PROCEDIMIENTO TÉCNICO PARA EL AISLAMIENTO CODIGO P-SA-81

Y RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS FECHA DE 22/07/2016

Clostridium sulfito reductor EMISIÓN
ICMSF VERSIÓN 01

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PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO Y RECUENTO DE FORMAS

ESPORULADAS DE Clostridium sulfito reductor EN MUESTRAS DE
ALIMENTOS DE CONSUMO HUMANO
ICMSF

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO SECRETARIO DE SALUD REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN
REPRESENTANTE DE CALIDAD
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
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EMISIÓN
MUESTRAS EN ALIMENTOS DE CONSUMO
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1. OBJETIVO

Describir la Técnica de Aislamiento y recuento de bacterias de Esporas Clostridium

sulfito reductor para detectar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en
análisis microbiológico en alimentos de consumo humano.

2. ALCANCE

El procedimiento técnico de Aislamiento y recuento de bacterias de Esporas

Clostridium sulfito reductor en Alimentos de consumo humano, aplica a todas las
muestras para análisis microbiológico que son recepcionadas y analizados en Laboratorio
de Salud Pública

3. DEFINICIONES

 Clostridium sulfito reductor: Son aquella bacterias de morfología bacilar gram

positiva, anaerobias estrictas, capaces de formar esporas y con capacidad de reducir
el sulfito a sulfuro. Son colonizadores habituales del intestino humano y de algunos
animales. Esta cualidad unidad a la alta resistencia de sus esporas le dan valor como
indicadores de contaminación fecal de carácter no reciente tanto en agua como en
alimentos

 Espora: Célula reproductora producida por ciertos hongos, plantas (musgos,

helechos) y algunas bacterias. Ciertas bacterias producen esporas como mecanismo
de defensa. Las esporas bacterianas tienen paredes gruesas y pueden resistir las
altas temperaturas, la humedad, la acción de productos de limpieza y otras
condiciones desfavorables.

 Unidades formadoras de colonias (UFC): Término que debe utilizarse para reportar
la cuenta de colonias en placa.

 Siembra volumétrica: Este método de siembra consiste en sembrar una muestra

liquida, en medio de cultivo sólidos o líquidos.

4. RESPONSABLES

Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de

Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Pública del Meta cumplir con los
lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté
debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de
muestras.
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5. GENERALIDADES

Algunas de las especies del género Clostridium tienen la propiedad de reducir el ion sulfito
a sulfuro que en presencia de citrato férrico o cualquier otra sal (metales pesados) forman
colonias de color negro

El recuento de esporas es considerado como el indicador más importante de las bacterias

anaerobias capaces de formar esporas. Estas estructuras de supervivencia suelen
presentarse en alimentos enlatados que no han sido producidos bajo condiciones de
calidad en cada proceso y malas condiciones de almacenamiento

6. REFERENCIAS

Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. INVIMA

7. DESARROLLO

7.1 Fundamento

Los microorgnismos anaerobios obligados (Bacillus, Clostridium...) sólo pueden crecer a

bajos potenciales redox, y algunos únicamente crecerán en ausencia de oxígeno. Suelen
encontrarse en la parte interna de los alimentos no procesados y juntamente con los
anaerobios facultativos constituyen los principales microorganismos de la alteración. Su
valoración en los alimentos nos sirve como indicador de contaminación telúrica remota por
la presencia de esporas resistentes. El número máximo de esporas, es decir, el "número
total de esporos", se puede determinar usando tratamientos térmicos de la muestra del
orden de los 70-80°C durante 10-15 minutos, con lo que conseguimos destruir las formas
vegetativas y revivificar tan solo los esporos. Al hacer recuento hay que partir del principio
de que una espora da lugar a una colonia en el medio de cultivo

7.1.1 AGAR SPS (AGAR SULFITO- POLIMIXINA - SULFADIAZINA)

SPS Agar se utiliza para la detección y recuento de Clostridium perfringens en los

alimentos.

SPS Agar contiene peptona como fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales.
Vitaminas, extracto de levadura material de construcción del complejo B que estimula el
crecimiento bacteriano. Citrato férrico de sodio y sulfito son indicadores de H2S.
Clostridium reduce el sulfito a sulfuro, que reacciona con el hierro de citrato férrico para
formar un negro hierro precipitado de sulfuro. Polisorbato 80 es un agente dispersante.
Sulfato de polimixina B y sulfadiazina son inhibidores para los organismos que no sea
Clostridium spp. tioglicolato de sodio es un reducción de agente. El agar es el agente
solidificante.
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7.2 MATERIALES

Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara

conforme al P-SA—83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de
muestras de alimentos para consumo humano.

7.2.1 Equipos

 Incubadora a 35°C ±1°C

 Tubos tapa rosca de 150 x 15mm estériles
 Jarra de anaerobiosis.
 Baño María 80°C

7.2.2 Medios de cultivo y reactivos

 Agar SPS (Agar Sulfito- Polimixina - Sulfadiazina)

 Kit de generación de condiciones de anaerobiosis AnaerogenTM (Oxoid).

7.2.3 Cepas de Referencia

 Escherichia coli ATCC 25922

 Clostridium perfringens ATCC 13124

7.3 PROCEDIMIENTO

7.3.1 Controles y o curvas de calibración

 Control Positivo: A partir de una siembra de Clostridium perfringens ATCC 13124

sembrado en Agar TSAYE, Agar Pate Count o Agar Nutritivo, se toma una porción
de la colonia con la ayuda de un asa recta desechable y estéril, siembra por
punción en un tubo que contiene Agar SPS (Agar Sulfito- Polimixina - Sulfadiazina)
e incubar en cámara de anaerobiosis los tubos a 35°C +/- 1°C - 24, 48 y 72 horas
debido a que los microorganismos pueden producir a las 24 horas.

 Control Negativo: A partir de una siembra de E.coli ATCC 25922 sembrado en

Agar TSAYE, Agar Pate Count o Agar Nutritivo, se toma una porción de la colonia
con la ayuda de un asa recta desechable y estéril, siembra por punción en un tubo
que contiene Agar SPS (Agar Sulfito- Polimixina - Sulfadiazina) e incubar en
cámara de anaerobiosis los tubos a 35°C +/- 1°C - C - 24, 48 y 72 horas debido a
que los microorganismos pueden producir a las 24 horas.

7.3.2 Condiciones Ambientales y manejo de equipos

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Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83

Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para
consumo humano.

7.4 Descripción del Método

La técnica se basa en Recuento en Tubo del número de colonias de bacterias

esporuladas y con capacidad sulfito reductora desarrolladas en medio de cultivo sólido
glucosado con sulfito sódico y una sal de hierro, tras incubación en anaerobiosis.

7.4.1 Metodología

 Preparación de la muestra. Realizar diluciones seriadas hasta 10-² bajo cabina de

flujo laminar.
 Pipetear 1ml de cada una de las diluciones en tubos estériles.
 Colocar los tubos en baño de María a 80°C durante 10min. Dejar enfriar
rápidamente en agua corriente
 Verter 9 mL del Agar SPS en los tubos mediante siembra en profundidad. Agitar y
dejar solidificar
 Adicionar una segunda capa de medio. Dejar solidificar
 Colocar las cajás en cámara de anaerobiosis e incubar a 35°C+/-1 durante 72
horas.

7.4.1.1 Lectura
7.4.1.1.1 Macroscópica
 Se recomienda observar los tubos a las 24, 48 y 72 horas debido a que los
microorganismos pueden producir a las 24 horas H2S tornando el medio de cultivo
de color negro, impidiendo su lectura.
 Se deben seleccionar las cajas que presenten recuentos entre 15-150 colonias. de
color negro.
 Calcular el número total de colonias multiplicándolo por el inverso de la dilución.

Crecimiento de colonias de Clostridium en agar SPS

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7.4.1.1.2 Microscopio
Género de bacterias anaerobias, bacilos grampositivas, parásitas y saprófitas algunas
de ellas, que esporulan, y son móviles, en general por intermedio de flagelos periticos.

7.4.1.2 Cálculos
 Resultado positivo: Las colonias de Clostridium sulfito reductores aparecerán de
color negro debido a la formación de sulfuro de hierro por reducción del sulfito.
Contar el número de colonias negras desarrolladas en la totalidad de la columna
de agar, sin tener en cuenta las puntiformes.
Ejemplo:

10-1: 4 colonias = 40 ufc/g ó mL

 Resultado negativo: Ausencia de colonias negras.

7.4.1.3 Expresión de Resultados

 Resultado Positivo. Presencia de colonias: 10-1: 4 colonias = 40 ufc/g ó mL

 Resultado Negativo: Ausencia de colonias, expresar el resultado como:

Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor: <10 ufc/g ó mL

8. VERIFICACIONES

8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados

Para comprobar la capacidad del laboratorio de realizar de detectar Formas

Esporuladas de Clostridium Sulfito Reductor, con el método técnico de Aislamiento y
Recuento, realizar los siguientes controles con material de Referencia y analizados en
las mismas condiciones que la muestra.

Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa
de siembra estéril e inoculo en una caja del medio selectivo utilizado una muestra
(actividad 7.5)
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Medio de Cultivo Control Imagen

Control Positivo
Clostridium
perfringens ATCC
13124
Agar SPS (Agar
Sulfito-
Polimixina -
Sulfadiazina)

Control Negativo
E.coli ATCC 25922

Registrar en los formatos

 F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

 F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas
 F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos
 F-SA-34 Control Interno de Equipos
 F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos.
 F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Criterio de Aceptación o Rechazo

ACCION PARA
RANGO DE ACEPTACION
CRITERIO LECTURA INCUMPLIMIENTO DE
CRECIMIENTO
CRITERIOS
Control Positivo
Clostridium perfringens Colonias negras con producción de Repetir Análisis
Inhibido
ATCC 13124 H2S Verificar.

Repetir siembra de
Control Negativo Verificar el Crecimiento en el control
Masivo cepas ATCC y repetir el
E.coli ATCC 25922 Positivo
Análisis
Descartar Reactivos y
Vigencia del reactivo dentro de la Reactivo Vigente a la fecha de adquirir y procesar con
Reactivos vigentes
fecha utilización reactivos en fechas
vigentes
Ajustar control de
Temperatura y tomar
Temperaturas de Temperatura ajusta a Temperatura
nuevamente hasta
Incubadoras 35ºC +/- 1 35ºC +/- 1
obtener temperatura
deseada.
Mantenimiento de Calibración, verificación y Calibración, verificación y Solicitar y ejecutar los
equipos mantenimiento vigente mantenimiento vigente mantenimientos o
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verificaciones
pendientes para realizar
análisis con equipos
idóneos
Descartar el Material y
Verificar la fecha de esterilización de Fecha de esterilización de realizar el proceso con
Control de Esterilización
Material, verificar el cumplimiento de Material. Controles de material que cumpla con
de Material
los controles de esterilización. esterilización. los controles de
esterilización.

Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis

Microbiológico F-SA-101

9. REGISTROS

Como Tiempo de
Registro Responsable Donde conservarlo Disposición final
conservarlo conservación
F-SA-18 Hoja
de Vida de Profesional
Equipos Universitario o
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Profesional del Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Laboratorio
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Físico maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-34
Control Interno Auxiliar de
de Equipos. Laboratorio, Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Profesional Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Profesional del Físico maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-46
Control De Auxiliar de
Temperatura, Laboratorio, Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Limpieza y Profesional
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Desinfección Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
de Equipos Profesional del Físico maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental
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Como Tiempo de
Registro Responsable Donde conservarlo Disposición final
conservarlo conservación
F-SA-64
Identificación Auxiliar de
de Sustancias Laboratorio,
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Químicas Profesional
Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
Universitario o
Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
Profesional del Físico
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

F-SA-75
Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Resultados Profesional
Microbiológico Universitario o Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
s de Alimentos Profesional del Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
Laboratorio
Físico tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental
F-SA-101 Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado Según F-MC-04 Listado
Control de Maestro de documentos, Maestro de documentos, Maestro de documentos,
calidad Profesional del Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado Según F-MC-03 -Listado
análisis Laboratorio Físico maestro de registros y/o maestro de registros y/o maestro de registros y/o
microbiológico tabla de retención tabla de retención tabla de retención
documental documental documental

10. HISTORIAL

VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS

CAMBIOS
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