Tipos de Electroforesis

1.
Tipos de electroforesis
Existen principalmente dos métodos electroforéticos ampliamente utilizados: la electroforesis

convencional y la electroforesis capilar. La primera se lleva a cabo sobre papel o sobre un gel, en
los que se aplica la muestra directamente. La disolución tampón, que será el medio conductivo,
cubre la capa de papel o de gel. Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a
través de la placa. Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el
paso de la corriente y, si es necesario, las muestras se tiñen para visualizarlas.
1.1 Electroforesis de frente móvil o libre
1.2. Electroforesis de zona:

• Electroforesis en papel
• Electroforesis en gel
Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos
categorías:
a) Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo)
○ Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

○ PAGE en condiciones desnaturalizante
○ PAGE en condiciones no desnaturalizantes
○ SDS – PAGE
○ Isoelectroenfoque
○ Electroforesis en campos pulsantes
b) Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)
1.3 Electroforesis capilar

1.3.1 Electroforesis capilar de zona (CZE)
1.3.2 Electroforesis capilar en gel (CGE)
1.3.3 Isotacoforesis capilar (CITP)
1.3.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF)
1.3.5 Cromatografía electrocinética capilar micelar (MEKC)
Explicaremos ahora las electroforesis más comunes, utilizadas en laboratorio:
○ SDS – PAGE
Permite el cálculo de parámetros moleculares, pues los complejos SDS-proteína se separan
estrictamente según su tamaño molecular. El SDS interacciona con las proteínas formando
complejos de características comunes independientemente de las de cada proteína. Las proteínas
unen una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, lo que implica que las cargas propias de las
proteínas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la molécula de SDS proporciona una carga
negativa, por lo que los complejos SDS-proteína están cargados negativamente de forma
uniforme.
Como se comentó, la movilidad electroforética en una PAGE es función del tamaño y de la carga
por unidad de masa; como ésta es constante para todos los complejos SDS-proteína, esta
movilidad es solamente función de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la masa
molecular de la proteína, mayor será la movilidad de la misma y viceversa.
En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas debido a:
1 La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS.
2 Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo
sentido.
3 Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración también lo es y las
electroforesis son muy rápidas.
4 La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa molecular, que se
puede calcular.
5 Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente.
Figura: Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforetica de proteinas monomericas. En una
proteina nativa de 25 KDa, carente de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS (_____) o con SDS
+ DTT (--------) producen identico resultado. La proteina con un puente disulfuro intracatenario, en
presencia de SDS se desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el
disulfuro. El tratamiento con SDS + DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de
la proteina.
Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfóteros se separan según su
punto isoeléctrico (pI; pH al cual la carga neta de la proteína es nula) en un gradiente continuo de
pH.
En todos los métodos electroforéticos descritos anteriormente, la difusión es un fenómeno con
efectos negativos, que tiende a ensanchar las bandas, disminuyendo la resolución. En el EEF el
efecto de la difusión es mínimo y por ello posee una enorme resolución, pudiendo llegar a separar
proteínas que difieran en 0.001 unidades de pI. Esto se debe a que si una proteína focalizada en
su pI se desplazase por difusión, adquiriría carga (positiva o negativa según hacia el polo que
difundiera) y por efecto del campo eléctrico volvería a la zona de su pI; esto se llama efecto
focalizante del EEF y es el responsable de su enorme resolución. Además, el EEF aumenta su
resolución al disminuir el intervalo de gradiente de pH.
Por todo esto, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del EEF; para ello, se
emplean compuestos anfóteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son
pequeñas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes grupos ácidos y básicos, con un pI
que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad de tamponación cerca de su pI y con una
gran solubilidad y conductividad.
Una disolución de una mezcla de estos anfolitos tendrán un pH próximo al promedio de los pI. Si
esta disolución se emplea para la preparación de un gel de poliacrilamida, al aplicar una diferencia
de potencial cada molécula de anfolito migrará hacia uno u otro polo en función de su carga, hasta
alcanzar la zona de su pI. Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo
largo del gel. Si, debido a la difusión, los anfolitos abandonasen la zona de su pI, adquirirían carga
y experimentarían el efecto focalizante mencionado anteriormente.
Una de las aplicaciones más importantes del EEF es el cálculo de pI (figura ..); en el pocillo I se
aplican los marcadores de pI, y en el II la muestra (X) cuyo pI se desea conocer. El carril III
(sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH. Una vez corrido el gel, se trocea el
carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en 1mL de agua, determinándose su pH.
Finalmente, se representa el pH de cada fracción, frente a su posición en gel. La distancia migrada
por la muestra (X) se interpola en la recta obtenida, determinándose así su pH.
Figura: Determinación del punto isoelectrico de una muestra.
1. Desventajas presentes en la electroforesis
Desventajas en la e. con papel:

• si el papel es fino se puede desgarrar con facilidad
• si el papel es grueso, las bandas se distorsionan
• se produce iteración entre las proteinas y los grupos hidroxilos de la celulosa del papel, por lo
tanto la migración se frena.
• Calidad del papel: 90% de alfa celulosa. Absorción de agua y conductividad electrica.
• Efecto electroosmotico anodo- cátodo(1)
Desventajas en la e. con acetato de celulosa:
• puede contener algunos grupos, como acido carboxilico y sulfato, que producen fenómeno
electroósmosis.
Desventajas de la e. en gel:
• El tamaño de los poros y el radio de la molécula van a producir cierta resistencia o friccio al
movimiento de migración de la muestra en el gel.
Desventajas de la e. en acetato de celulosa:

• La tiras de acetato de celulosa tiene propiedades de adsorcion minimas, por lo que captan poco
agua y son mas susceptibles a la evaporación que el papel.
• Son tambien mas susceptibles al flujo electro - endosmotico
(1)
Electroendósmosis (EEO). Es un fenómeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los no

restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debidas a grupos carboxilo o sulfato,
al estar en contacto con una disolución iónica.
Al aplicar el campo eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan según su carga, pero en su
migración se encuentran con un flujo de cationes desplazándose sobre la superficie del soporte y
otro de aniones haciéndolo por el centro de los poros (figura 2.1). Este flujo orientado se llama
flujo electroendosmótico. El EEO va en contra de la resolución de una electroforesis, ya que las
bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuirá a una mejor
resolución en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis
○ SDS – PAGE
Permite el cálculo de parámetros moleculares, pues los complejos SDS-proteína se separan
estrictamente según su tamaño molecular. El SDS interacciona con las proteínas formando
complejos de características comunes independientemente de las de cada proteína. Las proteínas
unen una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, lo que implica que las cargas propias de las
proteínas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la molécula de SDS proporciona una carga
negativa, por lo que los complejos SDS-proteína están cargados negativamente de forma
uniforme.
Como se comentó, la movilidad electroforética en una PAGE es función del tamaño y de la carga
por unidad de masa; como ésta es constante para todos los complejos SDS-proteína, esta
movilidad es solamente función de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la masa
molecular de la proteína, mayor será la movilidad de la misma y viceversa.
En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas debido a:
1 La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS.
2 Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo
sentido.
3 Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración también lo es y las
electroforesis son muy rápidas.
4 La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa molecular, que se
puede calcular.
5 Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente.
Figura: Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforetica de proteinas monomericas. En una
proteina nativa de 25 KDa, carente de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS (_____) o con SDS
+ DTT (--------) producen identico resultado. La proteina con un puente disulfuro intracatenario, en
presencia de SDS se desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el
disulfuro. El tratamiento con SDS + DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de
la proteina.
Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfóteros se separan según su

punto isoeléctrico (pI; pH al cual la carga neta de la proteína es nula) en un gradiente continuo de
pH.
En todos los métodos electroforéticos descritos anteriormente, la difusión es un fenómeno con
efectos negativos, que tiende a ensanchar las bandas, disminuyendo la resolución. En el EEF el
efecto de la difusión es mínimo y por ello posee una enorme resolución, pudiendo llegar a separar
proteínas que difieran en 0.001 unidades de pI. Esto se debe a que si una proteína focalizada en
su pI se desplazase por difusión, adquiriría carga (positiva o negativa según hacia el polo que
difundiera) y por efecto del campo eléctrico volvería a la zona de su pI; esto se llama efecto
focalizante del EEF y es el responsable de su enorme resolución. Además, el EEF aumenta su
resolución al disminuir el intervalo de gradiente de pH.
Por todo esto, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del EEF; para ello, se
emplean compuestos anfóteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores, que son
pequeñas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes grupos ácidos y básicos, con un pI
que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad de tamponación cerca de su pI y con una
gran solubilidad y conductividad.
Una disolución de una mezcla de estos anfolitos tendrán un pH próximo al promedio de los pI. Si
esta disolución se emplea para la preparación de un gel de poliacrilamida, al aplicar una diferencia
de potencial cada molécula de anfolito migrará hacia uno u otro polo en función de su carga, hasta
alcanzar la zona de su pI. Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo
largo del gel. Si, debido a la difusión, los anfolitos abandonasen la zona de su pI, adquirirían carga
y experimentarían el efecto focalizante mencionado anteriormente.
Una de las aplicaciones más importantes del EEF es el cálculo de pI (figura ..); en el pocillo I se
aplican los marcadores de pI, y en el II la muestra (X) cuyo pI se desea conocer. El carril III
(sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH. Una vez corrido el gel, se trocea el
carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en 1mL de agua, determinándose su pH.
Finalmente, se representa el pH de cada fracción, frente a su posición en gel. La distancia migrada
por la muestra (X) se interpola en la recta obtenida, determinándose así su pH.
Figura: Determinación del punto isoelectrico de una muestra.

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1.

Existen principalmente dos métodos electroforéticos ampliamente utilizados: la electroforesis

1.1 Electroforesis de frente móvil o libre

1.2. Electroforesis de zona:

a) Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo)

○ Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)

b) Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

1.3 Electroforesis capilar

Explicaremos ahora las electroforesis más comunes, utilizadas en laboratorio:

Figura: Determinación del punto isoelectrico de una muestra.

1. Desventajas presentes en la electroforesis

Desventajas en la e. con papel:

Desventajas de la e. en acetato de celulosa:

Electroendósmosis (EEO). Es un fenómeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los no

Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfóteros se separan según su

Figura: Determinación del punto isoelectrico de una muestra.

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