CRISTALIZACIÓN

La operación de cristalización consiste en separar un soluto de una solución mediante la

formación de cristales. Una vez formados, los cristales se separan de la solución obteniéndose el
soluto con un alto grado de pureza.

Durante el proceso de cristalización los cristales deben formarse primero y luego crecer. Al
fenómeno de formación de pequeños cristales se le llama nucleación y a la formación capa por capa
del cristal se le llama crecimiento.

La sobresaturación es la fuerza impulsora tanto de la nucleación como del crecimiento de

los cristales. Si la solución sólo está saturada, los cristales no se transforman ni crecen, mientras que
si está subsaturada éstos tienden a disolverse.

La cristalización es muy utilizada a nivel industrial para recuperar sales como cloruro de
sodio y sulfato de amonio a partir de soluciones acuosas. Algunas sustancias orgánicas como la
sacarosa y la glucosa también son obtenidas mediante procesos que involucran una operación de
cristalización. Varios productos biotecnológicos de uso masivo como algunos antibióticos y ácidos
orgánicos, así como algunos productos terapéuticos, son comercializados en forma de cristales. Esta
diversidad de procesos se traduce en una gran variabilidad en la capacidad de los cristalizadores
industriales que oscila de gramos a cientos de toneladas por día.

La cristalización es una operación ampliamente utilizada en los procesos biotecnológicos

debido a que ofrece entre otras, las siguientes ventajas: a) se puede obtener en una sola etapa un
producto de una pureza de hasta un 99%, b) se puede controlar la operación de tal manera que se
produzcan cristales uniformes que faciliten su manejo, empaque, almacenamiento, c) mejora la
presentación o apariencia del producto para su comercialización y d) es una operación que puede
llevarse a cabo a temperaturas moderadas. En el caso de proteínas terapéuticas, su forma
cristalizada puede ofrecer ventajas en su administración (Hekmat et al., 2008).

Frecuentemente la operación de cristalización va acompañada de un lavado de los cristales

en un equipo de separación sólido-líquido y de un secado final.

Para evaluar el uso de la operación de cristalización como alternativa para la purificación de

un producto, es necesario contar con determinada información básica relacionada con el producto
y sus soluciones como:

 Tipo de cristales que forma el producto.

 Pureza de los cristales en el producto.
 Equilibrio: Solubilidad y sobresaturación de soluciones del soluto en agua u
otro solvente.
 Modos de operación posibles para generar la sobresaturación de la solución
del soluto.
 Cinética: Velocidad con que se originan (nucleación) y aumentan de tamaño
los cristales en la solución (crecimiento).
 Distribución de tamaños en poblaciones de los cristales.
 Un cristal es un sólido compuesto por átomos, iones o moléculas dispuestos en un arreglo
tridimensional ordenado y periódico (retícula espacial). La distancia entre los átomos del cristal de
cualquier material es constante y característica de dicho material. Los ángulos entre las caras de los
cristales también son característicos y dan origen a cinco tipos básicos de cristales y a siete sistemas
cristalográficos.

En el sistema más sencillo, el sistema cristalográfico cúbico, tanto las distancias

características (largo, ancho y alto) como los tres ángulos característicos son iguales. Otros tipos de
sistemas difieren de este comportamiento originando los sistemas tetragonal, ortorrómbico,
hexagonal, monoclínico, triclínico y trigonal.

Desde el punto de vista industrial el término “hábitat del cristal” se refiere a los tamaños
relativos de las caras del cristal. El hábitat de un cristal es de gran importancia: los cristales largos
como agujas se rompen muy fácilmente durante su centrifugación y secado; los cristales en forma
de disco son difíciles de lavar durante su centrifugación y difíciles de filtrar. Los cristales esféricos
son los más fáciles de manejar.

Pureza de los Cristales

La mayoría de las soluciones cuando forman cristales a velocidades de crecimiento

moderadas y a condiciones constantes, los cristales formados sólo contienen un componente
alcanzado purezas hasta de 99.8%. Las impurezas de los cristales generalmente se deben al
atrapamiento de líquido en el cristal en pequeñas bolsas u oclusiones. Además de este tipo de
impureza, normalmente después de la separación de los cristales de la solución, parte de la solución
queda adherida a la superficie del cristal, lo que hace necesario lavar los cristales.

Las relaciones de equilibrio para los sistemas de cristalización se presentan en forma de

curvas de solubilidad, éstas presentan la solubilidad de soluciones saturadas a diferentes
temperaturas. Esta solubilidad es la máxima que puede alcanzar la solución en forma
termodinámicamente estable. La saturación es resultado del equilibrio entre la fase sólida y la fase
líquida, y consecuencia de la igualación de sus potenciales químicos.

Los datos experimentales de equilibrio sirven de base para la evaluación de las diversas
opciones que existen para llevar a cabo un proceso de cristalización ya que permiten, entre otras
cosas: a) determinar si el sólido que se cristaliza sólo contiene el soluto de interés, b) seleccionar el
solvente, c) establecer el rango de temperatura y presión de operación, d) conocer la concentración
del líquido a la salida del cristalizador y e) determinar la recuperación máxima posible de la
operación. El conocimiento del comportamiento de la solubilidad de una sustancia es básico en la
selección del modo para realizar su cristalización.

Sobresaturación

Pudiera pensarse que una solución con una concentración de soluto mayor a la de
saturación forma inmediatamente cristales pequeños o núcleos. Sin embargo, actualmente es bien
conocido que bajo diferentes condiciones una solución puede contener más soluto que el
correspondiente a la saturación, formando lo que se conoce como solución sobresaturada. El
estudio del fenómeno de sobresaturación es fundamental en el diseño de cristalizadores.
 La curva de solubilidad separa dos regiones: a) la región de subsaturación donde una
solución es capaz de disolver más soluto a las condiciones dadas y b) la región de sobresaturación.

El conocimiento de la región de sobresaturación permite determinar regiones de operación.

En el caso de una operación por lotes, con el propósito de lograr un tamaño de cristal lo más
uniforme posible, el grado de sobresaturación se mantiene en la región metaestable, de tal manera
que la sobresaturación generada sirva para el crecimiento de los cristales ya existentes (sembrados)
y no exista formación de cristales nuevos.

En una cristalización continua la sobresaturación debe ser mantenida en el límite inferior

de la región intermedia, de tal manera que el número de cristales que se retiran en la corriente de
salida sea igual al número de cristales generados por nucleación. Además, es necesario proveer un
mecanismo de clasificación de cristales, de tal manera que sólo se retiren cristales de un mismo
tamaño. Esto se logra utilizando un lecho fluidizado de cristales, el cual proporciona un área
adecuada para remover la sobresaturación mediante el crecimiento de los cristales.

El modo de operación en una cristalización es la técnica empleada para generar la

sobresaturación de la solución. La selección del modo de operación está fuertemente influenciada
por las características de la solubilidad en equilibrio del sistema. Una vez que se ha seleccionado el
modo de operación del cristalizador es posible desarrollar los balances de masa y energía del
sistema.

Los principales modos para generar la sobresaturación son por: a) enfriamiento, b)

enfriamiento evaporativo, c) evaporación térmica y d) evaporación térmica al vacío.

Sobresaturación por enfriamiento

Cuando la solubilidad del soluto varía sensiblemente con la temperatura, el enfriamiento de

la solución a tratar permite la formación de cristales con altos rendimientos y bajo consumo
energético. Este enfriamiento puede realizarse en forma externa mediante un intercambiador, o
directamente utilizando un líquido refrigerante inmiscible con la solución y con propiedades
termodinámicas que minimicen el trabajo de compresión necesario. En este tipo de operación la
evaporación de solvente es mínima.

Recientemente, se ha combinado la técnica de enfriamiento con el uso de antisolventes,

que son sustancias que se añaden al medio para mejorar la cristalización, ya sea por disminuir la
solubilidad o cambiar una propiedad química como el pH (Lindenberg et al., 2009).

Sobresaturación por enfriamiento evaporativo

En este modo el enfriamiento se produce con auxilio de un sistema de vacío. La alimentación

entra a una temperatura mayor que la mantenida dentro del cristalizador enfriándose
adiabáticamente dentro de éste. Este modo también es aplicable cuando la solubilidad del soluto es
muy sensible a la temperatura.

Sobresaturación por evaporación térmica

 En este modo se transfiere calor al sistema para evaporar solvente y generar la formación
de cristales por “salting out”. Este modo se emplea sólo cuando la solubilidad del soluto es insensible
a la temperatura.

Sobresaturación por evaporación térmica al vacío

En este modo la alimentación tiene una temperatura mayor que la mantenida en el

cristalizador y al entrar se enfría adiabáticamente. Paralelamente se transfiere calor al sistema para
evaporar solvente con auxilio de un sistema de vacío. Este modo es empleado para la cristalización
de solutos cuya solubilidad tiene una dependencia intermedia respecto a la temperatura.

Cinética de la Cristalización

Los fenómenos cinéticos asociados a la cristalización son la nucleación o formación de

cristales nuevos, y el crecimiento de éstos. La fuerza impulsora de ambos fenómenos es la
sobresaturación. A niveles elevados de sobresaturación ambos fenómenos compiten por el soluto
disponible.

Nucleación

La velocidad de nucleación afecta el tamaño que los cristales pueden alcanzar en un

cristalizador por lotes. Conforme mayor sea la velocidad de nucleación menor es el tamaño de los
cristales obtenidos. En el caso de una cristalización continua el aumento de la velocidad de
nucleación se traduce en un mayor tiempo de residencia de los cristales. Existen dos mecanismos
de formación de cristales: a) nucleación primaria y b) nucleación secundaria.

Nucleación primaria

En la nucleación primaria el cristal nuevo se origina espontáneamente a partir de la solución

sobresaturada (nucleación homogénea) o bien se origina a partir de un material insoluble, ya sean
impurezas o cristales del mismo material previamente sembrados (nucleación heterogénea).

Nucleación secundaria

Es la formación de cristales nuevos como resultado de la presencia de cristales ya crecidos

de soluto. Puede originarse por medio de varios mecanismos como:

a) Sembrado. Al colocarse cristales del material en una solución

sobresaturada, se piensa que el cristal libera pequeños cristales que se formaron durante el
proceso de secado y que dan origen a nuevos cristales.
b) Contacto. Consiste en la producción de cristales nuevos mediante el
rompimiento de los cristales por choques entre sí o con las diferentes partes del equipo:
tanque, bombas y agitadores.
c) Esfuerzo cortante. Cuando la solución sobresaturada fluye sobre la
superficie de los cristales se considera que puede despegar segmentos de cristal, que
pueden a su vez originar nuevos cristales.
 Velocidad de nucleación

La velocidad de nucleación es función de la sobresaturación y del mecanismo que la origina.

En general se observa que la dependencia de la velocidad de nucleación primaria con la
sobresaturación es de mayor orden que la de la velocidad de nucleación secundaria.

La mayoría de los cristalizadores operan en la región de baja sobresaturación para que el

crecimiento del cristal sea regular y el producto puro. Por tal motivo la nucleación secundaria es la
más empleada a nivel industrial. Por otro lado, los mecanismos para controlar la nucleación
secundaria pueden establecerse con relativa facilidad a ese nivel.

Crecimiento

El crecimiento de cristales es un fenómeno cuya fuerza impulsora también es la

sobresaturación. El crecimiento de un cristal es un proceso de adición capa por capa.

Velocidad de crecimiento

El crecimiento sólo puede ocurrir en la superficie del cristal y las resistencias involucradas
en el crecimiento son la de la difusión del soluto hasta la superficie del cristal y la resistencia a la
integración del soluto a la superficie del cristal.

Longitud característica

Uno de los objetivos de la cristalización es producir cristales de tamaño uniforme, por tal
motivo la velocidad de crecimiento de un cristal generalmente se asocia a una longitud característica
medible. Esta longitud puede ser determinada por varios métodos, siendo el más utilizado el del
tamizado de los cristales bajo estudio.

PRECIPITACIÓN

Introducción

Precipitación es el proceso en el que un soluto soluble se separa en forma de sólido insoluble

de una solución mediante la acción de un agente precipitante.

Algunos productos biotecnológicos presentan solubilidades que varían con la temperatura,

el pH, la fuerza iónica y con la constante dieléctrica del medio. Esta propiedad puede ser utilizada
para concentrar y purificar estos productos mediante la operación de precipitación. A nivel
industrial puede ser utilizada para la obtención de productos proteicos y nucleicos.

Teóricamente la precipitación debe producir un soluto concentrado y relativamente puro,

por lo que es una operación que se usa con frecuencia al inicio de un proceso de bioseparación. Los
agentes precipitantes seleccionados no deben producir desnaturalización del soluto y deben
proveer una mayor estabilidad del soluto en el precipitado que en la solución.
 La precipitación de proteínas y la subsecuente recuperación del precipitado, son de las
operaciones más importantes para la recuperación y purificación de proteínas tanto a nivel
laboratorio como a escala industrial.

Las ventajas de usar la precipitación para la concentración y purificación de solutos son,

entre otras, las siguientes:
1. Es relativamente barata.
2. Es una operación que se adapta fácilmente a gran escala.
3. Puede realizarse en forma continua.
4. El equipo que se utiliza es sencillo.
5. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos éstos son baratos.

La precipitación de proteínas puede realizarse empleando diferentes principios:

 Precipitación por disminución de la solubilidad.

 Precipitación por desnaturalización selectiva.
 Precipitación por afinidad.

Precipitación por Disminución de la Solubilidad

El hecho de que las proteínas sean moléculas anfotéricas se debe a que sus superficies
presentan regiones hidrofóbicas, y regiones hidrofílicas cargadas ya sea positiva o negativamente.

Debido a su naturaleza anfotérica cuando una proteína se encuentra en solución acuosa

produce complejas interacciones con la solución que la rodea. Particularmente, cuando se agrega
un agente precipitante a la solución, las proteínas que presentan mayor hidrofobocidad (por contar
con mayor cantidad de aminoácidos hidrofóbicos en su superficie) precipitan más fácilmente que
las de menor hidrofobicidad. En el primer caso las proteínas tienen una baja solubilidad y en el
segundo caso una alta solubilidad. De lo anterior se desprende que la estructura de la proteína
determina su solubilidad.

La proteína permanece en solución cuando termodinámicamente es más favorable estar

rodeada por el solvente que estar en un agregado con otra proteína formando una fase sólida. La
proteína puede insolubilizarse ya sea cambiando las características de su superficie, o cambiando el
solvente que la rodea. Como el cambiar las características de la superficie de la molécula puede
implicar cambiar la proteína misma, generalmente se opta hacer cambios en el solvente que alteren
la solubilidad de la proteína.

Los métodos utilizados para la precipitación de proteínas que se revisan en esta sección y
que están basados en la disminución de la solubilidad por alteración el solvente son: a) precipitación
con sales, b) precipitación isoeléctrica, c) precipitación con solventes y d) precipitación con
polímeros no iónicos.

Precipitación con sales

Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la purificación de enzimas es la llamada
precipitación por insolubilización por salado o “salting out” (Cheng et al., 2006), que se realiza
agregando altas concentraciones de sal a la solución en la que se encuentra la proteína para producir
su precipitación.

La descripción simplificada del mecanismo de insolubilización por salado está basada en el

hecho de que la adición de las sales elimina el agua de la proteína hidratada, dejando las regiones
hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente (Glatz, 1990). Aquellas proteínas que
presentan mayor número de regiones hidrofóbicas sobre su superficie, forman agregados y
precipitan más rápidamente que aquellas que presenten pocas regiones hidrofóbicas.

Debido a esta propiedad hay proteínas que pueden permanecer en solución a altas
concentraciones de sal.

Las sales que producen mejores resultados, esto es, una mayor precipitación de la proteína,
son aquellas que producen deshidratación de las regiones hidrofóbicas y fomentan la hidratación
de las regiones polares de la proteína, sin interaccionar directamente con ésta. Existen reglas
heurísticas para seleccionar la sal más adecuada para un proceso de precipitación, algunas de ellas
son las siguientes:

1. Los aniones son más efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):

citrato−3 > tartato−2 > SO−2 > F−> IO−3 > H2PO−4 > CH3COO- > Cl− > ClO−3 > Br−> NO−3 > ClO−4 > I−
2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:
NH+4 > K+> Na+
3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que requiere el
método.
4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea diferente a la de la
solución para facilitar su separación.
5. Añadir la sal en forma sólida y no como solución, para minimizar la dilución.

Precipitación isoeléctrica

Otra técnica muy utilizada para precipitar proteínas se basa en la disminución de su

solubilidad en el punto isoeléctrico. Las proteínas por su naturaleza anfotérica presentan una carga
neta negativa a pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH isoeléctrico
al cual la carga neta de la proteína es cero. A este pH la molécula es incapaz de desplazarse en un
campo eléctrico.

Cuando la proteína se encuentra a un pH diferente de su pH isoeléctrico, las moléculas

proteicas poseen una carga eléctrica neta del mismo signo. Debido a esto existe una repulsión
electrostática entre las moléculas ocasionando que su solubilidad se incremente.

En el punto isoeléctrico el efecto de las fuerzas electrostáticas entre las proteínas es casi
nulo. En estas condiciones la solubilidad de la proteína es mínima, y en consecuencia las moléculas
de proteína tienden a unirse y a precipitarse. A este tipo de precipitación se le llama precipitación
isoeléctrica.

Cada proteína tiene un pH isoeléctrico característico por lo que la precipitación isoeléctrica

puede utilizarse como una operación de purificación de proteínas. Sin embargo, cabe hacer notar
que hay algunas proteínas como las globulinas, que presentan una solubilidad considerable aún
cuando se encuentren en su pH isoeléctrico.

Selección del agente precipitante.

La precipitación isoeléctrica comúnmente se realiza a pH’s ácidos, debido a que los ácidos
son baratos y varios de ellos como el fosfórico, clorhídrico y sulfúrico son aceptables en productos
alimenticios (Salcedo-Chávez et al., 2002). La principal desventaja de usar ácidos es su potencial de
producir daños irreversibles a la proteína.

Precipitación con solventes

La precipitación de las proteínas de una solución también puede realizarse mediante la

adición de un solvente orgánico ligeramente polar. El agua se caracteriza por su alta constante
dieléctrica, esto significa que los iones en solución acuosa presentan interacciones más débiles que
en otros medios.

Cuando se agrega un solvente orgánico como etanol o acetona, a una solución acuosa de
proteínas (a un pH y temperatura dados), se producen agregados de moléculas proteicas que
tienden a precipitar. Este efecto se debe principalmente a que el solvente presenta una constante
dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las fuerzas de atracción entre
cargas opuestas y una disminución en el grado de ionización de los radicales de la proteína, y en
consecuencia una disminución de la solubilidad de ésta.

Debido a que la influencia de la constante dieléctrica es muy sensible a la temperatura, este

tipo de precipitación debe trabajarse a temperaturas bajas.

Selección del solvente

La mayor desventaja de la precipitación con solventes es la desnaturalización que puede

sufrir la proteína por acción del solvente, de tal manera que es importante seleccionar
adecuadamente éste. En el caso del uso de monoalcoholes como solventes, la desnaturalización se
incrementa conforme la cadena alquilo se incrementa.

También debe tenerse muy en cuenta la flamabilidad del solvente principalmente cuando
se trabaja a gran escala, ya que algunos de ellos como los alcoholes son altamente inflamables y el
uso seguro de los mismos ocasiona incrementos en los costos.

Algunos criterios que es necesario considerar en la selección del solvente es que éste debe
ser: a) completamente miscible en agua, b) no reactivo con las proteínas, c) un buen agente
precipitante y d) seguro.

Precipitación con polímeros no iónicos

La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros neutros como

el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes. Dichos polímeros de elevado peso molecular
son solubles en agua y sus soluciones presentan viscosidades moderadas (Guo et al., 1996). El
mecanismo por el cual ocurre la precipitación cuando se utilizan estos polímeros no está claramente
establecido, sin embargo, existen dos modelos que permiten una buena comprensión de este
fenómeno y sugieren que los polímeros excluyen a las proteínas de parte de la solución y reducen
la cantidad efectiva de agua disponible para su solvatación.

Selección del polímero

Es importante seleccionar adecuadamente el polímero que se utilice como agente

precipitante. Varios tipos de polímeros pueden ser efectivos en la precipitación de las proteínas, el
inconveniente es que algunos pueden generar una alta viscosidad que dificulta su manejo.

El polietilenglicol es un polímero disponible en varios grados de polimerización y presenta

una viscosidad moderada. El polietilenglicol de peso molecular 4,000 o mayor es más efectivo en la
precipitación de proteínas que el de bajo peso molecular. Se ha observado también (Bell et al., 1983)
que se requieren bajas concentraciones de polietilenglicol para precipitar proteínas de alto peso
molecular, mientras que para precipitar proteínas de bajo peso molecular las concentraciones
deben ser mayores.

Una ventaja adicional de la precipitación con polímeros no iónicos es que éstos estabilizan
la proteína y permiten realizar la precipitación a temperatura ambiente. Además, a diferencia de la
precipitación por salado en la cual debe eliminarse la sal antes de seguir con cualquier operación de
fraccionamiento por intercambio iónico, los polímeros no iónicos generalmente pueden ser eluidos
durante el paso de la proteína por un intercambiador iónico.

Precipitación con polímeros iónicos

Recientemente, se han utilizado polielectrolitos aniónicos en la precipitación de anticuerpos

monoclonales, sin afectar la actividad biológica de éstos. Los mejores resultados implican un
compromiso entre el pH de trabajo y el peso molecular del polímero (McDonald et al., 2009).

Precipitación de Proteínas por Desnaturalización Selectiva

Los métodos de precipitación por disminución de la solubilidad son efectuados a

condiciones moderadas de tal manera que la proteína de interés no se desnaturalice. Si la proteína
que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas de temperatura, pH, o en
solventes orgánicos, puede utilizarse esta propiedad en las primeras etapas del proceso de
purificación sujetando a la solución de proteínas a estas condiciones extremas, de tal manera que
se eliminen por desnaturalización las proteínas contaminantes y se obtenga una buena recuperación
de la proteína deseada.

El objetivo de la desnaturalización selectiva es crear las condiciones en las cuales la proteína

de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínima.

Desnaturalización por temperatura

En general las proteínas son muy sensibles a la temperatura. Sin embargo, hay proteínas
que se mantienen estables a temperaturas altas. Cuando esto sucede, puede usarse la temperatura
para desnaturalizar y precipitar proteínas contaminantes y aislar la proteína de interés.
 La precipitación con temperatura puede ser riesgosa debido a que los daños que se
ocasionen a la enzima de interés son irreversibles. La solución se calienta hasta una temperatura
dada, se mantiene por un periodo de tiempo a dicha temperatura y enseguida se enfría
rápidamente. Por lo tanto, se requiere contar con sistemas de enfriamiento adecuados, sobre todo
en tanques agitados, para lograr bajar adecuadamente la temperatura y evitar así que ésta pueda
dañar a la proteína de interés. Es conveniente realizar el calentamiento en presencia de sulfato de
amonio en la solución, debido a que éste estabiliza las proteínas e inhibe la actividad de las
proteasas, que como es sabido se incrementa con la temperatura.

Desnaturalización por pH

Debido a que ciertas proteínas de interés son estables a pH’s extremos, se ha utilizado esta
propiedad para purificarlas mediante la precipitación por desnaturalización selectiva de sus
proteínas contaminantes.

La desnaturalización por pH ocurre tanto por la formación en la molécula de proteína de

regiones con cargas iguales que tienden a repelerse, como por el rompimiento de las fuerzas de
atracción que le dan su conformación.

La velocidad de desnaturalización a pH’s extremos ya sean ácidos o básicos depende del

tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación. Este proceso es esencialmente
similar al que ocurre en la desnaturalización por temperatura.

Desnaturalización por solventes orgánicos

La estabilidad que presentan algunas proteínas en una solución con solventes orgánicos, es
una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificación mediante la precipitación de
proteínas contaminantes con estos solventes.

Cuando se utilizan solventes orgánicos como etanol, acetona o cloroformo para

desnaturalizar proteínas, la temperatura de la solución se mantiene entre 20 y 30 °C con el fin de
acelerar el proceso. Después de un tiempo de incubación a esta temperatura la solución se enfría.
El aumento de temperatura permite que la cantidad de solvente utilizada sea menor que la
empleada en la precipitación convencional de proteínas.

El pH y la temperatura de la solución deben definirse y manejarse cuidadosamente (pues

también actúan sobre la proteína de interés) con el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de
la proteína de interés, y de lograr la máxima precipitación de las proteínas contaminantes.

Una proteína estable en solventes orgánicos es la alcohol-deshidrogenasa de levadura. Esta

enzima puede ser purificada mediante un tratamiento con 33% vol/vol de etanol a 25 _C. Este
tratamiento permite desnaturalizar las proteínas contaminantes y obtener la deshidrogenasa.

Precipitación por Afinidad

La precipitación de proteínas por afinidad es un método de precipitación selectivo que se

basa en la capacidad que tienen las proteínas para unirse con ligandos por medio de sus sitios activos
(Hilbrig y Freitag, 2003; Mondal et al., 2006). En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede
ser un sustrato, un inhibidor o un anticuerpo. En el caso de pseudoafinidad los ligandos utilizados
son colorantes o metales.

La simple adición de ligandos a una solución proteica generalmente no es suficiente para

que ocurra la precipitación. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregación de los
complejos ligando-proteína.

La precipitación por afinidad bioespecífica ocurre sólo cuando el ligando se une con las
proteínas o enzimas y forma agregados. El tipo de agregados que se forman depende del tipo de
ligando y de la proteína.

SECADO

Introducción

El secado es el último paso en la recuperación de ciertos productos biotecnológicos.

Consiste básicamente en la reducción del contenido de solvente en el producto por medio de una
evaporación o una sublimación. Tiene como propósito estabilizar el producto, preservar su
actividad, reducir su volumen o recuperar el solvente.

Existen varias formas de secar un material. En el caso de productos biológicos una limitante
en la selección del método de secado, es la temperatura que puede soportar el material de interés
sin perder actividad, de tal manera que las alternativas para estos materiales son más limitadas.

En la práctica de secado el solvente generalmente es agua y el medio hacia donde ésta se

elimina es aire. Por esta razón, el análisis del secado se basa fundamentalmente en los sistemas aire-
agua, sin embargo, los resultados que se logran pueden ser generalizados a otros sistemas.

El análisis de la operación de secado requiere conocer las relaciones de equilibrio que

implica la distribución de agua entre dos fases: a) la sólida del material a secar y b) la gaseosa del
aire seco que sirve como medio para tal efecto.

Además, es necesario conocer las diferentes formas en que puede ser conducida una
operación de secado. Asimismo, se requiere el conocimiento de la cinética de secado que depende
de la velocidad de transferencia de calor y de la velocidad de evaporación (Tsotsas et al., 2003). Una
cinética necesaria de considerar en esta operación que no tiene paralelo con otras operaciones, es
la velocidad de desactivación del material de interés por efectos térmicos.

Equilibrio y Propiedades Térmicas

Si un sólido húmedo se expone a una corriente continua de aire, puede ganar o perder
humedad dependiendo de la presión de vapor que ejerza el agua del sólido y de la presión de vapor
de la corriente del aire. Si la presión de vapor del agua del sólido es mayor que la presión de vapor
del aire, entonces el sólido pierde humedad, en el caso contrario su humedad aumenta. Cuando la
presión de vapor del agua del sólido iguala la presión de vapor de la corriente de aire, entonces el
sistema está en equilibrio.
 La presión de vapor que ejerce la humedad contenida en un sólido depende de la forma de
la humedad, el tipo de sólido y la temperatura.

En la mayoría de los materiales biológicos se pueden distinguir dos formas del agua
contenida en el sólido: agua libre y agua ligada.

El agua libre se caracteriza por ejercer una presión de vapor igual a la del agua pura. Este
tipo de agua se localiza en los espacios entre las células de los materiales o en los capilares de
precipitados porosos.

El agua ligada se caracteriza por ejercer una presión de vapor menor a la del agua pura. Este
comportamiento lo presenta el agua cuando está contenida en el interior de células. También en el
caso de algunos caldos donde los solutos alteran las propiedades del agua o ésta forma enlaces con
sustancias orgánicas.

Algunos conceptos importantes son:

Humedad: La humedad H de una mezcla aire-agua (humedad específica o humedad

absoluta) se define como la masa de vapor de agua por unidad de masa de aire seco.

Humedad de saturación: Una mezcla aire-agua está saturada a cierta temperatura y

presión, cuando la presión parcial del agua en la mezcla es igual a la presión de vapor del agua pura.

Porcentaje de humedad: El porcentaje de humedad se define como la relación porcentual

de la humedad con respecto a la humedad de saturación.

Punto de rocío: El punto de rocío de una mezcla aire-agua es la temperatura a la cual dicha
mezcla (sin estar en contacto con agua) se satura al ser enfriada a presión total constante. Cuando
una mezcla en su punto de rocío se enfría más allá de este punto, el vapor de agua condensa
formando una neblina o rocío.

Calor húmedo de una mezcla aire-vapor de agua: El calor húmedo es la capacidad calorífica
de la mezcla aire-vapor de agua. Es el calor necesario para incrementar un grado centígrado la
temperatura de una mezcla aire-vapor de agua, por kg de aire seco de la mezcla.

Volumen húmedo: El volumen húmedo es el volumen total que ocupa una mezcla aire-
vapor de agua por kg de aire seco a la presión de una atmósfera

Entalpia total: La entalpia total de un kg de aire seco y su vapor acompañante referida a

una temperatura To, está dada por el calor sensible de la mezcla aire-vapor de agua más el calor
latente del vapor de agua a la temperatura To.

Temperatura de bulbo húmedo: La temperatura de bulbo húmedo es la temperatura de

estado estable que alcanza una pequeña masa de agua cuando se pone en contacto con una
corriente de aire en condiciones adiabáticas. Para determinar temperaturas de bulbo húmedo se
puede utilizar un termómetro cuyo bulbo se recubre con una tela impregnada de agua. El
termómetro se sujeta mediante una cuerda y se hace girar en el aire. Si el aire no está saturado se
produce un descenso en la lectura del termómetro debido a la evaporación de agua de la tela. La
lectura final de estado estacionario es la temperatura de bulbo húmedo (en contraposición, a la
lectura normal del termómetro se le llama temperatura de bulbo seco).

Métodos de Secado

El método de secado que debe ser utilizado en un bioproceso depende del tipo de producto,
sus propiedades físicas, su tolerancia a la temperatura y los requerimientos de proceso en cuanto a
la forma de operación ya sea intermitente o continua.

Los métodos de secado se pueden clasificar de acuerdo a la forma de transferir calor y

eliminar el solvente en dos tipos: a) adiabáticos y b) no adiabáticos.

Métodos adiabáticos

Estos métodos consisten en el secado por medio de adición de calor con aire caliente. Los
secadores por aspersión y los secadores de tipo instantáneo operan de acuerdo a este método. Son
utilizados para secar partículas que no toleran altas temperaturas como proteínas unicelulares y
enzimas.

Métodos no adiabáticos o por conducción

En el secado no adiabático el calor se proporciona en forma indirecta por conducción a

través de una pared metálica. Generalmente los secadores no adiabáticos operan a presión reducida
y se emplean para el secado de cristales y precipitados, donde las temperaturas de secado deben
ser menores a 60 °C.

El secado por congelamiento, un caso de secado no adiabático, se efectúa por sublimación

de agua congelada empleando bajas presiones y temperaturas. Se emplea para secar proteínas
terapéuticas que no toleran temperaturas arriba de las ambientales.

Velocidad de Secado: transferencia de calor y masa

En el diseño de secadores, además de las relaciones de equilibrio, es necesario establecer

relaciones que permitan determinar la velocidad del secado o el tiempo de secado. Debido a que el
conocimiento de los mecanismos básicos del secado no es completo, frecuentemente es necesario
efectuar mediciones experimentales de la velocidad de secado.

Cuando se seca un sólido ocurren dos procesos fundamentales y en forma simultánea: a) se

transfiere calor para evaporar un líquido y b) se transfiere masa: como líquido o vapor al interior de
sólido, y como vapor del sólido al aire.

Los factores que controlan la velocidad de estos procesos determinan la velocidad del
secado. Los mecanismos de transferencia de masa están íntimamente relacionados con el tipo de
sólido a secar (homogéneo, granular, etc.), mientras que la forma de transferir calor depende del
método de secado (adiabático o no adiabático).
 Existen dos enfoques fundamentales para modelar los procesos de secado: a) modelos de
parámetros agrupados y b) modelos de parámetros distribuidos. El primero supone que las
propiedades físicas y los componentes de los materiales a secar permanecen uniformes a través del
lecho del material. Los modelos de parámetros distribuidos permiten una diferente composición del
material en determinadas regiones (Katekawa y Silva, 2006; Wang y Langrish, 2009).

Efectos Colaterales del Secado

Cuando el secado de un material no se realiza apropiadamente, se presentan daños que

afectan la calidad del producto. En el caso de productos biotecnológicos los daños típicos que se
presentan en el secado son: endurecimiento, deshidratación química y desnaturalización.

El fenómeno de endurecimiento se presenta cuando la velocidad de secado es muy alta y el

sólido forma una capa interior húmeda y una capa exterior seca e impermeable, que impide la
evaporación y el secado apropiado. Este fenómeno puede evitarse disminuyendo la velocidad de
secado.

La deshidratación química consiste en la eliminación de agua de la estructura molecular del

producto y también se origina por una velocidad de secado alta. El tercer tipo de daño es la
desnaturalización que sufren las proteínas en el secado.

Fuente:
Tejeda, A., Montesinos, R., & Guzmán, R. (2011). Bioseparaciones. México:
Pearson.