UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS
E. A. P. DE BIOLOGÍA EN ACUICULTURA

PROYECTO DE TESIS

“Efecto de la concentración del extracto acuoso de Salicornia fruticosa

en el crecimiento poblacional y contenido de lípidos totales de la
microalga Tetraselmis suecica cultivada en condiciones de laboratorio”.

Presentado por:

Cano Manrique, Jorge Luis

Escobar Gil, Alexis Ricardo

------------------------------------------------
M. Sc. Juan Fernando Merino Moya

Nuevo Chimbote, Octubre del 2013

Perú
 PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES

1.1. Título del proyecto

Efecto de la concentración del extracto acuoso de Salicornia fruticosa en el crecimiento
poblacional y contenido de lípidos totales de la microalga Tetraselmis suecica cultivada
en condiciones de laboratorio

1.2. Personal investigador

1.2.1. Autores
Cano Manrique, Jorge Luis
Escobar Gil, Alexis Ricardo
Bachilleres de la Escuela Académico Profesional de Biología en Acuicultura
Facultad de Ciencias
Universidad Nacional del Santa

1.2.2. Asesor
M. Sc. Fernando Merino Moya
Docente principal del Dpto. de Biología, Microbiología y Biotecnología.
Escuela Académico Profesional de Biología en Acuicultura
Facultad de Ciencias
Universidad Nacional del Santa

1.3. Tipo de investigación

1.3.1. Por su propósito: Aplicativa
1.3.2. Por su naturaleza: Experimental

1.4. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto

Laboratorio de Cultivo de Especies Auxiliares de la Escuela Académico Profesional de
Biología en Acuicultura, Facultad de Ciencias, de la Universidad Nacional del Santa.
1.5. Cronograma de trabajo

SEMANAS
ACTIVIDADES 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Acondicionamiento
de materiales y
X X
equipos
Ejecución del
X X X X
proyecto
Recolección de
X X X X
datos
Procesamiento de
X X X
datos
Análisis e
interpretación de X X
resultados
Elaboración del
X
informe
Presentación del
X
informe

1.6. Recursos

1.6.1. Disponibles
Recursos humanos:
02 tesistas
01 asesor

Bienes
01 Termómetro columna de mercurio con 0,1 ºC de sensibilidad
01 Refractómetro VEE GEE A366ATC (+/- 1%o)
01 microscopio óptico
01 pH-metro marca OAKCTO de 0,1 de sensibilidad
01 Blower de 0,5 HP
01 Oxímetro digital HACH de ( +/- 0,01 mg. l-1)
10 Láminas
10 laminillas

1.6.2. No disponibles
02 l. Cepas de microalgas T. suecica.
02 l. Extracto acuoso de S. fruticosa
12 botellas de plásticas de 1,5 l. de capacidad.
01 Equipo de venoclisis
01 balde de plástico de 5 lt.

Material de Escritorio
01 Millar de papel bond, tamaño A4
02 Lapiceros
02 Lápices
01 Cuaderno de apuntes
01 USB de 8 GB

Servicios
Movilidad local
Fotocopiado y escaneado
Impresiones
1.7. Presupuesto y financiamiento

1.7.1. Presupuesto

Código Descripción Monto S/.

2.3.1.5.1.2 PAPELERIA EN GENERAL, UTILES Y 73,00
MATERIALES DE OFICINA
Papel bond, lapiceros, impresiones.

2.3.1.9.1.99 OTROS MATERIALES DIVERSOS DE 6500,00

ENSEÑANZA
Materiales de laboratorio como microscopio,
termómetro, ph-metro, Salinómetro.

2.3.1.10.1.2 MATERIAL BIOLOGICO 40,00

Salicornia fruticosa
SERVICIOS

2.3.2.1.2.99 OTROS GASTOS

Movilidad Local 300,00

2.3.1.11.1.6 MATERIALES DE ACONDICIONAMIENTO

Equipo de venoclisis, botellas de plastico 1500 ml. 11,00
de vidrio, balde de plástico de 5lt.

2.3.2.2.2.3SERVICIO DE INTERNET 80,00

2.3.2.2.4.4SERVICIO DE IMPRESIONES, ENCUADERNACION 260,00

Y EMPASTADO
Impresiones
TOTAL 7217.50

1.7.2. Financiamiento

Financiamiento Aporte (S/.) Participación (%)

U.N.S. 6500.00 90,06
Autofinanciamiento 717.50 9,94
Total 7217.50 100,00
II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

2.1. Antecedentes

El interés por las microalgas surgió en Alemania en los años cincuenta y sesenta al
ser consideradas como una fuente abundante de proteína de bajo costo para la
nutrición humana, interés que después se extendió a países de todos los continentes
(Garibay et al., 2009). El atractivo de las microalgas posteriormente fue encausado
hacia otras aplicaciones tales como la acuicultura, el tratamiento de aguas residuales,
la obtención de sustancias químicas finas, la producción de farmacéuticos y los
procesos de bioconversión energética (Arredondo & Vázquez, 1991).
Actualmente, vienen siendo cultivadas de manera industrial para la producción de
proteínas, vitaminas y otros suplementos nutritivos; son empleadas en simbiosis con
las bacterias para la remoción de fosfatos y nitratos de aguas residuales, como
biofertilizantes (Mora et al., 2005). Su cultivo se ha visto incrementado por ser fuente
de ácidos grasos insaturados, minerales, pigmentos, enzimas, aceites esenciales,
antibióticos y otros metabolitos biológicamente activos (Bermejo et al., 2002).
Recientemente las microalgas han merecido considerable atención por su
potencialidad como fuente de biocombustible, por la posibilidad de suplir de manera
parcial la escasez de suministro de petróleo y asimismo, se presentan como una
alternativa a los precios elevados de las materias primas tradicionales, para la
obtención de los biocombustibles como son la soja, caña de azúcar, maíz, palma
aceitera, colza, grasas animales, residuos de grasas, entre los más representativos.
(Garibay et al., 2009; Vieira Costa, 2004)
Esta tecnología aplicada a las microalgas es prometedora dadas las ventajas que
ofrece en contraste con las plantas oleaginosas, tales como: mayor eficiencia
fotosintética; eficacia superior en la asimilación de nutrientes y periodos cortos de
producción sostenida durante todo el año, debido a los breves tiempos de duplicación
de las microalgas. Igualmente, el contenido oleaginoso y el perfil de composición
lipídica de las microalgas, puede ser controlado en función de las condiciones de
cultivo, principalmente mediante la limitación de nutrientes. La ventaja competitiva
más importante del biodiesel de microalgas, consiste en los rendimientos lipídicos por
unidad de área considerablemente superiores a los obtenidos con plantas oleaginosas
(Arredondo & Vázquez, 1991)
Dependiendo de las especies, las microalgas producen diferente tipos de lípidos,
hidrocarburos y otros aceites complejos (Álvarez & Zarco, 1989; Guschina &
Harwood, 2006), de los cuales no todos son adecuados para producir biodiesel.
La producción de lípidos al igual que su composición en las microalgas, a pesar de
depender principalmente de la especie, y en última instancia de su constitución
genética, son afectados por diversas condiciones físicas y químicas de cultivo, tales
como la fase de crecimiento, la disponibilidad y la clase de nutrientes, la salinidad, los
periodos e intensidad de luz, la temperatura, el pH, e incluso, la asociación con otros
microorganismos (Garibay et al., 2009). Los lípidos comprendidos en las microalgas
por lo general constituyen del 20 al 50% de su peso seco, sin embargo se han
reportado valores en un rango del 1 al 80%, o incluso superiores (Arredondo &
Vázquez-Duhalt, 1991; Chisti, 2007),
La modificación de los parámetros de crecimiento, ocasiona modificación en su perfil
químico; por ejemplo la deficiencia de elementos nutritivos como el nitrógeno limita la
capacidad de crecimiento de las microalgas imposibilitando la síntesis de proteínas;
(Albarracín, 2007), y la limitación de nitrógeno es considerada como la estrategia más
eficiente para incrementar el contenido de lípidos neutros en las microalgas, en
particular el de triglicéridos conformados por ácidos grados con un elevado grado de
saturación (Garibay et al., 2009).
Entre las microalgas de potencial importancia para la producción de biocombustibles,
se encuentra la T. suecica, la cual posee en base seca 52% de proteína y de 15 a
23% de lípidos (Hirata et al., 2001). Y se caracteriza por ser una alga unicelular y
móvil con 4 flagelos, de 7 a 9 μm de diámetro y 10 a 16 μm de largo (Diaz et al.,
2006).
T. Suecica es una microalga eurihalina muy utilizada en la alimentación de micro
crustáceos de interés económico debido a que es capaz de sintetizar ácidos grasos
disueltos en el agua, transformar sales inorgánicas en compuestos orgánicos por
medio de la fotosíntesis, aspectos que las convierten en imprescindibles como
alimento vivo (Borowitzka & Borowitzka, 1989).

Uno de los factores importantes para la producción de las microalgas son los medios
de cultivos, los cuales pueden clasificarse en definidos y los naturales. Los primeros
son aquellos que se les conoce la naturaleza y la concentración de cada uno de sus
componentes y son usadas a escalas de laboratorio, y por lo tanto, permiten
determinar requerimientos específicos para el crecimiento algal (Running et al., 1994).
Uno de los medios definidos más utilizados es el medio Guillard f/2 que ha
demostrado ser eficiente para un gran número de microalgas (Torrentera & Tacon,
1989).

Por otro lado, los medios naturales, no son químicamente definidos, más bien se
preparan generalmente a partir de fertilizantes agrícolas (N:P:K) y sub productos
como (Melazas, extractos orgánicos y biodigeridos) provenientes de las industrias
azucareras, avícola, pesquera, acuícola, entre otras; resultando más económicas que
los medio definidos ( Hernandez et al.,2003).

T. suecica es una microalga que en cultivos autotróficos puede utilizar diferentes

fuentes nitrogenadas tradicionales (urea, fosfato diamonico, nitratos y nitritos, etc) sin
embargo en cultivos heterotróficos puede metabolizar diversos aminoácidos y
vitaminas produciendo cambios importantes en su crecimiento y composición
bioquímica (Merino com. Per. 2008) convirtiendo a esta microalgas como una de las
favoritas para realizar este tipo de investigación.
Ipanaque y Paredes, 2009, trabajaron con extracto de residuos blandos de Concha de
Abanico (EDBCA) como medio de cultivo para la obtención de lípidos en T. Suecica,
obteniendo una concentración de lípidos hasta los 180,6 mg.l -1 haciendo notar que
esta microalga marina está capacitada para sintetizar ácidos grasos, debido a su
capacidad de metabolizar y acumular los nutrientes orgánicos en condiciones
heterotrófica. Por otro lado Jiménez & Prada (2012), demostraron que los parámetros
de la dinámica del crecimiento de T. suecica ( crecimiento poblacional, tasa de
crecimiento y tiempo de duplicación) fueron estadísticamente mayores en los cultivos
dosificados con 80 ml.l-1 de EDBCA comparados con los otros tratamientos ( 40, 60 y
100 ml.l-1) y el control que utilizo medio Guillard f/2. Por otro lado también hacen
mención que los parámetros físicos de temperatura y ph no afectan la dinámica del
crecimiento de la microalga T. suecica por lo que los resultados obtenidos son el
reflejo de la influencia de los nutrientes, orgánicos e inorgánicos, presentes en el
ensilado posibilitando el crecimiento mixotrofico de dicha microalga.

Una nueva alternativa es el aceite de las plantas halófitas, organismos capaces de

sobrevivir en ambientes altamente salinos (Gargiulo,2000). Rodríguez et al. (2009)
sostiene que los lípidos son nutrientes principales capaces de cumplir la función
energética y ahorradora en relación de la planta con su ambiente y por esta razón,
Salicornia almacena ácidos grasos debido al estrés salino que presenta en el suelo
donde crece (Ivanova et al.,2006)

Robles (2011), demostró que el contenido de lípidos de las semillas de S. fruticosa

procedentes de zonas húmedas y zonas secas del Humedal de Villa María (Chimbote,
Perú), fue de 92.85 mg.g-1 y 65.83 mg.g-1 respectivamente. DaSilva et al (2002)
afirman que la halófita S. Fruticosa está siendo cultivada a pequeña y mediana escala
en Egipto, India, México, Pakistán, Arabia Saudita, así como en China a gran escala
ya que tiene 300 hectáreas de zonas costeras. Por otro lado, Arana & Salinas (2003)
reportan la presencia de S. fruticosa en la flora vascular del país y especialmente en
los humedales de Villa María (Chimbote, Perú).

Actualmente se realizan esfuerzos para la generación de nuevas metodologías y

desarrollo tecnológico para la producción masiva de microalgas y sus derivados,
mediante el uso de medios de cultivos alternativos. Una alternativa a los medios de
cultivo tradicionales ya estandarizados (puros y químicamente definidos, como el
medio Guillard) son los sustratos orgánicos, mayormente subproductos de otras
industrias y en cuya composición se encuentran fuentes de C, N, P, microelementos y
oligoelementos. La carencia de investigaciones de salicornia como medio de cultivo
alternativo para el crecimiento poblacional de microalgas ha motivado la realización
del presente trabajo, a fin de posibilitar su biotransformación en biomasa algal.
En tal sentido nos planteamos el siguiente problema: ¿Cuál será el efecto de la
concentración del extracto acuoso de Salicornia fruticosa en el crecimiento
 poblacional y contenido de lípidos totales de la microalga Tetraselmis suecica
cultivada en condiciones de laboratorio?

2.2. Justificación del problema

Es factible la utilización del extracto de S. fruticosa, por la presencia de gran cantidad

de sustancias mucosas que al parecer son polisacáridos aportadores de fuente de
carbono orgánico para T. suecica. Con bajos contenidos de nitrógeno que permitirán
incrementar el contenido de lípidos. El contenido de lípidos debe ser mayor porque el
ESALI (extracto de salicornia) presenta un bajo contenido de proteínas (nitrógeno
orgánico) ya que según Gomez & Rosas (1996), el contenido de lípidos es mayor
cuando menor es la concentración de nitrógeno; convirtiéndose así en una fuente
alternativa de sustrato para la producción de lípidos.
La existencia de áreas costeras arenosas cercanas al mar, facilita el cultivo masivo de
S. fruticosa y su posterior uso en la producción de biocombustible procedentes de
microalgas, especialmente T. suecica.

2.3. Importancia

La obtención del extracto de S. fruticosa es un proceso muy sencillo y económico que

no requiere de procedimientos y equipos sofisticados y costosos. En tal sentido, el
empleo de ESALI permitirá desarrollar una nueva metodología de producción masiva
de microalgas. Debido a la abundancia de la materia prima (Salicornia) es posible
escalar los cultivos de microalgas al aire libre a niveles semi-industriales e industriales
contribuyendo al establecimiento y desarrollo de la alguicultura en nuestro Región y
país. La importancia del presente proyecto radica en la transformación de Salicornia
mediante sus extractos líquidos, en biomasa algal con especial énfasis en la
obtención de lípidos y su posible uso como biocombustible.
La gran cantidad de arenales costeros se convertiría en un gran potencial ya que
podrían ser sembrados con S. fruticosa para sustentar altas producciones de lípidos
procedentes de las microalgas en especial de T. suecica

2.4. Objetivos

2.4.1. Objetivo general

Determinar el efecto de la concentración del extracto acuoso de Salicornia fruticosa

en el crecimiento poblacional y contenido de lípidos totales de la microalga
Tetraselmis suecica cultivada en condiciones de laboratorio
 2.4.2. Objetivos específicos

 Determinar el crecimiento poblacional (cel. ml-1) de la microalga T. suecica

dosificados con tres concentraciones (5, 10 y 15 ml.l-1) de extracto acuoso
de S. fruticosa.
 Determinar la concentración de lípidos totales de la microalga T. suecica,
dosificados en concentraciones (5, 10 y 15 ml.l-1) con extracto acuoso de S.
fruticosa.

2.5. Hipótesis

Si en condiciones de laboratorio, utilizamos las concentraciones de 5, 10 y 15 ml. l-1

de ESALI, se obtendrá mayor crecimiento poblacional y concentración de lípidos
con el tratamiento de 10 ml. l-1

Ho: El crecimiento poblacional y la concentración de lípidos totales de los tres

tratamientos serán iguales a los obtenidos con el control.

Ha: El crecimiento poblacional y la concentración de lípidos totales serán mayor en

el tratamiento T2 (10 ml. l-1) con respecto a los otros tratamientos.

Hipótesis
H0 = Tc = T1 = T2 = T3
H1 = Tc < T1 < T2 > T3
Donde:
Tc: Medio de cultivo Guillard f/2
T1: 5 ml. l-1 de ESALI
T2: 10 ml. l-1 de ESALI
T3: 15 ml. l-1 de ESALI

2.6. Diseño experimental

El diseño experimental a utilizar será el de estimulo creciente (Arroyo, 1984), con

tres tratamientos (T1, T2, T3) y un grupo control, cada uno con 3 repeticiones (r1,
r2 y r3).
 Tratamientos Repeticiones Especificaciones
T1 r1 r2 r3 Cultivo de T. suecica con 5 ml. l-1 de
ESALI
T2 r1 r2 r3 Cultivo de T. suecica con 10 ml. l-1 de
ESALI
T3 r1 r2 r3 Cultivo de T. suecica con 15 ml. l-1 de
ESALI
Tc r1 r2 r3 Cultivo de T suecica con f/2 de Guillard

2.7. Estrategia de trabajo

Universo y Población

Durante la realización del experimento, se utilizarán 12 litros de T. suecica, cepa

proporcionada por el Laboratorio de Cultivos de Especies Auxiliares de la Universidad
Nacional del Santa.

Diseño y caracterización de la muestra

Los cultivos de T. suecica se mantendrán en condiciones de laboratorio bajo

iluminación y aireación constantes y los diferentes tratamientos con sus respectivas
réplicas serán realizados en botellas plásticas de 2000 ml de capacidad. Los cultivos
se realizarán en 1000 ml de agua de mar previamente tratada y filtrada, iniciándose
los cultivos con densidades de 20 x 104 cel.ml-1 y se realizarán conteos diarios de las
microalgas.

Técnicas e instrumentos de recolección de datos

1.- Preparación del extracto Acuoso de S. fruticosa (ESALI)

Se recolectará 1 kg de las “ramitas” de Salicornia procedentes de los arenales

aledañas al AA.HH. “Las Brisas”- Nuevo Chimbote, para lo cual se utilizará 1 balde de
plástico de 5 litros de capacidad, y posteriormente será llevado al laboratorio de
Cultivos de especies Auxiliares de la Universidad Nacional del Santa, para su
respectivo procesamiento. La elaboración del ESALI se realizará según el siguiente
flujograma (fig. 1).
 Ramitas de S. fruticosa (100 g)

Trituración mecánica

Filtrado (10 micras)

Centrifugado

Aforado (1000 ml)

Extracto de S. fruticosa

Fig. 1. Flujograma para la elaboración del ESALI.

2.- Análisis proximal de ESALI

Se destinara 100 ml. Del extracto acuoso de S. fruticosa para realizar un análisis
proximal del contenido de Proteínas, Carbohidratos, Lípidos, etc. Este análisis se
llevará a cado en el Laboratorio de COLECBI

3.- Cultivo de T. suecica

Los cultivos de T. suecica serán colocados en 12 botellas de vidrio de 2000 ml de

capacidad conteniendo 20 x 104 cel.ml-1 de inóculo; cada botella dispondrá de
mangueras de plástico y llaves reguladoras para el ingreso del aire proveniente de
un blower. Las 12 botellas serán distribuidas en tres tratamientos con sus
respectivas repeticiones más el tratamiento control.

4.- Dosificación del ESALI

Los cultivos experimentales serán dosificados al inicio de los ensayos en las

diferentes concentraciones consideradas (5, 10, 15 ml. l-1) del ESALI, y al tratamiento
control se le suministrará 1 ml. l-1 de medio Guillard f/2.

5.- Determinación de la curva de crecimiento

La curva de crecimiento de los cultivos algales será evaluada mediante conteos

diarios con una cámara de Neubauer con la finalidad de determinar las diferentes
fases del crecimiento con especial énfasis en el inicio y final de la fase exponencial.
6.- Determinación de lípidos.
Los lípidos se determinaron según metodología de Bligh & Dyer (1959) y Marsh &
Weinstein (1966), cuyo procedimiento es agregar a los tubos de ensayo 0.5 mg de
la biomasa seca pulverizada de B. plicatilis de cada unidad experimental, y después
se adiciona 3 ml de solución de cloroformo: metanol (2:1) se deja reposar por 24
horas bajo refrigeración a 5 °C. Luego se centrifuga a 10000 g por un periodo de 10
minutos, se elimina el sobrenadante y se evapora en un baño María a 80°C. Acto
seguido se lleva a la estufa a 105°C para su secado por una hora. Se agrega 2 ml de
ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado y se lleva a 200°C. Se deja enfriar a 10°C y las
lecturas se realizaron por espectrofotometría a 375nm de longitud de onda. La
correspondiente curva de calibración será elaborada utilizando colesterol y ácido
oleico.

ABSORBANCIA

K
Concentración de Lípidos (%) = x 100
Peso muestra

Donde k (1,8851) es el promedio de las curvas de calibración.

7. Técnicas de procesamiento y análisis de datos

Se aplicará el análisis de varianza (ANOVA) para establecer diferencias entre

promedios y de existir diferencias entre estos se empleará la prueba de comparación
múltiple de Tukey. Para ambos casos se utilizará un nivel de significancia del 5%.
8. Referencias bibliográficas

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