo Tubos de ensayo
Reactivos para determinar glucosa: Micropipetas
A. Reactivo: Fosfatos 100 mmol/L, fenol 5 mmol/L, glucosa oxidasa > 10 U/mL,
peroxidasa > 1U/mL, 4-aminoantipirina 0,4 mmol/L, pH 7,5
S. Patrón de Glucosa/Urea/Creatinina: Glucosa 100 mg/dL (5,55 mmol/L), urea
50 mg/dL, creatinina 2 mg/dL. Patrón primario acuoso.
Espectrofotómetro
Conservación de los reactivos:

Conservar a 2-8ºC.
El Reactivo y el Patrón son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se
conserven bien cerrados y se evite la contaminación durante su uso.
Indicaciones de deterioro:
− Reactivo: Presencia de partículas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,150 a 500 nm (cubeta de 1
cm).
− Patrón: Presencia de partículas o turbidez.
Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El suero o plasma deben separarse de los
elementos celulares lo antes posible para evitar la glucolisis. La adición de fluoruro sódico a la muestra de
sangre previene la glucolisis. La glucosa en suero o plasma es estable 5 días a 2-8ºC. Los anticoagulantes
como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.
Características metrológicas
− Límite de detección: 0,23 mg/dL = 0,0126 mmol/L
− Límite de linealidad: 500 mg/dL = 27,5 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra
1/4 con agua destilada y repetir la medición.
− Sensibilidad: 4 mA‫ڄ‬dL/mg = 0,22 mA‫ڄ‬L/mmol
− Interferencias: la hemoglobina (> 3 g/L), la lipemia (trigliceridos >1,25 g/L) y la bilirrubina (10 mg/dL)
interfieren.. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.
1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.

2. Pipetear en tubos de ensayo:
Tubo 1 (blanco) Tubo 2 Tubo 3

Patrón - 10 µL -
Muestra - - 10 µL
Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Nota: para la conservación y economía del reactivo se recomienda preparar solo un tubo blanco por grupo.
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 5 minutos a
37ºC.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al
menos 2 horas.
Cálculos: La concentración de glucosa en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
A Muestra
C Muestra = x C Patrón
A Patrón
Valores de referencia:
Neonato, prematuro 25-80 mg/dL = 1,39-4,44 mmol/L

Neonato, a término 30-90 mg/dL = 1,67-5,00 mmol/L
Niños, adultos 70-105 mg/dL = 3,89-5,83 mmol/L
Residuos
Todos se depositan en residuos orgánicos no halogenados
Pregunta
¿En qué consiste el método de valoración reflectométrica y el método de sensores por capilaridad para la
determinación de glucosa en sangre?
Referencias
1. http://www.biosystems.es/Methods/11503c.pdf
2. http://www.bganalizadores.com.ar/resultado.html?linea=4
3. http://www.insp.mx/Portal/Cuidados_salud/diabetes-INSP.pdf
PRACTICA 10
PERFIL LIPÍDICO
Objetivos
1. Determinación de la concentración de colesterol total, HDL-colesterol y triglicéridos.

2. Cálculo de LDL-colesterol, mediante la fórmula de Friedewald.
3. Dar interpretación diagnóstica del resultado.
Aspectos Teóricos
Dentro de los lípidos, los triglicéridos y el colesterol y sus ésteres, constituyen dos grupos muy importantes. Los
primeros por su alto contenido energético y el segundo por su papel estructural en la formación de membranas
celulares animales en donde constituyen hasta el 25%. Existen varias técnicas experimentales para extraer y
cuantificar lípidos. Uno de los métodos, utilizado actualmente a nivel clínico y de investigación, para valorar el
colesterol y los triglecéridos en el plasma y/o suero sanguíneos es el enzimático calorimétrico.
Colesterol Total
El colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructura ciclopentanofenantreno. El
colesterol de la dieta se absorbe parcialmente y también se sintetiza en el hígado y otros tejidos. El colesterol se
encuentra en las membranas celulares en forma libre, en algunas células capaces de almacenarlo, eterificado
reversiblemente en ácidos grasos y en las lipoproteínas circulantes en el plasma sanguíneo, las cuales lo
transportan eterificado en el centro de la célula y libre en su capa externa. El colesterol es necesario para que
las células eucarióticas formen nuevas membranas y es el precursor biosintetico de sales biliares, hormonas
esteroidales y vitamina D. Las concentraciones elevadas de colesterol se asocian con un riesgo
progresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias.
La cuantificación de colesterol en el plasma y/o suero sanguíneos por el método enzimático calorimétrico, se
fundamenta en una hidrólisis de los ésteres del colesterol catalizada por la colesterol éster hidrolasa, este
colesterol junto con el colesterol libre presente en el plasma o suero sanguíneo es oxidado por la colesterol
oxidasa a ∆4-colestenona (cetona) y peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al
sistema cromógeno 4-aminoantipirina/fenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con
un pico de máxima absorbancia a 500 nm.
Colesterol-HDL
Las HDL participan en la captación del colesterol de los tejidos y en su transporte hacia el hígado donde se
elimina en forma de ácidos biliares. Existe una correlación positiva entre concentraciones bajas de HDL-
colesterol en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes
cerebrovasculares. Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con niveles
reducidos de HDL: enfermedades hepatocelulares agudas o crónicas, hiperalimentación intravenosa,
malnutrición severa, diabetes, anemia crónica, alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier,
analfalipoproteinemia, estrés agudo, algunos medicamentos y el tabaco. El diagnóstico clínico no debe
realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de
laboratorio.
El colesterol de las proteínas de baja densidad (LDL), las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones es
hidrolizado por la colesterol oxidasa mediante una reacción enzimática acelerada no formadora de color. El
detergente presente en el reactivo B solubiliza el colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) de la
muestra. El colesterol de HDL se cuantifica espectrofotométricamente mediante las reacciones acopladas
descritas a continuación.
Triglicéridos
Los triglicéridos son ésteres de glicerol y ácidos grasos que provienen de la dieta o son sintetizados
principalmente en el hígado. Los triglicéridos se transportan en el plasma en las lipoproteínas y son utilizados
por el tejido adiposo, músculo y otros. Su principal función es suministrar energía a la célula. Las
concentraciones elevadas de triglicéridos en suero pueden ser debidas a alteraciones hepatobiliares, diabetes
mellitus, nefrosis, hipotiroidismo, alcoholismo, hiperlipoproteinemia familiar IV y V entre otras.
Los triglicéridos presentes en la muestra son hidrolizados por la lipasa para liberar ácidos grasos y glicerol, este
último es fosforilado por ATP en presencia de glicerol quinasa. El glicerol resultante es oxidado por GPO a
dihidroxiacetona fosfato y peróxido de hidrogeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al sistema
cromógeno 4-aminoantipirina/4-clorofenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con un
pico de máxima absorbancia a 500 nm.
Colesterol-LDL
Las LDL son las principales lipoproteinas que transportan colesterol hepático hacia los tejidos. Existe una
correlación positiva entre concentraciones elevadas de LDL-colesterol en plasma y la incidencia de
aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Existen diversos estados
patológicos o influencias ambientales asociados con niveles elevados de LDL: nefrosis, diabetes, obesidad,
algunos medicamentos y el tabaco. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de
un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.
Si los triglicéridos son menor de 400 mg/dl, la concentración de colesterol LDL (LDL-C) se calcula de la
concentración de colesterol total (COL-T), la concentración de HDL colesterol (HDL-C) y la concentración de los
triglicéridos (TG) de acuerdo a la formula de Friedewald:
LDL-C = COL-T – HDL-C – (TG/5) (mg/dl)
LDL-C = COL-T – HDL-C – (TG/2,2) (mmol/l)
La ecuación anterior se obtiene después hacer el siguiente análisis:
Colesterol total = Colesterol de VLDL + Colesterol LDL + Colesterol HDL
Por lo tanto:
Colesterol LDL = Colesterol total - Colesterol de VLDL- Colesterol HDL
De aquí, el colesterol total y el HDL-colesterol fueron medidos anteriormente, y el Colesterol de VLDL se estima
que es igual a la cantidad de Triglicéridos dividido por 5.
Valores de Referencia:
Hasta 100 mg/dL (2,59 mmol/L) Optimo

100-129 mg/dL (2,59-3,34 mmol/L) Casi optimo
130-159 mg/dL (3,37-4,12 mmol/L) Moderado
160-189 mg/dL (4,14-4,90 mmol/L) Elevado
>190 mg/dL (>4,92 mmol/L) Muy elevado

Reactivo para determinar colesterol: 10 x 50 mL. Pipes 35 mmol/L, colato sódico Pipetas y micropipetas
0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa >
0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0.
Patrón de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L)
Reactivo para determinar triglicéridos: Pipes 45 mmol/L, 4 - clorofenol 6 mmol/L, Espectrofotómetro

cloruro magnésico 5 mmol/L,lipasa > 100 U/mL, glicerol quinasa > 1,5 U/mL,
glicerol-3-fosfato oxidasa > 4 U/mL,peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,75
mmol/L, ATP 0,9 mmol/L, pH 7,0.
Patrón de Triglicéridos: Glicerol equivalente a trioleina 200 mg/dL (2,26 mmol/L).
Reactivos para determinar colesterol-HDL: Baño de agua a 37oC

A. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfotungstato 0,4 mmol/L, cloruro de magnesio 20
mmol/L.
B. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfatos 35 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL,
colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 1 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L,
colato sódico 0,5 mmol/L, diclorofenol-sulfonato 4 mmol/L, pH 7,0.
S. Patrón de Colesterol HDL: 1 x 5 mL. Colesterol 15 mg/dL. Patrón primario
acuoso.
Aguas desionizada
Conservación de los reactivos: Conservar a 2-8ºC. El Reactivo es estable hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, siempre que se conserve bien cerrado y se evite la contaminación durante su uso.
Indicaciones de deterioro: Presencia de partículas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,200 a 500
nm (colesterol total y trigliceridos).
Características Generales de la Prueba
1. Colesterol Total
a. Metrología
− Límite de linealidad: 1000 mg/dL = 26 mmol/L
− Interferencias: La hemoglobina (>5 g/L) y la bilirrubina (>10 mg/dL) interfieren. La lipemia (triglicéridos 10
g/L) no interfiere.
b. Limitaciones
Una muestra con una concentración de colesterol que excede el límite de linealidad debe diluirse con solución
salina a 0.9% y volverse a analizar incorporando el factor de dilución en el cálculo del resultado. Muestras muy
ictéricas, hemolíticas o lipémicas requieren del uso de un blanco de muestra que puede prepararse agregando
25 µL de la muestra a 2.5 mL de agua desionizada.
c. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El colesterol en suero o plasma es estable 7 días
a 2-8ºC. Pueden utilizarse como anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.
2. Triglicéridos
a. Metrología
− Límite de linealidad: 600 mg/dL = 6,78 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra
1/4 con agua destilada y repetir la medición.
− Sensibilidad analítica: 1,2 mA‫ڄ‬dL/mg = 112 mA‫ڄ‬L/mmol
− Interferencias: La hemoglobina (10 g/L) no interfiere. La bilirrubina (2,5 mg/dL) interfiere.
b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. Los triglicéridos en suero o plasma son estables
5 días a 2-8ºC. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.
3. Colesterol-HDL
a. Metrología
− Límite de linealidad: 150 mg/dL = 3,9 mmol/L.
− Interferencias: La lipemia (triglicéridos 10 g/L) no interfieren. La hemolisis (hemoglobina > 5g/L) y la bilirrubina
(> 10 mg/dL) pueden interferir.
b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El Colesterol HDL en suero o plasma es estable
7 días a 2-8ºC. Como anticoagulante puede utilizarse EDTA, litio o heparina sódica.
A. Determinación de Colesterol Total
Tubo 1 (blanco) Tubo 2 (patrón) Tubo 3 (Muestra)

Patrón de - 10 µL -
Colesterol
Muestra - - 10 µL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 5 minutos
a 37ºC.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante
al menos 2 horas.
Cálculo: La concentración de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
A Muestra
A Patrón
Hasta 200 mg/dL (5,2 mmol/L) Óptimo
200-239 mg/dL (5,2-6,21 mmol/L) Moderado
>240 mg/dL (>6,24 mmol/L) Elevado
B. Determinación de Colesterol-HDL
Precipitación
1. Pipetear en un tubo de centrífuga
Muestra 0.2 mL
Reactivo A 0.5 mL
2. Agitar bien y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Centrifugar durante 10 minutos a 5.000 r.p.m.
4. Recoger con cuidado el sobrenadante. El sobrenadante debe ser completamente claro. En caso de persistir
la turbidez o de no obtener una buena sedimentación del precipitado, adicionar otros 0,5 mL de Reactivo A,
mezclar bien y centrifugar de nuevo. Multiplicar el resultado obtenido por 1,7 para corregir la
dilución efectuada.
Colorimetría
5. Atemperar el Reactivo B a temperatura ambiente.
Blanco Patrón Muestra

Patrón Colesterol HDL - 50 µL -
Sobrenadante muestra - - 50 µL
Reactivo (B) 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 10 minutos a
37ºC.
8. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al
menos 30 minutos.
Cálculo: La concentración de colesterol HDL se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
AMuestra
C Muestra = x CPatrón x 3.5 (Factor de dilución)
APatrón
Valores de Referencia
Las concentraciones de colesterol de HDL varían considerablemente con la edad y el sexo. El siguiente valor
discriminante ha sido recomendado para identificar individuos con elevado riesgo de enfermedad coronaria.
Hasta 35 mg/dL (0.91 mmol/L) Riesgo elevado

> 60 mg/dL (1,56 mmol/L) Riesgo bajo
C. Determinación de Triglicéridos
Tubo 1 (blanco) Tubo 2 (patrón) Tubo 3 (Muestra)

Patrón de - 10 µL -
Triglicéridos
Muestra - - 10 µL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 5 minutos
a 37ºC.
4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante
al menos 2 horas.
Cálculo: La concentración de triglicéridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
A Muestra
A Patrón
Hasta 150 mg/dL (1,7 mmol/L) Bajo

150-199 mg/dL (1,70-2,25 mmol/L) Dudoso
200-499 mg/dL (2,26-5,64 mmol/L) Alto
>500 mg/dL (>5,65 mmol/L) Muy alto
Residuos
Consulta
Consultar sobre las familias de enzimas a las que pertenecen las enzimas empleadas en esta sesión.
Preguntas
1. ¿A qué clase de compuestos pertenecen triglicéridos y el colesterol?

2. ¿Cuál es el rol funcional de las diversas lipoproteínas?
3. ¿Cuál es el rol de las lipoproteínas en el proceso aterogénico?
4. ¿Qué es el colesterol HDL, LDL y VLDL?
5. Mencione algunas fuentes endógenas de colesterol
Referencias
1. http://www.biosystems.es/Methods/
2. http://www.labomed.com.ve
3. http://www.mediben.com/Nutsem2.htm
PRACTICA 11
DETERMINACION DE BILIRRUBINAS EN SUERO SANGUÍNEO
Objetivos
1. Cuantificar el contenido de bilirrubinas en suero sanguíneo

2. Dar interpretación diagnóstica del resultado.
Aspectos Teóricos
La bilirrubina es un pigmento amarillo rojizo biliar que se encuentra normalmente en el suero como resultado de
la destrucción de los eritrocitos. Es un producto de la degradación de la hemoglobina por el sistema
reticuloendotelial y existe en dos formas. La bilirrubina no conjugada (indirecta) es transportada hacia el hígado
donde es fijada a la albúmina donde luego es conjugada (directa) con ácido glucurónico, se excreta en la bilis
pasando por el duodeno para ser eliminada. Las concentraciones de bilirrubina en la sangre pueden aumentar
debido a varios motivos como son: sobreproducción de la misma, disminución de la absorción por parte del
hígado, disminución de la conjugación, disminución de la secreción del hígado o bloqueo de las vías biliares.
En caso de aumento de producción, disminución de absorción del hígado o disminución de la conjugación, la

bilirrubina no conjugada, denominada bilirrubina indirecta, estará básicamente elevada. En casos de
disminución de secreción del hígado u obstrucción de las vías biliares, la bilirrubina conjugada o bilirrubina
directa, estará básicamente elevada. Existen una serie de enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a
la producción, captación, metabolismo y excreción de bilirrubina, resultando en una hiperbilirrubinemia.
Se observa hiperbilirrubinemia no conjugada en recién nacidos (icterícia fisiológica), en un aumento de la

destrucción de eritrocitos (anemia hemolítica, hematoma extenso), en eritropoyesis defectuosa así como en
algunas enfermedades genéticas poco frecuentes (síndrome de Gilbert, síndrome de Crigler-Najjar).
La hiperbilirrubinemia conjudada se asocia a una disminución en la excreción de bilis debida a enfermedades

hepáticas (hepatitis o cirrosis) o bien a una colestasis intra o extrahepática. La ictericia es una manifestación
clínica de la hiperbilirrubinemia, que consiste en una deposición de los pigmentos biliares en la piel, originando
coloración amarillenta de la piel y mucosas.
Los métodos tradicionales para la determinación de la bilirrubina se basan en la reacción de ésta con el reactivo
diazo para formar el compuesto colorido azo-bilirrubina. La bilirrubina directa presente en la muestra reacciona
con el ácido sulfanílico diazoado formando azobilirrubina, un complejo coloreado que puede determinarse
espectrofotométricamente. La reacción diazo puede acelerarse mediante la adición de varios compuestos
químicos, tales como etanol, cafeína o DMSO. Para la determinación de la bilirrubina total se adiciona un
tensoactivo como agentes solubilizantes, como es el caso de la cetrimida, la cual solubiliza la bilirrubina
indirecta permitiendo su reacción junto con la fracción directa. Los términos “directa” y “total” se refieren a las
características de reacción en presencia o ausencia de solubilizantes (aceleradores). La bilirrubina “directa” e
“indirecta” equivale sólo de forma aproximada a las fracciones conjugada y no conjugada.
Tensoactivo
Bilirrubina Total + Sal de 2,4-diclorofenil diazonio Azobilirrubina

Pipetas y micropipetas
BILIRRUBINA (TOTAL)
AT. Reactivo. Acido sulfanílico 29 mmol/L, ácido clorhídrico 0,2 mol/L, cetrimida 50
mmol/L.
BT. Reactivo. Nitrito sódico 11,6 mmol/L.
Espectrofotómetro
BILIRRUBINA (DIRECTA):
AD. Reactivo. Acido sulfanílico 35 mmol/L, ácido clorhídrico 0,24 mol/L.
BD. Reactivo. Nitrito sódico 3,5 mmol/L.
Baño de agua a 37oC
Conservación
Conservar a 15-30ºC.
Los Reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien
cerrados y se evite la contaminación durante su uso.
Indicaciones de deterioro: Presencia de partículas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,05 a 540 nm
(cubeta de 1 cm).
Características Metrológicas
− Límite de detección (bilirrubina total): 0,03 mg/dL = 0,51 µmol/L
− Límite de detección (bilirrubina directa): 0,02 mg/dL = 0,34 µmol/L
− Límite de linealidad: 15 mg/dL = 257 µmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/3
con agua destilada y repetir la medición.
− Interferencias: La hemólisis no interfiere (hemoglobina 10 g/L). La lipemia (trigliceridos > 15 g/L)
Muestras
Suero recogido mediante procedimientos estándar. La bilirrubina en suero es estable 2 días a 2-8ºC si se
protege de la luz.
A. BILIRRUBINA TOTAL
Tubo 1 (blanco muestra) Tubo 2 (Muestra)

Muestra 100 µL 100 µL
Reactivo (AT) 1.0 mL 1.0 mL
Reactivo (BT) - 250 µL
2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
3. Leer la absorbancia (A1) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm.
B. BILIRRUBINA DIRECTA
Tubo 3 (blanco muestra) Tubo 4 (Muestra)

Muestra 100 µL 100 µL
Reactivo (AD) 1.0 mL 1.0 mL
Reactivo (BD) - 250 µL
2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 5 minutos a 37ºC.
3. Leer la absorbancia (A2) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm.
Cálculos
La concentración de bilirrubina en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
Bilirrubina total = A1 x 12,5 mg/dL, este valor es el producto de la división 2,5/0,2 donde 2,5 es la concentración
y 0,2 es la observancia del patrón.
Bilirrubina directa: A2 x 7,74 mg/dL, este valor es el producto de la división 2,5/0,2 donde 2,5 es la
concentración y 0,2 es la observancia del patrón.
Si se desea expresar la concentración de bilirrubina total o directa en µmol/L se puede utilizar la siguiente
ecuación:
Concentración masa (mg/dL) x 17,1 = concentración sustancia (µmol/L)
Valores de referencia en adultos
Total Hasta 1,1 mg/dL (18,8 µmol/L)

Directa Hasta 0.25 mg/dL (4,3 µmol/L)
Significado Clínico
La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina. Es transportada del bazo al hígado y se excreta
en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más
probables de la hiperbilirrubinemia: Bilirrubina Total (T): Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas,
anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas. Bilirrubina Directa (D): Colestasis hepática,
alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas.
Residuos
Referencias
1. http://www.biosystems-sa.com/Methods/11515c.pdf
2. http://www.spinreact.com.mx/pdf/1001044.pdf
3. http://www.pkids.org/Spa_phrliv.pdf
4. http://www.thermo.com/eThermo/CMA/PDFs/Various/File_28459.pdf
PRACTICA 12
ANALISIS CUALITATIVO DE ORINA
Objetivos
1. Realizar un análisis cualitativo, mediante pruebas químicas, de algunos componentes de la orina, como
son: la urea, la creatinina, los cuerpos cetónicos, los sulfatos, la glucosa y los cloruros.
2. Comprobar en la orina algunos de los componentes mencionados mediante el uso de tiras reactivas
Aspectos Teóricos
Tiras reactivas para urianálisis: Las tiras reactivas para urianálisis son tirillas de plástico firme en la cual se
encuentran sujetos algunos diferentes reactivos. Dependiendo del producto que se esté usando, las tirillas
reactivas proveen pruebas para la glucosa, bilirrubina, cuerpos cetónicos (Ácido acetoacetico), gravedad
específica, sangre, pH, proteínas, urobilinógenos, nitrito y leucocitos en orina. El resultado de la prueba podrá
suministrar información de acuerdo con el estado del metabolismo del carbohidrato, del hígado, de la función
hepática, del balance ácido-base y bacteriurea. Cada tirilla es estable y lista para usarse después de removida
del bote. La tirilla reactiva en su totalidad es desechable. Los resultados son obtenidos por comparación directa
entre la tirilla de prueba con los bloques de color impresos en la etiqueta del bote. No se requieren cálculos o
instrumentos de laboratorio.
Orina: La orina es un líquido acuoso transparente y amarillento, de olor característico, excretado por los riñones
y eliminado al exterior por el aparato urinario. Después de la producción de orina por los riñones, ésta recorre
los uréteres hasta la vejiga urinaria donde se almacena y después es expulsada al exterior del cuerpo a través
de la uretra, mediante la micción.
Análisis Físico de Orina
Olor: La orina normal recién emitida no huele, salvo si se han ingerido determinados alimentos (espárragos). En
las infecciones por microorganismos que degradan la urea la orina huele amoníaco. En los enfermos con
cetoacidosis huele a acetona. Un olor dulzón desagradable sugiere inflamación o focos supurativos urinarios.
Hay errores congénitos del metabolismo en los que adquiere un olor peculiar (fenilcetonuria, enfermedad del
jarabe de arce, malabsorción de metionina) con el ejemplo característico del olor a pies sudados de la acidemia
isovalérica.
Aspecto (color y turbidez): La orina normal tiene color amarillo. La intensidad es inversamente proporcional a
la concentración de solutos. La orina muy diluida es muy pálida y si está concentrada adquiere un color amarillo
intenso, debido a la mayor concentración de pigmentos excretados por el riñón, como la riboflavina.
El color de la orina varía en numerosas situaciones fisiológicas y patológicas:
CAUSAS ENDÓGENAS COLOR DE LA ORINA FACTORES EXÓGENOS
Bilirrubina (conjugada) Amarillo intenso Antocianinas (remolacha) Roja

Hemoglobina y mioglobina Rojo-parduzco Antraquinonas (laxantes) Anaranjada (pH alcalino)
Hematuria Rojo turbio Rifampicina Anaranjada
Porfirinas y sus Rojo Azul de metileno Verde
precursores
Melanógenos Pardo negruzca L-dopa Pardusca
Ácido homogentísico Pardo negruzca
Quiluria Blanquecina (láctea)
Piuria Blanquecina (turbia)
Densidad: La densidad urinaria indica la capacidad de concentración/dilución del riñón. En los adultos sanos
varía entre 1,002 y 1,035 g/ml. En situaciones de deshidratación extrema puede alcanzar 1,040 g/ml. La
densidad urinaria es un parámetro muy variable en condiciones fisiológicas, y por lo tanto de poco valor
diagnóstico, por lo que sólo hay que tenerla en cuenta si es discordante con la situación clínica que se
sospeche:
— Debe ser mayor de 1,025 en situaciones de baja perfusión renal con función tubular conservada:
deshidratación, diabetes mellitus mal controlada, insuficiencia cardiaca.
— Debe ser menor de 1,010 en enfermos con diabetes insípida, polidipsia o bajo tratamiento diurético.
— Es constante (alrededor de 1,010) en enfermos en la fase isostenúrica de la insuficiencia renal crónica.
Hay diversos métodos para medir la densidad urinaria, como el clásico densitómetro de vidrio. Actualmente las
tiras reactivas proporcionan una lectura aproximada. Esta prueba se basa en un intercambio iónico entre los
polielectrolitos del área de prueba y los iones en la muestra, lo que resulta en un cambio de color de un
indicador acido-base. Este color va de azul-verde en muestras con baja fuerza iónica hasta marrón-amarillo en
orinas concentradas. Altas concentraciones de acido ascórbico (>700 mg/l) pueden simular una densidad
especifica alta. Un medio acido (pH<6.5) da una densidad específica baja falsa.
La densidad medida utilizando tiras reactivas puede variar ligeramente del valor determinado por otros métodos,
visto que no serán registrados aumentos de densidad causados por concentraciones de glucosa >1.000 mg/dL
(> 56 mmmol/L). Excreción elevada de proteína puede llevar a resultados más altos. Orinas muy alcalinas
pueden causar lecturas bajas.
Análisis Químico de Orina
pH urinario: el pH es el inverso del logaritmo de la concentración de iones hidrógeno. Valores bajos indican
acidez y valores altos alcalinidad. La orina ácida se asocia con cálculos de xantina, cistina, ácido úrico y oxalato
de calcio; en tanto que la orina alcalina se asocia con cálculos de carbonato de calcio, fosfato de calcio y fosfato
de magnesio.
En adultos sanos oscila entre 4,5 y 8,0 aunque normalmente es ligeramente ácido. Esta acidez se atribuye a la
presencia de fosfato ácido y ácidos orgánicos libres. Disminuye en situaciones de acidosis fisiológica (ayuno) y
patológica (salvo en las acidosis tubulares), así como si se sigue una dieta rica en proteínas o si hay
deshidratación o proliferación en la orina de bacterias productoras de ácido. Aumenta después de las comidas,
en situaciones de alcalosis y si hay colonización por gérmenes que degradan la urea, como Proteus (olor
amoniacal), dieta vegetariana o vómitos pertinaces.
La prueba con la tira reactiva se basa en el método de doble indicación de pH. En donde el azul de bromotimol
y el rojo de metilo dan colores distintivos sobre los rangos del pH de 5-9 el rango de los colores desde el rojo-
anaranjado hasta el amarillo y el amarillo-verde hasta el azul-verde.
El valor del pH en orina reciente de un paciente sano varía entre 5 y 6. La escala cromática distingue
claramente valores entre pH 5 y pH 9. El valor pH siempre se debe determinar en orina recién recolectada,
evitando, de esa manera, el aumento indeseado a valores pH > 9, causado por la descomposición bacteriana.
Proteínas: la albumina urinaria es una mezcla de seroalbumina y seroglobulinas. La albuminuria se atribuye a

una lesión renal (nefrosis) o la inflamación del órgano (nefritis). En condiciones normales el contenido en
proteínas de la orina no rebasa los 150 mg/24 horas en el adulto.
La tira reactiva es altamente sensible para albúmina, pero no para globulinas o hemoglobina. La sensibilidad
mínima de la tira reactiva es de 10 mg de proteína/dL de orina. Los campos de referencia corresponden a las
siguientes concentraciones de albúmina: negativo, 30, 100 y 500 mg/dL o 0,3, 1,0 y 5,0 g/L. Resultados falso-
positivos son posibles en orinas alcalinas (pH>9), tras la infusión con polivinilpirrolidina (sustituto sanguíneo),
tras la ingestión de medicamentos conteniendo quinina y también por residuos de desinfectantes en el
recipiente de colecta. La coloración de la proteína se puede enmascarar por la presencia de colorantes médicos
(azul de metileno) o pigmentos de remolacha
El significado patológico de la proteinuria depende de su cuantía, de las características de las proteínas

excretadas y de las circunstancias en que se produce. Por lo tanto, ante una proteinuria positiva, es necesario
cuantificarla y expresarla en cantidad eliminada en 24 horas y además realizar un estudio electroforético que
permita conocer la proporción de las distintas proteínas. En términos cuantitativos, la proteinuria se clasifica en
4 categorías: microalbuminuria, proteinuria leve (de 150 mg a 1 g/24 horas), moderada (de 1 a 3,5 g/24 horas) y
grave o nefrótica (más de 3,5 g/24 horas).
Glucosa: La presencia glucosa en orina es anormal y se denomina Glucosuria. Esta se da por estado de
hiperglucemia, en donde los niveles plasmáticos de glucosa sobrepasan los 170 mg/dl. La hiperglucemia indica
un mal control de la diabetes mellitus o un estado transitorio de resistencia a la insulina.
Las tiras reactivas son muy específicas, basadas en el método de la glucosa-oxidasa, que ha desplazado a
métodos clásicos, como el de Benedict, que no es específico para glucosa (otros azucares reductores como la
fructosa y la galactosa también dan prueba positiva).
Esta prueba está basada en un principio de una reacción secuencial doble de una enzima. Una enzima; la
glucosa oxidasa, cataliza la formación de ácido glucónico y el peróxido de hidrógeno de la oxidación de la
glucosa. Una segunda enzima, peroxidasa, cataliza la reacción de peróxido de hidrógeno de potasio iodado a
cromógeno oxidado.
Concentraciones patológicas de glucosa se indican por un cambio de coloración de verde a verde azulada.
Áreas reactivas amarillas o verdosas se deben considerar como resultado negativo o normal. Todas las áreas
que presentan un verde más intenso que el campo de referencia negativo indican un resultado positivo. Los
campos de referencia corresponden a los siguientes rangos de concentración de glucosa: neg. (amarillo), neg. o
normal (verdoso), 50, 150, 500 y 1000 mg/dL o neg. (amarillo), neg. o normal (verdoso), 2,8, 8,3, 27,8 y 55,5
mmol/L.
Gran cantidad de ácido ascórbico presente en la orina tras la ingestión de vitamina C (p. ej., tabletas de
vitamina, antibióticos o jugos de fruta) puede llevar a resultados bajos o falsamente negativos. Adicionalmente,
un efecto inhibidor se produce por ácido gentísico. Reacciones falso-positivas también pueden ser causados por
residuos de peróxido presente en detergentes domésticos.
Cuerpos cetónicos: Derivan del metabolismo lipídico y son tres: ácido acetoacético, acetona y ácido 3-
hidroxibutírico.
La cetonuria (presencia de cuerpos cetónicos en orina) se da en situaciones de ayuno prolongado y se ve

facilitada por la existencia de vómitos, especialmente en niños pequeños. En la deficiencia insulínica se produce
un incremento del metabolismo de los ácidos grasos, con formación final de cuerpos cetónicos que se eliminan
por la orina. La cetonuria en un diabético indica un control metabólico muy deficiente y es anuncio de una grave
complicación, el coma cetoacidótico.
Los cuerpos cetónicos, acetona y acetoacetato, se detectan mediante tiras reactivas impregnadas con
nitroprusiato sódico en medio alcalino dando un rango de colores que van desde el beige o rosa tenue para un
resultado “negativo” hasta uno rosa y rosa-púrpura para una lectura “positiva”. La toma de aspirina o de L-
DOPA a dosis altas puede inducir falsos positivos.
Un resultado negativo del examen es normal. Los resultados de la presencia de acetona en la orina
generalmente aparecen como pequeña, moderada o grande con sus valores correspondientes: Pequeña: < 20
mg/dL, Moderada: 30-40 mg/dL, Grande: > 80 mg/dL
Creatinina: La creatinina (Cr) procede del metabolismo de la creatina del músculo esquelético. La eliminación
urinaria de creatinina es bastante constante, de 0,8 a 1,8 g/24 horas, y disminuye en la insuficiencia renal,
mientras que aumenta en situaciones de rabdomiolisis o ingesta proteica excesiva.
En solución básica la creatinina reacciona con acido pícrico dando un complejo de color rojo, el cual se utiliza
para su determinación colorimétrica.
Urea: La urea es el principal metabolito de las proteínas, se filtra con facilidad por el glomérulo y se reabsorbe
en un 40-50 % en el túbulo, aunque este porcentaje varía en función del grado de hidratación y de la diuresis.
La excreción urinaria de urea oscila entre límites muy amplios: 6-20 g/día en adultos, 13-15 g/día en niños y 2-3
g/día en lactantes. Aumenta en estados de hipercatabolismo proteico y en dietas ricas en proteínas y disminuye
en la insuficiencia hepática (por reducción de la síntesis) y en la insuficiencia renal.
Cloruros: Aparte de la urea, son los cloruros las sustancias más abundantes en la orina. El más importante es
el de sodio y todos ellos derivan principalmente de los alimentos; por lo tanto, su expulsión fluctua según lo
ingerido. Durante el ayuno puede desaparecer su expulsión, permitiendo asi que se mantenga durante algún
tiempo su concentración normal en la sangre.
Su determinación puede realizarse mediante el precipitado blanco de cloruro de plata que se forma cuando se
trata la mezcla que contiene cloruros con una solución de nitrato de plata.
La excreción diaria oscila normalmente entre 80 y 180 mEq/24 horas. Sus oscilaciones en condiciones
patológicas suelen ir paralelas a las del sodio. El cual, en la insuficiencia renal “prerrenal”, por disminución del
flujo sanguíneo renal, así como en el síndrome hepatorrenal, el riñón reabsorbe ávidamente el sodio y su
concentración en orina suele ser inferior a 10 mEq/l. En la insuficiencia renal intrínseca el túbulo pierde su
capacidad de reabsorción de sodio y la concentración supera los 20 mEq/l.
Bilirrubina y urobilinógeno: Son los principales pigmentos biliares que pueden aparecer en la orina. La
bilirrubina es el producto final del metabolismo del hemo y el urobilinógeno es su principal producto de
degradación por las bacterias de la flora intestinal. Por lo tanto, si no hay paso de bilirrubina al intestino, no se
producirá urobilinógeno. Una pequeña parte del urobilinógeno se reabsorbe y es eliminado por la orina en forma
de urobilina. La excreción máxima de urobilina por orina es de 5 mg/24 horas en el adulto sano.
La determinación de bilirrubina y urobilina en orina se realiza mediante tiras reactivas, que integran el
acoplamiento de la bilirrubina con sales diazotadas estabilizadas en medio fuertemente acido. Normalmente la
bilirrubina no se detecta en la orina. Cantidades muy escasas son indicador suficiente de una enfermedad del
hígado. La reacción no se afecta por el pH urinario. Resultados falsos bajos o negativos se observan con altas
concentraciones de acido ascórbico. La luz solar directa promueve la oxidación de la bilirrubina y produce por
eso falsos bajos o negativos. Concentraciones de urobilinogeno superiores a 100 µmol/l producen un cambio en
el color de la zona reactiva de la bilirrubina el cual vira a color naranja (realizar la lectura al cabo de los 2
minutos de haber escurrido la orina). Falsos positivos se observan con la presencia de metabolitos de drogas
que desarrollan color en pH acido, como por ejemplo las fenazopiridinas.
La sensibilidad mínima de la tira reactiva es de 0,5 a 1mg de bilirrubina/dL de orina. Los campos de referencia
corresponden a los siguientes valores: 0 (negativo), 1 (+), 2 (++), 4 (+++) mg/dL o 0 (negativo), 17 (+), 35 (++),
70 (+++) mmol/L.
NITRITO: La presencia de nitritos en orina es signo de colonización o infección bacteriana. La mayoría de los
gérmenes Gram negativos que suelen colonizar la orina reducen los nitratos a nitritos, y en esta propiedad se
basa la detección por tiras reactivas.
El Test es específico para nitritos y no reacciona con los demás componentes de la orina. Un resultado negativo
no indica la ausencia de bacterionuria, ya que los organismos que no contienen reductasa para convertir el
nitrato en nitrito no son detectados. El test presenta una sensibilidad de 13-22 umol/L y tiene como
interferencias la elevada densidad específica de la orina y el ácido ascórbico (1,40 mmol/L), los cuales pueden
reducir la sensibilidad del método.
Cualquier coloración rosa indica una infección bacteriana del tracto urinario. La intensidad del color representará
la concentración del nitrito, pero no proporciona información con respecto a la extensión de la infección. Un
resultado negativo no excluye la hipótesis de una infección del tracto urinario, si ésta es causada por una
bacteria que no reducen los nitratos (Enterococcus spp., S. saprophyticus, Acinetobacter y Candida spp.).
Resultados falso- negativos se pueden provocar por altas dosis de ácido ascórbico, por terapia con antibióticos,
o por una concentración muy baja de nitrito como resultado de una dieta pobre en nitrato o fuerte dilución
(diuresis). En muestras de pacientes femeninas, el flujo vaginal puede causar resultados falso-positivos. A fin de
evitar reacciones falso-positivas, antes de la colecta, se deben debidamente lavar los órganos genitales.
Esta prueba depende en la conversión de nitrato en nitrito mediante la acciòn de bacteria gram negativaen la
orina. En un medio àcido el nitrito en la orina reacciona con àcido p-arsanìlico para formar un compuesto
diazònico. El compuesto diazonio forma un par con 1N-(1-naptil)-etilenediamine para producir un color rosado.
En el cuadro siguiente se resumen las enfermedades asociadas a la presencia de algunas sustancias en la orina:
Consideraciones sobre las tiras reactivas
a. Reactivos (Basados en pesos secos al momento de la impregnación)
Reactivo Tiempo de Composición Descripción

Lectura
0,3% w/w 2,6-diclorofenolindofenol Detecta Acido Ascórbico tan bajo
Acido 30 Segundos 99,7% w/w buffer e ingredientes no como 5-10 mg/dl (0,28-0,56 mmol/l)
Ascórbico reactivos
Detecta glucosa tan bajo como 50-

Glucosa 30 Segundos 1,5% w/w glucosa oxidasa; 0,5% w/w 100 mg/dl (2,5-5 mmol/l), Los
peroxidasa; 10% w/w yoduro de potasio resultados Pueden ser leìdos a los 10
75% w/w buffer; 13% w/w ingredientes segundos cualitativamente y en
no reactivos. treinta segundos para resultados
semi-cuantitativos.
0,5% w/w 2,4-dicloroanilina sal Detecta bilirrubina desde 0,4-0,8

Bilirrubina 30 Segundos diazònica; 99,5% w/w buffer e mg/dl (6,8-13,6 µmol/l).
ingredientes no reactivos.
Cuerpos 40 Segundos 5% w/w Nitroprusiato de sodio, 95% w/w Detecta àcido acetoacètico desde
Cetònicos buffer 2,5-5 mg/dl (0,25-0,5 mmol/l).
2,5% w/w indicador Azul de bromotimol Determina la gravedad Especìfica

Gravedad 45 Segundos 17,5% w/w buffer e ingredientes no entre 1,000-1,030. Los resultados
Especìfica reactivos; 55% (Eter metil Vinìlico correlativos con los valores obtenidos
/Anhídrido maleico); 25% Hidròxido de por el mètodo del Index refractario
sodio. entre ±0,005.
4% w/w 3,3’ ,5,5’–Tetrametilbenzidina Detecta Hemoglobina libre desde

Sangre 60 Segundos (TMB); 6% w/w Hidroperòxido de 0,015-0,062 mg/dl o 5-10 Ery/µl en
Cumena; 90% w/w buffer e ingredientes especimenes de orina con, contenido
no reactivos. de Acido Ascórbico de <50 mg/dl.
0,5% w/w Rojo de metilo sal sòdica, 5% Permite la diferenciación cuantitativa

pH 60 Segundos w/w Azul de bromotimol; 94,5% w/w de de valores de pH entre el Rango de
Ingredientes no reactivos. 5-9.
0,3% w/w Azul de tetrabromofenol; Detecta albúmina desde 7,5-20 mg/dl

Proteínas 60 Segundos 99,7% w/w buffer e ingredientes no (0,075-0,2 g/l).
reactivos
2,5% w/w p-dietilaminobenzaldehido; Detecta el Urobilinògeno desde

Urobilinògeno 60 Segundos 97,5% w/w buffer e ingredientes no 0,2-1,0 mg/dl (3,5-17 µmol/l).
reactivos.
4,5% w/w p-Acido Arsanìlico; 95,5% w/w Detecta el nitrito de sodio desde
Nitritos 60 Segundos ingredientes no reactivos. 0,05-0,1 mg/dl, en orina con una
gravedad Especìfica baja y con
menos de 30 mg/dl de Acido
Ascórbico.
0,5% del derivado del ester del Acido Detecta leucocitos tan bajo como 10-
Leucocitos 120 Segundos amino pirrol; 0,4% w/w sal diazònica; 25 glóbulos blancos Leu/µl en orinas
. 32% w/w buffer; 67,1% w/w Ingredientes clínicas
no reactivos.
b. Advertencias y precauciones: Las tiras reactivas para orina son para uso in vitro. No toque las áreas
de prueba de las tirillas de orina.
c. Almacenaje: Almacene a temperatura ambiente entre 15°-30°c (59°-59°F) y fuerza de la luz directa del
sol. No las utilize después de la fecha de expiración.
d. Procedimiento recomendado para su menejo: Todas las tirillas no usadas deberán permanecer en el
bote. Él transferirlas a otro contenedor podrá causar el deterioro de las tirillas y volverse no reactivas.
No tire el secante del bote. No abra el contenedor hasta que esté listo para usarse. Los botes abiertos
deberán ser usados dentro de los 3 siguientes meses después de abiertos.
e. Recolección de la muestra y preparación: Recolecte la muestra de orina en un contenedor limpio y
realice la prueba lo más pronto posible. No centrifugue. No se recomienda el uso de conservadores
para orina. Si la prueba no se puede llevarse a cabo dentro de una hora después de la recolección,
refrigere la muestra inmediatamente. Permita que la muestra refrigerada tome la temperatura ambiente
antes de realizar la prueba.
Sustancias y Materiales
Sustancias Materiales
Orina Tubos de ensayo
Solucion fenol-nitroprusiato de sodio: 4,7g fenol y 6mg de Un baño de agua a 40ºC y otro de agua
nitroprusiato de sodio en 100ml de agua desionizada ( 250ml) hirviendo
Nitroprusiato de sodio 0.1M Tiras reactivas para el análisis de orina
Hipoclorito de sodio alcalino: disolver 2g de NaOH en 100ml
de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sodio
comercial al 5%. Guardar en frasco ambar.
Nitrato de plata 1%
Acido pícrico 1%
Hidróxido de sodio 1M
Reactivo de Benedict
Acido acético 10%
Reactivo de Biuret
A. Pruebas Químicas
1. pH: Tome una tira de papel indicador, sumérjala en la orina y determine el valor del pH
2. Urea: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solución fenol-nitroprusiato y 10
gotas de hipoclorito alcalino. Coloque el tubo en un baño de agua a 40 ºC durante 5 minutos y anote los
resultados. La aparición de una coloración azul-violeta es positivo para urea.
3. Creatinina: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 4 gotas de la solución de ácido pícrico y 4
gotas de hidróxido de sodio 1M. La aparición de una coloración naranja que se torna rojiza es prueba positiva
para creatinina.
3. Cuerpos cetónicos: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solución de
nitroprusiato y 10 gotas de hidróxido de sodio 1M. Anote la aparición de algún color. Coloque el tubo en un baño
de agua hirviendo y observe si hay algún cambio. En caliente adicione 5 gotas de ácido acético al 10%.
Observe y anote los resultados. La formación de un complejo verde-azul es prueba positiva para acetona.
4. Cloruros: Adicione 1.0 mL de orina en un tubo de ensayo y añadale 1 gota de nitrato de plata. La formación
de un precipitado blanco es prueba positiva para cloruros.
6. Glucosa y otros azucares reductores: añada 1.0 mL de orina a un tubo de ensayo, adiciónele 2 mL de
solución de Benedict y caliente la solución en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos. Enfríe el tubo a
temperatura ambiente. Si la solución permanece transparente y azul, significa que no hay glucosa (o cualquier
otro azúcar reductor). Si la solución es verde, la muestra de orina contiene aproximadamente 0.25% de glucosa;
si es amarilla, 1% de glucosa; si es naranja, más del 1% de glucosa; y si es rojo ladrillo, más del 2% de glucosa.
7. Albúmina: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de hidróxido de sodio al 25 % y 10
gotas del reactivo biuret. Observe y anote los resultados. La aparición de una coloración violeta es prueba
positiva para proteínas.
B. Prueba con Tiras Reactivas

Notas de la prueba
1. Se recomienda usar solo orina fresca, bien homogenizada y sin centrifugar. Se recomienda usar la primera
orina de la mañana por que se concentra durante la noche.
3. La recolección de la muestra debe realizarse en frascos limpios y libre de desinfectactes o detergentes.
4. No tocar las zonas reactivas de las tiras.
5. Inmediatamente después de retirar el número de tiras necesarias, tapar correctamente el envase.
6. Retire el bote solamente de las tirillas necesarias para usarse inmediatamente y tape nuevamente el bote
bien cerrado.
Procedimiento
1. Sumerja completamente la tira reactiva en la muestra de orina por dos segundos.
2. Mientras es retirada, toque la tirilla por un lado con el borde del bote para retirar el exceso de orina.
3. Coloque la tira sobre una toalla de papel absorbente para eliminar el exceso de orina y evitar que se corra
(contaminación de los cuadros reactivos adyacentes).
4. Compare cada área de reacción a su bloque de color correspondiente en la tabla y lea a los tiempos
específicos. La lectura apropiada a tiempo es crítica para obtener resultados óptimos
5. Obtenga los resultados directos por medio de la comparación directa de colores
NOTA: Todas las áreas de los reactivos a excepción de los leucocitos deberán ser leídas entre 1-2 minutos
para visión de orina positiva de orina negativa. Los cambios en el color después de 2 min no son para valores
de diagnóstico.
Bibliografía
1. http://www.mn-net.com
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Orina
3. http://www.hsa.es/org/dmedica/centrales/bioquimica/docs/boletin/Sistematico_de_Orina.pdf
4. http://protgtstore.com/pdf/PruebaUrianalisisACON.pdf
5. http://www.spinreact.com.mx/pdf/52010.pdf
6. ftp://ftp.mn-net.com/espanol/Flyer_Catalogs/Medi-Test/Br_Medi-TestES.pdf
7. Holum, John r, Practicas de química general, química orgánica y bioquímica, México, Limusa Wiley, 1972, p:
143.
PRACTICA 13
TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS
Objetivos
1. Realizar la titulación de un aminoácido y hacer su correspondiente curva de titulación

2. Determinar a partir de la curva de titulación los valores de pKa y el punto isoeléctrico
3. Determinar las posiciones de las formas iónicas de los aminoácidos al variar el pH.
Aspectos Teóricos
Generalidades
Las proteínas son biomoléculas grandes que se encuentran en todo organismo viviente. Existen muchos tipos y
tienen funciones biológicas diferentes. La queratina de la piel y las uñas, la fibroina de la seda, las telas de la
araña y la mayor parte de las enzimas que catalizan las reacciones biológicas dentro de las células son
proteínas. Las proteínas están constituidas de muchas unidades de aminoácidos enlazados en una cadena
larga (figura 1).
Estructura general de una proteína
H H O H R3 O
H2 N C C N C C N C C OH
R1 O H R2 H
n
Aminoácido Aminoácido
Enlaces amídicos C-terminal
N-terminal
Figura 1. Estructura de una proteína
Los aminoácidos, como su nombre lo indica, son compuestos orgánicos bifuncionales. Contienen un grupo
amino básico y un grupo carboxilo ácido (figura 2):
R H
C O
H2N C
OH
Figura 2. Estructura general de un aminoácido
La hidrólisis ácida, básica o enzimática de las proteínas de todos los seres vivos produce veinte α-L-
aminoácidos, los cuales se muestran en la siguiente tabla:
Tabla única. Aminoácidos presentes en las proteínas
Nombre Símbolo pK1 (α-COOH) pK2 (α-NH3+) pK3

Glicina Gly 2.4 9.8 -
Alanina Ala 2.4 9.9 -
Valina Val 2.2 9.7 -
Leucina Leu 2.3 9.7 -
Isoleucina Ile 2.3 9.8 -
Serina Ser 2.2 9.2 ~ 13
Treonina Thr 2.1 9.1 ~ 13
Cisteina Cys 1.9 10.8 8.3
Metionina Met 2.1 9.3 -
Acido aspartico Asp 2.0 9.9 3.9
Asparagina Asn 2.1 8.8 -
Acido glutámico Glu 2.1 9.5 4.1
Glutamina Gln 2.2 9.1 -
Arginina Arg 1.8 9.0 12.5
Lisina Lys 2.2 9.2 10.8
Histidina His 1.8 9.3 6.0
Fenilalanina Phe 2.2 9.2 -
Tirosina Tyr 2.2 9.1 10.1
Triptófano Trp 2.4 9.4 -
Prolina Pro 2.0 10.6 -
Definición de ácidos y bases

Un ácido y una base se pueden definir según los modelos de Lewis y Brönsted, los cuales se explican a
continuación:
9 En el modelo de Lewis, un ácido es una molécula que es capaz de aceptar pares de electrones y una base
es aquella molécula que tiene la capacidad de donar pares de electrones. En la siguiente ecuación se
puede observar que el enlace, entre el nitrógeno y el aluminio, es formado por el par libre de electrones
provenientes del amoniaco.
H3N + AlCl3 H3N-AlHCl3

Base Lewis Ácido Lewis Complejo ácido-base Lewis
9 En la definición de Brönsted, las sustancias que tienen la capacidad de donar protones son clasificados
como ácidos Brönsted y las sustancias que sirven como aceptores de protones se clasifican como bases
Brönsted. En la siguiente ecuación se ejemplifica un caso general de la reacción ácido-base cuyo equilibrio
está determinado por la fuerza ácida y básica relativa de los reactivos y donde las concentraciones de
equilibrio pueden ser calculadas a través de la constante de equilibrio, K. En esta ecuación, igualmente, se
define lo que se conoce como ácido y base conjugados.
K
HA + B BH + A
Ácido Base
Ácido Base
conjugado conjugada
de B de HA
Fuerza ácida
Ácidos Carboxílicos: La fuerza ácida es la capacidad que tiene una sustancia de donar protones. Esta se
determina por medio de la constante de acidez o constante de ionización ácida, la cual está definida de la
siguiente manera:
[H3O+][RCOO--]
RCOOH + H2O RCOO- + H3O+ Ka =
[RCOOH]
Como los valores de Ka son pequeños, es más conveniente manejar la acidez en términos del pKa, el cual está
definido igual que el pH como:
pKa = - Log Ka
Mientras más bajo sea el valor del pKa para una sustancia más ácida será esta.
Aminas: Las aminas son el resultado del reemplazo de uno ó varios átomos de hidrógeno por grupos alquílicos
o arílicos en la molécula de amoniaco. Son las bases orgánicas más fuertes encontradas en los organismos
vivientes, aunque su fuerza básica es moderada comparada con las bases inorgánicas; al igual que en el
amoniaco, es el par libre de electrones sobre el nitrógeno el que tiene la habilidad para enlazarse al protón.
N R2
R donde R, R1 y R2 son
R1 grupos alquílicos ó arílicos
Amina
Kb
RNH2 + H2O RNH3 + OH
Amina Sal de amonio
La fuerza básica relativa de una base se determina en términos del valor del pKa de su ácido conjugado.
Entre más grande sea el valor del pKa del el ácido conjugado, más básica es la amina:
Ka
RNH3 + H2O H3O + RNH2
[H+][RNH2]
Ka =
[RNH3+]
Estructuras de los aminoácidos

Como los aminoácidos contienen un grupo ácido y un grupo básico, presentan una reacción ácido-base y se
encuentran principalmente en la forma de un ion bipolar o zwitterión (figura 3):
H O H O
R C C OH R C C O-
NH2 NH3+
Forma ionizada
(zwitterión)
Figura 3. Formación del ion dipolar de un aminoácido
Los iones dipolo de los aminoácidos son sales internas y por ello tienen muchas de las propiedades físicas
asociadas con las sales. Son solubles en agua e insolubles en solventes poco o no polares y son sustancias
cristalinas de punto de fusión alto. Además, los aminoácidos son anfóteros: pueden reaccionar como ácidos o
bases, dependiendo del pH. En solución acuosa ácida, un ion dipolo de un aminoácido se comporta como una
base que acepta un protón para formar un catión; en solución acuosa básica, es un ácido que pierde un protón
y da lugar a un anión (figura 4).
R H R H
H3O+ +
C O C O H2O
+ +
H 3N C H3N C
O_ OH
R H R H
OH- + H2O
C O C O
+
H3N C H2N C
O_ O_
Figura 4. Comportamiento anfótero de un aminoácido

Note que es el carboxilato, -COO-, no el grupo amino, el que actúa como sitio básico y acepta un protón en
solución ácida. De modo similar, es el catión amonio, -NH3+, y no el grupo carboxilo, el que funciona como el
sitio acídico y dona un protón en solución básica.
Puntos isoeléctricos
En solución ácida, un aminoácido se protona y se encuentra principalmente como un catión. En solución básica,
se desprotona y se presenta como anión. Así, debe haber un pH intermedio al cual el aminoácido este
equilibrado entre las formas aniónica y catiónica y se encuentre como el ion dipolo neutro. Este pH se llama
punto isoeléctrico pI del aminoácido (figura 5).
R H
R H R H
OH- OH-
C O C O
+ C O
+ H3N C
H3N C + H 3O + H2 N C
H3 O
I OH II O_ III O_
pH bajo pH alto
pH (desprotonado)
(protonado)
Punto isoeléctrico
(ion dipolo neutro)
Figura 5. Punto isoeléctrico del aminoácido
El punto isoeléctrico de un aminoácido depende de su estructura. Los 15 aminoácidos con cadena lateral
neutras o algo ácidas tienen puntos isoeléctricos cercanos a la neutralidad, en el intervalo de pH de 5.0 a 6.0,
los dos aminoácidos con cadenas laterales más ácidas, presentan puntos isoeléctricos a un pH menor y los tres
aminoácidos con cadena lateral básica tienen puntos isoeléctricos a un pH más elevado.
Los puntos isoeléctricos de los 13 aminoácidos sin cadena lateral acida o básica son el promedio de las dos
constantes de disociación, pKa1 y pKa2. La alanina, por ejemplo, tiene pKa1 = 2.34 y pKa2 = 9.69, de modo que
el pI de la alanina es (2.34 + 9.69)/2 ó 6.01. Para los cuatro aminoácidos con una cadena lateral muy acida, el
pI es el promedio de los dos valores más bajos de pKa, por último, para los tres aminoácidos con una cadena
lateral básica, el pI es el promedio de los dos valores más altos de pKa.
Titulación de un aminoácido
La titulación es un procedimiento analítico que consiste en agregar a una solución del aminoácido cantidades
sucesivas de un agente titulante (acido o base) registrando simultáneamente los valores de pH que se generan.
Los datos obtenidos se grafican, ubicando los volúmenes del titulante en la abscisa (eje x) y los valores de pH
en la ordenada (eje y), de la unión de estos puntos se obtiene una gráfica denominada curva de titulación, a
partir de la cual se pueden determinar los valores de pKa y el punto isoeléctrico de los aminoácidos. La
siguiente figura muestra los cálculos y el grafico de titulación para determinar el pI de la alanina.
Figura 6. Curva de titulación y cálculo de pI para la alanina

La forma de la curva de titulación presenta dos regiones planas amortiguadas y una inflexión con una vertical
muy pronunciada; las regiones planas indican la mínima variación del pH a medida que se agrega la base, ello
muestra la presencia de dos sistemas amortiguadores, el primero formado por las especies I y II, y el segundo
por las especies II y III. La máxima capacidad de ellos se obtiene a la mitad de cada semititulación, cuando la
concentración de las especies I y II, y II y III, son iguales; para el primer sistema el punto medio muestra un pH
= 2.3, y ese será el pKa del equilibrio entre las especies I y II, en otro sistema el punto medio ocurre a un pH =
9.7, y será por lo tanto el pKa del equilibrio entre las formas II y III.
La región vertical de la curva indica una variación brusca del pH con mínimas adiciones de NaOH, denotando la
finalización de la primera semititulación y la no presencia de sistemas amortiguadores; igual situación ocurre al
inicio y final de toda la titulación, donde la presencia mayoritaria de una sola especie provoca esas variaciones
bruscas en el pH. Lo práctico de este hecho es que sirve para mostrar el punto final de la titulación y para
determinar con cierta aproximación el punto isoeléctrico del aminoácido, entendido como el pH correspondiente
al punto medio de la parte más vertical de la curva de titulación, que en este caso seria 6.0.
Las curvas de titulación de los aminoácidos con grupos en su cadena lateral que se ionizan, tales como la
histidina, la lisina y el acido glutamico, son más complejas, puesto que son una combinación de la curva
correspondiente a la disociación del grupo de la cadena lateral y las curvas de valoración de los grupos α-amino
y α-carboxilo. A continuación se muestran las curvas de titulación para la lisina y acido glutámico
respectivamente (figura 7).
OH- OH- OH-

H3N(CH2)4CHCO2H H3N(CH2)4CHCO2- H3N(CH2)4CHCO2- H2N(CH2)4CHCO2-
H3O+ H3 O + H3O+
NH3 NH3 NH2 NH2
Forma dicatiónica Forma monocatiónica Ion dipolar Forma aniónica
pKa1 = 2.2 pKa2 = 9.0 pKa3 = 10.5
OH- OH- OH-

HO2CCH2CH2CHCO2H +
HO2CCH2CH2CHCO2- -O2CCH2CH2CHCO2- -O2CCH2CH2CHCO2-
H3O H3O+ H3O+
NH3 NH3 NH3 NH2
Forma monocatiónica Ion dipolar Forma aniónica Forma dianiónica

pKa2 = 2.19 pKa3 = 4.25 pKa1 = 9.67
B
Figura 7. Curva de titulación y cálculo de pI para A). lisina y B). ácido glutámico

Solución de aminoácidos (glicina, alanina, Beakers
tirosina) 0.1M en HCl 0.05M
Solución de NaOH 0.1M Bureta de 25 mL
Agua destilada pH-metro
1. Calibre el pH-metro. Siga las instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro.
2. Adicione 10 mL de la solución de aminoácido suministrada por el profesor, a un erlenmeyer y sumerja el

electrodo indicador de pH; anote el valor.
3. Con un poco de NaOH 0.1M enjuague una bureta, bote el residuo y proceda a llenarla con la misma solución.
4. Adicione 0.5 mL de NaOH 0.1M a la solución de aminoácido, agite, mida y anote el pH.
5. Continúe agregando de a 0.5 mL de NaOH 0.1M hasta que el pH sea cercano a 12. No olvide medir y anotar
el pH después de cada adición de titulante.
6. Consulte con el monitor donde depositar el NaOH sobrante; proceda luego a enjuagar la bureta con
abundante agua.
Informe
• Haga una gráfica de pH vs mL de NaOH

• De la curva anterior deduzca y justifique, para el aminoácido que está titulando, los valores de pKa1,
pKa2, y pI. Compárelos con los reportados en la literatura.
• Escriba la reacción que sufre la forma dipolar del aminoácido a medida que se adiciona la base.
Residuos
Todos se depositan en residuos para neutralizar
Referencias
1. Hormaza, Angelina, Manual de laboratorio de biorganica, Medellin : Universidad Nacional de Colombia,

2004, pp: 87-90.
2. Litwack, Gerard, Bioquímica experimental : un manual de laboratorio, Ed. Omega, Barcelona, 1967, pp:
157-164

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PRACTICA 1

FOTOCOLORIMETRÍA Y CURVA DE CALIBRACIÓN

1. Analizar los principios básicos de la fotocolorimetría

Absorción de energía por sustancias coloreadas

Energía absorbida y concentración (ley de Beer)

A α c x l donde: A = absorción (intensidad de la energía absorbida)

Aplicación de la ley de Beer-Lambert

La aplicación más importante de esta ley es la determinación de concentraciones desconocidas de soluciones

Apat/Cpat = Aprob/Cprob luego Cprob = Cpat x Aprob/Apat

• Reactivo de Biuret • Muestras problema: caseína, suero

A- MANEJO DEL FOTOCOLORÍMETRO.

a. Seleccione la longitud de onda.

B- DETERMINAR EL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE UN COMPUESTO.

a. Coloque la longitud de onda en el instrumento a 420 nm.

d. Calibre el instrumento siguiendo las recomendaciones anteriores.

e. Coloque el tubo con la solución problema y anote la absorbancia o transmitancia indicada en el

g. Recoja los datos en la siguiente tabla:

λ (nm) Absorbancia λ (nm) Absorbancia

C. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA SOLUCIONES DE ALBÚMINA

Solución 0,5 1,0

c. Coloque en el fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia obtenida en la experiencia

e. Grafique los resultados absorbancia y concentración tabulados en d, la línea resultante corresponde a

f. Del gráfico, determine la concentración de las muestras problema.

g. Calcule las concentraciones de las muestras problema utilizando la ecuación de Beer-Lambert y

Todos los desechos se adicionan a residuos con metales

1. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir?

Clasificación de las proteínas

b. Según su forma tridimensional

• Albúminas, cuando son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas diluidas.

Proteínas del suero sanguíneo

Métodos para aislar y purificas proteínas

Cprob = Cpat x Aprob/Apat

Donde: Apat. Y Cpat. = son la absorbancia y concentración de la solución patrón, respectivamente.

A. Separación de las globulinas del suero.

a. Coloque en un tubo de centrífuga 1 mL de suero sanguíneo y 4 mL de agua destilada.

B. Preparación de la solución de proteínas totales.

C. Medición de la absorbancia en las soluciones que contienen proteínas.

TUBOS BLANCO (mL) PATRÓN (mL) GLOBULINAS PROTEÍNAS ABSORBANCIA

Solución salina 1,0

g. Agite cada tubo y déjelo reposar 30 minutos.

Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos con metales1

a. Dilución del patrón:

b. Concentración de proteínas totales en el suero:

(%) sln patrón x Absorbancia (proteínas totales)

20 x 5 x (%) proteínas totales

c. Concentración de las globulinas:

(%) sln patrón x Absorbancia (sln globulinas)

5 x (%) sln globulinas x5

La dilución con Debido a la dilución

d. Concentración de albúmina de suero:

(%) Albúmina = % Proteína Total - % Globulinas

2. Consulte la función de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el procedimiento de

TIROSINASA I: Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimática

8. Extraer el enzima tirosinasa de diferentes fuentes (banano, manzana, papa).

ΔAbsorb./Δt = velocidad = + d [L-matildopacromo]/dt = - d[L-metildopa]/dt

Obtención del extracto enzimático

Medida de la actividad enzimática

Actividad Enzimática = Velocidad de la reacción/Cantidad de enzima

Actividad molar = Veloc./[E] = d[S]/dt x [E] = ηsustrato/ηenzima x t