Sondas Nucleotido

Escuela Superior Politécnica De Chimborazo
Facultad De Ciencias
Escuela De Ciencias Químicas
Carrera De Ingeniería En Biotecnología
 Título: Sondas de ácidos nucleicos: Hibridación

fluorescente (FISH), Southern Blot, Northen Blot.
INTEGRANTES:
 Laura Gallegos 2786
 Camila Sucuy 2772
 Josephe Masson 2682
 Evelyn Guamán 2778
 Karen Diaz 2672
Fecha de entrega: Curso:

24/01/2019 Sexto “A”
1. INTRODUCCIÓN
Las sondas genéticas son fragmentos específicos de ADN susceptibles de hibridación

y generados por la acción de enzimas de restricción. Se denominan también clones
subgenómicos, ya que derivan directamente del ADN genómico.
Las sondas de ácidos nucleicos son fragmentos de ácido desoxirribonucleico (ADN) o de

ácido ribonucleico (ARN) marcados con algún elemento que les permite revelar,
mediante una señal, su presencia. Estos fragmentos pueden cumplir su tarea como sondas
debido a que tienen la capacidad de unirse a fragmentos complementarios eventualmente
presentes en la muestra que se desea analizar. La descripción de la estructura de los ácidos
nucleicos nos llevará a comprender hasta qué punto es inherente a ellos el unirse a un
complemento.
El uso de las sondas se basa en el descubrimiento, realizado en la década del 60, de

que es posible hibridar ácidos nucleicos en función de la complementariedad de sus
secuencias de nucleótidos. Puestas en contacto dos soluciones de ácidos nucleicos (una
que se desea analizar y otra, cuya composición es conocida por los investigadores, que
actúa como sonda), se realizará un reconocimiento muy específico de secuencias
complementarias eventualmente presentes en la solución que se analiza: las son das
reconocerán, si las hubiera, las secuencias complementarias que se desea identificar, se
unirán a ellas y revelarán su presencia mediante la marca de la que son portadoras.
2. DESARROLLO
TÉCNICA NORTHERN BLOT
Esta técnica detecta moléculas de ARN en una secuencia dada dentro de una mezcla. Fue
desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad
de Stanford. (Contreras, 2014)
PROCEDIMIENTO
Comienza con el aislamiento del ARN, los ARN se aplican a un gel de agarosa con
formaldehído para promover la linealización de todas las moléculas de ARN. Se coloca
una lámina de membrana encima del gel. La presión se aplica de manera uniforme al gel
(colocando una pila de toallas de papel y un peso encima de la membrana), para garantizar
un contacto bueno y uniforme.
Se utilizan sondas de hibridación (de secuencia conocida y marcadas de forma radiactiva,

fluorescente o con enzimas para identificar cadenas de ARN particulares de interés. Las
señales híbridas son luego detectadas por una película de rayos X. (Fernández, 2012)
APLICACIÓN
Permite observar un patrón de expresión de un gen particular entre tejidos, órganos e

infección por patógenos. La técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de los
oncogenes y la regulación negativa de los genes supresores de tumores en células
cancerosas en comparación con el tejido normal.
Inconvenientes:
-Técnica lenta que requiere grandes cantidades de ARN. (López, Campo, & Díez, 2010)
La degradación de la muestra por RNasas se puede evitar mediante la esterilización

adecuada de la cristalería.
HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
La FISH es una técnica que combina la biología molecular y las técnicas histoquímicas
para detectar secuencias específicas de nucleótidos pudiendo marcar porciones
cromosómicas o hasta cromosomas enteros en células metafásicas (células en división) o
núcleos celulares fijados. (Aguilar, 2015). Ésta se fundamenta en la capacidad que poseen
los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada
secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia a través de
puentes de hidrógeno formados entre las bases adenina- timina (DNA) o uracilo (RNA)
y citosinaguanina (DNA y RNA). (Martinez R. R., 2013).
Emplea sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorocromos las cuales van

dirigidas hacia secuencias específicas del ácido ribonucleico ribosomal (ARNr), lo que
permite la identificación rápida y específica de células microbianas ya sea que estén como
células individuales o se encuentren agrupadas en su ambiente natural. (Martinez, 2011).
La técnica consiste en desnaturalizar el DNA con calor, encubar las muestras con
formamida y tampón salino para mantener las cadenas desnaturalizadas e hibridarlas
posteriormente con sondas específicas de determinados fragmentos de DNA que se
quieres estudiar. (Lleonart, 2013)
METODOLOGÍA DE FISH
Un protocolo de la técnica de FISH incluye 4 pasos:
 Fijación y permeabilización de la muestra.

 Hibridación
 Lavado
 Detección de las células marcadas a través del
microscopio de epifluorescencia o confocal.
(Martinez R. R., 2013)
APLICACIONES
Es útil en la detección de alteraciones numéricas y estructurales cromosómicas (ploidias

y reordenamientos genómicos), para mapear de cromosomas metafásicos e incluso para
detectar bacterias y otros microorganismos. Además, es de gran utilidad ya que permite
la monitorización de enfermedades (seguimiento de una terapia antitumoral,
cuantificación de células genéticamente alteradas) y la localización precisa de los puntos
de rotura cromosómicos en tumores, en la búsqueda de nuevos genes implicados en el
cáncer. También identificar los cambios en la localización de nucleótidos;
translocaciones, inversiones y microdelecciones (Aguilar, 2015) y la monitorización de
tejidos procedentes de trasplantes. (Lleonart, 2013)
La FISH presenta numerosas ventajas frente a otras técnicas citogenéticas convencionales

sobre todo a la hora del diagnóstico clínico para la detección de tumores y aberraciones
cromosómicas, presentando una alta sensibilidad y especificidad, además de ser una
técnica relativamente rápida (24 horas). (Aguilar, 2015).
SOUTHERN BLOT
El Southern Blot es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de

ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa
o nylon. El nombre de esta técnica se debe al inventor de la misma, el biólogo
británico Edwin Southern. El trabajo de esta técnica apareció en el Journal of Molecular
Biology, número 98, en 1975.. (Fernandez, 2015)
Esta técnica se basa en tratar el DNA con enzimas de restricción y separar los fragmentos
con electroforesis en un gel de agarosa. Para su realización se parte de DNA aislado del
tejido en las mejores condiciones posibles, el DNA, tras cortarlo con enzimas de
restricción, se desnaturaliza para obtener fragmentos de cadena sencilla que se transfieren
del gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa sobre el cual quedan inmovilizados.
. Esta transferencia es necesaria para que pueda realizar la reacción de hibridación. El
DNA queda atrapado en la nitrocelulosa y es entonces cuando se puede hibridar con la
sonda radiactiva o colometrica. Cada secuencia complementaria da lugar a una banda
marcada que adquiere una posición determinada por el tamaño del fragmento de DNA.
La reacción se puede detectar por autorradiografia, ya que las ondas se pueden marcar
radiactivamente. (Lleonard, 2014)
APLICACIONES
 Esta técnica se utiliza en reordenamientos de procesos linfoproliferativos para

determinar clonalidad a partir de los genes de las inmunoglobulinas en los
linfomas B o de los receptores T en los linfomas T.
 Investigar la organización molecular de las secuencias genómicas.
 Detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermedades
genéticas humanas y a cáncer.
 Con las actuales técnicas de hibridación se pueden detectar virosis latentes, es
decir, infecciones víricas en las que no hay replicación del virus. En el diagnóstico
de las enfermedades virales lo ideal es aislar el agente causal.
 técnicas se pueden distinguir infecciones recurrentes o latentes de
primoinfecciones por los virus del herpes, citomegalovirus o varicela-zoster . Para
ello, el ADN se trocea mediante enzimas de restricción y luego se hibridan los
fragmentos. (Garcia, 2010)
BIBLIOGRAFÍA
 Contreras, R. (2014). Biología. Obtenido de

https://biologia.laguia2000.com/tecnicas-en-biologia/northern-blot
 Fernández, P. (2012). Hibridación de los ácidos nucleicos. Obtenido de
https://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=dd48aeb8-9e38-4541-
bcfb-d75fd6b2ee9f&groupId=10157
 López, M., Campo, J., & Díez, R. (2010). Aplicación de las técnicas de biología.
Obtenido de http://scielo.isciii.es/pdf/odonto/v26n4/original2.pdf



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Emplea sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorocromos las cuales van

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